CN103403174B - 活性药物成分及其中间物的酶促合成 - Google Patents

活性药物成分及其中间物的酶促合成 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过使用能够催化氧化或脱氢的酶，制备活性药物成分(API)或其中间物的方法，应注意的是用于例如制备抑制素的中间物合成中的特定步骤。本发明还提供了有效翻译所述酶的表达体系。此外，本发明涉及这类酶用于制备API或其中间物的具体用途，以及特别是用于制备抑制素或其中间物的具体用途。

Description

活性药物成分及其中间物的酶促合成
发明领域
本发明一般涉及化学技术领域，特别是使用酶制备活性药物成分(API)或其中间物的方法。特别的是，本发明涉及HMG-CoA还原酶抑制剂的制剂，其也被称为抑制素，其中提供某些酶用于催化合成中的特别步骤。在某些实施方案中，本发明涉及通过提供所述酶制备中间物的方法。本发明还涉及有效翻译所述酶的表达体系。此外，本发明涉及这类酶用于制备API或其中间物，特别是用于制备抑制素或其中间物的具体用途。
发明背景
合成途径常规上是通过在体外进行化学反应实施的。化学能够变得复杂，并能够需要昂贵的试剂、多个长的步骤，由于低立体异构选择性，可能伴随低产率。在特定情况下，可以应用微生物或其部分，所述微生物或其部分能够在其生物化学途径中使用起始材料作为底物的，将起始材料转化为理想的化合物。在微生物或其部分(例如酶)的帮助下，任选地连同合成方法步骤，可以组合完整的合成途径，用于制备API或其中间物，但这是充满挑战的任务。
例如，Patel等人，Enzyme Microb.Technol.，第14卷，778-784(1992)描述了通过使用马肝醇脱氢酶或通过氧化化合物的微生物，立体异构选择性地将7-氧双环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲醇微生物/酶促氧化为相应的手性内半缩醛和内酯。此外，Moreno-Horn等人，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymes，第49卷，24-27(2007)描述了使用红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)作为生物催化剂，经γ-内半缩醛将1,4-烷二醇氧化成γ-内酯。
复杂合成途径的特定例子是酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG CoA还原酶)的抑制剂合成，发现其可作为优秀的工具，用于降低血液的脂类和胆固醇水平，以降低由动脉硬化触发的病理学过程和疾病中的严重心血管事件造成的死亡率。在HMG CoA还原酶抑制剂中，天然的洛伐他汀是已知的，它已被半合成的普伐他汀、辛伐他汀，而后被完全合成的阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀和达伐他汀取代。临床上有效的HMG CoA还原酶抑制剂也被称为他汀类(特征是INN名称结尾的他汀)。
所有的抑制素都共享特征性侧链，所述侧链分别由与抑制素骨架(方案1)相连的庚烯酸或庚酸部分(游离的酸、盐或内酯)组成。抑制素的生物学活性与该结构及其立体化学相联系。一般需要多个化学步骤制备庚烯酸或庚酸部分。该侧链的构建对化学家而言仍然是一个挑战。
方案1
经内半缩醛制备侧链和抑制素的首次尝试公开在US 7414119中。WO 2006/134482公开了应用醛缩酶(特别是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶；DERA；EC分类EC 4.1.2.4.)合成内半缩醛，后者能够直接偶联得到阿托伐他汀。
为了其他用途和最终生产抑制素的化合物，必需氧化内半缩醛。在J.Am.Chem.Soc.116(1994),第8422-8423页和WO 2008/119810中，通过Br2/BaCO3将纯化的内半缩醛氧化为内酯。WO 2006/134482公开了用于相同目的的催化脱氢的应用(例如Pt/C，Pd/C)。
本发明的目标是提供新的方法，所述方法一般允许在制备API或其中间物时，以数量减少的方法步骤、较短的时间、高产率和改善的、更经济、更简化的方式氧化或脱氢。本发明的具体方面可用于制备抑制素或其中间物。
发明概述
为了实现上述目的，本发明提供了根据权利要求1的方法。从属权利要求中提出了优选的实施方案。本发明还提供了根据权利要求9的反应体系，根据权利要求13的制备药物组合物的方法，根据权利要求14和15的表达体系，和根据权利要求18-21的用途。
令人惊讶的发现，可以使用特定的酶将某些内半缩醛氧化成通常用于抑制素类化合物合成的内酯部分。应注意的是，用化学试剂氧化内半缩醛需要先分离内半缩醛，这是非常麻烦并耗费大量有机溶剂的。此外，必需先用羟基保护基保护4-羟基-内半缩醛，这增加了反应步骤数和API的最终杂质谱。另一方面，相对于现有技术中用Br2/BaCO3化学氧化或化学催化脱氢(例如Pt/C，Pd/C)，用如根据本发明上文定义的酶催化剂实施式(II)的化合物的氧化或脱氢是非常有利的。化学氧化剂是非特异性的，因此需要先纯化内半缩醛，否则在副产物或试剂甚至溶剂的氧化中会消耗太多试剂。内半缩醛纯化是要求高的，且需要大量的溶剂进行萃取，这与内半缩醛通常是亲水性，且难以萃取到有机溶剂(如乙酸乙酯)中的事实相关。还应注意，需要蒸发用于萃取的溶剂，这对于工业规模的操作是不理想的。本发明的方法解决了化学氧化的所有上述缺点。通过使用能够催化氧化或脱氢的酶，规避了纯化和蒸发步骤，显著缩短了制备式(I)的化合物的方法。
虽然内半缩醛(如化合物(II))是非天然类型的化合物，但令人惊讶的是发现可以用作为本文公开的酶的有效底物。基于该发现，使用能够催化氧化或脱氢的酶为一般性制备合成的API或其合成的中间物提供了宝贵的工具。因此，一般而言，在本发明用于制备非天然的合成API或其中间物的用途中的底物不同于能够催化氧化或脱氢的酶的天然存在的底物，从而排除了例如选自乙醇、甲醇、乙醛、乙酸、天然存在的糖或氨基酸、或源自糖的糖酸，包括具有羧基的单糖(如葡萄糖酸)的天然底物。
下列项目概况了本发明的方面、优势特征和优选的实施方案，分别单独或组合地对解决本发明的目的有贡献。
(1)用于制备式(I)的化合物
或其可药用的盐或酯或立体异构体的方法，其中
R1独立于R2表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3、NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基；和
R2独立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；
或R1和R2都表示X、OH或O((CH2)nCH3)；
或R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5，或共同形成环-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中
上述任一个CH2或CH3基团可任选地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或
每个CH2连接碳原子都可被O、S或NR3替换；其中
R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
R5表示任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基，
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1；
所述方法包括使式(II)的化合物，
其中R1和R2的定义如上，与能够催化氧化或脱氢的酶接触，和任选地使产品成盐、酯化或立体异构选择性地解析产品。
(2)根据项(1)的方法，其中
R5表示选自式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)和(IX)的部分；
(3)根据项(1)或(2)的用于制备式(I)的化合物的方法，其中
R1独立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3，任选的取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基；和
R2独立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；
或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；
或者R1和R2共同表示＝O，或共同形成环-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中
上述任一个CH2或CH3基团可任选地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或
每个CH2连接碳原子都可被O、S或NR3替换；其中
R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
X表示F,Cl,Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1。
(4)根据任一项前述项目的用于制备式(I)的化合物的方法，其中
R1独立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3，或NR3CO(CH2)nCH3；和
R2独立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；
或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；
或者R1和R2共同表示＝O、-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中
R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
X表示F,Cl,Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1。
(5)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶是氧化酶或脱氢酶。
(6)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶能够催化醛糖脱氢。
(7)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶是醛糖脱氢酶。
(8)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶特异性氧化内半缩醛羟基。
(9)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶是醛糖1-脱氢酶(EC 1.1.5.2)。
(10)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶选自吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖性脱氢酶。
(11)根据任一项前述项目的方法，其中酶是水溶性的或膜结合的。
(12)根据任一项前述项目的方法，其中酶选自由脱氢酶编码基因编码的脱氢酶，所述脱氢酶编码基因包含在SEQ ID NO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一条核苷酸序列内，或由SEQ ID NO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一条核苷酸序列构成；或者由任一条氨基酸序列定义的脱氢酶，所述氨基酸序列包含在SEQ IDNO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62内，或由SEQ ID NO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62组成；或分别与所述序列具有至少50％，优选70％，更优选90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的任何脱氢酶，只要所获得的序列变体保持脱氢酶活性。
(13)根据任一项前述项目的方法，其中酶是Ylil醛糖脱氢酶或Gcd膜结合的葡萄糖脱氢酶。
(14)根据任一项前述项目的方法，其中2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC4.1.2.4)用于制备式(II)的化合物。
(15)根据项(14)的方法，其中2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC 4.1.2.4)用于合成步骤中，所述合成步骤先于，或备选地至少在重叠的时间段内同时地，使式(II)的化合物与能够催化氧化或脱氢的酶接触。
(16)根据任一项前述项目的方法，其中在没有先分离或纯化式(II)的化合物的条件下，使式(II)的化合物与能够催化氧化或脱氢的酶接触。
(17)根据任一项前述项目的方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶，任选地以及DERA酶，独立地包含在活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中；或者是纯化的、固定的和/或处于胞外表达的蛋白质的形式，优选地在活的全细胞、失活的全细胞，或均质化的全细胞中，更优选地在活的全细胞或失活的全细胞中，特别是包含在活的全细胞中。
(18)根据项(14)至(17)的任一项的方法，其中式(I)的化合物至少部分是与式(II)的化合物制剂同时制备的。
在项(14)至(17)定义的优选的实施方案中，安排使用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)制备化合物(II)，并允许产物用于，优选地至少在重叠的时间段内同时用于能够催化氧化或脱氢的酶的随后的氧化反应，对于方法的效率和减少方法所需的时间而言是特别有利的。当方法至少部分同时进行时，所制备的式(II)的化合物可以作为随后氧化反应的底物立即消耗，这使第一反应的稳态平衡向产物的方向移动。
(19)根据任一项前述项目的方法，其中电子受体包含在方法中或添加到能够催化氧化或脱氢的酶中，优选使用或添加氧；和/或其中为了变得有功能，方法包含或添加酶的辅助因子，例如选自FAD、NAD(P)+和/或PQQ的辅助因子，和任选地本文公开的其他添加剂和助剂。
当根据该另外的优选的实施方案向能够催化氧化或脱氢的酶添加氧时，或者当反应在存在氧的条件下进行时，例如在充气条件下，优选地当向由脱氢或氧化酶催化的脱氢或氧化反应中鼓气时，反应变成不可逆的，这确保了获得的产物，并且当同时制备式(II)和(I)的化合物时，进一步增强了第一反应的稳态平衡移动。存在氧，特别是存在大于5％的溶解氧，其中100％溶解氧理解为给定方法条件下的氧饱和溶液，也是增加产率和减少反应时间的有利方法参数。此外，在特定情况下允许存在氧促进了所用微生物的增殖。类似的解释可用于相应酶的辅助因子和任选的其他有用的添加剂和助剂的使用。
(20)用于制备式(I)的化合物
或其可药用的盐、酯或立体异构体的反应体系，或单罐装(one pot)方法，其中，R1和R2如项(1)至(4)的任一项所定义，
反应体系能够或被安排用于，或单罐装(one pot)方法包括，将式(X)的化合物与乙醛在存在2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)和能够催化氧化或脱氢的酶的条件下反应，
其中，R表示式(I)的R1-CH-R2部分，R1和R2如项(1)至(4)的任一项所定义，
并且任选地成盐、酯化或立体异构选择性地解析产物。
在本文中，能够催化氧化或脱氢的酶优选是由项(5)至(13)的任一项定义的酶表示。
术语“反应体系”意指技术体系，例如体外系统、反应器、培养容器或发酵罐。
术语“能够”或“被安排”意指反应体系是合适的，或者条件和构象设置为可以进行定义的反应。
(21)根据项(20)的体系或方法，其中项(1)定义的式(II)的化合物是作为中间物生成的，其未分离。
(22)根据项(20)或(21)的任一项的体系或方法，其中能够催化氧化或脱氢的酶，任选地以及DERA酶，都独立地包含在活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中；或者是纯化的、固定的和/或处于胞外表达的蛋白质的形式，优选地在活的全细胞、失活的全细胞或均质化的全细胞中，更优选地在活的全细胞或失活的全细胞中，特别是包含在活的全细胞中。
(23)根据项(20)至(22)的任一项的体系或方法，其中两种所述的酶，即，DERA和能够催化氧化或脱氢的酶，都由相同细胞表达。
(24)根据项(17)的方法，或根据项(22)或(23)的体系或方法，其中细胞是细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选的是细菌或酵母，更优选的是细菌。
(25)根据项(24)的体系或方法，其中细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enteorobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、根瘤菌属(Rhizobioum)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、拉恩氏菌属(Rahnella)和异常球菌属(Deinococcus)。在更特定的含义中，微生物可选自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)、肠杆菌(Enterobacter)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，最优选选自大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌，特别是大肠杆菌。
(26)根据项(24)的体系或方法，其中酵母选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)和假丝酵母属(Candida)，优选酵母属。
(27)根据项(24)的体系或方法，其中哺乳动物细胞是中华田鼠卵巢细胞或肝细胞，优选的是中华田鼠卵巢细胞。
(28)根据任一项前述项目的方法，还包括使所述化合物(I)经历这样的条件，所述条件足以制备抑制素或其可药用的盐，优选地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀或其可药用的盐，更优选地阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀或其可药用的盐，特别是罗苏伐他汀或其可药用的盐。
(29)制备抑制素或其可药用的盐、酯或立体异构体的方法，包括步骤：
(I)使式(II)的化合物：
与能够催化氧化或脱氢的酶接触，以制备项(1)至(4)的任一项定义的式(I)的化合物，其中R1和R2如项(1)至(4)的任一项所定义；和
(II)使所述化合物(I)经历足以制备抑制素的条件；
(III)任选地成盐,酯化或立体异构选择性地解析产物。
(30)根据前述项目的方法，其中式(II)的化合物是通过2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC 4.1.2.4)制备的。
(31)根据前述项目的方法，其中至少部分同时制备式(II)和(I)的化合物。
(32)根据项(29)至(31)的任一项的方法，其中抑制素是洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀，更优选地阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀，特别是罗苏伐他汀。
(33)根据项(29)至(32)的任一项的方法，其中还满足单独或组合的项(5)至(19)，或(20)至(27)的任一项定义的其他特定条件。
(34)根据项(29)至(33)的任一项的方法，还包括在药物配方中配制所述抑制素或其可药用的盐，优选地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀或其可药用的盐，更优选地阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀或其可药用的盐，特别是罗苏伐他汀或其可药用的盐。
(35)包含一种或多种细胞类型的表达体系，相应的细胞类型经遗传改造，在所有的细胞类型中表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)和能够催化氧化或脱氢的酶。
(36)表达体系，其能够翻译2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)和能够催化氧化或脱氢的酶，并过表达所述翻译需要的两种基因。
(37)根据项(35)或(36)的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶是氧化酶或脱氢酶。
(38)根据项(35)至(37)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶能够催化醛糖脱氢。
(39)根据项(35)至(38)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶是醛糖脱氢酶。
(40)根据项(35)至(38)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶选自广谱的糖脱氢酶。
(41)根据项(35)至(40)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶在位置C1特异性氧化。
(42)根据项(35)至(41)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶是醛糖1-脱氢酶(EC 1.1.5.2)。
(43)根据项(35)至(42)的任一项的表达体系，还能够表达用于提供吡咯并喹啉醌(PQQ)的基因簇。
(44)根据项(35)至(43)的任一项的表达体系，其中所述表达体系是细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选是细菌或酵母，更优选是细菌。
(45)根据项(44)的表达体系，其中细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enteorobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、根瘤菌属(Rhizobioum)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、拉恩氏菌属(Rahnella)和异常球菌属(Deinococcus)。在更特定的含义中，微生物可选自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)、肠杆菌(Enterobacter)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，最优选选自大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌，特别是大肠杆菌。
(46)根据项(44)的表达体系，其中酵母选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)和假丝酵母属(Candida)，优选酵母属。
(47)根据项(44)的表达体系，其中哺乳动物细胞是中华田鼠卵巢细胞或肝细胞，优选的是中华田鼠卵巢细胞。
(48)根据项(35)至(47)的任一项的表达体系，经安排同时表达能够催化氧化或脱氢的酶、DERA(脱氧核糖5-磷酸醛缩酶)、PQQ依赖性脱氢酶和PQQ生物合成的途径基因。
(49)根据项(35)至(48)的任一项的表达体系，其中能够催化氧化或脱氢的酶选自由脱氢酶编码基因编码的脱氢酶，所述脱氢酶编码基因包含在SEQ ID NO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一条核苷酸序列中，或由SEQ ID NO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一条核苷酸序列构成；或者由任一条氨基酸序列定义的脱氢酶，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中或由SEQ ID NO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62组成；或分别与所述序列具有至少50％，优选70％，更优选90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的任何脱氢酶，只要所获得的序列变体保持脱氢酶活性。
(50)根据项(35)至(49)的任一项的表达体系，其中通过如下方式提供PQQ：通过表达PQQ-合成编码基因，所述PQQ-合成编码基因包含在SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列中，或由SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列组成；或者通过表达编码SEQ ID NO.12、13、14、15、16、18、19、20、21和22的任一条氨基酸序列的PQQ-合成基因；或者通过表达与所述序列具有至少50％，优选70％，更优选90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的的PQQ-合成编码基因，只要所获得的序列变体保持生产PQQ的活性。
(51)根据项(50)的表达体系，提供了PQQ基因簇。
(52)能够催化氧化或脱氢的酶用于制备合成的API或其中间物的用途。
(53)根据项(52)的用途，其中合成的API或其中间物是能够催化氧化或脱氢的酶的底物化合物，所述化合物是选自取代的或未取代的双脱氧醛糖,合成的非天然醇、被另外羟基化的酯和被另外羟基化的内半缩醛的非天然化合物，优选地所述非天然化合物包含内半缩醛结构部分。
根据该实施方案，能够催化氧化或脱氢的酶，更具体的是项(5)至(13)的任一项定义的酶，可作用于包含相应的内半缩醛结构部分的前体化合物。
(54)根据项(52)或(53)的能够催化氧化或脱氢的酶的用途，与DERA酶同时或随后使用。
(55)根据项(52)至(54)的任一项的用途，其中排除了通过能够催化氧化或脱氢的酶转化乙醇、单糖或乙醛。
(56)醛糖脱氢酶用于制备式(I)的化合物的用途，其中式(I)如项(1)至(4)的任一项所定义。
(57)根据项(56)的醛糖脱氢酶的用途，其中所述酶与项(1)定义的式(II)的化合物接触。
(58)根据项(52)至(57)的任一项的用途，其中还满足单独或组合的项(2)至(51)的任一种的条件。
(59)醛糖脱氢酶用于制备抑制素或其可药用的盐，优选地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀或其可药用的盐，更优选的阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀或其可药用的盐，特别是罗苏伐他汀或其可药用的盐的用途。
(60)根据项(35)至(51)的任一项的表达体系用于制备式(I)的化合物的用途，其中式(I)如项(1)至(4)的任一项所定义。
(61)根据项(60)的表达体系的用途，其中还满足单独或组合的项(2)至(34)的任一种条件。
(62)根据项(35)至(51)的任一项的表达体系用于制备洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀，更优选地阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀，特别是罗苏伐他汀的用途。
(63)根据项(62)的表达体系的用途，其中还满足单独或组合的项(2)至(34)的任一种条件。
(64)微生物用于制备式(I)的化合物
或其可药用的盐或酯或立体异构体的用途，其中
R1独立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3、NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基；和
R2独立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；
或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；
或者R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5或共同形成环-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中
任一种上述CH2或CH3基可任选地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或
每个CH2连接碳原子都可被O、S或NR3替换；其中
R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
R5表示任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基，
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1；
任选地进一步加工式(I)的化合物以制备抑制素；
其中微生物
