JP5954539B2 - １−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを選択的に製造する方法に関する。１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。

非特許文献１と非特許文献２は、互変異性があり水溶液中でラセミ化を生じる、ピペリジン骨格もしくはピロリジン骨格をもつオキソカルボン酸エステルから、パン酵母を用いた立体選択的なケトン還元により、特定の立体異性体のヒドロキシカルボン酸エステルの合成を開示している。具体的には１−ブトキシカルボニル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステから１−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの合成方法が報告されている。
しかしながら、使用されている微生物はパン酵母であり、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルについての記載はない。パン酵母は、食品用に使用される微生物で供雑物も多いことが推測され、反応後の精製などの後処理を考慮すると工業的な製造方法とは言いがたい。また、１−ブトキシカルボニル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの立体配置は（３Ｒ，４Ｓ）の立体異性体の１種類に限定されている。
これらのことより、工業的に有効な微生物学的方法を用いたケトン還元により、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを製造する方法は知られていない。

「ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティー、パーキン・トランザクションズ１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １）」（英国）、１９９８年、ｐ．３６７３〜３６８３ 「テトラヘドロン；アシンメトリー（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ；Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）」（オランダ）、１９９３年、第４巻、ｐ．６２５〜６２８

本発明者らは、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの４位のケトン還元について検討を行った。１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの４位のケトンを非立体選択的に還元した場合、４種の異性体が生成する。すなわち、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、下記一般式（１）と下記一般式（１’）に記載のようにケト−エノール互変異性のある化合物であり、水溶液中でラセミ化が生じる。本発明者らは、この１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから、立体選択性の高いケトン還元酵素を用いることで、理論収率１００％で特定の立体配置の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを合成することができると考えた。

（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示し、そして＊は不斉炭素を示す。）
しかしながら、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは生体内に存在する基質ではないため、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを基質とする立体選択性の高いケトン還元酵素、及びそのような酵素を有する微生物は全く知られていなかった。
従って、本発明の目的は、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを、立体選択的に製造することのできる微生物又はケトン還元酵素を提供することである。

本発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、又はメナディオンレダクターゼ若しくはグルコースデヒドロゲナーゼが、立体選択的にケトン還元を行い、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを著量生成し、蓄積する能力を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］下記一般式（１）

（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示す）で表される１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに、（ｉ）クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、又は前記微生物の調製物、又は
（ii）１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素、
を作用させ、立体選択的にケトン還元を行うことを特徴とする、
下記一般式（２）

（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示し、そして＊は不斉炭素を示す）
で表される１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［２］前記ケトン還元活性を有する酵素が、メナディオンレダクターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼである、［１］に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［３］前記メナディオンレダクターゼがキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物由来であり、グルコースデヒドロゲナーゼがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来である、［２］に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［４］前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）である、［１］又は［３］に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［５］前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）又はバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）である、［１］又は［３］に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［６］前記クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物がクルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）である、［１］に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法、
［７］１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体選択的ケトン還元用メナディオンレダクターゼ、
［８］１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体選択的ケトン還元用グルコースデヒドロゲナーゼ、
［９］受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５である、クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０、
［１０］受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４０２であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＭＲ、
［１１］受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４０１である、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＧＤＡ、
［１２］メナディオンレダクターゼの１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体選択的ケトン還元酵素としての使用、及び
［１３］グルコースデヒドロゲナーゼの１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体選択的ケトン還元酵素としての使用、
に関する。

本発明の製造方法によれば、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルにクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、又はメナディオンレダクターゼ若しくはグルコースデヒドロゲナーゼを作用させることにより、立体選択的に１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを得ることができる。

［１］１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法
本発明の前記一般式（２）で表される１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法は、前記一般式（１）で表される１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに、（ｉ）クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、若しくは前記微生物の調製物、又は（ii）１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素を作用させ、立体選択的にケトン還元を行うことを特徴とするものである。

《１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステル》
本発明の製造方法によって製造される前記一般式（２）で