(i)选自源自克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enteorobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、根瘤菌属(Rhizobioum)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、拉恩氏菌属(Rahnella)和异常球菌属(Deinococcus)的细菌；更特别地选自具体微生物肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)、肠杆菌属(Enterobacter)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)；优选选自氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌；或
(II)是大肠杆菌，所述的大肠杆菌经过遗传改造以能够表达用于提供吡咯并喹啉醌(PQQ)的基因簇的基因，或补充添加了外源性PQQ。
发明详述
我们令人惊讶的发现了用于制备式(I)的化合物
或其可药用的盐或酯或立体异构体的方法，其中
R1独立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，或任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基；和
R2独立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；
或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；
或者R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5或共同形成环-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中
任一种上述CH2或CH3基可任选地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或
每个CH2连接碳原子都可被O、S或NR3替换；其中
R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
R5表示任选地取代的单环或二环芳基、杂环或脂环基，
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1；
其中，可以简单地使式(II)的化合物：
与能够催化氧化或脱氢的酶接触，和任选地将产物成盐、酯化或立体异构选择性解析，其中R1和R2的定义如上。
术语“单环或二环芳基”在本文中指任何单环或二环、5-、6-或7-元芳香环或芳香杂环，例如吡咯基、呋喃基、噻吩基(tiophenyl)、苯基、咪唑基、嘧啶基、哒嗪基(piridazinyl)、吲哚基、kinolinyl ftaliminyl和苯并咪唑基。
除非对特定实施方案另外说明，术语“芳基”在本文中包括指代包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16环碳原子的芳香环系统。芳基可以是苯基。还可以是具有2个或多个环的多环系统，其中至少一个是芳香环。该术语包括了苯基、萘基、芴基、甘菊环基(azulenyl)、茚基、蒽基等。
术语“单环或二环的杂环基”在本文中指任何单环或二环、5-、6-或7-元的饱和或不饱和环，其中环中的至少1个碳被选自氧、氮和硫的原子取代。单环或二环的杂环基的非限制性例子是oksazolyl、噻唑基(tiazolyl)、异噻唑基(isotiazolyl)、吗啉基(morfolinyl)。
除非对特定实施方案另外说明，术语“杂环”在本文中包括具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子的饱和(例如，杂环烷基)或不饱和(例如，杂环芳基)杂环部分，至少1个所述原子选自氮和氧。特别是，杂环包括3-至10-元环或环系统，并且更特别的是5-或6-或7-元环，其可以是饱和或不饱和的；其例子包括环氧乙烷基、azirinyl、1,2-oxathiolanyl、咪唑基、噻吩基、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、thiopyranyl、噻蒽基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、苯并二氢吡喃基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫代吗啉基，尤其是硫代吗啉基、吲哚嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、cumaryl、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮杂苯基、邻二氮杂菲基、呋咕基(furazanyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、ehromenyl、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基等。
更具体而言，饱和的杂环部分可具有3、4、5、6或7个环碳原子，和1、2、3、4或5个选自氮和氧的环杂原子。基团可以是多环系统，但更常见的是单环，例如包括氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、环氧乙烷基、吡唑烷基、咪唑基、吲哚里西定基(indolizidinyl)、哌嗪基、噻唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、quinolinidinyl等。另外，“杂芳基”可包括具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子的芳香杂环系统，其中至少1个原子选自氮和氧。基团可以是具有2个或多个环的多环系统，其中至少1个环是芳香族的，但更常见单环的。该术语包括嘧啶基、呋喃基、苯并[b]苯硫基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡咯烷基、吡啶基、苯并[b]呋喃基、吡嗪基、嘌呤基、吲哚基、苯并咪唑基、喹啉基、吩噻嗪基、三嗪基、酞嗪基、2H-苯并二氢吡喃基、唑基、异唑基、噻唑基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹唑啉基、蝶啶基等。
术语“单环或双环脂环基”在本文中指任何单环或二环、5-,6-或7-元脂环族环。
在可被任选地取代的式(I)或(II)的化合物、API或抑制素的上下文中，术语“成盐”或“可药用的盐”在本文中指处于盐形式例如，钾、钠、钙、镁、盐酸、氢溴酸等的化合物或抑制素，其基本上也是生理耐受的。可以通过任选地在含水溶剂，或有机溶剂，或其混合物中，混合式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中间物与酸或碱，使式(I)或(II)的化合物、API或抑制素成盐，或成为盐的形式。优选的溶剂是在后去除的。
在式(I)或(II)的化合物、API或抑制素的上下文中，术语“酯化”或“酯”在本文中指式(I)或(II)的化合物或抑制素，其结构中具有至少1个酯键。在化合物或抑制素含有羟基的情况下，通过偶联式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中间物与含羧酸或磷酸基的化合物，可以实现此类酯键或酯化化合物。在式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中间物含有羧酸或磷酸基的情况下，可以通过与另一个化合物的羟基偶联来实现。
术语“立体异构选择性解析的”在本文中用于指任何本领域技术人员已知的分离立体异构体的混合物，立体特异性化合物的制备化学或分析学的方法。可以通过例如HPLC获得立体异构体，其中使用立体选择性柱。立体选择性柱是本领域已知的。
酶、生物体
术语“能够催化氧化或脱氢的酶”在本文中指催化氧化或脱氢的任何酶。酶识别和使用例如式(II)的化合物作为底物。本发明还考虑酶的组合、多单元酶(其中不同的单元任选地催化不同的反应)、融合或联结的酶，或与另一种结构性或非催化性化合物、单元、亚基或部分偶联的酶，只要满足能够催化氧化或脱氢的要求。酶可以是例如在原核或真核细胞的电子传递链中的酶，或真核或原核细胞的醇、醛或糖的生物化学途径中的酶。预料之外的发现：通常作用于天然底物的酶识别和氧化相当复杂的合成化合物，特别是将内半缩醛转变为内酯或可能转变为酯。本发明的一个重要的方面是意在用于能够催化氧化或脱氢的酶的反应通常不是自然界中存在的，因为底物不同于天然存在的底物，例如排除使用乙醇、甲醇、乙醛、乙酸、天然存在的糖或天然存在的氨基酸或从糖获得的酸，例如葡萄糖酸。然而，令人惊讶的发现，本文公开的合成底物，即使结构相当复杂，也可以通过使用能够催化氧化或脱氢的酶方便地加工，以最终获得API，特别是抑制素或其中间物，包括例如式(I)的内酯化合物。一般而言，酶可以选自氧化还原酶。
根据酶命名法，可用于本发明中的酶主要属于EC 1.1(主要作用于供体的CH-OH基团上的氧化还原酶)，更具体的是但不限于以下亚类：EC1.1.1(以NAD+或NADP+为受体)、EC1.1.2(以细胞色素为受体)、EC1.1.3(以氧为受体)、EC 1.1.5(以醌或核黄素或相似化合物为受体)。反应可使用本领域已知的任何氧化还原酶，不论其序列同一性。
下文将进一步详细描述原则上可用于本发明中的酶——之后将描述示例性的实验例子，需要时，本文还提供了合适的筛选和/或验证测试。在本发明之前，已描述和任选地使用了一些特定的酶，但是在不同于本发明的其他条件或领域中。下文将阐述和列举其公开内容并入本文中的参考文献。
具有糖氧化/脱氢活性的酶已广泛地用于工业中。氧化发酵的典型例子是D-葡萄糖酸盐(葡萄糖酸)、L-山梨糖等的传统生产。这些方法是在澄清相应酶的分子机制前，基于对一些微生物特性的经验性的发现，作为实践产业出现的[Adachi,2007]。
糖氧化酶在食品加工中被用作添加剂，在乳业和乳过氧化物酶体系中用于食品防腐，在面包制作中用于生产干燥蛋粉末，作为抗氧化剂/防腐剂(氧清除剂)用于还原含醇酒，作为葡萄糖测定和燃料细胞[Wong,2008]。糖氧化酶也被用作电流测定的生物传感器，例如用于测量血液中的葡萄糖浓度[Igarashi,2004]，用于检测重金属[Lapenaite,2003]，用于检测空气中的甲醛[Acmann,2008]，用于检测流动注射分析中的酚类化合物[Rose,2001]，用于肾上腺素的超敏型双酶传感器用于[Szeponik,1997]，用于确定木糖浓度[Smolander,1992]等。
普遍已知的能够氧化六元糖的酶是葡萄糖氧化酶，Gox(EC 1.1.3.4)，作为黑曲霉(Aspergillus niger)的提取物可自Sigma购买。该酶具有非常狭窄的底物特异性[Keilin,1952]。它是在一些真菌和昆虫中天然产生的，其中该酶的催化产物——过氧化氢——作为抗菌和抗真菌剂发挥作用。Gox一般被视为安全的，黑曲霉的Gox是许多工业应用的基础[Wong,2008]。Gox催化的反应还被用于烘焙、干燥蛋粉末生产、酒生产、葡萄糖酸生产等。它的电化学活性使其成为葡萄糖传感器中的重要组分，尤其是在糖尿病中以及PQQ依赖性糖脱氢酶的情况下，并潜在地在燃料细胞中应用。葡萄糖氧化酶能够氧化单糖、硝基烷和羟基化合物[Wilson,1992]。利用葡萄糖的反应速率作为参照(100％)，仅2-脱氧-D-葡萄糖(20–30％)、4-O-甲基-D-葡萄糖(15％)和6-脱氧-D-葡萄糖(10％)被黑曲霉的葡萄糖氧化酶以显著速率氧化[Pazur,1964；Leskovac,2005]。葡萄糖氧化酶对其他底物的活性通常低下，反应速率低于葡萄糖的2％[Keilin,1948；Pazur,1964；Leskovac,2005]。
在优选的实施方案中，能够催化氧化或脱氢的酶是脱氢酶。特别地，酶能够催化糖脱氢，更特别地能够催化醛糖脱氢。优选的酶是糖脱氢酶(EC1.1)。在具体的实施方案中，酶是醛糖脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。现有技术中描述这类酶的术语可能与本发明提供的不同，但应理解，本文中考虑的底物特异性和酶催化化合物(II)或其他化合物氧化/脱氢的能力不依赖于现有技术中的术语。一个例子是大肠杆菌中发现的酶的术语(YliI,Adh,Asd)，该酶被一些作者称为“可溶性葡萄糖脱氢酶”，被另一些作者称为“醛糖糖脱氢酶”或“可溶性醛糖脱氢酶”。另一个例子是关于大肠杆菌中发现的膜结合的葡萄糖脱氢酶的术语(mGDH,GCD,PQQMGDH)，该酶被一些作者称为“PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶”，被另一些作者称为“膜结合的葡萄糖脱氢酶”或GCD。
糖脱氢酶(醛糖脱氢酶)的天然底物是被氧化的多种糖。醛糖脱氢酶可以作用的糖的广泛范围涵盖了戊糖、己糖、二糖和三糖。优选地，能够催化氧化或脱氢的酶在位置C1特异性氧化。在醛糖1-脱氢酶的情况下，酶将醛或环状半缩醛氧化为内酯。
与上文一致，根据电子受体(在一些情况下，这些电子受体是这些酶使用从而有功能的辅助因子，即，FAD、NAD(P)+或PQQ)将糖氧化还原酶分类。按照在糖氧化还原酶亚类之间的显著不同的底物特异性，本发明优选使用PQQ依赖性脱氢酶(EC 1.1.5)。
FAD-(黄素蛋白脱氢酶)和PQQ-依赖性糖脱氢酶(醌蛋白脱氢酶)，EC1.1.5，分别使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或吡咯并喹啉醌(PQQ)辅助因子，并位于细菌细胞膜的外表面，其活性位点朝向周质空间。这些通常被称为膜糖脱氢酶。可选的，尤其在PQQ-依赖性糖脱氢酶组中，发现许多酶处于可溶性的形式，位于周质空间中。根据本发明，对使用的糖脱氢酶的溶解度没有任何本性的限制，但关于可利用的克隆、表达方法和分子工具，优选选择可溶的、细胞周质的糖脱氢酶，即，水溶性的酶。构建用于有效的细胞周质表达这类酶的表达菌株在技术上是较简单的，因此是优选的。另一方面，膜结合的糖脱氢酶对于有效表达是更加挑战性的，但由于与呼吸链更密切的联系(通过从PQQ向泛醌池传递电子)，也是优选的。在本发明的过程中，提供了例如这样的实例，其中使用天然存在的膜结合的糖脱氢酶以及过表达的膜结合的糖脱氢酶，用于以工业有用的产率将化合物(II)转化为化合物(I)。
呼吸链；电子受体
在宿主生物的呼吸链中，氧化过程中产生的电子通过酶辅助因子(电子载体)从底物传递到末端的泛醇氧化酶，以泛醌作为中间物。终末电子受体是氧，被呼吸链氧化还原酶还原成水。
呼吸链是一系列氧化还原酶，具有在最终以氧的还原结束的精密协同的逐步反应的级联中，从经还原的分子传递电子的能力。每个步骤利用氧化还原电势的差异进行有效工作，例如，将质子传递穿过细胞膜，还原其他分子等。电子载体在呼吸链和细胞的整体氧化还原过程中具有重要的作用。
电子可以在多个水平进入呼吸链。在氧化NADH/NADPH(通过细胞内的多种氧化还原过程获得的)的NADH脱氢酶的水平，将电子传递给泛醌池，并释放质子至胞外空间。可选的，氧化还原酶可以通过酶结合的辅助因子(FAD,PQQ)直接将电子传递给泛醌。泛醌再被末端的氧化还原酶(例如，细胞色素、硝酸盐还原酶等)进一步氧化，从而将电子与胞外质子偶联来还原氧(形成水)，而泛醌结合的质子则被释放到胞外空间。任何能够利用氧化还原电势运输质子的系统通常被称为质子泵。因此建立起跨膜质子电势，这是ATP合成酶发挥作用的动力。
这些水平相继具有更正的氧化还原电势，即，相对于终末电子受体差异相继降低的电势。个体细菌通常同时使用多种电子传递链。细菌可以利用多种不同的电子供体、多种不同的脱氢酶、不同的氧化酶和还原酶，和不同的电子受体。例如，大肠杆菌(当有氧生长时，使用葡萄糖作为能源)使用2种不同的NADH脱氢酶和2种不同的醌醇氧化酶，同时运行共计4种不同的电子传递链。
因此很明显，仅当提供电子受体时，氧化还原酶(例如糖脱氢酶)才能够有功能。在天然系统的情况下是由呼吸链提供的，可选的,可以使用相比底物/酶/辅助因子级联反应具有恰当的氧化还原电势的人工电子受体。在后一选项中，缺点是必须提供相当大量的人工电子受体，换言之，通常是必需与氧化底物等摩尔的量。
在该方面，反应混合物中可以提供由能够催化氧化或脱氢的酶产生的电子受体，从而促进电子流和化合物(II)的氧化或脱氢。受体可以选自但不限于：二氯酚吲哚酚(DCPIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、铁氰化钾(PF)、草酸铁钾、对苯醌、苯对苯醌、杜醌、硅钼酸盐、维生素K3、二氨基杜烯(DAD)、N,N,N’,N’-四甲基-对苯二胺(TMDP)。电子受体还可以是氧。本领域技术人员将认识到并可以例如应用作为Hill试剂列举的化合物、作为还原时变色的人工电子受体发挥作用的染料，并从文献中发现多个其他的候选受体。
PQQ脱氢酶
已显示了PQQ具有在溶液中复合二价阳离子的能力，这是细菌醌蛋白脱氢酶的催化活性的先决条件[Mutzel,1991；Itoh,1998；Itoh,2000]。为了活化细菌醌蛋白脱氢酶(不论其来源)，除PQQ外还必须存在二价离子(例如，Mg2+、Ca2+)，以实现成功重建全酶形式[James,2003]。除了结构性作用外，复合的二价离子在维持PQQ的活性构象中也有作用[Anthony,2001]。
在筛选PQQ依赖性醛糖脱氢酶后，令人惊讶的发现：在存在电子受体的情况下，测试的所有酶(例如，大肠杆菌的YliI醛糖脱氢酶，大肠杆菌的Gcd膜结合的葡萄糖脱氢酶，乙酸钙不动杆菌的GDH(可溶性的或膜结合的形式)，氧化葡糖杆菌的GDH，中间克吕沃尔菌的GDH)都可以将化合物(II)氧化为化合物(I)–(R1＝H，R2＝O-CO-CH3)，而不论受体是合成的分子或微生物的呼吸链。实际上，我们的实验发现测试的所有含有PQQ依赖性氧化还原酶的生物体都成功地将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯氧化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。一些还成功地测试用于其他化合物(II)分子，如下文示例。
从这个意义上来说，本发明的优选的方面涉及PQQ依赖性脱氢酶(醌蛋白，EC1.1.5)，更具体的是PQQ依赖性糖1-脱氢酶(EC 1.1.5.2)。
例如，YliI是大肠杆菌的醛糖糖脱氢酶，其活性需要PQQ[Southall,2006]。尽管大肠杆菌本身缺少合成PQQ的能力[Hommes,1984；Matsushita,1997]，其对环境中发现的PQQ表现出正趋化效应[de Jonge,1998]，并可以利用外部供应的辅助因子[Southall,2006]。YliI醛糖糖脱氢酶是可溶性的周质蛋白质，含有通过细胞质膜迁移至周质所必需的N-端信号序列。YliI醛糖糖脱氢酶(Asd)的折叠含有6个四链反平行的β-片层，其中PQQ结合位点位于蛋白质表面上暴露给溶剂的浅缝中。YliI蛋白是单体，每个单体结合2个钙离子，其中1个位于PQQ结合口袋中，另一个压缩在形成螺旋桨折叠的六条链中的两条之间[Southall,2006]。
已显示[Southall,2006]D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、D-岩藻糖、D-甘露糖、D-来苏糖、D-木糖、D-核糖、木糖醇、肌醇、L-山梨糖、甘露醇、2-脱氧-D-葡萄糖、葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖1-磷酸、葡萄糖6-磷酸、麦芽糖、α-乳糖、D-蔗糖、D-纤维二糖、蜜二糖和麦芽三糖是YliI醛糖1-脱氢酶的可接受的天然底物。Suthall等人没有测试与化合物(II)类似的、在C3位具有立体异构化学的天然糖，例如D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-古罗糖或D-艾杜糖。
除YliI醛糖糖脱氢酶外，大肠杆菌还含有膜结合的葡萄糖脱氢酶(mGDH)，这也是参与醇和糖的细胞周质氧化呼吸链的醌蛋白[Yamada,2003]。该酶也被称为GCD或mGDH或PQQGDH，以与YliI相似的脱辅基酶的形式存在，原因是大肠杆菌缺少合成酶的辅基——吡咯并喹啉醌(PQQ)的能力。mGDH是膜结合醌蛋白[Matsushita,1993；Anthony,1996；Goodwin,1998]，其在其延伸到周质空间中的C-端结构域上，催化D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸盐。PQQ介导的电子传递进一步受N端的膜整合结构域驱动；流向呼吸链的电子流穿过泛醌池至泛醇氧化酶[Van Schie,1985；Matsushita,1987；Yamada,1993]。通过添加PQQ和Mg2+或Ca2+或其他二价金属离子，获得mGDH酶的活性全酶形式。GCD是单体蛋白质，其具有跨内膜的N-端疏水结构域[Yamada,1993]，和位于周质空间中的含有PQQ和Mg2+或Ca2+的结合位点的大型C-端结构域[Yamada,1993；Cozier,1999]。
令人惊讶的是，mGDH酶还能够催化人工底物，式(II)的化合物的氧化。Cozier等人测试了它对D-阿洛糖的活性，所述D-阿洛糖是测试的唯一与化合物(II)具有相似的C-3原子立体异构化学的天然己醛糖，并且表现出较之D-葡萄糖相似的活性。应注意的是，D-阿洛糖在C-2和C-4上的另外两个OH基中不同于化合物(II)，这使得对化合物(II)的活性同样令人惊讶和预料之外的。
PQQ依赖性糖脱氢酶的另一个例子是乙酸钙不动杆菌GDH。至少2种不同的乙酸钙不动杆菌的醌蛋白葡萄糖脱氢酶是已知的：膜结合形式(mGDH)和可溶形式(sGDH)，其含有用于通过细胞质膜迁移至周质所需的24个氨基酸的N-端信号序列。两种形式的所有特征是不同的，例如底物特异性、分子大小、动力学、最佳pH、免疫活性。
sGDH的底物特异性与mGDH不同。sGDH优选氧化D-葡萄糖、麦芽糖和乳糖，较不成功氧化D-岩藻糖、D-木糖、D-半乳糖；而mGdh较不与二糖反应；其优选氧化D-葡萄糖、6-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖、D-阿洛糖、D-岩藻糖、2-氨基-D-葡萄糖(葡萄糖胺)、3-脱氧-D-葡萄糖、D-蜜二糖、D-半乳糖、D-甘露糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-来苏糖和D-核糖，较不成功氧化麦芽糖和乳糖[Cozier,1999；Adachi,2007]。
sGDH的两种可能的反应机制是：(A)添加-消除机制，包括广义碱-催化的去质子作用，再通过共价添加底物和之后消除产物；(B)包括广义碱催化的去质子作用的机制，所述去质子作用与从底物直接传递氢化物至PQQ并互变异构化为PQQH2相呼应[Oubrie,1999]。大肠杆菌YliI醛糖脱氢酶也假设是相似的机制。
与上述PQQ依赖性脱氢酶相似，sGDH和mGDH的二聚化和功能需要钙或镁[Olsthoorn,1997]。现有结构验证了每个单体存在3个钙结合位点[Oubrie,1999]。
如本发明示例的多种上述酶，就结构特性、定位、辅助因子结合和电子传递的机制等而言，不影响所述多种酶催化化合物(II)氧化为化合物(I)的功效。
PQQ依赖性糖脱氢酶的现有工业应用包括在经典发酵方法中生产D-葡萄糖酸(氧化葡糖杆菌)，以及生产多种天然糖。氧化葡糖杆菌生物体的不完全氧化天然碳底物，例如D-山梨糖醇(生产用于维生素C合成的L-山梨糖)、甘油(生产二羟基丙酮)、D-果糖和D-葡萄糖(生产葡萄糖酸、5-酮-、2-酮-和2,5-二酮葡萄糖酸)的重要能力用于生物技术应用中是普遍已知的。
与上述说明不同，在乙酸钙不动杆菌中发现了PQQ依赖性脱氢酶，所述乙酸钙不动杆菌是醋生产中使用的工业微生物。
对PQQ依赖性糖脱氢酶的最新关注是涉及研发不同的电流测定生物传感器，例如用于测量血液中的葡萄糖浓度[D’Costa,1986；Igarashi,2004；Heller,2008]，用于检测重金属[Lapenaite,2003]，用于检测空气中的甲醛[Acmann,2008]，用于检测流动注射分析中的酚类化合物[Rose,2001]，作为用于肾上腺素的超敏型双酶传感器[Szeponik,1997]，用于确定木糖浓度[Smolander,1992]等。PQQ依赖性糖脱氢酶还可以在纳米技术中用作生物燃料细胞[Gao,2010]。可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶已成为用于自身监控血糖的生物传感器体系中使用的主要酶类，因为这些酶与葡萄糖氧化酶不同，依赖于氧存在[Heller,2008]。
在现有技术中，不存在或尚未考虑过使用PQQ依赖性醛糖脱氢酶生产非天然化合物，尤其是与活性药物化合物或其中间物联合的方法，但如本发明所公开和提供的，已经证明这类酶提供用于有用的非天然化合物的有效且简单的合成原理是可行和可实现的。因此，本发明开辟了这类酶在其他氧化还原反应中的新应用领域，用于合成非天然化合物的目的，所述非天然化合物尤其是属于合成API及其中间物化合物的类别。
选择本发明中特别有用的酶
利用本文提供的信息和实验指导，本领域技术人员可以理解和推测如何选择能够催化氧化或脱氢的酶，从而基于其底物特异性或杂乱性、操作pH、温度和离子强度窗、对其他离子或辅助因子的需求等，将例如式(II)的化合物转变为式(I)的化合物。通常选择产生最佳酶活性的底物和反应条件。然而，可以协调对携带酶的细胞产生最小抑制效应或降低产物的稳定性的底物和条件，与达到最佳活性的底物和条件。原则上，允许增强的，优选最佳的酶活性的底物是优选的，反之亦然，对理想的化合物底物具有增强的，优选最佳特异性的酶是优选的。本领域技术人员可立即理解：反应条件一方面包括温度、pH、溶剂组成、搅拌和允许理想产物积累的反应长度。除了满足酶活性外，本领域技术人员根据本文提供的公开内容可知，调整条件以应用合适的pH、温度和反应时间，来阻止产物(例如内酯或酯)破坏。如果需要，可以向酶加入特定的辅助因子、共底物和/或盐，从而允许或改善酶的活性。辅助因子是盐或化学化合物。通常，所述种类已经包括在溶剂混合物中，尤其是如果酶包含在活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中。即使如此，还可以向酶、溶剂或反应混合物中加入辅助因子、共底物和/或盐。取决于酶，可以向酶、溶剂、基质或包含酶的反应混合物中加入二价铜、铁、镍、硒、锌、镁、钙、钼或锰离子，或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、硫锌酰胺、抗坏血酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、辅酶Q、辅酶F420、吡咯并喹啉醌、辅酶B、谷胱甘肽、血红素、四氢生物蝶呤等。例如，对于醛糖-1-脱氢酶或优选的Ylil或Gcd，向反应混合物、酶或溶剂或基质中加入钙离子或镁离子和吡咯并喹啉醌、或相似的电子受体。具体而言，下文实施例中说明了合适的条件。
用于本发明的脱氢酶可特别选自任何对上述底物(II)具有氧化活性的酶。一般而言，可以使用本领域已知的任何糖1-脱氢酶，而不论其与下文所列举酶(即脱氢酶)的序列同一性。应注意，挑选能够在C1位置特异性催化氧化或脱氢的酶是有利的。在醛糖1-脱氢酶的情况下，酶将醛或环状半缩醛氧化为内酯。
本发明还考虑酶的特殊变体，例如，在耐热性微生物菌株中发现的酶。这也同样适用于经过修饰或改良的天然存在的酶，其氨基酸序列或结构已经改变，以获得更好的底物特异性、更高的活性、在更宽温度或pH范围内的活性、对存在的有机溶剂或溶剂中的高离子强度的抗性等。
令人惊讶的发现了两种不同的糖脱氢酶，其源自分类学不同的微生物，并且仅具有21,8％氨基酸序列同一性，在本实验中同样成功地实施。具体而言，在代表的大肠杆菌的GDH 01醛糖糖脱氢酶YliI的氨基酸序列SEQ ID NO.02与代表乙酸钙不动杆菌的GDH 02葡萄糖脱氢酶GdhB的氨基酸序列SEQ ID NO.06之间实施比较。用Vector NTI Advance 11.0软件(Invitrogen)的组件，AlignX模块的默认设置进行序列比较算法，使用clustal W算法作为默认设置。
此外，还发现尽管在略微不同的反应条件下，甚至结构高度不同的酶，如具有氨基酸序列SEQ ID NO.02的大肠杆菌的可溶性醛糖1-脱氢酶，和具有氨基酸序列SEQ ID NO.04的大肠杆菌的膜结合的葡萄糖脱氢酶，也在本实验中同样成功。
由于此令人惊讶的发现，有理由预期能够将化合物(II)转变为化合物(I)或相似反应的蛋白质的氨基酸序列可以显著不同。然而，反应的产率依赖于各个糖脱氢酶酶的底物特异性。
合适的脱氢酶的例子包括但不限于序列表中的酶，所述酶是由其核苷酸序列、或各自的密码子优化的核苷酸序列、或序列表中所述的氨基酸序列定义的。
GDH 01是包含在SEQ ID NO.01的核苷酸序列中的脱氢酶编码基因，或SEQ IDNO.02的氨基酸序列。
GDH 02是具有SEQ ID NO.03的核苷酸序列或SEQ ID NO.04的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 03是具有SEQ ID NO.05的核苷酸序列或SEQ ID NO.06的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 04是具有SEQ ID NO.07的核苷酸序列或SEQ ID NO.08的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 05是具有SEQ ID NO.09的核苷酸序列或SEQ ID NO.10的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 06是具有SEQ ID NO.23的核苷酸序列或SEQ ID NO.24的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 07是具有SEQ ID NO.25的核苷酸序列或SEQ ID NO.26的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 08是具有SEQ ID NO.27的核苷酸序列或SEQ ID NO.28的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 09是具有SEQ ID NO.29的核苷酸序列或SEQ ID NO.30的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 10是具有SEQ ID NO.31的核苷酸序列或SEQ ID NO.32的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 11是具有SEQ ID NO.33的核苷酸序列或SEQ ID NO.34的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 12是具有SEQ ID NO.35的核苷酸序列或SEQ ID NO.36的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 13是具有SEQ ID NO.37的核苷酸序列或SEQ ID NO.38的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 14是具有SEQ ID NO.39的核苷酸序列或SEQ ID NO.40的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 15是具有SEQ ID NO.41的核苷酸序列或SEQ ID NO.42的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 16是具有SEQ ID NO.43的核苷酸序列或SEQ ID NO.44的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 17是具有SEQ ID NO.45的核苷酸序列或SEQ ID NO.46的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 18是具有SEQ ID NO.47的核苷酸序列或SEQ ID NO.48的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 19是具有SEQ ID NO.49的核苷酸序列或SEQ ID NO.50的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 20是具有SEQ ID NO.51的核苷酸序列或SEQ ID NO.52的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 21是具有SEQ ID NO.53的核苷酸序列或SEQ ID NO.54的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 22是具有SEQ ID NO.55的核苷酸序列或SEQ ID NO.56的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 23是具有SEQ ID NO.57的核苷酸序列或SEQ ID NO.58的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 24是具有SEQ ID NO.59的核苷酸序列或SEQ ID NO.60的氨基酸序列的脱氢酶。
GDH 25是具有SEQ ID NO.61的核苷酸序列或SEQ ID NO.62的氨基酸序列的脱氢酶。
因此，用于本发明的糖脱氢酶可以是对化合物(II)具有糖1-脱氢酶活性的任何化合物。在本发明的一个实施方案中，糖1-脱氢酶是PQQ依赖性糖1-脱氢酶。合适的PQQ依赖性糖1-脱氢酶的例子包括但不限于：GDH 01、GDH 02、GDH 03、GDH 04、GDH 05、GDH 06、GDH07、GDH 08、GDH 09、GDH 10、GDH 11、GDH 12、GDH 13、GDH 14、GDH 15、GDH 16、GDH 17、GDH18、GDH 19、GDH 20、GDH 21、GDH 22、GDH 23、GDH 24和GDH 25，其中每个酶是通过上文序列表所述的相应的核苷酸序列、或各自的密码子优化的核苷酸序列、或氨基酸序列定义的。
本发明提供了与选自GDH 01、GDH 02、GDH 03、GDH 04、GDH 05、GDH 06、GDH 07、GDH 08、GDH 09、GDH 10、GDH 11、GDH 12、GDH 13、GDH 14、GDH 15、GDH 16、GDH 17、GDH 18、GDH 19、GDH 20、GDH 21、GDH 22、GDH 23、GDH 24和GDH 25的任何脱氢酶具有至少50％，优选至少70％氨基酸序列同一性的糖脱氢酶。通过序列比较算法分析或目测，确定氨基酸序列标识。在一个方面，用Vector NTI Advance 11.0软件(Invitrogen)的组件，AlignX模块的默认设置进行序列比较，使用clustal W算法作为默认设置。
本发明提供的优选糖1-脱氢酶可以是源自大肠杆菌的糖脱氢酶，在上文序列表中鉴定为GDH01，并具有相应的核苷酸序列SEQ ID NO.01和氨基酸序列SEQ ID NO.02。
本发明提供的同样优选的糖1-脱氢酶可以是源自大肠杆菌的糖脱氢酶，在上文序列表中鉴定为GDH02，并具有相应的核苷酸序列SEQ ID NO.03和氨基酸序列SEQ ID NO.04。
本发明提供的另一个优选的糖1-脱氢酶可选自源自乙酸钙不动杆菌的糖脱氢酶，在上文序列表中鉴定为GDH03，并具有相应的核苷酸序列SEQ ID NO.05和氨基酸序列SEQID NO.06。
本发明提供的另一个优选的糖1-脱氢酶可选自源自乙酸钙不动杆菌的糖脱氢酶，在上文序列表中鉴定为GDH04，并具有相应的核苷酸序列SEQ ID NO.07和氨基酸序列SEQID NO.08。
本发明提供的最优选的糖1-脱氢酶可以是源自大肠杆菌的糖脱氢酶，在上文序列表中鉴定为GDH02，并具有相应的核苷酸序列SEQ ID NO.03和氨基酸序列SEQ ID NO.04。本领域和本发明中也描述了所述糖1-脱氢酶为PQQ依赖性糖脱氢酶、PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶、膜结合的葡萄糖脱氢酶、PQQ依赖性醛糖脱氢酶、醛糖脱氢酶、醛糖脱氢酶醌蛋白或葡萄糖脱氢酶醌蛋白。该特定的酶是由大肠杆菌中天然存在的基因gcd编码的，并编码被称为Gcd、mGDH或PQQGDH的蛋白质。
本发明示例性地利用了与氨基酸序列SEQ ID NO.02具有至少21.8％、50％，优选至少70％氨基酸序列同一性的糖脱氢酶。
在本发明中，根据作为产品的所需的合成的API或其前体化合物，可以筛选能够氧化式(II)的内半缩醛或另一种非天然底物的酶/生物体。在本发明的一个方面，本领域技术人员可以从文献中发现其他候选酶，可用于理想类型的酶促转化。
可以在不同的微生物和/或酶中筛选对化合物(II)的氧化/脱氢活性。术语“分析的材料”在本文中指可用于筛选方法中的任何微生物和/或酶，所述方法筛选和鉴别由本发明的任何微生物提供的作为活的全细胞催化剂、剩余的全细胞催化剂、无细胞裂解液、部分纯化的或纯化酶、固定化酶或任何其他形式的催化剂，能够将化合物(II)转变为化合物(I)的微生物和/或酶，而不论所述微生物是天然的或遗传修饰的微生物。出于实践目的，下文可理解术语“分析的材料”包括上述候选催化剂的所有制剂。本公开内容中提供了若干允许筛选和鉴别对化合物(II)的氧化/脱氢活性的方法，以及因此用于筛选和鉴别可用于执行本发明的生物体和/或酶的方法。
为了成功的实施所述筛选方法，可以根据培养特性，获得“分析的材料”。可以实施培养，以在满足营养需求的生长培养基中获得“分析的材料”的生物量。可以在液体培养基或固体培养基中实施培养。生长培养基和培养条件可以选自但不限于Difco&BBL Manual,2010，以及本领域技术人员普遍已知的其他规程。可以将培养的微生物制备成由本发明提供的不同的形式的催化剂。特别是在允许化合物(I)形成和积累的条件下，使“分析的材料”与化合物(II)接触。在一个方面，这些条件包括提供足以能够实施氧化/脱氢的负载的“分析的材料”；在另一个方面，反应中存在的底物和电子受体的量对催化剂活性表现出最低的抑制作用，在另一个方面，温度、pH、溶剂组成、搅拌和反应的长度允许积累理想的产物，在另一个方面，所述条件对产物稳定性没有有害作用。具体而言，这类条件可如实施例公开的值或条件所示定义，或从实施例公开的值或条件修饰或改变而来。“分析的材料”在本质上能够提供对化合物(I)(即PQQ)的活性所需的所有辅助因子，或者当如本发明所述从外部提供PQQ时，“分析的材料”具有将化合物(II)转变为化合物(I)的能力。在本文提供的所有筛选方法中，可以优选地添加所述和示例的浓度的PQQ。以盐的形式(例如CaCl2或MgCl2)提供的二价金属离子(例如钙或镁离子)促进PWW重构为脱辅基酶蛋白，获得活性形式的醛糖脱氢酶。这些可优选地以所述和示例的浓度添加至酶。
对本领域技术人员显而易见的是：可以通过上述方法和本说明书别处所述，定量确定PQQ的存在。在此情况下，用于方法的材料必须耗尽PQQ，或本质上已不含任何PQQ。
一个这类筛选和鉴别候选催化剂的方法是使“分析的材料”与化合物(II)接触。应该在上述最佳反应条件下实施化合物(II)向化合物(I)的转变。可以通过本领域已知的任何普遍已知的层析方法，在存在“分析的材料”的条件下，实现对底物转变为产物的检测。非限制性的例子包括液相HPLC、GC、TLC分析等。用于监控化合物(I)和相应化合物(II)的示例而非限制性的方法是气相层析分析(层析柱：DB-1 100％二甲基聚硅氧烷；温度程序：初始温度：50℃，初始时间：5min，温度速率：10℃/min，终末温度：215℃，终末时间：10min；注射器：分流/无分流注射器；运载气体：氦，初始流动：10mL/min；检测器：火焰离子化检测器(FID)，检测器温度：230℃)。执行这类方法的先决条件是反应混合物中存在电子受体。对于存在天然电子受体(例如呼吸链)的“分析的材料”，不需要任何其他组分(除了与空气中的氧气)而能够通过利用所述层析方法，观察从化合物(II)形成化合物(I)。当不能获得能够释放PQQ的电子对的电子受体的情况下(例如在无细胞裂解液或细胞膜级分中)，就需要人工电子受体，如DCPIP。然而，所述方法是分析方法，仅需要少量人工电子受体，优选的方式是在存在人工电子受体的条件下，用任何种类的“分析的材料”进行筛选方法。用于进行上述方法的示例性和优选的条件由实施例中公开的数值和条件定义。
本发明提供的另一种筛选方法是在存在可选的人工电子受体的条件下实施的方法，所述人工电子受体具有相比可使用的底物/酶/辅助因子级联反应的恰当的氧化还原电势。就该意义而言，本发明提供了使用人工电子受体的筛选方法，所述人工电子受体在被还原时会改变自身的光学可测量特性(例如颜色、吸光值、光谱等)。可以在反应混合物(连接了染料的体系)中提供这类人工电子，从而促进电子流，因而提示化合物(II)的氧化或脱氢。受体/指示剂可选自但不限于：2,6-二氯酚吲哚酚(DCPIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、铁氰化钾(PF)、草酸铁钾、对苯醌、苯对苯醌、杜醌、硅钼酸盐、维生素K3、二氨基杜烯(DAD)、N,N,N’,N’-四甲基-对苯二胺(TMDP)。本领域技术人员将认识到作为Hill试剂列举的化合物、作为还原时变色的人工电子受体发挥作用的染料，并可以从文献中发现许多其他的候选受体/指示剂。优选地，可以使用2,6-二氯酚吲哚酚(DCPIP)与吩嗪硫酸甲酯(PMS)的组合。示例性的筛选方法在反应混合物中含有下列组分：DCPIP与PMS组合作为人工电子受体、“分析的材料”和化合物(II)。分光光度法由DCPIP吸光值的降低，跟踪“分析的材料”对化合物(II)的氧化/脱氢活性，其中DCPIP被氧化时是蓝色的，被还原时变为无色。当“分析的材料”能够对化合物(II)具有氧化/脱氢活性时，电子被传递给人工电子受体，所述人工电子受体被还原并因此反应混合物的颜色从蓝色变成无色。
进行所述方法的一个例子是遵从下列方法：对于两种所述人工电子受体DCPIP和PMS都使用从约0.01mM至约10mM的浓度，特别是从约0.05mM至约5mM DCPIP与0.01mM至约2mM DCPIP组合。优选的，筛选方法中提供的DCPIP的量是浓度从0.1mM至约1mM，与浓度从0.05mM至约0.5mM PMS组合。最优选的，所提供的DCPIP与PMS的组合的量允许在分光光度法可以跟踪的时间线内观察到吸光值的降低。可以将化合物(II)溶解在恰当的含水溶液中，并在筛选方法中使用从约0.5mM至约1M，优选从约10mM至约500mM，最优选20mM至200mM的浓度。可以将化合物(II)溶解在蒸馏水或合适的缓冲溶液中。用于调节pH值的合适缓冲液是由酸、碱、盐或其混合物制备的，特别是可以使用磷酸和氢氧化钠。实施筛选方法的含水悬浮液可以缓冲至pH 5.5-9.0，优选6.0-8.5，更优选6.0.-8.0。在所述含水悬浮液中(特别是在从约0.05g/L至约50g/L的浓度范围内)，任选地在缓冲溶液(特别是磷酸缓冲液，pH6.0-8.5)中，将“分析的材料”加入到反应混合物中。可以跟踪吸光值降低的时间线，可以在380nm至750nm之间的波长，优选在450nm至650nm之间的波长，更优选在550nm至650nm之间的波长内，用分光光度法观察，对能够将化合物(II)转变为化合物(I)的催化剂进行筛选和鉴别。
本发明还提供了醛糖脱氢酶活性单位。醛糖脱氢酶活性单位定义为每单位湿重的用于制备任何“分析的材料”的培养的微生物中，每分钟吸光值减少的绝对值(abs[mAUmin-1mg-1])。为了比较研究，可以将测试的微生物的细胞密度定量化为每mL样品的湿重mg、蛋白质浓度和/或本领域技术人员普遍已知的的其他用于定量的间接或直接方法。
用于鉴别能够将化合物(II)转变为化合物(I)的生物体的另一种筛选方法是使用本领域任意已知的耗氧量测量方法。本发明提供的非限制性例子是使用加入化合物(II)后的测试生物的培养物中的溶解氧的测量值。更特别地，实验设置由含有测试生物的液体培养肉汤的搅拌型充气容器，和溶解氧的传感器组成。在加入化合物(II)后，可以观察到增加的的耗氧量，显示为溶解氧的数值下降。在标准化条件下，溶解氧的数值下降越快越深，测试生物促进化合物(II)的氧化速率越高。
PQQ
吡咯并喹啉醌(4,5-二氢-4,5-二氧-1H-吡咯-[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸：PQQ)是使用醌蛋白时发挥功能所需要的分子。PQQ，氧化还原辅助因子，是水溶性和热稳定的，被认为是生物氧化还原作用中除烟酰胺和黄素以外的第三类辅酶，是Hauge,1964发现的。当时，Anthony和Zatman还在醇脱氢酶中发现了未知的氧化还原辅助因子，并命名为methoxantin[Anthony,1967]。之后，据报道PQQ存在于脱氢酶、氧化酶、加氧酶、水合酶和脱羧酶中。这些醌蛋白的作用是催化非磷酸化的底物，例如醇、醛或醛糖的初级氧化步骤。
在原核(例如肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、扭脱甲基杆菌、中间克吕沃尔菌、氧化葡糖杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射异常球菌)和真核生物(例如云芝(Polyporus versicolor)、漆树(Rhus vernicifera))中都已发现了PQQ[Goodwin,1998；Hoelscher,2006；Yang,2010]。
一般接受的PQQ结构是：
其中，PQQox是辅助因子的氧化形式，PQQred是辅助因子的还原形式。
参与PQQ生物合成的基因数随物种而不同，一般已知生物合成至少需要5或6个基因，通常成簇存在于pqqABCDE或pqqABCDEF操纵子中。由下列实施例可见，基因的数量和组织方式是可变的。在肺炎克雷伯氏菌中，PQQ生物合成的基因成簇存在于pqqABCDEF操纵子中，而在铜绿假单胞菌中，pqqF则与pqqABCDE操纵子分开。在乙酸钙不动杆菌中，已知存在pqqABCDE，但没有pqqF基因。兼性甲基营养性的扭脱甲基杆菌AM1含有pqqABC/DE操纵子，其中融合了pqqC和pqqD基因，而pqqFG基因与其他3个基因形成操纵子。
虽然了解了许多关于使用PQQ作为辅助因子的酶，但关于PQQ的生物合成却知之甚少。然而，PQQ的骨架是由谷氨酸和酪氨酸构建的。最可能的是，这些氨基酸被编码在前体肽PqqA中。不同生物体之间的小肽长度不同(肺炎克雷伯氏菌是23个氨基酸，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是39个)，而在所有的变体中段中，PqqA肽基序Glu-X-X-X-Tyr是保守的。PqqB蛋白可能参与了其向周质的运输，因此不是PQQ生物合成直接必需的。PqqC蛋白的残基在PqqC蛋白之间是高度保守的，其负责催化不同细菌的PQQ形成的最后一步。尽管不同生物体的PqqD蛋白的蛋白质序列比对显示出严格保守的残基，但PqqD的功能尚未完全解析。在肺炎克雷伯氏菌中，显示了PqqE识别连接C9和C9a的PqqA，之后被PqqF接受，所述PqqF切断相连的氨基酸。在所述生物体中，显示出下一步反应(Schiff碱)是自发的，在双加氧作用。最后的环化和氧化步骤由PqqC催化[Puehrunger,2008]。
当在蛋白质数据库中实施源自肺炎克雷伯氏菌的PqqF和PqqG蛋白比较时，据称所述蛋白质与切割小肽的、含二价阳离子的内肽酶家族具有相似性[Meulenberg,1992]。尽管扭脱甲基杆菌的PqqF和PqqG蛋白与线粒体加工的肽酶的2个亚基具有一定程度的相似性[Springer,1996]，肺炎克雷伯氏菌的PqqF与由tldD基因编码的大肠杆菌的肽酶溶加压素(pitrilysin)最密切相关[Meulenberg,1992]。假设并实验显示了可以使用仅包含pqqABCDE基因而缺少pqqF的PQQ基因簇，在大肠杆菌中提供完整的PQQ生物合成装置(KimC.H.等人，2003,Yang X.-P.等人，2010)。溶加压素蛋白酶(由tldD基因编码)明显与一些微生物中发现的pqqF基因的活性互补。
虽然大肠杆菌本身缺少合成PQQ的能力[Hommes,1984；Matsushita,1997]，但它对环境中的PQQ表现出正趋化效应[de Jonge,1998]，并可以使用外部供应的辅助因子[Southall,2006]。因此，可以在大肠杆菌中重组表达PQQ生物合成基因，这是本发明描述的一个方面。
一般而言，对于上述内容，至少有3种方式向PQQ-依赖性脱氢酶原位提供PQQ：
首先，可以向含有醛糖脱氢酶的活细胞、或休眠细胞或无细胞裂解液、或纯化的醛糖脱氢酶添加PQQ。全酶形式重构为活性的脱辅基酶蛋白几乎是瞬间的，这是本发明显示的一个方面。为了促进酶与PQQ的偶联，向混合物中加入钙、镁或其他二价金属离子。这可以通过向酶混合物中添加盐(如MgCl2或CaCl2)来实现。此外，还有其他一些添加PQQ的可能性，所述可能性不需要纯化成膳食补充剂、基质组分，如酵母提取物等的形式。醌蛋白对PQQ具有非常高的亲和力的这一事实[de Jonge,1998]允许使用与醌蛋白等摩尔的量。实际上，这意味着纳摩尔浓度至微摩尔水平。对本领域技术人员显而易见的是，为了降低方法的成本，可方便地实施醛糖脱氢酶的最佳活性所需要的PQQ量的优化。作为非限制性的例子，向醛糖脱氢酶催化剂添加递增量(从0.1nM起)的PQQ，并且当所述催化剂的活性不再随提供的额外的PQQ增加时，所添加的量是最佳的。
就该意义而言，本发明提供了向醛糖脱氢酶提供PQQ的方法。更具体的是向活的全细胞催化剂、休眠或失活的全细胞催化剂、无细胞裂解液或提取物，或本发明提供的任何其他的催化剂形式，浓度为从约0.1nM至约5mM。特别是可以提供从约1nM至约100uM的PQQ。更优选的是提供浓度为从100nM至约5uM的PQQ。最优选的是提供允许所述催化剂的最大活性的最少量的PQQ。可以从任何来源获得PQQ，并作为固体物质或PQQ储液提供给催化剂。为了便于PQQ重构醛糖脱氢酶，向酶提供钙或镁离子，优选浓度为从约0.1mM至约50mM，更优选从约1mM至约20mM的CaCl2或MgCl2。MgCl2是优选的选项，但不同的酶对具体二价离子的偏好可以不同。
其次选择是用于生产恰当的脱氢酶的宿主生物本质上具有PQQ生物合成的能力，换言之，在其遗传材料中已经整合了含有PQQ生物合成的功能基因。非限制性的例子是：肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、扭脱甲基杆菌、中间克吕沃尔菌、氧化葡糖杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射异常球菌等。
当使用这类微生物作为表达同源或异源醛糖脱氢酶的宿主时，表达的酶与PQQ偶联，以形成活性形式。一些所述微生物除PQQ生产能力外，还存在活性PQQ依赖性醛糖脱氢酶，其能够将化合物(II)转变为化合物(I)。在本发明的一些方面，该方法经证实是非常有效且成功的，如下文示例。
在这一方面，本发明提供了具有生产PQQ的天然能力的微生物，所述微生物可用作同源或异源表达PQQ依赖性醛糖脱氢酶的宿主。所述微生物优选选自细菌，更优选是可以工业培养的细菌，特别是肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、扭脱甲基杆菌、中间克吕沃尔菌、肠杆菌、氧化葡糖杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射异常球菌。在最优选的实施方案中，可以使用肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、氧化葡糖杆菌。
类似地，还在不同的实施方案中，本发明提供了具有将化合物(II)转变为化合物(I)的天然能力的微生物。所提供的生物不需要进行任何遗传修饰以获得能够实施所需氧化的催化剂。因此，本发明提供了用于本公开目的和用途的微生物，选自细菌来源，更特别的是来自以下属：克雷伯氏菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属、甲基杆菌属、克吕沃尔氏菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、拉恩氏菌属和异常球菌属。在更特定的含义中，微生物可选自肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、扭脱甲基杆菌、中间克吕沃尔菌、肠杆菌、氧化葡糖杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射异常球菌，最优选的选自氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌。
上述是具有执行本发明的理想特性的非限制性微生物实例。此外，还公开和提供了允许筛选和鉴别这类微生物的方法。
第三个选项特别可用于本质上不具有生物合成PQQ的能力的微生物，例如大肠杆菌。本领域普遍已知，一些微生物(如大肠杆菌)和大部分高等生物的基因组中编码了PQQ-依赖性酶，并在某些条件下表达，但缺乏PQQ的生物合成[Matshushita,1997]。本领域认为这类微生物获得PQQ作为必需营养素，或换言之，作为维生素。在用于本发明的这类生物体中建立PQQ的生物合成的方式对本领域技术人员是显而易见的。已描述了向这类生物体提供PQQ的生物合成的方式(参见例如Goosen,1988；Yoshida,2001；Kim,2003；Khairnar,2003；Hoelscher,2006；Yang,2010)。本发明还提供了可以通过从具有PQQ生物合成机制的微生物中克隆PQQ生物合成基因簇至质粒载体或细菌染色体，然后允许这类基因在宿主生物中表达，予以建立。适用于该目的的微生物的非限制性例子包括肺炎克雷伯氏菌、扭脱甲基杆菌、铜绿假单胞菌、氧化葡糖杆菌、中间克吕沃尔菌、解淀粉欧文氏菌等。作为上述方法描述的普遍建立的术语，本领域技术人员可立刻理解术语“PQQ基因簇的异源表达”。
对于在本发明中使用，可使用任何PQQ基因簇，只要所述基因簇编码具有PQQ生物合成能力的上述功能蛋白，不论单独或与宿主生物的酶协调生物合成PQQ。
在本发明的一个实施方案中，pQQ基因簇可自任何生产PQQ的活的生物体中获得。在本发明的更特别的实施方案中，PQQ基因簇可以从选自细菌的任何微生物中获得，更特别的选自以下属：克雷伯氏菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属、甲基杆菌属、克吕沃尔氏菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、拉恩氏菌属和异常球菌属。在更特定的含义中，微生物可选自肺炎克雷伯氏菌、乙酸钙不动杆菌、扭脱甲基杆菌、中间克吕沃尔菌、肠杆菌、氧化葡糖杆菌、铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射异常球菌，最优选地选自氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌。
合适的PQQ基因簇的例子包括但不限于簇的核苷酸序列或包括在序列表中的基因，这是由序列表中所述的核苷酸序列或氨基酸序列鉴定的。一般而言，反应可以使用提供本领域已知的功能基因的任何PQQ簇，不论其与列举的PQQ簇、包含在内的基因和由所述基因编码的蛋白质的序列同一性。
PQQ 01是来自氧化葡糖杆菌621H的PQQ编码基因簇，其包含在核苷酸序列SEQ IDNO.68中并允许表达分别编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD和pqqE，所述蛋白质分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.12、13、14、15、16。
PQQ 02是来自中间克吕沃尔菌的PQQ编码基因簇，包含在核苷酸序列SEQ IDNO.69中并允许表达分别编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD和pqqE，所述蛋白质分别具有氨基酸序列SEQ ID NO.18、19、20、21、22。
PQQ 03是来自肺炎克雷伯氏菌324的基因簇pqqABCDEF，具有核苷酸序列SEQID.NO 63并允许表达分别编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作为基因组序列的一部分获得，在NCBI基因组数据库具有登录号CP000964，位置在2602846和2599706之间。
PQQ 04是来自扭脱甲基杆菌AM1的基因簇pqqABC/DE和pqqFG，分别具有核苷酸序列SEQ ID.NO 64和SEQ ID.NO 65并允许表达编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作为基因组序列的一部分获得，在NCBI基因组数据库具有登录号CP001510，位置在1825235和1821763(pqqABC/DE)之间，2401055和2403792(pqqEF)之间。
PQQ 05是来自铜绿假单胞菌PA7的基因簇pqqABCDE和pqqF，分别具有核苷酸序列SEQ ID.NO 66和SEQ ID.NO 67，并允许表达编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作为基因组序列的一部分获得，在NCBI基因组数据库具有登录号CP000744，位置在3420385和3423578(pqqABCDE)之间，3439512和3437221(pqqF)之间。
PQQ 06是来自解淀粉欧文氏菌ATCC 49946的基因簇pqqABCDEF，具有核苷酸序列SEQ ID.NO 70，并允许表达编码蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作为基因组序列的一部分获得，在NCBI基因组数据库具有登录号FN666575，位置在597604和600850之间。
利用普遍建立的数据挖掘工具，本领域技术人员还将认识到在公众可利用的数据库(GenBank、Swiss-Prot/TrEMBL、RCSB PDB、BRENDA、KEGG、MetaCyc)中的供PQQ合成的其他候选基因簇。
可以使用本发明提供的用于测量PQQ依赖性醛糖脱氢酶活性的方法,如本发明示例，筛选和鉴别能够生产PQQ的生物体而不论其来源(天然的或遗传修饰的)，并且如果需要，还允许评估所生产的PQQ的量的半定量的方法。可以使用任何形式的PQQ依赖性醛糖脱氢酶，优选在大肠杆菌中表达的(或任何其他不能生产PQQ的微生物)，用于重构活性全酶。比较校准曲线和补充了分析的样品的所述PQQ依赖性醛糖脱氢酶的活性，所述校准曲线是通过测量补充了多种PQQ量的所述PQQ依赖性醛糖脱氢酶的活性获得的。在方法的线性范围内，分析的样品中存在越多的PQQ，就观察到越高的活性。
在本发明的特定实施方案中，PQQ基因簇(或其部分)源自中间克吕沃尔菌或氧化葡糖杆菌。特别是可以使用氧化葡糖杆菌621H的基因簇，所述基因簇包含在核苷酸序列SEQID NO.68中。可选的，本发明的特定实施方案提供了中间克吕沃尔菌的基因簇的用途，所述基因簇包含在核苷酸序列SEQ ID NO.69中。可以通过本领域已知的方法，例如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3'^”Ed.,Cold Spring Harbor,NY2001中描述的方法修饰所述基因簇，从而允许所述簇中编码的基因在大肠杆菌中表达。可以使用任意的多种大肠杆菌菌株：例如大肠杆菌K12菌株，如JM109、DH5、DH10、HB101、MG4100等，或大肠杆菌B菌株，如BL21、Rossetta、Origami等。可以通过本领域已知的任何遗传方法，将基因导入到所述宿主菌株中，例如，通过转染、转化、电穿孔、接合转移等。所述基因簇可以以本领域已知的任何形式维持在所述宿主微生物中，例如，编码在自主复制型质粒中，或整合到宿主的基因组中。可以通过利用天然启动子的活性控制所述基因表达，或者通过更适合在所述宿主微生物中表达的启动子替代启动子，获得所述基因簇中编码的基因的表达。进行这类修饰的方法是本领域普遍已知的。
在一个方面，本发明提供了来自氧化葡糖杆菌621H的基因簇，其包含在核苷酸序列SEQ ID NO.68中，由包含在宿主大肠杆菌菌株中的自主复制型质粒携带。在该特定的方面，簇上编码的基因在其相应的天然启动子的控制下表达。
在一个方面，本发明提供了来自中间克吕沃尔菌的基因簇，其包含在核苷酸序列SEQ ID NO.69中，由包含在宿主大肠杆菌菌株中的自主复制型质粒携带。在该特定的方面，簇上编码的基因在其相应的天然启动子的控制下表达。在同一特定的方面，用于在大肠杆菌中提供PQQ合成的基因是pqqABCDE，而pqqF的功能由大肠杆菌的固有活性提供。
根据我们的发现，在异源表达PQQ依赖性脱氢酶的过程中，PQQ的可用性对其正确的折叠、运输、前导序列的切割和其他翻译后修饰作用几乎没有影响。这意味着不论何时(即，在任何时间或在任何时间段中)，例如在培养和诱导表达的过程中或之后向脱氢酶提供PQQ，脱氢酶活性都几乎没有差异。在允许与细胞的天然电子受体(呼吸链)最优偶联的条件下，当在周质空间或细胞膜中建立起增强的、或者甚至最大的PQQ依赖性醛糖脱氢酶活性时，其他参数是更加相关的。参数之一是存在恰当的前导序列，将蛋白质定向至周质空间或细胞膜。另一个这类参数是表达强度，它可以受培养温度、选定的转录启动子、PQQ依赖性醛糖脱氢酶编码基因中的密码子使用、表达诱导剂的量等的控制。另一个这类参数是选定的PQQ依赖性醛糖脱氢酶的内在特性，例如在异源宿主中正确折叠的能力，对异源宿主的毒性、对宿主的降解酶的抗性等。所有这类可用于增强活性和优化的参数，以及实施它们的方法，对本领域技术人员都是显而易见的。
本发明的其他示例性、修改的或备选的实施方案
根据上述说明书，执行本发明的其他多种实施方案、修改的和备选方案是显而易见的。
进一步示例，本发明提供了例如特定的方法，包括步骤：在脱氢酶催化氧化的条件下反应底物(II)以形成相应的内酯(I)，其中，在第一实施方案中，脱氢酶选自GDH 01或GDH02或GDH 03或GDH 04或GDH 05，或任何与上述酶具有至少70％，更优选90％氨基酸序列同一性的脱氢酶。在另一个实施方案中，脱氢酶选自GDH 06或GDH 07或GDH 08或GDH 09或GDH10，或任何与上述酶具有至少70％，更优选90％氨基酸序列同一性的脱氢酶。
在另一个具体的方面，本发明涉及构建和提供恰当的合成的生物学途径的方法，例如以大肠杆菌作为宿主微生物示例，其中同时表达DERA(脱氧核糖5-磷酸醛缩酶)、PQQ依赖性脱氢酶和任选地PQQ生物合成的途径基因。还建立和提供了宿主生物的呼吸链。
Gcd醛糖脱氢酶满足所有的优选特征，并因此是使用的最优选的酶。Gcd涵盖了与本文所述Gcd具有至少50％，优选70％氨基酸序列同一性的任何醛糖脱氢酶。氨基酸序列同一性是通过序列比较算法分析或目测确定的。在一个方面，用Vector NTI 9.0(InforMax)的AlignX算法的默认设置，进行序列比较算法。
在其他特定的方面，本发明涉及使用上述酶氧化或脱氢化合物(II)的方法，所述方法包括提供作为活的全细胞催化剂、休眠的全细胞催化剂、无细胞裂解液、部分纯化的或纯化酶、固定化酶或任何其他形式的催化剂使用的微生物或微生物来源材料，其中，上述能够催化氧化或脱氢反应的酶是在所述微生物中天然表达的，即，是微生物的天然特性。在所述方面，当培养和在所述反应中用作催化剂时，这类生物可以将化合物(II)转变为相应的内酯，而不需要对所述微生物进行额外的遗传修饰。所述微生物可选自下文示例的多种细菌。具有所述特性的生物可选自细菌，更特别的是变形菌门、放线菌目、mixobacteriaceae。更特别的，所述微生物可选自γ变性菌纲。就该意义而言，最优选的生物选自肠细菌、根瘤菌、葡糖杆菌和不动杆菌。
考虑到胞外提供的公开内容，如何搜寻具有氧化或脱氢化合物(II)的能力的生物对本领域技术人员是显而易见的。一种这类方法是向研究微生物的培养物提供一定量的化合物(II)，并寻找活性。
在另一特定的实施方案中，式(II)的化合物以及因此式(I)的化合物的定义也可以限制于R5表示选自式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)和(IX)的部分。
在另一个特定的实施方案中，式(II)以及因此式(I)的定义可具体化为以下定义，其中：
R1独立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3；和
R2独立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；
或R1和R2都表示X、OH或O((CH2)nCH3)；
或R1和R2共同表示＝O、-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-，其中R3和R4彼此独立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成环–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亚芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亚芳香基)-(CO)s-；
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
p代表2至6的整数；
并且r和s中至少一个是1。
由本发明方法获得的式(I)的化合物可用作制备抑制素的中间物。本领域技术人员已知如何将根据本发明获得所述化合物的方法放入抑制素合成的环境中。原则上，获得抑制素有2种基本方式。根据第一种方式，从内半缩醛制备内酯，然后与抑制素骨架偶联。可选的，先制备含有醛侧链部分的抑制素骨架，所述骨架之后通过使用例如2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)转变为内半缩醛，然后氧化为内酯。作为例子，对于阿托伐他汀的具体情况，可以参考WO 2006134482的方案2-4。
在具体的实施方案中，使用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)制备式(II)的化合物，所述化合物之后被能够催化氧化或脱氢的酶转变为内酯。本领域已知DERA酶的多个野生型、变体或突变形式，包括但不限于J.Am.Chem.Soc.116(1994),第8422-8423页，WO 2005/118794或WO 2006/134482。在优选的实施方案中，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶用于刚好位于使式(II)的化合物与能够催化氧化或脱氢的酶接触的步骤之前的合成步骤。
在另一个优选的实施方案，使用DERA制备式(II)的化合物至少是部分地与能够催化氧化或脱氢的酶将所述化合物转化为式(I)的化合物同时进行的。应立即理解，催化制备式(II)的化合物的反应和将所述化合物氧化成式(I)的反应所必需的酶可以在反应混合物中使用，或者可以同时、相继、一次性、间隔地或连续地添加到反应混合物中。具有由DERA制备的式(II)的化合物，以及因此与能够催化氧化或脱氢的酶反应的起始材料的实施方案是有利的，因为这一安排的相容性更好，并允许在在先步骤中使用含水溶剂，从而不必在提供给能够催化氧化或脱氢的酶用于转化为内酯转化之前纯化式(II)的化合物。因此，优选的实施方案是在不先分离或纯化所述化合物的条件下，使式(II)的化合物与能够催化氧化或脱氢的酶接触。在该事件中，在先步骤的全部反应混合物可用于后续反应，减少了方法步骤的数量，简化了方法。避免纯化步骤也增加了产率。此外，由于酶特异性优于化学氧化剂，在大部分程度上仅式(II)的化合物被氧化成内酯，而剩余的存在的化合物不变，因此降低了形成杂质的倾向，改善了后续的工作或纯化规程。根据本发明的任何酶反应中的所有底物可以一次性加入到反应中，或者可以在较长时间内连续添加，或以一批或间隔数批添加。
当与制备式(II)的化合物至少部分同时制备式(I)的化合物时，可以实现明显的改善。与此同时，还克服了单独使用DERA酶的反应的多个缺陷。例如，用作DERA酶制备式(II)的化合物的起始材料的醛倾向于在反应过程中使DERA酶失活，因而降低酶活性。此外，构成反应混合物中的式(II)的内半缩醛对活的微生物是有毒的。因此，缩短DERA的反应步骤和尽快消耗起始的醛和/或内半缩醛是非常理想的，这可以在两个酶促反应步骤至少部分同时实施时实现。即，当两个反应步骤至少部分同时实施时，优选完全同时实施时，有毒的内半缩醛立即进入后续反应并被转化为无毒的内酯。此外，由于如下文实施例验证的，第二个反应步骤通常不是限速步骤，并比使用DERA的第一个步骤速度更快，因此，第一步反应的稳态平衡向产物方向移动。这导致完成第一个步骤的时间减少，因此，保护DERA不被失活。还保护活细胞免受高浓度内半缩醛的破坏。
本发明的重要方面涉及微生物通过其呼吸链将由(II)的氧化/脱氢产生的电子传递给氧(终末电子受体)的固有能力。这驱使全细胞体系中酶催化的化合物(II)的氧化/脱氢的反应。显而易见的是，作为电子池发挥作用的能力是如本发明所述的全细胞体系的重要和有益特性。
因此，利用完整的细胞避免使用额外的电子受体，如DCIP和上述其他电子受体。利用全细胞的方法的额外的好处是能够在一个生物体中提供所述合成的生物学途径的所有方面，即，DERA酶、PQQ和PQQ依赖性糖脱氢酶。如下示例，由于这类方法的生产力和产率适合产业，优选利用全细胞因为成本可被控制在显著低于其他方法的水平，例如无酶的方法、固定化酶、无细胞裂解液等。利用单罐装(one pot)设计，能够完全或部分地同时实施DERA和氧化/脱氢步骤也导致用于工业规模时的成本显著降低。
就利用全细胞体系作为电子池的意义而言，还有利的是在存在氧的条件下实施所述方法，特别是所提供的氧的量允许在给定的方法条件下为至少5％，优选至少15％的溶解氧，其中100％的溶解氧理解为在给定的方法条件下饱和的氧溶液，0％理解为在所述给定的方法条件下的无氧液体，并且氧浓度和溶解氧百分比之间的相关性在0％至100％之间是线性的。在这一方面，方法条件理解为液体组成、温度、pH、压力，其中在动态过程中测量理解为是在均质的固/液/气多相体系中实施的。
存在的氧的量使氧化或脱氢反应是不可逆的，这确保了所获得的内酯，并进一步增强了第一反应的稳态平衡向产物移动。因此，该优选的实施方案增加了产率，并降低了方法所需的时间。
能够催化氧化或脱氢的酶，和/或DERA酶，可以分别单独地或组合地，任选独立地包含在单个或多个活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中；或者分别是纯化的、固定化的和/或处于胞外表达的蛋白的形式。优选地两种酶之一，更优选地两种酶包含在同一活的全细胞、同一失活的全细胞或同一均质化的全细胞中，更优选地在同一活的全细胞或同一失活的全细胞中，特别是包含在同一活的全细胞中，因为酶在共同的全细胞或至少在共同的失活的全细胞中不需要在其用于方法之前对酶进行更多处理，降低了成本。此外，酶包含在同一活的全细胞中使得能够通过过滤简单地去除酶，这减轻了在工业规模的最终纯化步骤。此外，允许在后续批次中重复利用包含在活细胞中的酶。
利用在全细胞或至少在失活的全细胞中的酶的另一个优点是能够如上文详述，固有地提供PQQ辅助因子。
作为有利的选择，可以安排能够翻译2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)酶和能够催化氧化或脱氢的酶的全细胞体系来过表达所述翻译所需的两种基因。用于过表达的手段是本领域技术人员已知的，有时可参考本文的其他地方。
根据本发明的另一方面，提供的表达体系包含一种或多种细胞类型，各自的细胞类型经遗传改造以在所有的细胞类型中表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)酶和能够催化氧化或脱氢的酶。
表达体系可以由恰当的生物体或细胞，任选地其他因子和添加物组成，其中参考本文提供的公开内容。
在一个方面，本发明提供了构建或提供用于本发明的合成的生物学途径的方法，以大肠杆菌作为宿主微生物为例，其中同时表达DERA(脱氧核糖5-磷酸醛缩酶)、PQQ依赖性脱氢酶和任选地PQQ生物合成的途径基因。考虑到宿主生物的呼吸链，所述合成的生物学途径具有从简单分子(如下述化合物(X)和乙醛)生产化合物(I)的能力。由于该方法联合了之前生产化合物(II)、生产化合物(II)和将化合物(II)氧化为化合物(I)的单独的步骤，因此，该方法是有利的。此外，在一个工业发酵方法中实施培养携带所述合成的生物学途径的生物体，所述方法立刻提供了能够将分子(如化合物(IX)和乙醛)转变为式(I)的化合物的材料。
本发明的另一个实施方案是在单罐装(one pot)方法中，通过在存在2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)酶和能够催化氧化或脱氢的酶的条件下，使用于DERA酶反应的起始材料起反应，获得式(I)的化合物或其盐、酯或立体异构体，和任选地将产物成盐、酯化或立体异构选择性解析。该实施方案考虑从式(X)的化合物开始：
其中，R表示式(I)的R1-CH-R2部分，R1和R2如上文定义；和在存在两种酶(即，醛缩酶(DERA)酶和能够催化氧化或脱氢的酶)的条件下，使所述化合物(X)与乙醛反应。该设置允许以单个方法步骤从简单的起始材料(如乙醛)获得式(I)的化合物。因为反应在若干小时内完成，因此适合工业。导致不需要中间物纯化步骤。此外，提供了一起加入两种酶的可能性——第一酶促反应的产物形成第二酶促反应的底物——优选包含在同一活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中；或者是纯化的、固定化的和/或处于胞外表达的蛋白的形式，优选包含在同一活的全细胞、失活的全细胞或均质化的全细胞中，更优选包含在同一活的全细胞或失活的全细胞中，特别是包含在同一活的全细胞中。
这利用了组合酶促反应的所有有利效应，包括但不限于本文所述的那些。在一个方面，向混合物中加入底物总量，使所加入的底物(X)总量是从每升反应混合物约20mmol至每升反应混合物约2mol，特别是从每升反应混合物约100mmol至每升反应混合物约1.5mmol，更特别是从每升反应混合物约200mmol至每升反应混合物约700mmol。可以通过若干种手段添加乙醛。在一个方面，在一批或多批中，或可选地连续向反应混合物中加入乙醛。可以预先混合乙醛和式(X)的底物，并加入到反应混合物中。加入到反应混合物中的乙醛总量是从受体底物总量的约0.1至约4摩尔当量，特别是从约2至约2.5摩尔当量。在本发明的一个方面，反应使用的pH值是从约4至约11。在一个实施方案中，反应使用的pH值是从约5至约10。在另一个实施方案中，反应使用的pH值是从约5至约8。具体而言，可以通过合适的缓冲液将pH值维持在5.2至7.5的范围内。可选地上述pH值可以根据对本领域技术人员显而易见的需要，由可控地加入酸或碱来控制，但不限于此。
在一个方面，可以优化本发明所述反应使用的pH，使在最佳酶活性和最佳底物和/或产物稳定性之间达成妥协。在本文中应理解，本发明所述的不同酶的最佳酶促活性可以不与底物/产物稳定性的最佳条件相同。本领域技术人员可发现，通过调节条件牺牲一部分酶活性来适合底物和/或产物稳定性(反之亦然)，从而获得最佳产物产率是有利的。
具体而言，醛缩酶酶，任选地与能够催化氧化或脱氢的酶是至少部分共同地在含水溶液中制备的(特别是每者浓度为0.1g/L至3g/L)，任选存在盐(特别是浓度为从50至500mM的NaCl)，任选添加PQQ(特别是浓度250nM至5uM)和CaCl2、MgCl2或备选的钙盐或镁盐，特别是浓度从0.1至20mM。含水溶液可含有与水混溶的有机溶剂(特别是浓度为从2-15％V/V的二甲亚砜)，并可缓冲至pH 4-11。一些常用的缓冲液通过限制醛缩酶-缩合中间物，特别是第一缩合反应产物的可用性，可以降低从乙醛开始的上述反应的产率，因为所述反应产物在缓冲液中进行化学反应。例如，Bis-Tris丙烷与所述中间物((S)-3-羟基-4,4-二甲氧基丁醛)反应，产生(S,Z)-2-(3-((1,3-二羟基-2-羟基甲基)丙烷-2-基)(3-羟基-4,4-二甲氧丁-1-烯基)氨基)丙胺基)-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇。其他可以相似反应的缓冲液是Bis-Tris、tricin、Tris、Bicin或具有伯胺、仲铵或叔氨基的任何其他缓冲液。因此，当如果调节pH，用于调节pH的合适缓冲液是用酸、碱、盐或其混合物制成的缓冲液，特别是磷酸和氢氧化钠。在特别优选的实施方案中，缓冲液是磷酸缓冲液。特别是可以使用浓度10至500mM的磷酸缓冲液。还可以通过将醛缩酶，任选地与能够催化氧化或脱氢的酶至少部分地共同加入到水中，制备含水溶液，并通过自动添加无机酸、碱、盐或其混合物，维持反应过程中的pH值。
在本发明的一个方面，用于始自乙醛的反应的温度是从约10至约70℃。在一个实施方案中，用于反应的温度是从约20至约50℃。在另一个实施方案中，用于反应的温度是从约25至约40℃。
在一个方面，可以优化用于本发明所述反应的温度，使在最佳酶活性和最佳底物和/或产物稳定性之间达成妥协。在本文中应理解，本发明所述的不同酶的最佳酶促活性可以不与底物/产物稳定性的最佳条件相同。本领域技术人员可发现，通过调节条件牺牲一部分酶活性来适合底物和/或产物稳定性(反之亦然)，从而获得最佳产物产率是有利的。
在完成反应后，可以从反应混合物中去除两者之中任一种酶，例如通过向1体积的反应混合物中添加至少约1体积的乙腈。可选的，可以通过本领域已知的任何盐析方法去除酶。在一个实施方案中，通过添加至少5％m/V硫酸铵来实施盐析。在酶包含在活细胞或失活细胞中的实施方案中，可以通过过滤或离心反应混合物去除酶。
在另一个实施方案中，通过液/液萃取至多种不与水混溶或难以混溶的溶剂之一，去除产物。溶剂可以选自但不限于：二氯甲烷、乙酸乙酯、二乙醚、丙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、硝基甲烷、戊烷、己烷、庚烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、正丁醇、正戊醇、苯、甲苯、邻-、间-、对-二甲苯、环己烷、石油醚、三乙胺。在用选定的溶剂液/液萃取前，可以将产物水溶液的pH调节至1至12之间，优选2至8之间，更优选3至5之间的值。在完成萃取后，可以通过但不限于添加盐来干燥有机相中的残留水，所述盐列举如下：硫酸钠、硫酸镁(单水合)、硫酸钙、氯化钙、硫酸铜。
一般而言，可以通过本领域已知的任何方式制备所使用的醛缩酶和/或能够催化氧化或脱氢的酶，例如，通过Sambrook等人，(1989)Molecular cloning：A laboratoryManual第2版,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor中描述的蛋白质表达方法。可以将编码醛缩酶和/或能够催化氧化或脱氢的酶的基因克隆到表达载体中，并在合适的表达宿主中表达所述酶。已知的醛缩酶或能够催化氧化或脱氢的酶的修经饰的形式可以是必需的，或根据克隆条件获得，并也涵盖在本发明中。
细胞和生物
本发明的一个方面提供了使用本文所述的处于任何形式的、表达能够催化氧化或脱氢反应的酶的微生物，将化合物(II)或本文所述其他化合物氧化或脱氢的方法。在所述方面，当这类微生物被培养和用作催化剂时，可以将化合物(II)转变为相应的内酯，而不需要对所述微生物作出额外的遗传修饰。本发明中示例了鉴别这类生物的方法。这类生物的非限制性例子可选自多种细菌，更特别的是埃希氏菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属、甲基杆菌属、克吕沃尔氏菌属、欧文氏菌属、拉恩氏菌属和异常球菌属。
在所述实施方案中，并且为了以最好的方式实践本发明的实施方案，提供了特别调整过的表达体系，所述表达体系能够翻译2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)酶和能够催化氧化或脱氢的酶，并过表达所述翻译必需的两种基因。术语“过表达”在本文中指处于强启动子控制下的表达，或其中基因以高水平表达(相比野生型表达对照)并在胞内或胞外积累。获得这类修饰的表达的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用Sambrook等人，(1989)Molecular cloning：A laboratory Manual第2版,New York：Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor描述的克隆方法。例如，可以将酶的基因克隆到相同或不同的载体上，并转化到细胞中。备选地，表达体系包含单独的细胞，其中第一细胞过表达醛缩酶基因，第二细胞过表达能够催化氧化或脱氢的酶的基因。本说明书示例而非限制性地面对一般常识，提供了制备这类表达体系的例子。所述表达体系特别适合制备抑制素或其中间物。
本领域技术人员可以理解用于制备或容纳DERA酶或能够催化氧化或脱氢的酶的所有可能的细胞体系，单独或组合的，和任选地彼此依赖的。一般而言，细胞体系可以是原核或真核的。在具体实施方案中，可以合成制备酶。用于制备或容纳两者之中任一种酶的细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。优选的细胞是细菌或酵母，更优选的是细菌，因为细菌或酵母细胞更易于培养和生长。细菌可选自埃希氏菌、棒杆菌、假单胞菌、链霉菌、红球菌、芽孢杆菌和乳杆菌，优选选自埃希氏菌和乳杆菌，更优选埃希氏菌，特别是大肠杆菌。在酵母的情况下，细胞可选自酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属和假丝酵母属，优选酵母属。哺乳动物细胞的例子是中华田鼠卵巢细胞或肝细胞，优选中华田鼠卵巢细胞。
本发明的另一个实施方案是用于制备化合物(I)的方法，特别是工业发酵方法，其中所述方法包括培养能够氧化化合物(II)的微生物的步骤，其中使所述微生物与化合物(II)接触。
本发明的另一个实施方案是用于制备化合物(I)的方法，特别是工业发酵方法，其中所述方法包括培养能够氧化化合物(II)的微生物的步骤，其中使所述微生物与具有酶促生产(II)的能力的另一种微生物接触，特别是通过DERA的催化，并且其中向反应混合物提供允许生产化合物(II)的底物。
本发明的优选的实施方案是用于制备化合物(I)的方法，特别是工业发酵方法，其中所述方法包括培养能够生产以及氧化/脱氢化合物(II)的微生物的步骤，并且其中向反应混合物提供允许生产化合物(II)的底物。
在特定的实施方案中，根据本发明的方法包括下列步骤：
步骤a1)如果尚未了解或提供，如本文他处公开的，该步骤包括鉴别能够将化合物(II)氧化/脱氢的微生物，和/或产生经遗传修饰而获得如本发明所述将化合物(II)氧化/脱氢的能力的微生物菌株。特别优选的是具有糖1-脱氢酶活性的生物体。
步骤a2)如果尚未了解或提供，如本文他处公开的，该步骤包括鉴别能够生产化合物(II)的微生物，和/或产生经遗传修饰而获得如本发明所述生产化合物(II)的能力的微生物菌株。特别优选的是具有醛缩酶催化能力的生物体。
特别优选的是鉴别和/或遗传修饰微生物，从而获得步骤a1)和步骤a2)所述的两种性质。就这一意义而言，本发明具体涉及遗传修饰的微生物菌株，其中菌株的遗传材料包括至少1个过表达的基因，所述基因编码能够催化缩合醛醇形成化合物(II)的酶，更具体的是编码DERA酶的基因。
本发明中详细示例了步骤a1)和步骤a2)所述的鉴别和/或遗传修饰微生物的方法，然而，本领域技术人员可立即找到替代的方法，获得所述微生物相同的理想特性。例如，可以使用Sambrook等人，(1989)Molecular cloning：A laboratory Manual 2nd Edition,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor所述的克隆方法。例如，可以将酶的基因克隆到相同或不同的载体中，并转化到细胞中。在备选方案中，表达体系包括不同的细胞，其中第一细胞过表达醛缩酶的基因，第二细胞过表达能够催化氧化或脱氢的酶的基因。本说明书示例而非限制的考虑了公知常识，提供了制备这类修饰的微生物的例子。微生物特别适合制备抑制素或其中间物。
本领域技术人员了解所有的可能的细胞体系，所述细胞体系用于制备或容纳DERA酶或能够催化氧化或脱氢的酶，或任选的，PQQ生物合成基因，以单独的或组合的，以及任选的以彼此依赖的方式。一般而言，细胞体系可以是原核的或真核的。在特定的实施方案中，可以合成制备酶。用于制备或容纳任一酶的细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。优选的细胞是细菌或酵母，更优选的是细菌，因为细菌或酵母细胞更易于培养和生长。
细菌可选埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enteorobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、根瘤菌属(Rhizobioum)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、拉恩氏菌属(Rahnella)和异常球菌属(Deinococcus)。就更特定的含义而言，微生物可选自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)、肠杆菌属(Enterobacter)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，最优选大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、乙酸钙不动杆菌和中间克吕沃尔菌。在酵母的情况下，细胞可选自酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属和假丝酵母属，优选酵母属和毕赤酵母属。
特别优选的是鉴别和/或遗传修饰微生物，从而获得步骤a1)和步骤a2)中所述的两种特性。就该含义而言，本发明具体涉及遗传修饰的微生物菌株，其中菌株的遗传材料包括至少1个过表达的基因，所述基因编码能够催化缩合醛醇形成化合物(II)的酶，更具体的是编码DERA醛缩酶的基因。
相应的，本发明提供了构建合成的生物学通路的示例性方法，以大肠杆菌作为宿主微生物为例，其中同时表达DERA(脱氧核糖5-磷酸醛缩酶)、PQQ依赖性脱氢酶和任选的PQQ生物合成的通路基因。考虑到宿主生物的呼吸链，所述合成的生物学通路具有从简单分子(例如化合物(X)和乙醛)生产化合物(I)的能力。
本发明描述的一个方面是同时或独立的培养步骤a1和a2中描述的微生物。
步骤b)制备种子培养基
可以通过本领域技术人员已知的方法培养本发明所述的微生物。各种微生物的培养方法描述在例如手册“Difco&BBL Manual,Manual of Microbiological CultureMedia”(Zimbro M.J.等人，2009，第2版，ISBN 0-9727207-1-5)中。优选的，从所述微生物的菌落开始，生产可用于生产(I)的主要发酵方法的种子微生物。在这一方面，根据本申请的方法包括制备所述微生物的冷冻储液。可使用现有技术已知的方法制备该冷冻储液，例如使用液体扩增培养基。优选的，该微生物的冷冻储液通过接种营养培养基，用于生产营养性种子培养基。
可以将种子培养基无菌的转移至生物反应器。原则上，可以在如主发酵方法(步骤c所述)的条件(例如，pH和温度)下进行种子微生物的培养。
步骤c)主发酵方法
优选的在生物反应器中进行利用本申请所述微生物的主发酵方法，特别是在搅拌和/或充气的条件下。优选的，在浸泡式好氧条件下，在含水营养培养基(生产培养基)中，进行用于生产本申请所述化合物(I)的方法中的微生物的培养，所述培养基含有可同化的碳源、氮源、磷酸源和矿物质源。可以在培养方法的过程中或之后，向生产培养基中添加其他化合物，从而获得恰当的酶活性。可以包括表达诱导剂、辅助因子源和/或允许保持遗传元件的化合物(例如抗生素)。
优选的，主发酵方法包括用步骤b)中获得的种子微生物接种生产培养基，特别是通过无菌的转移到反应器中。优选使用微生物的营养形态进行接种。
在主发酵方法中，向反应器中添加营养培养基(生产培养基)可以进行一次，或多次分批，或连续进行。可以在发酵方法之前和/或过程中添加营养培养基(生产培养基)。
营养培养基中的优选碳源可选自糊精、葡萄糖、可溶性淀粉、甘油、乳酸、麦芽糖、果糖、磨拉石和蔗糖，如下文示例。
营养培养基中的优选氮源是氨溶液、酵母提取物、大豆蛋白胨、大豆粉(soybeanmeal)、细菌蛋白胨、酪蛋白水解物、L-赖氨酸、硫酸铵、玉米浆等。
还可以向培养基中添加无机/矿物盐，例如碳酸钙、氯化钠、磷酸钠或磷酸钾、镁、锰、锌、铁和其他盐。
特别是可以在主发酵方法中添加其他已知的用于发酵方法的添加剂。为了阻止培养基过度发泡，可以加入止泡剂，例如硅油(silicone oil)、脂肪油、植物油等。特别是可以在发酵方法过程中加入基于硅酮(silicone)的止泡剂，阻止培养基过度发泡。可以向培养基中加入表达诱导剂，例如异丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四环素、indoleacrilate等。此外，可以加入辅助因子，例如PQQ(吡咯并喹啉醌)、NAD(P)、FAD，改善所涉及的酶的活性。在特定的方面，可以使用IPTG和PQQ。
可以在好氧条件下实施发酵方法，伴随生产培养基的搅拌和充气。可以以多种方式实现培养混合物的搅拌和充气。可以通过螺旋桨或相似的机械装置提供生产培养基的搅拌，并根据发酵条件和规模作出不同程度的改变。相对于生物反应器的工作体积，充气速率可以在0.5至2.5VVM的范围内变化(每分钟每单位液体体积的气流体积(体积/体积/分钟))。
在约6.3-8.5的pH范围和18-37℃的温度范围内，进行本方法的主发酵方法。优选的，pH在约6.5-8.3的pH范围，温度在约21-31℃的范围内。
优选的，孵育培养物16至约300小时，更优选约30至70小时。
对本领域技术人员显而易见的是：不同的微生物可能需要不同的生长条件，且本领域普遍描述了如何确定特定生物生长的最佳条件。对本领域技术人员还显而易见的是：不同的生长条件对参与所提供方法的酶活性具有巨大的影响。本发明提供了可用于优化生长条件，获得所述酶的最大活性和反应速率的方法的详细例子。
本发明的另一个实施方案涵盖了同时或独立的培养步骤a)所述的微生物。同时，还可以进行反应，分别或同时、相继或以单罐装的方式制备化合物(II)和化合物(I)。
具体而言，在步骤c)之后，在含水溶液中制备脱氢酶/氧化酶(特别是在0.1g/L至300g/L的浓度范围)，任选的在存在盐的条件下(特别是浓度范围50-500mM的NaCl)，稀释或浓缩至所述浓度范围。当补充新鲜的培养基或允许生物体的活力培养基组分时，获得活的全细胞催化剂。当在含水的缓冲溶液或在使用的培养基中制备时，获得休眠的全细胞催化剂。含水溶液可以缓冲至pH 4.0-11，优选pH 5.0-10.0，更优选5.0-pH 8.0。最优选的，溶液缓冲至约pH5.2-约pH 7.5。可以从酸、碱、盐或其混合物、本领域已知的任何其他缓冲体系(除了具有伯氨基、仲氨基或叔氨基的以外)制备合适的缓冲液。特别是可以使用浓度10至500mM的磷酸盐缓冲液。可以通过向水中加入所述脱氢酶/氧化酶，制备含水溶液，并通过自动添加无机或有机酸、碱、盐或其混合物的手段，维持反应过程中的pH。
步骤d)酶促反应
提供实施本发明的一些选项。可以分别或同时、相继或以单罐装的方式进行制备化合物(II)和化合物(I)的反应。在一个实施方案中，改变是：
1.将化合物(II)加入到具有氧化/脱氢化合物(II)的能力的微生物培养物中
在主发酵步骤中完成前述培养能够氧化/脱氢化合物(II)的微生物的步骤后，使化合物(II)与所述微生物接触。所述微生物可内在的含有所有需要的辅助因子，或者可以使用外部添加PQQ。可以添加浓度约0.1nM至约5mM的PQQ。特别是可以提供约1nM至约100uM的PQQ。更优选的是提供浓度100nM至约10μM的PQQ。最优选的是提供允许所述催化剂的最大活性的最少量的PQQ。实践中，是在250nM至5μM终浓度范围内的PQQ。为了促进用外部提供的PQQ重构能够氧化/脱氢的酶，可以加入镁或钙离子。优选的加入浓度约0.1mM至约50mM，特别是约1mM至约20mM，最优选浓度约2mM至约20mM的MgCl2或CaCl2。任选的，加入与本发明所述化合物II等摩尔浓度的人工电子受体。优选的使用能够接受脱氢/氧化反应的过程中形成的电子进入其内在呼吸链中的微生物实施所述方法。化合物(II)可以作为从之前的反应混合物或其他来源(有机合成)中获得的部分或完全分离的化合物(II)提供，所述反应混合物含有在醛缩酶-催化的醛醇缩合条件下的DERA醛缩酶。可以通过本发明所述的任何手段和速率添加化合物(II)，终浓度为约20mM至约1M，优选约50mM至约700mM，最优选的浓度是在100mM至500mM之间。在化合物(II)脱氢/氧化的过程中，可以以与步骤c)所述相似的方式，添加其他营养物，从而支持微生物的活力。实践中，向本发明所述的反应化合物中提供额外的碳源是有利的，任选还独立或额外的添加氮源。在这一特殊方面，允许化合物(II)脱氢/氧化的一般反应条件如本发明的“醛糖脱氢/氧化条件”中定义。
可以在一批或多批中，向反应混合物添加作为氧化酶/脱氢酶底物的化合物(II)以获得化合物(II)。在一个方面，添加到混合物中的底物总量使添加的化合物(II)的总量为约每升反应混合物20mmol至约每升反应混合物1.5mol，更特别的是每升反应混合物约100mmol至每升反应混合物约700mmol。在优选的实施方案中，通过可编程的泵，在任何给定的反应时间，以特定流速向反应混合物中连续添加底物。流速最好确定为反应混合物中不积累底物时的最大流速。特别地，这允许最低浓度的不想要产物。在另一个实施方案中，可以使用校正添加对策，进一步最小化底物的抑制效应。
2.使用DERA醛缩酶和氧化/脱氢酶酶连续反应
在这一方面，本发明提供了d1)所述的变化形式，然而，在此情况下，化合物(II)是以反应混合物的形式直接原位提供的，所述反应混合物是通过本领域已知的方法反应DERA醛缩酶和化合物(X)和乙醛获得的。优选的，该方法使用了实施单罐装反应的优势，因此显著影响了组合方法的简便性。有利的是在根据“醛缩酶-催化的醛醇缩合条件”的在先步骤中，使用含有DERA醛缩酶的全细胞催化剂。
3.使用在两个分开的催化剂中的DERA醛缩酶和氧化/脱氢酶酶的同时反应
两种催化剂都是通过发酵方法同时或独立获得的(如步骤c所述)，然后，将催化剂转移到合适的容器或反应器中，优选合并于或留在用于获得催化剂的同一发酵罐中。在本方法的另一个相似的方面，两种酶活性都存在于优选如步骤c所述获得的单个微生物中。在特定的实施方案中，同时方法含有使用DERA醛缩酶和能够氧化/脱氢的酶，因此提供化合物(I)。更优选的，乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)作为DERA醛缩酶的底物以获得化合物(II)，可以被连续的添加到反应混合物中，或可选的，乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)可以在一个或多个批次中添加到反应混合物中。在一个方面，混合物中添加的底物总量使得添加的乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)的总量是每升反应混合物约20mmol至每升反应混合物约1.5mol，更特别的是每升反应混合物约100mmol至每升反应混合物约700mmol。可以通过若干种手段添加乙醛。在一个方面，在一个或多个批次中向反应混合物中添加乙醛，或可选的连续添加。乙醛可以与乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)预先混合，并添加到反应混合物中。相对于受体底物乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)的总量，添加到反应混合物中的乙醛总量是约0.1至约4摩尔当量，特别是约1至约3摩尔当量，更优选约2-2.5摩尔当量。特别的是，这允许最低浓度的不想要产物。任选的，向反应混合物中添加的PQQ浓度是约0.05μM至约10mM，更优选的0.1uM至约100uM。为了促进外部提供的PQQ重构能够氧化/脱氢的酶，可以添加镁或钙离子。优选的，MgCl2或CaCl2添加的浓度是约0.1mM至约50mM，特别是约1mM至约20mM，最优选的浓度是约2mM至约20mM。在优选的实施方案中，通过可编程的泵，在任何给定的反应时间，以特定流速向反应混合物中连续添加底物。流速确定为反应混合物中不积累底物时的最大流速。特别地，这允许最低浓度的不想要产物。在另一个实施方案中，可以使用校正添加对策，进一步最小化底物的抑制效应。在一个方面，用于脱氢酶/氧化酶-催化的反应的温度是从约10℃至约70℃。在一个实施方案中，用于脱氢酶/氧化酶反应的温度是从约20至约50℃。在一个实施方案中，用于脱氢酶/氧化酶反应的温度是从约25℃至约40℃。由于反应在少数小时内完成，因此是适合工业的。
术语“醛糖脱氢/氧化条件”在本文中使用时指本领域已知的任何脱氢/氧化条件，可以被任何脱氢酶/氧化酶催化，如本文所述。特别是脱氢酶/氧化酶活性条件是允许形成和积累所需产物的条件。这些条件一方面包括脱氢酶/氧化酶是以足够的负载提供而能够实施脱氢/氧化作用的活性酶。在另一个方面，作为底物的化合物(II)在反应混合物中存在的量对醛缩酶的活性表现出最低的抑制。优选的，反应的温度、pH、溶剂组成、搅拌和反应长度允许积累理想的产物，因此从化合物(II)形成相应的化合物(I)，在另一个方面，所述条件对稳定性没有不利影响，具体而言，这些条件是由实施例中公开的值定义的。用于本发明的脱氢酶/氧化酶可以是任何对式(II)的化合物具有脱氢酶/氧化酶活性的酶。在优选的实施方案中，脱氢酶/氧化酶包括但不限于：GDH 01、GDH 02、GDH 03、GDH 04、GDH 05、GDH 06、GDH 07、GDH 08、GDH 09、GDH 10、GDH 11、GDH 12、GDH 13、GDH 14、GDH 15、GDH 16、GDH 17、GDH 18、GDH 19、GDH 20、GDH 21、GDH 22、GDH 23、GDH 24和GDH 25，其中每种酶都是通过其相应的核苷酸序列或各自的密码子优化的核苷酸序列或氨基酸序列表征的，如上文序列表所述。本文所述的脱氢酶/氧化酶催化剂可以本发明提供的任何生物学活性形式使用。一般而言，在合适的容器或反应器中提供能够获得化合物(I)的催化剂，分批或连续的添加化合物(II)，或通过至少部分地同时生产化合物(II)来提供化合物(II)，优选的在“醛缩酶-催化的醛醇缩合条件”下的同一容器中。
术语“醛缩酶-催化的醛醇缩合条件”在本文使用时指本领域已知的可以被任何醛缩酶催化的、任何醛醇缩合条件，描述在例如WO2008/119810 A2中。醛缩酶-催化的丁间醛醇缩合条件特别是允许形成和积累所需产物，更优选形成和积累取代的乙醛R1CO2CH2CHO的条件，更特别的是反应混合物中存在作为底物的乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)与乙醛，存在的量对醛缩酶的活性表现出最低的抑制，在另一个方面，反应的温度、pH、溶剂组成、搅拌和反应长度允许积累理想的产物，因此形成相应的内半缩醛(化合物II)。本文所述的DERA醛缩酶可以所述发明提供的任何生物学活性形式使用。根据相应的化合物(II)选择DERA醛缩酶的底物，式(X)的化合物。这些具有被遮蔽的醛基的产物在WO2008/119810 A2和WO2009/092702 A2中是关键中间物，允许制备抑制素的进一步步骤，特别优选的是产生具有醛基的产物的底物。化合物(X)特别可以是乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)。
任选的步骤e)：分离和/或纯化化合物(I)
可在另一独立步骤中，从所述培养基中分离和/或纯化在主发酵步骤中生产的化合物(I)。
在第一个分离步骤中，可以通过任何已知类型的过滤/絮凝/沉降/离心方法去除反应混合物中存在的全细胞催化剂，或对含有反应混合物的全细胞实施其他分离步骤。优选的，本发明的目标是省略分离固体颗粒与反应混合物的步骤，和在完成反应后立刻实施直接的抽提步骤，如进一步所述。
在本发明的一个实施方案中，可以通过在能够结合化合物(I)的吸附剂上吸附显著的水平，并在洗脱条件下释放化合物(I)，来分离化合物(I)，所述洗脱条件例如用更加非极性的化合物替代培养基。吸附剂可以选自但不限于：硅胶、沸石、活性炭、AmberliteTMXADTM吸附树脂、AmberliteTM和AmberliteTM FP离子交换树脂等。
可选的，可以使用与水混溶的溶剂(例如乙腈或甲醇)，并向混合物补充高浓度的盐，进行液-液抽提，任选的在被称为“盐析”抽提方法中补充高浓度的氯化钠。在该方法中，观察到相分离，化合物(I)优选分布在富含溶剂的相中。
在优选的实施方案中，用于液/液抽提的抽提溶剂选自任何一些不与水混溶的或较难混溶的溶剂。溶剂可以选自但不限于：二氯甲烷、乙醚、丙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、硝基甲烷、戊烷、己烷、庚烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、正丁醇、正戊醇、苯、甲苯、邻-、间-、对二甲苯、环己烷、石油醚、三乙胺。在用选定的有机溶剂液/液抽提前，产物水溶液的pH可以调节至1至9之间，优选2至8之间，更优选2至5之间的值。此外，在优选的实施方案中，在添加任何无机/有机酸、盐或碱进行液/液抽提前，水相的离子强度增加。这类酸、盐或碱的非限制性例子是：磷酸及其盐、硫酸及其盐、柠檬酸及其盐、盐酸及其盐等。增加的水相离子强度增加了化合物(II)在水相和有机相之间的分布系数，因此增加了抽提方法的效果。
在完成抽提后，干燥有机相中的剩余水可以通过但不限于添加下列盐来实施：硫酸钠、硫酸镁(单水合)、硫酸钙、氯化钙、硫酸铜。
在纯化方法的最优选的实施方案中，首先校正反应混合物的pH至约1至9，优选约2至8，更优选约3至6的值。最优选的，使用酸性化合物校正pH至约5，例如磷酸、硫酸或盐酸等。添加的硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钠等的浓度是从50g/L至300g/L，最优选从100至200g/L。至少添加1次乙酸乙酯，是向1体积的反应混合物添加至少1体积的乙酸乙酯，优选的至少3次向1体积的反应混合物添加至少1体积的乙酸乙酯。最优选的，进行添加乙酸乙酯和分离提取物的步骤，直到水相中存在不超过5％化合物(I)。收集乙酸乙酯级分，用本领域已知的任何干燥盐(优选CaCl2或MgSO4)或本领域已知的其他脱水方法干燥。在一个方面，可以蒸发得到的乙酸乙酯提取物，产生分离的化合物(I)，形式为室温下黄色-琥珀色的油状物，或可选的可以进入其他步骤，从而产生药物有效的化合物，优选抑制素。
任选的步骤f)：进一步加工
在获得式(I)的化合物后，通过使所述化合物(I)经历足以制备API，优选抑制素的条件，可以将式(I)的化合物进一步转化为API，优选的抑制素或其可药用的盐。因此，在实施方案中，通过(i)使上文定义的式(II)的化合物与能够催化氧化或脱氢的酶接触，制备上文定义的式(I)的化合物；(ii)使所述化合物(I)经历足以制备抑制素的条件；和(III)任选的将产物成盐、酯化或立体异构选择性的解析，来制备抑制素或其盐、酯或立体异构体。此外，可以使用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC4.1.2.4)酶，制备式(II)的化合物。可以安排反应设置，基本上同时或相继、一次性或连续的在一批或间隔的批次中，导入两种酶。优选的，至少部分同时的，更优选基本同时的制备式(II)和(I)的化合物。有利的是在酶的情况下，使用酶制备式(I)和/或(II)的化合物，因为产物立刻含有正确的取代基空间构象，不需要其他纯化或分立。在需要其他立体异构体的情形下，方法可以与本领域技术人员已知的立体特异性化学方法组合。在优选的实施方案中，制备的抑制素是洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或达伐他汀，更优选阿托伐他汀、罗苏伐他汀或匹伐他汀，特别是罗苏伐他汀。
术语“足以生产API，优选抑制素的条件”在本文使用时指本领域描述过的手段，包括本文描述过的用于将式(I)的化合物进一步转化为API，优选抑制素的手段。在具体的实施方案中，在制备抑制素时，本领域技术人员可以通过选择正确的R1和R2，或R，来选择化学途径。在选择R1、R2和R代表抑制素骨架的情形下，式(I)的化合物已经是抑制素分子或其“高级”中间物。但是，还可以修饰抑制素，例如，通过打开内酯环，形成盐或酯或从立体异构体的混合物解析理想的立体异构体。在可选的方案中，如果通过首先提供内酯然后与抑制素骨架偶联来制备抑制素，可以遵循反应方案2。在获得式(I)的化合物后，可以用保护基P(式(XI))保护第4位的羟基，所述保护基可以是任何常规使用的保护基，特别是甲硅烷基保护基。之后，使化合物成为醛或其水合物的形式(分别是式(XII)和(XIII))。
可以进一步使用从I获得的式(XII)的化合物或其水合物(XIII)制备抑制素，通过在Wittig偶联条件下，使式(XII)的化合物或其水合物(XIII)与杂环或脂环衍生物(抑制素骨架)反应，需要时再进行氢化。在涉及制备罗苏伐他汀的具体实施方案中，在后续反应步骤中，可以在Wittig偶联条件下(存在碱)，使(2S,4R)-4-(对氧基)-6-氧代-四氢-2H-吡喃-2-甲醛(XII)与((4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-(N-甲基甲磺胺)嘧啶-5-基)甲基)三苯基-卤化或任何其他的((4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-(N-甲基甲基磺酰氨基)嘧啶-5-基)甲基)盐，或可选的二-i-丙基({4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲基磺酰)氨基]-5-嘧啶基}甲基膦酸盐，或任何其他的({4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲基磺酰)氨基]-5-嘧啶基}甲基膦酸酯反应，产生N-(5-((E)-2-((2S,4R)-4-(对氧基)-6-氧代-四氢-2H-吡喃-2-基)乙烯)-4-(4-氟苯基)-6-异丙基嘧啶-2-基)-N-甲基甲烷磺酰胺。可以使用六甲基二硅氮烷锂(LiHMDS)、六甲基二硅氮烷钾(KHMDS)、六甲基二硅氮烷钠(NaHMDS)、二异丙胺锂(LDA)、氢化钠、丁基锂或Grignard试剂，优选六甲基二硅氮烷锂，作为碱。当来源是水合物形式的XIII，或XII与其水合物形式的XIII的混合物时，其溶解在选自THF、Et2O、i-Pr2O、tBuMeO的醚；选自戊烷、己烷、环己烷、甲基环己烷、庚烷的烃类；选自甲苯或其氯化衍生物的芳香族烃类；选自氯仿和二氯甲烷的氯化烃类；或上述溶剂的混合物中，在添加到形成的内盐溶液之前，应该先去除从水合物中释放的水。反应的优选溶剂是无水甲苯和二氯甲烷。可以在-80℃至90℃之间，优选0至90℃，更优选80至90℃之间的温度下实施反应。在1-12小时内完成反应。可以用AcOEt、醚或烷烃，优选用BuMeO实施利用抽提分离粗制产物。可去除保护基，打开内酯，生产罗苏伐他汀的游离酸或其盐，任选的可以转化为半钙盐的胺。可以在合适的溶剂中，在0℃-80℃，优选20或40℃的温度下实施去保护化，优选的溶剂选自醇、乙酸、THF、乙腈、甲基四氢呋喃、二烷、CH2Cl2，更优选的是醇和THF/AcOH的混合物。可以使用常见的去保护剂，例如四-正丁基氟化铵、氟化铵、AcCl、FeCl3、TMSCl/HF·2H2O、氯乙基氯甲酸酯(CEC)、Ph3PCH2COMeBr。内酯的打开优选发生在20℃-60℃的温度下的THF/H2O的4:1至2:1混合物中，以及纯的THF中，其中含合适的碱，例如NaOH、KOH、氨或胺。在30分钟(60℃)至2小时(20℃)内完成水解。在水解步骤之后，可以在10℃至50℃的温度下进行THF减压蒸发，并在0℃-40℃的温度下实施向钙盐的转化，优选通过添加Ca(OAc)2.×H2O，其可以作为一份或在5至60分钟内逐滴添加。在添加Ca(OAc)2.×H2O后，可以在0℃-40℃的温度下搅拌得到的悬浮液30分钟至2小时。这类反应的细节是本领域已知的，包括但不限于WO2008/119810。
通过任何上述实施方案获得的API，优选抑制素，可以配制在药物配方中。用API，优选抑制素制备药物制剂的方法是本领域技术人员已知的。一般而言，可以选择制备制剂，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、栓剂、溶液剂、软膏剂、混悬剂、泡沫剂、贴剂、输注液、注射用溶液等。为了修饰API的特定方面，例如释放性、稳定性、功效或安全性，可以改变制剂。根据API，本领域技术人员已知如何选择用于所述API的正确的施用途径。基于这一点，可以选择正确的制剂。然后，本领域技术人员能够选择配制药物制剂所需的赋形剂。除API外(可以与至少一种其他API任选的组合)，本领域技术人员可以选择赋形剂和添加剂来配制药物制剂。合适的赋形剂可以是例如，粘合剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、助流剂、溶剂、pH调节剂、离子强度调节剂、表面活性剂、缓冲剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、增塑剂、乳化剂、防腐剂、粘度调节剂、passifier、矫味剂，但不限于此，均可以单独或组合使用。根据选定的制剂，方法可涉及混合、研磨、湿法造粒、干法造粒、压片、溶解、冷冻干燥、胶囊填充，但不限于此。
API及其中间物的应用
在本发明的其他方面，一般可使用能够催化氧化或脱氢的酶制备与本文公开的酶促体系相容的API或其中间物。
本发明的这一方面优选涉及合成这样的API或其中间物，所述物质可分别归类为以取代的或未取代的双脱氧醛糖、内半缩醛(任选的包含多个羟基)和合成的非天然醇类作为可能的底物，和以(任选的被羟基化的)内酯或酯作为可能的产物。根据本发明的公开内容及其技术特征应理解：在糖(例如糖酵解、戊糖磷酸通路、糖原生成)、脂肪酸或细胞呼吸链的生物化学通路中天然存在的或出现的化合物将被排除视为能够催化氧化或脱氢的酶的底物或根据本发明的API或其中间物。以相同的方式，天然存在的氨基酸、维生素或辅助因子也被排除在根据本发明的API或其中间物的定义之外。这类通路在自然界中的底物或产物包括甲醇、乙醇、甲醛、乙醛、甲酸、乙酸、单糖、二糖、三糖、葡萄糖酸，尤其是甲醇、乙醇、甲醛、乙醛、甲酸、乙酸、单糖、葡糖醛酸，特别是乙醇、乙酸和单糖。在优选的实施方案中，能够催化氧化或脱氢的酶用于制备式(I)的化合物，其中式(I)定义如上。在这一方面，最有效的是使用酶作用于式(II)的化合物，其中式(II)定义如上。当考虑上文公开的本发明的其他实施方案、方面或优选特征时，用途的具体替代方案对本领域技术人员是显而易见的。
为了给出进一步示例的例子，下列式XIV给出了对底物的可能有用的进一步定义，以及因此可用于制备恰当的API或其中间物的起始化合物，从而导致获得由式XV定义的相应产物化合物。
其中Q是任何理想的结构部分，例如选自上文定义的R1、R2和R5，任选的在R1、R2或R5与内半缩醛/内酯环之间具有中间接头分子。如结构式所示，未被氧化的非内半缩醛羟基可位于内半缩醛/内酯环的任何位置。
在优选的实施方案中，同时或相继使用能够催化氧化或脱氢的酶和DERA酶，制备API或其中间物。
实施例
下列实施例仅仅是本发明的示例性例子，不应被视为以任何方式对本发明范围的限制，根据本公开内容和所附权利要求，这些例子及其其他的等价形式对本领域技术人员是显而易见的。
实施例1：制备包含在全细胞内的醛糖脱氢酶
如下文实施例所述，制备一些醛糖脱氢酶：
首先，制备由基因gcd(大肠杆菌GeneBank#JW0120，位置标签b0124)编码的、膜结合的葡萄糖脱氢酶，其为吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖性脱氢酶。
使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明分离大肠杆菌DH5α的基因组DNA。使用在LB培养基上37℃生长的大肠杆菌过夜培养物，分离基因组DNA。使用寡核苷酸引物GCGCCATATGGCAATTAACAATACAGGCTCGCG和GCGCGCTCAGCGCAAGTCTTAC TTCACATCATCCGGCAG通过PCR实施基因gcd的扩增。通过Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下实施扩增：在94℃初始变性10min，再进行30个循环的94℃下45s，52℃下45s和68℃下150s。在68℃下实施最终延伸420s。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有gcd(SEQ ID NO.03)的2.4-kb DNA片段，并纯化。在T4连接酶反应中，将产物连接到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性内切酶NdeI和BlpI切割质粒构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有gcd的2.4kb片段。使用相同的上述限制性内切酶切割表达载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)，并纯化。在T4连接酶反应中，将含有gcd基因的2.4kb片段与切割过的表达载体装配。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/Gcd，测序验证基因序列。实施克隆方法，允许表达具有序列(SEQ IDNO.04)的蛋白质，其含有掺入到细胞膜中必需的信号。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达膜结合的葡萄糖脱氢酶的生物。
第二，制备由基因yliI(大肠杆菌GeneBank#ECK0827，位置标签b0837)编码的水溶性醛糖脱氢酶，是一种吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖性脱氢酶。
使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明分离大肠杆菌DH5α的基因组DNA。使用在LB培养基上37℃生长的大肠杆菌过夜培养物，分离基因组DNA。使用寡核苷酸引物GCGCCATATGCATCGACAATCCTTT和GCGCGCTCAGGCTAATTGCGTGGGCTAA CTTTAAG通过PCR实施基因yliI的扩增。通过Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下实施扩增：在94℃初始变性10min，再进行30个循环的94℃下45s，52℃下45s和68℃下150s。在68℃下实施最终延伸420s。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有yliI(SEQ ID NO.01)的1.2-kb DNA片段，并纯化。在T4连接酶反应中，将产物连接到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性内切酶NdeI和SalI切割质粒构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有yliI的1.2kb片段。使用相同的上述限制性内切酶切割表达载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)，并纯化。在T4连接酶反应中，将含有yliI基因的1.2kb片段与切割过的表达载体装配。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/YliI，测序验证基因序列。实施克隆方法，允许表达具有序列(SEQ IDNO.02)的蛋白质，其包括YliI易位到周质的前导序列。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达醛糖脱氢酶的生物。
使用在乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)中发现的另一种水溶性醛糖脱氢酶进行备选的氧化研究。优化编码基因的核苷酸序列和用于转运到周质的前导序列(PQQ GdhB，乙酸钙不动杆菌GeneBank#X15871)，用于在大肠杆菌中表达，并化学合成DNA(Geneart,Regensburg,Germany)(SEQ ID.NO.05)。用具有核苷酸序列gdhB的人工质粒转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA，用限制性内切核酸酶NdeI和HindIII切割构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化1.5kb片段(SEQID.NO.05)。使用相同的上述限制性内切核酸酶切割表达载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)，并纯化。在T4连接酶反应中，将含有gdhB基因的1.5kb片段装配在切割过的表达载体中。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/GdhB，测序验证基因序列。实施克隆方法，目标是允许表达具有序列SEQ ID NO.06的蛋白质。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备来自乙酸钙不动杆菌表达生物的醛糖脱氢酶。
使用在乙酸钙不动杆菌中发现的另一种的水溶性醛糖脱氢酶(PQQ GdhB，乙酸钙不动杆菌GeneBank#X15871)，其具有改变的序列和增加的热稳定特性[Igarashi,2003]。优化编码基因的核苷酸序列和用于转运到周质的前导序列(PQQ GdhB，乙酸钙不动杆菌GeneBank#X15871)，用于在大肠杆菌中表达，并化学合成DNA(Geneart,Regensburg,Germany)(SEQ ID.NO.07)。用具有核苷酸序列gdhB_therm的人工质粒转化大肠杆菌JM109细胞，并培养氨苄青霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA，用限制性内切核酸酶NdeI和HindIII切割构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化1.5kb片段(SEQ ID.NO.07)。使用相同的上述限制性内切核酸酶切割表达载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)，并纯化。在T4连接酶反应中，将含有gdhB_therm基因的1.5kb片段装配在切割过的表达载体中。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/GdhB_therm，测序验证基因序列。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达备选的醛糖脱氢酶的生物。实施克隆方法，目标是允许表达具有序列SEQ ID NO.08的蛋白质。与SEQ ID NO.06相比，SEQ ID NO.08具有改变的序列，第231位编码的Ser残基变为Lys残基。
当提起时，使用具有表达质粒载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照。通过用所述质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，制备对照细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。
在大肠杆菌中表达各种酶的方法如方法1A所述。在表达后，收获细胞，如方法1B所述获得全细胞催化剂。为了获得休眠的全细胞催化剂，进行方法1C。
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方法1A：
用来自新鲜划线的VD琼脂平板，并预先培养至对数后期(37℃，250rpm，8h)的单菌落大肠杆菌BL21DE(3)pET30/Gcd或大肠杆菌BL21DE(3)pET30/YliI或BL21DE(3)pET30/GdhB或BL21DE(3)pET30/GdhB_therm，接种补充了卡那霉素(25μg/mL)的VD培养基(30mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)。
然后，将预培养的细胞(接种量10％，v/v)转移到补充了卡那霉素(25μg/mL)的新鲜VD培养基(100mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)中。为了诱导蛋白质表达，加入0.1mM异丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷类(IPTG，购自Sigma Aldrich,Germany)。细胞在摇瓶中25℃，250rpm培养16h。
方法1B：
在表达后(如方法1A所述)，通过离心(10 000g，5min，4℃)收获细胞。抛弃离心后的上清液，将沉淀重悬在新鲜的VD培养基(10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。
方法1C：
在抛弃上清液后(涉及方法1A)，将沉淀重悬在磷酸盐缓冲液(50mM KH2PO4，150mMNaCl，pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。
实施例2：制备包含在无细胞裂解物中的醛糖脱氢酶
为了获得表达大肠杆菌YliI、大肠杆菌GdhB、大肠杆菌Gcd或大肠杆菌GdhB_therm后的无细胞裂解物(如实施例1所述，更具体的在进行方法1A后)，通过离心(10 000g，5min，4℃)收获细胞。抛弃离心后的上清液，将沉淀重悬在十分之一初始体积的磷酸盐缓冲液(50mM KH2PO4，150mM NaCl，pH＝7.0)中。细胞补充了1mg/mL溶菌酶溶液。在37℃下实施裂解1h。在裂解后，通过沉降(10min，20 000g，4℃)去除细胞碎片，获得清澈的含水溶液。因此获得了包含在无细胞提取物中的醛糖脱氢酶。
可选的，将沉淀重悬在裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，pH＝7.0，300mM NaCl，2mM DTT)中，使用每1L所述缓冲液200g沉淀。使用Branson数字超声仪将细胞超声波处理(3x15s)，通过沉降(10min，20 000g，4℃)去除细胞碎片，获得清澈的含水溶液。因此获得了包含在无细胞提取物中的醛糖脱氢酶。
以上述相同的方式，从中间克吕沃尔菌(Klyuvera intermedia)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的全细胞中制备无细胞裂解物(全细胞催化剂的培养和制备分别描述在实施例9和实施例10中)。
用相同的方法处理作为阴性对照的大肠杆菌BL21(DE3)pET30培养物。
实施例3：制备含有醛糖脱氢酶的周质细胞级分
为了获得表达大肠杆菌YliI、大肠杆菌Gcd、大肠杆菌GdhB或大肠杆菌GdhB_therm后周质蛋白的特定释放(如实施例1所述，更具体的在进行方法1A后)，使用下列方法。通过离心沉淀来自新鲜表达的培养物的细胞，完全去除生长培养基。在20mM Tris-HCl(pH 7.5)中洗涤细胞沉淀3次。然后，在重悬在十分之一初始培养体积的高渗溶液之前，离心(10000g，5min，4℃)细胞沉淀，所述高渗溶液含有20mM Tris HCl(pH 7.5)、20％蔗糖和0.5mMEDTA。将细胞悬浮液在冰上孵育10min。在离心(10min，12 000g，4℃)后，通过移液至与高渗溶液等体积的低渗溶液(50mM Tris-HCl pH 7.0)中，温和的重悬细胞沉淀。再在冰上孵育细胞10min。通过离心(10min，20 000g，4℃)沉淀细胞，将上清液移除并视为周质级分。
用相同的方法处理作为阴性对照的大肠杆菌BL21(DE3)pET30培养物。
实施例4：制备含有醛糖脱氢酶的膜细胞级分
为了获得表达大肠杆菌Gcd后膜结合蛋白的特定释放(如实施例1所述，更具体的在进行方法1A后)，使用下列方法。通过离心沉淀来自新鲜表达的培养物的细胞，完全去除生长培养基。将细胞沉淀重悬在含有0.05％(v/v)Triton X-100和1mg/mL溶菌酶的初始体积的磷酸盐缓冲液(50mM KH2PO4，150mM NaCl，pH 6.0)中，在37℃下孵育30分钟。通过离心(30min，20 000g，4℃)去除细胞碎片，将上清液分离并标记为膜级分。
用相同的方法处理作为阴性对照的大肠杆菌BL21(DE3)pET30的培养物。
实施例5：制备包含在全细胞内的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶酶(DERA)
通过多种方法获得包含在全细胞催化剂中的醛缩酶基因deoC(大肠杆菌GeneBank#EG10221，位置标签b4381)，例如WO2009/092702所述。然而，本文提供了制备包含在全细胞内的醛缩酶酶(DERA)的非限制性实施例。
使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明分离大肠杆菌DH5α的基因组DNA。使用在LB培养基上37℃生长的大肠杆菌过夜培养物，分离基因组DNA。使用寡核苷酸引物CCGGCATATGACTGATCTGAAAGCAAGCAG和CCGCTCAGCTCATTAGTAGCTGCTG GCGCTC通过PCR实施基因deoC的扩增。通过Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下实施扩增：在95℃初始变性10min，再进行30个循环的94℃下45s，60℃下45s和68℃下60s。在68℃下实施最终延伸420s。通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段并纯化。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有deoC(SEQ ID NO.09)的0.9-kb DNA片段，并纯化。在T4连接酶反应中，将产物连接到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性内切酶NdeI和BlpI切割由此得到的质粒构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有deoC的0.9kb片段。使用相同的上述限制性内切酶切割表达载体pET30a(+)(Novagen Inc.,Madison,WI,USA)，并纯化。在T4连接酶反应中，将含有deoC基因的0.9kb片段与切割过的表达载体装配。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/DeoC，测序验证基因序列。实施克隆方法，目标是允许表达具有序列(SEQ ID NO.10)的蛋白质。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达DERA醛缩酶的生物。
deoC的表达：用来自新鲜划线且培养过夜(37℃，250rpm)的单菌落大肠杆菌BL21DE(3)pET30/DeoC，接种补充了卡那霉素(25μg/mL)的VD培养基(50mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，pH＝7.0)。
按方法1A所述进行大肠杆菌DeoC的表达方法，唯一的差别在于IPTG诱导剂的浓度是0.5mM。在收获表达细胞后，如用于获得活的全细胞催化剂的方法1B所述，获得全细胞催化剂。为了获得休眠的细胞催化剂，进行方法1C。
实施例6：制备包含在单个微生物的全细胞培养物中的醛缩酶(DERA)和醌蛋白葡 萄糖脱氢酶
构建同时具有醛缩酶活性(DERA)和葡萄糖脱氢酶活性的遗传修饰的生物体的两个例子。
在第一种情况下，将具有额外的核糖体结合位点(RBS)的基因yliI加入到构建体pET30/DeoC中。得到的构建体具有两种不同的编码序列(一种编码DERA，另一种编码Yli)，所述编码序列被组织在一个操纵子中，并处于IPTG诱导型启动子的转录控制下。
具体而言，使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明从大肠杆菌JM109 pET30/YliI(实施例1中描述了它的构建)中分离质粒DNA。使用在LB培养基上37℃生长的大肠杆菌过夜培养物，分离质粒DNA。
在PCR反应中，使用分离的质粒pET30/YliI作为模板，扩增含有基因yliI和源自表达载体pET30a(+)的编码区上游的RBS的序列。使用寡核苷酸引物GCAGGCTGAGCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG和GCGCGCTCAGCCTAAT TGCGTGGGCTAACTTTAAG实施PCR反应。使用Pfu ULTRA II Fusion HS DNA 200聚合酶(Agilent,Santa Clara,CA,USA)，如下实施该片段的扩增：在98℃初始变性3min，再进行30个循环的98℃下20s，55℃下20s和72℃下90s。在72℃下实施最终延伸180s。通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并纯化含有yliI和RBS位点的1.2kb片段。将产物转移到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中，命名为pGEM/RBS_yliI。用限制性内核酸切酶BlpI切割构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有yliI和RBS位点的1.2kb片段。使用上述限制性内切核酸酶(BlpI)切割构建体pET30a/DeoC(实施例5中描述了它的构建)，并纯化。根据生产商的说明，使用虾碱性磷酸酶(SAP，购自Promega,Madison,WI,USA)将切割过的pET30a/DeoC的5’磷酸化末端去磷酸化。从而阻止pET30/DeoC的自身连接。在T4连接酶反应中装配片段。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/DeoC_RBS_YliI，测序验证基因序列。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达DERA醛缩酶和醌蛋白葡萄糖脱氢酶的生物。
在第二种情况下，将不仅具有额外的核糖体结合位点(RBS)，还具有额外的T7启动子序列的基因gcd加入到构建体pET30/DeoC中。得到的载体具有处于IPTG诱导型启动子的转录控制下的2种不同的编码序列(1种编码DERA，另一种编码Gcd)。
具体而言，使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明从大肠杆菌JM109 pET30/Gcd(实施例1中描述了它的构建)中分离质粒DNA。使用在LB培养基上37℃生长的大肠杆菌过夜培养物，分离质粒DNA。
在PCR反应中，使用分离的质粒DNA作为模板，扩增含有基因gcd和源自表达载体pET30a(+)的编码区上游的RBS序列的序列。使用寡核苷酸引物GCTGGCTCAGCCTCGATCCCGCGAAATTAATA和GCGCGCTCAGCGCAA GTCTTACTTCACATCATCCGGCAG实施PCR反应。使用Pfu ULTRA II Fusion HS DNA 200聚合酶(Agilent,Santa Clara,CA,USA)，如下实施该片段的扩增：在98℃初始变性3min，再进行30个循环的98℃下20s，55℃下20s和72℃下90s。在72℃下实施最终延伸180s。通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并纯化含有gcd和RBS位点的1.2kb片段。将产物转移到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中，命名为pGEM/T7p_RBS_gcd。用限制性内核酸切酶BlpI切割构建体，在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有gcd、RBS和T7启动子序列位点的2.4kb片段。
使用相同的上述限制性内切核酸酶(BlpI)切割构建体pET30a/DeoC(实施例5中描述了它的构建)，并纯化。根据生产商的说明，使用虾碱性磷酸酶(SAP，购自Promega,Madison,WI,USA)将切割过的pET30a/DeoC的5’磷酸化末端去磷酸化。从而阻止pET30/DeoC的自身连接。在T4连接酶反应中装配片段。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落。然后分离质粒DNA。得到的构建体被命名为pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd，测序验证基因序列。通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备表达DERA醛缩酶和醌蛋白葡萄糖脱氢酶的生物。
除非另外指出，如方法1A所述，实施由上述方法获得的菌株编码的酶的表达。
实施例7：制备能够合成吡咯并喹啉醌(PQQ)的大肠杆菌
在大肠杆菌中表达参与吡咯并喹啉醌(PQQ)生物合成的氧化葡糖杆菌(ATCC621H)基因簇pqqABCDE(pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE，GeneBank#CP000009，大致位置在基因组1080978…1084164)。
使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega,Madison,WI,USA)，根据生产商的说明分离氧化葡糖杆菌(ATCC 621H)的基因组DNA。使用在甘露醇培养基(10g/Lbacto酵母提取物，3g/L蛋白胨，5g/L甘露醇，pH 7.0)上26℃生长48h的氧化葡糖杆菌培养物，分离基因组DNA。使用所述分离的基因组作为模板，扩增基因簇pqqABCDE及其本身的启动子。使用寡核苷酸引物GCGCGGTACCGCACATGTCGCGGATGTTCAGGTGTTC(SEQ ID NO.80)和GCGCGGATCCGGGCGGAGAGTTTGGAGAACCTCTTCA(SEQ ID NO.81)，和使用Pfu ULTRA II FusionHS DNA 200聚合酶(Agilent,Santa Clara,CA,USA)，如下通过PCR实施扩增：在95℃初始变性2min，再进行30个循环的95℃下20s，65℃下20s和72℃下120s。在72℃下实施最终延伸180s。通过琼脂糖凝胶电泳分离具有pqqABCDE操纵子和部分上游和下游序列的氧化葡糖杆菌的3.4-kb DNA片段，并纯化。将3.4-kb产物(SEQ ID NO.11)连接到质粒pGEM T-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养氨苄青霉素抗性菌落，和分离质粒DNA。得到的质粒构建体被命名为pGEMpqqA-E，测序验证基因序列。实施克隆方法，目标是允许处于其天然启动子控制下的基因表达，因此生产源自氧化葡糖杆菌的蛋白质PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE(分别是SEQ ID NO.12、13、14、15、16)。
在大肠杆菌中合成PQQ：(方法7A)：用来自新鲜划线且预培养至对数末期(37℃，250rpm，8h)的单菌落大肠杆菌JM109pGEM/pqqA-E，接种补充了氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基(30mL；20g/L Bacto LB肉汤)。通过离心(10 000g，10min)沉淀预培养的细胞，用50mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)洗涤3次。将预培养的细胞重悬在与预培养中相同体积的同一上述缓冲液中。然后，将悬浮液(接种量5％，v/v)转移到葡萄糖基础培养基(100mL，5g/L D-葡萄糖，2g/L柠檬酸钠，10g/L K2HPO4，3.5g/L(NH4)2SO4，pH 7.0)中。在37℃，250rpm下生长培养物48h。细胞培养物补充了1mg/mL溶菌酶溶液。在37℃实施裂解1h。在裂解后，通过沉降(10min，20 000g，4℃)去除细胞碎片，获得清澈的含水溶液。因此获得了包含在无细胞提取物中的PQQ。
用于验证大肠杆菌中的PQQ生产的方法描述在实施例13中。
实施例8：制备包含在能够合成吡咯并喹啉醌(PQQ)的单个微生物的全细胞培养物 中的醛糖脱氢酶
构建具有基因yliI和基因簇pqqA-E的表达质粒。
用限制性内切核酸酶SphI消化构建体pET30/YliI(如实施例1所述制备)。根据生产商的说明，使用虾碱性磷酸酶(SAP，购自Promega,Madison,WI,USA)将切割过的pET30/YliI的5’磷酸化末端去磷酸化。从而阻止pET30/YliI的自身连接。之后，用SphI切割后，将含有双限制性酶识别位点SphI和用于限制性内切核酸酶BamHI、KpnI和HindIII的识别位点的双链接头GCGCAAGCATGCGGATCCGGTACCAAGCTTGCATGCACACTA(SEQ ID NO.82)(订购自Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，导入到经过消化的构建体pET30/YliI的SphI位点中。
在T4连接酶反应中装配切割接头和切割的构建体。接头的导入在质粒中插入了额外的限制性内切核酸酶识别位点。用限制性内切核酸酶BamHI和KpnI切割构建体pGEM/pqqA-E(根据实施例7)，然后在琼脂糖凝胶电泳上分离得到的片段，并纯化含有基因操纵子pqqABCDE的3.4kb片段。使用上述限制性内切核酸酶切割含接头的构建体pET30/YliI，并纯化。在T4连接酶反应中装配片段(分别是含接头的切割过的pET30/YliI和pqqA-E)。用获得的连接反应物转化大肠杆菌JM109细胞，并培养卡那霉素抗性菌落，分离质粒DNA。得到的质粒构建体被命名为pET30/YliI+pqqA-E，测序验证基因序列。
通过用所述质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，制备能够表达醛糖脱氢酶，同时合成吡咯并喹啉醌的生物。
如方法1A所述，进行大肠杆菌YliI的表达，所述YliI包含在能够生产PQQ的单个微生物的全细胞培养物中。根据方法1B和1C，分别制备活的全细胞催化剂和休眠的全细胞催化剂。按实施例2描述的方法，制备无细胞裂解物。
用于验证大肠杆菌的氧化能力和PQQ生产的方法描述在实施例13中。
此外，组装含有DERA、和醛糖脱氢酶YliI、以及氧化葡糖杆菌(ATCC 621H)的PQQ生物合成簇的构建体。与上述方法类似的实施所述方法，但使用载体pET30/DeoC_RBS_YliI(描述在实施例6中)作为起点。得到的质粒被命名为pET30/DeoC_RBS_YliI+pqqA-E(图1)。
实施例9：制备中间克吕沃尔菌的全细胞催化剂
培养中间克吕沃尔菌(ATCC 33421，以前称为中间肠杆菌(Enterobacterintermedia))：用来自新鲜划线的VD琼脂平板，并预先培养至对数后期(30℃，250rpm，8h)的单菌落中间克吕沃尔菌，接种VD培养基(30mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)。
然后，将预培养的细胞(接种量10％，v/v)转移到新鲜的VD培养基(100mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)中。细胞在30℃，250rpm下维持16h。
制备全细胞催化剂(方法1B)：在培养后，通过离心(10 000g，5min，4℃)收获细胞。抛弃离心后的上清液，将沉淀重悬在新鲜的VD培养基(10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。因此在新鲜培养基中获得了包含在活的全细胞中的醛糖脱氢酶。
可选的(方法1C)：在抛弃离心后的上清液后，将沉淀重悬在磷酸盐缓冲液(50mMKH2PO4，150mM NaCl，pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。因此获得了包含在休眠全细胞中的醛糖脱氢酶。
按实施例2描述的方法制备无细胞裂解物。
实施例10：制备氧化葡糖杆菌的全细胞催化剂
培养氧化葡糖杆菌(ATCC#621H)：用来自新鲜划线的甘露醇琼脂平板的单菌落氧化葡糖杆菌，接种甘露醇培养基(100mL；10g/L bacto酵母提取物，3g/L蛋白胨，5g/L甘露醇，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)，并培养。细胞在26℃，250rpm下维持48h。
制备全细胞催化剂(方法1B)：在培养后，通过离心(10 000g，5min，4℃)收获细胞。抛弃离心后的上清液，将沉淀重悬在新鲜的VD培养基(10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。因此在新鲜培养基中获得了包含在活的全细胞中的醛糖脱氢酶。
可选的(方法1C)：在抛弃离心后的上清液后，将沉淀重悬在磷酸盐缓冲液(50mMKH2PO4，150mM NaCl，pH＝6.0)中。细胞重悬在十分之一的初始培养体积中。因此获得了包含在休眠全细胞中的醛糖脱氢酶。
按实施例2描述的方法制备无细胞裂解物。
实施例11：使用DCPIP作为电子受体，确定化合物(II)的氧化/脱氢活性的方法
该方法可用于确定醛糖脱氢酶活性(或其他脱氢酶和/或氧化酶的活性)。相应的，使用相同的方法筛选和鉴别能够进行化合物(II)的氧化/脱氢反应，获得化合物(I)的酶和/或生物体。
可以使用任何微生物的活的全细胞催化剂(涉及方法1B)、休眠的全细胞催化剂(涉及方法1C)、裂解物(按实施例2描述的制备)、周质级分(实施例3)或膜级分(实施例4)，测量对化合物(II)的氧化/脱氢活性，不论所述微生物是天然的或遗传修饰的微生物。出于实践的目的，下文可以理解术语“分析材料”包括前述实施例中描述的所有催化剂制品。所提供的下表分别给出了使用不同制品获得的结果。
为了比较研究，将测试微生物的细胞密度定量为每mL样品的湿重(mg)。通过离心(10 000g，10min)分离样品中的细胞和肉汤，称重湿的沉淀。裂解时，使用周质级分或膜级分作为测试级分，考虑这些级分所来源的全细胞的细胞湿重数据。
1mL“分析材料”补充了5μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2(SigmaAldrich，Germany)，并在室温孵育10分钟。在测量前，用1M NaOH调节“分析材料”的pH值至8.0。当另外说明时(符号“＊”表示例外)，测量的差异是pH值，更特别的是pH 6.0。当说明时，除了内在的PQQ外，不向反应混合物中添加额外的PQQ。
为了筛选和鉴别可用于将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯转化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的“分析材料”，在存在人工电子受体2,6-二氯吲哚酚(2,6-dichlorobenzenone-indophenole,DCPIP)与吩嗪硫酸甲酯(PMS)组合的条件下，在96孔板中实施筛选方法。
反应混合物(总体积200μL)含有磷酸盐缓冲液pH 8.0(或者当说明时，磷酸盐缓冲液pH 6.0)、100mM底物乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯)、1mM DCPIP(Sigma Aldrich，Germany)、0.4mM PMS(Sigma Aldrich，Germany)。将“分析材料”加入到反应混合物中。需要时(由于反应快速完成)，将“分析材料”在磷酸盐缓冲液pH 8.0或磷酸盐缓冲液pH 6.0(指出时)中稀释。所有测试的“分析材料”都制备一式三份。发现测定是线性的有效范围是在10至400mAU/sec。
用分光光度计Spectra Max Pro M2(Molecular Devices,USA)实施方法。在28℃下每15秒测量600nm的吸光度，测量15分钟。收集结果，并使用软件SoftMax Pro DataAcquisition&Analysis Software分析。
“分析材料”的活性，和执行将化合物(II)转化为化合物(I)的反应的能力，具体而言是将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯转化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的能力，定义为反应混合物中存在的每单位湿重的培养细胞每分钟吸光度单位减少的绝对值(abs[mAU min-1mg-1])，所述培养细胞根据方法1C、2、3或4用于制备任何“分析材料”。数据是3组平行测量值的平均值，显示在下表中。
标记：‘’＊”-反应的pH值是6.0
‘’＊＊”-在“无PQQ”的列中，除内在的PQQ外，没有加入额外的PQQ
对于阴性对照，适当时用磷酸盐缓冲液pH 8.0或pH 6.0替代反应混合物的至少一种组分(除电子受体DCPIP与PMS的组合)。即使经过延长的孵育后，在所有的阴性对照孔中没有观察到任何变色。当用磷酸盐缓冲液替代清澈的醛糖脱氢酶水溶液时，没有观察到变色。当用磷酸盐缓冲液替代任何底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯、葡萄糖、半乳糖或甘油)时，没有观察到变色。当通过本发明所述的任何手段，不向反应混合物提供PQQ(除了混合物9、10和11，其中PQQ是内在提供的)时，没有观察到变色。
实施例12：在存在DCPIP的条件下，确定包含在大肠杆菌中的醛糖脱氢酶的特性
a)为了确定大肠杆菌YliI醛糖脱氢酶对其他底物和不同浓度的活性，实施额外的实验。
将50μL“分析材料”(更特别的是用5μL PQQ和10mM MgCl2重构的大肠杆菌BL21pET30/YliI，并进行方法1B)，将1mM DCPIP，0.4mM PMS以及不同浓度(2.5–10g/L)的底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖和D-半乳糖)置于96孔微滴度板的孔内。反应混合物的最终体积是200μL，所有组分都溶解在磷酸盐缓冲液pH8.0中。
在这些孔中观察到了DCPIP变色。使用乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯作为底物的变色速率比含有D-葡萄糖或D-半乳糖作为底物的对照孔快约2倍。
使用10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯作为底物时比2.5g/L所述底物变色更快。仅当反应混合物中的乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的浓度升至大于40g/L时，观察到对反应速率轻微的底物抑制作用。
为了评估产物乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯对反应速率的可能影响，在反应开始前，向反应混合物中加入各种量的所述产物。仅当除10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯以外，加入超过35g/L乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯时，才观察到反应速率的轻微降低。
为了研究大肠杆菌YliI醛糖脱氢酶的底物特异性和最适pH，实施下列实验：
一种反应混合物(总体积200μL)含有磷酸盐缓冲液pH 8.0，50mM底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖或甘油)，1mM DCPIP，0.4mM PMS。向混合物中加入50μL补充了5μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2的“分析材料”(下文进一步详述)。催化剂大肠杆菌BL21pET30/YliI培养物是作为休眠的全细胞催化剂(进行方法1C获得的)或裂解物(如实施例2所述)获得的。反应混合物的初始pH值是8.0。所有的测试溶液都一式三份。
制备与上述相同的第二种反应混合物，唯一的区别是：配制的混合物的pH值是6.0(将反应混合物的所有化合物溶解在磷酸盐缓冲液pH 6.0中，因此反应混合物的初始pH值是6.0)。所有的测试溶液都一式三份。
用分光光度计Spectra Max Pro M2(Molecular Devices,USA)确定所述反应混合物中不同的最适条件下醛糖脱氢酶的差异和由此的转化底物的差异。在28℃下每15秒测量600nm的吸光度，测量15分钟。收集结果，并使用软件SoftMax Pro Data Acquisition&Analysis Software分析。如实施例11所述实施实验。在下表中，显示了“分析材料”的活性(abs[mAU min-1mg-1])。
b)另外，使用DCPIP方法，评估大肠杆菌的膜结合的葡萄糖脱氢酶Gcd在结构上不同的特征。
将50μL“分析材料”(更具体是用5μL PQQ和10mM MgCl2重构的大肠杆菌BL21pET30/Gcd，并接受方法1B)，1mM DCPIP，0.4mM PMS置于96孔微滴度板的孔内，加入不同浓度(2.5–10g/L)的底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖和D-半乳糖)。反应混合物的最终体积是200μL，所有组分都溶解在磷酸盐缓冲液pH6.0中。
在这些孔中观察到了DCPIP变色。使用乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯作为底物的变色速率比含有D-葡萄糖或D-半乳糖作为底物的对照孔慢约2倍。
使用10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯作为底物时比2.5g/L所述底物变色更快。仅当反应混合物中的乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的浓度升至大于60g/L时，观察到对反应速率轻微的底物抑制作用。
为了评估产物乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯对反应速率的潜在影响，在反应开始前，向反应混合物中加入各种量的所述产物。仅当除10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯以外，加入超过55g/L乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯时，才观察到反应速率的轻微降低。
为了研究所述大肠杆菌膜醛糖脱氢酶的底物特异性和最佳pH，在催化剂大肠杆菌BL21pET30/Gcd上实施上述实验。
结果显示，当底物是乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯时，在膜中过表达Gcd醌蛋白脱氢酶在pH 6.0时的性能更好。对乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的活性略微慢于使用葡萄糖作为底物时的活性。
结果明确的显示，即使源自同一生物(大肠杆菌)，不同的醌蛋白脱氢酶也具有完全不同的活性最佳值和其他特性，提示了对于每种单个酶的单个表征和反应条件优化的需求。
实施例13：使用pO2传感器，在生物反应器中确定全细胞的催化能力
使用具有最大体积2L的实验室生物反应器Infors ISF100确定大肠杆菌醛糖脱氢酶的全细胞的催化能力。如下所述对反应器搅拌反应器、充气、控制温度和pH。当具有全醛糖脱氢酶的全细胞催化剂暴露给各种底物时，出现了不常见的耗O2量。使用pO2传感器Hamilton OXYFERM FDA 225 PN 237452，发现提供底物后的pO2随时间的下降速率(耗氧量)与全细胞的催化能力的速率相关。
使用全细胞催化剂大肠杆菌BL21pET30/Gcd实施实验(制备方法如实施例1，方法1A和实施例25所述)。
将全细胞催化剂溶解在磷酸盐缓冲液(50mM KH2PO4，150mM NaCl，pH 6.2)中，至生物反应器的终体积(1L)的浓度为5g/L，10g/L和20g/L。
在加入底物前的初始方法参数如下：37℃，气流速率1.0L/min(1.0VVM)，搅拌速度1000rpm，pH 6.2，保持溶解氧浓度≥80％饱和。向生物反应器肉汤中提供5μM PQQ和10mMMgCl2。补料溶液是12.5％(v/v)氢氧化铵溶液，并连续补料硅酮止泡化合物synperonic止泡剂(Sigma，A-5551)。
一次性加入底物(D-葡萄糖和乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯)，浓度为0.25g/L，0.5g/L和1g/L。当以肉汤提供底物时，按时间记录耗氧量。
就溶解氧水平随时间变化的数学描述而言，所述系统是非常复杂的。一方面取决于kLa(容器性质、搅拌、充气、培养基、温度等)，另一方面取决于醛糖脱氢酶的的酶促动力学。此外，氧探针延迟的动力学也发挥了重要作用。因此，在经验上发现：在底物的脉冲补料之后的阶段直到该动力学系统中溶解氧最小值，期间的耗氧量与二次方程最相关。所研究的生物催化剂的活性潜力的良好指标是该二次方程的斜率，测量在具体时间值(例如，t＝15秒)。根据二次方程的第一导数计算斜率。该计算过程显示了良好的可重复性和方法的线性。
实施例14：从多种来源用PQQ重构醛糖脱氢酶全酶，并用DCPIP作为电子受体测定
有不同的可能性通过向PQQ-依赖性醛糖脱氢酶原位提供PQQ和恰当的二价阳离子(如Mg2+和Ca2+)并且因此获得活性醛糖脱氢酶来构建全酶。为了确定，使用了实施例11所述的人工电子受体(DCPIP组合PMS)的方法。
根据方法1B或1C制备的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30或全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/GdhB、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/GdhB_therm、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI和pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd，可以如下供应PQQ：
-方法14A：向活的全细胞催化剂或休眠的全细胞催化剂(5mL)加入5μM PQQ(SigmaAldrich，Germany)，10mM MgCl2(Sigma Aldrich，Germany)和磷酸盐缓冲液pH 6.0(5mL)，室温孵育10min。
-方法14B：在存在10mM MgCl2的条件下，5mL培养的大肠杆菌JM109pGEM/pqqA-E的上清液(如方法7D所述获得的裂解物)，补充全细胞催化剂或休眠的细胞催化剂(5mL)，室温孵育10min。
-方法14C：5mL培养的中间克吕沃尔菌或氧化葡糖杆菌的上清液(其培养分别描述在实施例10和实施例11中)，补充全细胞催化剂或休眠的细胞催化剂(5mL)。离心培养物(10000g，5min，4℃)后获得上清液，在悬浮存在10mM MgCl2的条件下，室温孵育10min。
按相同的体积比，用磷酸盐缓冲液pH＝6.0和10mM MgCl2补充进行过方法1B或1C的活的全细胞催化剂或休眠的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E(5mL)，室温孵育10min。
在存在人工电子受体DCPIP的条件下，进行实施例11所述的方法，在96孔微滴度板中测试所有反应混合物将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯转化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的能力。
符号：“＊”-反应的pH值为6.0
在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中诱导质粒pET30、pET30/YliI、pET30/Gcd、pET30/GdhB、pET30a/GdhB_therm表达时(按方法1A)，加入5μM PQQ和10mM MgCl2，揭示了与在反应前立刻添加相似的结果。
实施例15：用包含在活的全细胞催化剂中的各种醛糖脱氢酶氧化内半缩醛乙酸 ((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
测试含有醛糖脱氢酶(各种酶分别描述在实施例1、7、8、9和10中)的各种活的全细胞催化剂将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯生物转化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。
按方法1B所述制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30a、大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/Gcd、大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/GdhB、大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/GdhB_therm(制备描述在实施例1中)。实施反应时，将9mL上述活的全细胞催化剂的样品转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。反应混合物补充了1μM PQQ(10μL的1mM预先制备的PQQ储液，Sigma)和10mM MgCl2(2.5μL的4M预先制备的MgCl2储液，Sigma)。
按方法1B所述制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/YliI+pqqA-E(制备描述在实施例7中)。实施反应时，将9mL上述细胞的样品转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。
按方法1B所述制备活的全细胞催化剂中间克吕沃尔菌(实施例10)和氧化葡糖杆菌(实施例11)。实施反应时，将9mL上述细胞的样品转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。
将乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯溶解在磷酸盐缓冲液(50mM KH2PO4，150mM NaCl，pH 6.0)中，浓度为2mol/L。浓缩的活的全细胞催化剂的所有样品补充了1mL 2mol/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。在旋转摇床上，37℃、250rpm下进行反应6小时。在时间0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’，采集样品。用乙腈稀释每个样品50倍，用于GC-MS分析。下表显示了时间0’、180’和360’时的结果。
反应的主要产物具有与通过现有技术所述的化学氧化获得的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滞留时间和离子分布。
在360min后，用等体积的乙酸乙酯提取反应混合物5次，收集所有的有机级分，并在旋转蒸发仪上干燥。最后获得黄色油状物。
得到的产物的结构用NMR验证，与现有技术报道的相同。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ4.88(m，1H)，4.45(d，J＝3.0Hz，1H)，4.38(hex，J＝3.0Hz，1H)，4.23(dd，J＝3.5Hz，J＝12.0Hz，1H)，4.16(dd，J＝5.5Hz，J＝12.1Hz，1H)，2.68(dd，J＝4.3Hz，J＝17.5HZ，1H)，2.51(dddd，J＝0.8Hz，J＝2.0Hz，J＝3.3Hz，J＝17.5Hz，1H)，2.03(s，3H)，1.91(m，2H)，13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δ170.8、169.7、74.2、66.5、62.7、39.1、32.3、20.6。
使用大肠杆菌BL21(DE3)pET30作为阴性对照。在上述相同的条件下进行反应，反应结束时，观察到少量的乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。然而，并非所有提供的乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯都保持未被接触。转化的原因是当提供PQQ和MgCl2时，激活了存在于大肠杆菌中的内源性醌蛋白脱氢酶(YliI和Gcd))，形成了全酶。
实施例16：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(YliI或Gcd)的系列反应，用于从乙酰氧 基乙醛和乙醛生产乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
根据方法1B，按实施例5所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC。将5mL活的全细胞催化剂转移到100mLErlenmeyer摇瓶中。
制备乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。将600.5mg乙酰氧基乙醛(在本实验室中化学合成所述化合物，显示为85％纯度)和467.2mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积10mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。在旋转摇床上，37℃、250rpm实施反应3小时。
3小时后，将补充了1μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2(SigmaAldrich，Germany)的5mL活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI(根据方法1B按实施例1所述制备)，加入到同一Erlenmeyer摇瓶中。在旋转摇床上，37℃、250rpm再保留氧化反应3小时。
在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’时，采集样品。用乙腈稀释每个样品50倍，用于GC-MS分析。反应的主要产物具有与通过现有技术所述的化学氧化获得的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滞留时间和离子分布。在360’后，观察到12.3g/L乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表64％摩尔产率。
使用活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd(根据方法1B按实施例1所述制备)，实施上述相同的方法。在360’od后，向含大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应混合物添加5ml活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd活的全细胞催化剂。观察到14.45g/L乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表75％摩尔产率。
实施例17：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(Gcd)同时反应，从乙酰氧基乙醛和乙醛 生产乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述制备)。将两种活的全细胞催化剂按相同的体积比(5mL)转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。
设置两种不同的反应，都存在活的全细胞催化剂。第一种反应混合物补充了5μMPQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2(Sigma Aldrich，Germany)，而第二种用作对照，仅存在脱辅基的醛糖脱氢酶。
制备乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。将1.201g乙酰氧基乙醛(在本实验室中化学合成所述化合物，显示为85％纯度)和934.4mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积10mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。乙酰氧基乙醛和乙醛的最终浓度分别是100mM和210mM。反应在37℃、250rpm实施6小时。
在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’时，采集样品。用乙腈稀释每个样品50倍，用于GC-MS分析。反应的主要产物具有与通过现有技术所述的化学氧化获得的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滞留时间和离子分布。
在存在脱氢酶全酶的第一反应混合物中，在360’后，观察到13.6g/L乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表71％摩尔产率。在360’后，仅观察到少量的内半缩醛乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，然而，此时仍然存在底物(乙醛和乙酰氧基乙醛)和中间物((S)-(4-hydroxyoxtetan-2-基)甲基乙酸酯)。
与此同时，在仅存在脱辅基脱氢酶并且因此在反应中仅DERA醛缩酶具有活性的第二反应混合物中，仅产生9.55g/L的内半缩醛内半缩醛乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。
上述显示：用醛糖脱氢酶(Gcd)的反应步骤比用醛缩酶酶(DERA)催化的步骤更快，醛糖脱氢酶的存在使DERA反应步骤的稳态平衡移向产物，而同时与醛糖脱氢酶(Gcd)的反应实际上改善了向内酯(化合物I)的整体速率。
实施例18：包含在单个微生物的活的全细胞催化剂中的DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶 (YliI或Gcd)的用于从乙酰氧基乙醛和乙醛生产乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的同时反应
下列实施例提供了由活的微生物提供的合成生物学通路，所述通路能够从简单便宜的分子：乙酰氧基乙醛和乙醛，生产高度对映异构纯的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。
按方法1A所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd(按实施例6所述制备)。分别通过离心(5000g，10min)浓缩所述全细胞催化剂，并将沉淀重悬在十分之一初始体积的相同上清液中。抛弃多余的上清液。将10mL所述浓缩的活的全细胞催化剂转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。向细胞肉汤中补充5μM PQQ和10mM MgCl2，用氨溶液将肉汤的pH值调节为6.0。
制备包含乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。将1.201g乙酰氧基乙醛(在本实验室中化学合成所述化合物，显示为85％纯度)和934.4mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积10mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。乙酰氧基乙醛和乙醛在反应混合物中的终浓度分别是100mM和210mM。反应在37℃、250rpm实施6小时。
在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’时，采集样品。用乙腈稀释每个样品50倍，用于GC-MS分析。反应的主要产物具有与通过现有技术所述的化学氧化获得的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滞留时间和离子分布。
在存在大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI作为催化剂时，在360’后，观察到7.80g/L乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表41％摩尔产率。在同一时间，在存在大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd的条件下实施反应时，360’后，观察到13.12g/L的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表69％摩尔产率。
实施例19：包含DERA醛缩酶和活的全细胞催化剂中间克吕沃尔菌用于从乙酰氧基 乙醛和乙醛生产乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的同时反应
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC和中间克吕沃尔菌(分别按实施例1和11所述制备)。将两种活的全细胞催化剂以相同的体积比(5mL)转移到100mL Erlenmeyer摇瓶中。
制备乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。将1.201g乙酰氧基乙醛(在本实验室中化学合成所述化合物，显示为85％纯度)和934.4mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积10mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的储液。乙酰氧基乙醛和乙醛在反应混合物中的终浓度分别是100mM和210mM。反应在37℃、250rpm实施6小时。
在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’时，采集样品。用乙腈稀释每个样品50倍，用于GC-MS分析。反应的主要产物具有与通过现有技术所述的化学氧化获得的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滞留时间和离子分布。
在360’后，观察到10.40g/L乙酸((2S.4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表54％摩尔产率。
实施例20：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(Yli或Gcd)生产((4R,6S)-6-(氯甲基)- 4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮)的同时反应
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述制备)。将6mL活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI或大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd转移到50mL聚苯乙烯锥形管(BD Falcon,USA)中。反应混合物补充了1μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2。
制备氯乙醛和乙醛的储液。将817μL氯乙醛溶液(在H2O中50wt.％，购自Aldrich，USA)和500.6mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积5mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述氯乙醛和乙醛的储液——总反应体积因此是10mL，且氯乙醛和乙醛在反应混合物中的起始浓度分别是100mM和225mM。反应在37℃、200rpm下水浴振荡实施2小时。
用气相色谱监控反应进程。120min后，用等体积的乙酸乙酯抽提反应混合物3次，收集所有的有机级分，在旋转蒸发仪中干燥。在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余66mg(36.2％产率)的干燥产物(4R,6S)-6-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮，在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余72mg(39％产率)的干燥产物。用NMR分析产物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.01(m，1H)，4.47(m，1H)，3.80(m，1H)，3.68(m，1H)，2.69(d，J＝3.6Hz，2H)，2.09(m，1H)，1.97(m，1H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.2、74.8、62.5、46.6、38.5、32.8。
实施例21：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(YliI或Gcd)生产((4R,6S)-6-(二甲氧 甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮)的同时反应
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述制备)。将6mL活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI或大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd转移到50mL聚苯乙烯锥形管(BD Falcon,USA)中。反应混合物补充了1μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2。
制备二甲氧乙醛和乙醛的储液。将868μL的2,2-二甲氧乙醛溶液(在H2O中60wt.％，购自Fluka，USA)和500.6mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH6.0中，至终体积5mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述二甲氧乙醛和乙醛的储液——总反应体积因此是10mL，并且二甲氧乙醛和乙醛在反应混合物中的起始浓度分别是100mM和225mM。反应在37℃、200rpm下水浴振荡实施2小时。
用气相色谱监控反应进程。120min后，用等体积的乙酸乙酯抽提反应混合物3次，收集所有的有机级分，在旋转蒸发仪中干燥。在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余53mg(25.3％产率)的干燥产物(4R,6S)-6-(二甲氧甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮，在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余67mg(31.9％产率)的干燥产物。用NMR分析产物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ4.74(五重峰，J＝3.5Hz，1H)，4.43(m，2H)，3.49(s，3H)，3.47(s，3H)，3.10(br s，1H)，2.72(dd，J＝3.5Hz，J＝17.8Hz，2H)，2.62(m，2H)，1.99(m，2H)。
实施例22：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(YliI或Gcd)生产((4R,6S)-6-(苄氧甲 基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮)的同时反应
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述制备)。将6mL活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI或大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd转移到50mL聚苯乙烯锥形管(BD Falcon,USA)中。反应混合物补充了1μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2。
制备苄氧乙醛和乙醛的储液。将774.1mg苄氧乙醛(购自Fluka，USA)和500.6mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH 6.0中，至终体积5mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述苄氧乙醛和乙醛的储液——总反应体积因此是10mL，并且苄氧乙醛和乙醛在反应混合物中的起始浓度分别是100mM和225mM。反应在37℃、200rpm下水浴振荡实施2小时。
用气相色谱监控反应进程。120min后，用等体积的乙酸乙酯抽提反应混合物3次，收集所有的有机级分，在旋转蒸发仪中干燥。在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余51mg(19.6％产率)的干燥产物(4R,6S)-6-(苄氧甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮，在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余56mg(21.5％产率)的干燥产物。粗制产物溶解在二氯甲烷中，与TBDMSCl和咪唑反应24h。浓缩溶液，并通过层析纯化，产生TBDMSCl保护的化合物((4R,6S)-6-(苄氧甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮)，其用NMR分析。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.36(m，5H)，5.17(s，2H)，4.93(五重峰，J＝4.7Hz，1H)，4.38(dd，J＝3.4Hz，J＝11.8Hz，1H)，4.35(五重峰，J＝3.3Hz，1H)，4.27(dd，J＝4.7Hz，J＝11.8Hz，1H)，2.58(d，J＝3.3Hz，2H)，1.85(m，2H)，0.88(s，9H)，0.09(s，3H)，0.08(s，3H)，13C NMR(125MHz，CDCl3)δ154.8、134.8、128.7、128.6、128.4、73.2、70.0、68.8、63.2、39.0、32.2、25.6、17.8、-5.0。
实施例23：使用DERA醛缩酶和醛糖脱氢酶(YliI或Gcd)生产((4R,6R)-4-羟基-6- 甲基四氢-2H-吡喃-2-酮)的同时反应
按方法1B所述，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI、大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述制备)。将6mL活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI或大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd转移到50mL聚苯乙烯锥形管(BD Falcon,USA)中。反应混合物补充了1μM PQQ(Sigma Aldrich，Germany)和10mM MgCl2。
制备乙醛的储液。将445mg乙醛(购自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸盐缓冲液pH6.0中，至终体积5mL。
在0’时，向反应混合物中加入1mL所述乙醛的储液——总反应体积因此是10mL，并且乙醛在反应混合物中的最终浓度是200mM。反应在37℃、200rpm下水浴振荡实施2小时。
用气相色谱监控反应进程。120min后，用等体积的乙酸乙酯抽提反应混合物3次，收集所有的有机级分，在旋转蒸发仪中干燥。在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余99mg(34.1％产率)的干燥产物(4R,6R)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-酮，在组合大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反应后，还剩余110mg(37.9％产率)的干燥产物。用NMR分析产物。1HNMR(300MHz，丙酮-d6)δ4.76(dq，Jd＝11.2Hz，Jq＝3.2Hz，1H)，4.41-4.15(m，2H)，2.63(dd，J＝4.3Hz，J＝17.0Hz，1H)，2.46(ddd，J＝1.7Hz，J＝3.3Hz，J＝17.0Hz，1H)，1.92(m，1H)，1.71(dd，J＝3.0Hz，J＝14.3Hz，1H)，1.29(d，J＝6.4Hz，3H)。13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δ170.6、72.7、63.1、39.1、38.2、21.8。
实施例24：高细胞密度生产活的全细胞催化剂和从乙酰氧基乙醛和乙醛单罐装 (one pot)顺序生产乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
在使用最大体积2L的实验室生物反应器Infors ISF100的“补料分批”生物方法中，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例7和4所述制备)的高细胞密度培养物。如下文所述对反应器进行搅拌、充气、控制温度和pH。在消耗了培养基中提供的初始底物后，分别向方法中连续补料氨和葡萄糖作为氮源和碳源。
培养基的组成和制备如下：
13.3g/L KH2PO4、1.7g/L柠檬酸、60mg/L柠檬酸Fe(III)、40g/L D-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/L MgSO4·7H2O和10mL/L矿物质溶液。
预先制备矿物质溶液如下：
1.5g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L H3BO3、0.25g/L NaMoO4·2H2O、0.25g/L CoCl2·6H2O、0.15g/L CuCl2·2H2O、0.84g/L EDTA、1g/L Na2PO4·2H2O。
为了阻止沉淀，根据特定规程制备初始培养基：作为溶液顺序添加KH2PO4、柠檬酸Fe(III)、矿物质溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至约二分之一终体积。在高压蒸汽灭菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液调节pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的无菌溶液。加入无菌蒸馏水，调节生物反应器中的终体积(1L)。上述溶液分别被过滤(0.2μm)灭菌。
补料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡剂(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。
对于两种培养物都提供50mL对数生长期的摇瓶培养物的接种。用来自新鲜划线的VD琼脂平板，并预先培养至对数后期(37℃，250rpm，8h)的所述全细胞催化剂的单菌落，接种VD培养基(50mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)。
接种时的初始方法参数如下：25℃，空气流速1.5L/min(1.5VVM)，搅拌速度800rpm，pH 6.8。在培养过程中，通过pO2/震荡速率控制环路(pO2/agitation ratecontrol loop)和pO2/空气流比例控制环路(pO2/air flow ration control loop)，保持溶解的氧浓度≥20％饱和，至生物过程结束时(接近0％)，而生物反应器的能力达到最大值(搅拌速度2000rpm，充气3L/min)。
在整个过程中，使用pH传感器控制型外部泵，保持pH为6.8，所述泵在pH降至低于6.8时向生物反应器提供氨溶液脉冲。
在耗尽初始培养基中存在的葡萄糖后，观察到pO2和pH水平的明显升高(进入方法约10-12h)。此时，开始用50％(w/v)葡萄糖补料，并手动调节至接近指数曲线(补料开始使用0.1mL/min，在24h周期结束时使用0.6mL/min)。可以通过底物供应控制方法；当葡萄糖浓度保持在动态0时，葡萄糖溶液流控制了培养物的呼吸速率。以该方式可以成功的克服关于供氧和热传递的技术限制。
在补料期开始6小时后，通过添加0.05mM IPTG(Sigma Aldrich，Germany)诱导大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E培养物中的蛋白质YliI表达。
在补料期开始6小时后，通过添加0.1mM IPTG(Sigma Aldrich，Germany)诱导大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC培养物中的蛋白质DeoC表达。
方法的总时长是34-42h，获得了水平在200至240g/L之间的生物质湿重。
将大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E的高密度培养物冷却至15℃，保持在轻转速和充气的反应器(400rpm，0.5L/min)中直到用于反应(5h)。
将大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培养物保持在生物反应器中，以800rpm搅拌。将温度升高至37℃，用可编程的泵向反应混合物中加入56.6g乙酰氧基乙醛和120mL水稀释的乙醛(45.4g)。在30分钟内，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的总量。如下表所述，在3小时实践跨度内连续添加乙醛：
在反应过程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反应器的传感器依赖性pH校正功能，将pH保持在5.8。在反应3h后，从反应器中去除一些反应混合物，留下1L反应混合物(在37℃下以800rpm搅拌)。将预热至37℃的大肠杆菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E的高密度培养物0.5L加入到反应混合物中，并提供充气(1L/min)。保持反应混合物6小时，在此期间，向混合物中加入0.1mL/min甘油，并用12.5％(v/v)氨水溶液维持pH在5.8。
6小时后终止反应。使用5M HCl溶液将pH降低至5，将反应混合物的总体积转移到普通玻璃容器中，与1.5L乙酸乙酯混合，实施“总肉汤”抽提方法。收集有机相，并向水相中再加入1.5L乙酸乙酯。整个方法重复5次。合并收集到的有机相级分，加入200g无水硫酸钠(为了结合乙酸乙酯溶解的水)并将其滤出。然后，通过在37℃低压蒸发去除溶剂。剩余物质(82.6g)是黄色至琥珀色油状物，在RT下与蜂蜜相似。后续分析使用1H NMR和GC-MS验证了乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的结构，层析纯度为52％。反应的整体摩尔产率据估计是42.5％。
实施例25：高细胞密度生产活的全细胞催化剂和从乙酰氧基乙醛和乙醛单罐装 (one pot)顺序生产乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
在使用最大体积2L的实验室生物反应器Infors-ISF100的“补料分批”生物方法中，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分别按实施例1和5所述构建)的高细胞密度培养物。如下文所述对反应器进行搅拌、充气、控制温度和pH。在消耗了培养基中提供的初始底物后，分别向方法中连续补料氨和葡萄糖作为氮源和碳源。
培养基的组成和制备如下：
13.3g/L KH2PO4、1.7g/L柠檬酸、60mg/L柠檬酸Fe(III)、40g/L D-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/L MgSO4·7H2O和10mL/L矿物质溶液。
预先制备矿物质溶液如下：
1.5g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L H3BO3、0.25g/L NaMoO4·2H2O、0.25g/L CoCl2·6H2O、0.15g/L CuCl2·2H2O、0.84g/L EDTA、1g/L Na2PO4·2H2O。
为了阻止沉淀，根据特定规程制备初始培养基：作为溶液顺序添加KH2PO4、柠檬酸Fe(III)、矿物质溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至约二分之一终体积。在高压蒸汽灭菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液调节pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的无菌溶液。加入无菌蒸馏水，调节生物反应器中的终体积(1L)。上述溶液分别被过滤(0.2μm)灭菌。
补料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡剂(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。
对于两种培养物都提供50mL对数生长期的摇瓶培养物的接种。用来自新鲜划线的VD琼脂平板，并预先培养至对数后期(37℃，250rpm，8h)的所述全细胞催化剂的单菌落，接种VD培养基(50mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)。
接种时的初始方法参数如下：25℃，空气流速1.5L/min(1.5VVM)，搅拌速度800rpm，pH 6.8。在培养过程中，通过pO2/震荡速率控制环路(pO2/agitation ratecontrol loop)和pO2/空气流比例控制环路(pO2/air flow ration control loop)，保持溶解的氧浓度≥20％饱和，至生物过程结束时(接近0％)，而生物反应器的能力达到最大值(搅拌速度2000rpm，充气3L/min)。
在整个过程中，使用pH传感器控制型外部泵，保持pH为6.8，所述泵在pH降至低于6.8时向生物反应器提供氨溶液脉冲。
在耗尽初始培养基中存在的葡萄糖后，观察到pO2和pH水平的明显升高(进入方法约10-12h)。此时，开始用50％(w/v)葡萄糖补料，并手动调节至接近指数曲线(补料开始使用0.1mL/min，在24h周期结束时使用0.6mL/min)。可以通过底物供应控制方法；当葡萄糖浓度保持在动态0时，葡萄糖溶液流控制了培养物的呼吸速率。以该方式可以成功的克服关于供氧和热传递的技术限制。
在补料期开始6小时后，通过添加0.1mM IPTG(Sigma Aldrich，Germany)诱导大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd培养物中的蛋白质Gcd表达。
在补料期开始6小时后，通过添加0.2mM IPTG(Sigma Aldrich，Germany)诱导大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC培养物中的蛋白质DeoC表达。
方法的总时长是34-42h，获得了水平在150至200g/L之间的生物质湿重。
将大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd的高密度培养物冷却至15℃，保持在轻转速和充气的反应器(400rpm，0.5L/min)中直到用于反应(5h)。
将592ml大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培养物保持在生物反应器中，以1300rpm搅拌。将温度升高至37℃，制备39.30g乙酰氧基乙醛和100mL水稀释的乙醛(48.46g)。在27分钟内，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的总量。如下表所述，在90分钟实践跨度内用可编程的泵向反应混合物连续添加乙醛溶液：
时间[min] 0 30 60 90
添加的乙醛溶液体积[mL] 0.00 52.50 71.75 77.00
流速[mL/min] 1.750 0.642 0.175 0.000
在反应过程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反应器的传感器依赖性pH校正功能，将pH保持在5.8。在反应30min后，加入另外70mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培养物。在反应2h后，留下的735mL反应混合物在37℃下以1400rpm搅拌。GC-FID分析显示：在反应结束时，存在浓度为75.6/L的乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。
将183mL预热至37℃的大肠杆菌BL21(DE3)pET30/Gcd的高密度培养物加入到反应混合物中，并提供充气(1.4L/min)。分别加入MgCl2和PQQ至其终浓度10mM和2μM，保持反应混合物搅拌10min，从而实现用PQQ完全重构Gcd酶。保持反应混合物3小时，在此期间，用12.5％(v/v)氨水溶液维持pH在6.2。在第二步反应开始65min后，将搅拌速度降低至1200rpm，充气流速降低至1.2L/min。在第二步反应开始137min后，再次将搅拌速度降低至1000rpm，充气流速降低至1.0L/min。GC-FID分析显示：在反应结束时，存在浓度为58.6g/L的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。在该步中，根据GC-FID结果计算，从乙酸((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯转化为乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的转化产率高于95％。
3小时后终止反应，使用5M磷酸溶液将pH降低至4.0，将反应混合物的总体积转移到普通玻璃容器中，其中加入200g/L Na2SO4，再用5M磷酸将pH校正为4.0，与920mL乙酸乙酯混合(1:1)，实施“总肉汤”抽提方法。收集有机相，并向水相中再加入920mL乙酸乙酯。整个方法重复5次。合并收集到的有机相级分，加入～150g无水硫酸镁(为了从乙酸乙酯相中去除水)并将其滤出。然后，通过在40℃低压蒸发去除溶剂。剩余物质(51.1g)是黄色至琥珀色油状物，在RT下与蜂蜜类似，所述物质是使用1H NMR和GC-MS来分析的，所述1H NMR和GC-MS验证了乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的结构，层析纯度(GC-FID)为78.6％。两步顺序酶促反应的整体摩尔产率据计算为81.6％。
实施例26：高细胞密度生产活的全细胞催化剂和从乙酰氧基乙醛和乙醛单罐装 (one pot)同时生产乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯
在使用最大体积2L的实验室生物反应器Infors-ISF100的“补料分批”生物方法中，制备活的全细胞催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd(按实施例6所述制备)的高细胞密度培养物。如下文所述对反应器进行搅拌、充气、控制温度和pH。在消耗了培养基中提供的初始底物后，分别向方法中连续补料氨和葡萄糖作为氮源和碳源。
培养基的组成和制备如下：
13.3g/L KH2PO4、1.7g/L柠檬酸、60mg/L柠檬酸Fe(III)、40g/L D-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/L MgSO4·7H2O和10mL/L矿物质溶液。
预先制备矿物质溶液如下：
1.5g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L H3BO3、0.25g/L NaMoO4·2H2O、0.25g/L CoCl2·6H2O、0.15g/L CuCl2·2H2O、0.84g/L EDTA、1g/L Na2PO4·2H2O。
为了阻止沉淀，根据特定规程制备初始培养基：作为溶液顺序添加KH2PO4、柠檬酸Fe(III)、矿物质溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至约二分之一终体积。在高压蒸汽灭菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液调节pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的无菌溶液。加入无菌蒸馏水，调节生物反应器中的终体积(1L)。上述溶液分别被过滤(0.2μm)灭菌。
补料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡剂(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。
对于两种培养物都提供50mL对数生长期的摇瓶培养物的接种。用来自新鲜划线的VD琼脂平板，并预先培养至对数后期(37℃，250rpm，8h)的所述全细胞催化剂的单菌落，接种VD培养基(50mL；10g/L bacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/L NaCl，4g/L NaH2PO4·2H2O，用1M NaOH调节pH至pH＝7.0)。
接种时的初始方法参数如下：25℃，空气流速1.5L/min(1.5VVM)，搅拌速度800rpm，pH 6.8。在培养过程中，通过pO2/震荡速率控制环路(pO2/agitation ratecontrol loop)和pO2/空气流比例控制环路(pO2/air flow ration control loop)，保持溶解的氧浓度≥20％饱和，至生物过程结束时(接近0％)，而生物反应器的能力达到最大值(搅拌速度2000rpm，充气3L/min)。
在整个过程中，使用pH传感器控制型外部泵，保持pH为6.8，所述泵在pH降至低于6.8时向生物反应器提供氨溶液脉冲。
在耗尽初始培养基中存在的葡萄糖后，观察到pO2和pH水平的明显升高(进入方法约10-12h)。此时，开始用50％(w/v)葡萄糖补料，并手动调节至接近指数曲线(补料开始使用0.1mL/min，在24h周期结束时使用0.6mL/min)。可以通过底物供应控制方法；当葡萄糖浓度保持在动态0时，葡萄糖溶液流控制了培养物的呼吸速率。以该方式可以成功的克服关于供氧和热传递的技术限制。
在补料期开始6小时后，通过添加0.1mM IPTG(Sigma Aldrich，Germany)诱导大肠杆菌BL21(DE3)pET30/DeoC+Gcd培养物中的蛋白质DERA和Gcd表达。
方法的总时长是34-42h，获得了水平在150至200g/L之间的生物质湿重。
将690mL大肠杆菌BL21(DE3)pET30a/DeoC+Gcd的高密度培养物保持在生物反应器中，以1300rpm搅拌。将温度升高至37℃，提供充气(1.0L/min)，并且制备32.67g乙酰氧基乙醛和100mL水稀释的乙醛(37.00g)。分别加入MgCl2和PQQ至其终浓度为10mM和5μM，保持搅拌混合物10min，从而实现用PQQ完全重构Gcd酶。在35分钟内，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的总量。如下表所述，在60分钟的时间跨度内用可编程的泵向反应混合物连续添加乙醛溶液：
时间[min] 0 30 60
添加的乙醛溶液体积[mL] 0.00 60.00 80.00
流速[mL/min] 2.000 0.667 0.000
在反应过程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反应器的传感器依赖性pH校正功能，将pH保持在6.2。保持反应混合物3.5h，在此期间，用12.5％(v/v)氨水溶液维持pH在6.2。GC-FID分析显示：在反应结束时，存在浓度为46.1g/L的乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯。
3.5小时后终止反应，使用5M磷酸溶液将pH降低至4.0，将反应混合物的总体积转移到普通玻璃容器中，其中加入200g/L Na2SO4，再用5M磷酸将pH校正为4.0，与800mL乙酸乙酯混合(1:1)，实施“总肉汤”抽提方法。收集有机相，并向水相中再加入800mL乙酸乙酯。整个方法重复5次。合并收集到的有机相级分，加入～150g无水硫酸镁(为了从乙酸乙酯相中去除水)并将其滤出。然后，通过在40℃低压蒸发去除溶剂。剩余物质(34.2g)是黄色至琥珀色油状物，在RT下与蜂蜜类似，所述物质是使用1H NMR和GC-MS来分析的，所述1H NMR和GC-MS验证了乙酸((2S,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基酯的结构，层析纯度(GC-FID)为76.3％。两步同时酶促反应的整体摩尔产率据计算为59.9％。
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Claims (19)

1.用于制备式(I)的化合物
或其可药用的盐或立体异构体的方法，
其中
R1独立于R2表示H、X、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3；和
R2独立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；
或R1和R2都表示X或O((CH2)nCH3)；
其中
上述任一个CH2或CH3基团可任选地被X、(CH2)n-CH3、C6-10芳基或O-(CH2)n-CH3另外取代；
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
所述方法包括使式(II)的非天然内半缩醛化合物，
其中R1和R2的定义如上，与醛糖1-脱氢酶接触，
其中所述醛糖1-脱氢酶是Ylil醛糖脱氢酶或mGDH的葡萄糖脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述芳基是苯基。
3.根据权利要求1的方法，其中醛糖1-脱氢酶选自由脱氢酶编码基因编码的脱氢酶，所述脱氢酶编码基因由SEQ ID NO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一条核苷酸序列构成；或者由以下任一条氨基酸序列定义的脱氢酶：SEQ ID NO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62。
4.根据权利要求1的方法，其中2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC4.1.2.4)用于制备式(II)的化合物。
5.根据权利要求1的方法，其中醛糖1-脱氢酶，任选地以及DERA酶，独立地包含在活的全细胞、失活的全细胞、均质化的全细胞或无细胞提取物中；或者是纯化的、固定的和/或处于胞外表达的蛋白质的形式。
6.根据权利要求4的方法，其中两种所述的酶，即，DERA和醛糖1-脱氢酶，都由一个或多个细胞表达，其中细胞类型选自细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
7.根据权利要求4的方法，还存在吡咯并喹啉醌(PQQ)。
8.根据权利要求7的方法，其中通过选自以下的手段实现吡咯并喹啉醌(PQQ)的存在：
(I)从外部添加PQQ；
(II)使用不仅存在脱氢酶活性，还具有内在的PQQ生物合成能力的宿主生物；和
(III)使用不具有内在的PQQ生物合成能力，但经过遗传改造表达PQQ合成相关基因簇的微生物。
9.根据权利要求8的方法，其中，根据手段(III)使用的微生物经过遗传改造，从而表达PQQ合成编码基因，所述编码基因包含在SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列内或由SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列组成；或者表达编码SEQ ID NO.12、13、14、15、16、18、19、20、21和22的任一条氨基酸序列的PQQ-合成基因。
10.根据权利要求1的方法，还包括将所述化合物(I)置于足以制备抑制素或其可药用的盐的条件下，任选地使抑制素产物成盐、酯化或立体异构选择性地拆分。
11.根据权利要求10的方法，其中，抑制素选自洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀和达伐他汀，及其可药用的盐。
12.包含2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)酶和醛糖1-脱氢酶的反应体系，所述反应体系能够或被安排用于将式(IX)的化合物与乙醛转化为式(I)的化合物，
其中，R表示式(I)的R1-CH-R2部分，R1和R2如权利要求1-2的任一项中所定义，
其中，R1和R2如前定义；
其中所述醛糖1-脱氢酶是Ylil醛糖脱氢酶或mGDH的葡萄糖脱氢酶。
13.根据权利要求12的反应体系，其中两种所述的酶，即，DERA和醛糖1-脱氢酶，都由一个或多个细胞表达，其中细胞类型选自细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
14.根据权利要求12的反应体系，还存在吡咯并喹啉醌(PQQ)。
15.根据权利要求14的反应体系，其中通过选自以下的手段实现吡咯并喹啉醌(PQQ)的存在：
(I)从外部添加PQQ；
(II)使用不仅存在脱氢酶活性，还具有内在的PQQ生物合成能力的宿主生物；和
(III)使用不具有内在的PQQ生物合成能力，但经过遗传改造表达PQQ合成相关基因簇的微生物。
16.根据权利要求15的反应体系，其中，根据手段(III)使用的微生物经过遗传改造，从而表达PQQ合成编码基因，所述编码基因包含在SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列内或由SEQ ID NO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一条核苷酸序列组成；或者表达编码SEQ ID NO.12、13、14、15、16、18、19、20、21和22的任一条氨基酸序列的PQQ-合成基因。
17.根据权利要求12-16的任一项的反应体系的用于制备式(I)的化合物的用途，其中式(I)如权利要求1-2的任一项定义，以及任选的还用于制备抑制素或其可药用的盐的用途。
18.微生物用于由权利要求1中所定义的式(II)化合物制备式(I)的化合物
或其可药用的盐或立体异构体的用途，其中
R1独立于R2地表示H、X、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3；和
R2独立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；
或者R1和R2都表示X或O((CH2)nCH3)；
其中
任一种上述CH2或CH3基可任选地被X、(CH2)n-CH3、C6-10芳基、O-(CH2)n-CH3另外取代；
X表示F、Cl、Br或I；
n代表0至10的整数；
m代表0至3的整数；
任选地进一步加工式(I)的化合物以制备抑制素；
其中微生物包含权利要求1中所定义的醛糖1-脱氢酶，并且其
(i)选自变形细菌(proteobacteria)、放线菌(actinomycetales)、miobacteriaceae、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enteorobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、根瘤菌属(Rhizobioum)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、拉恩氏菌属(Rahnella)和异常球菌属(Deinococcus)的细菌来源；或
(ii)是大肠杆菌，所述的大肠杆菌经过遗传改造以能够表达用于提供吡咯并喹啉醌(PQQ)的基因簇的基因，或添加了外源性PQQ以被补充。
19.权利要求18的用途，其中所述芳基是苯基。
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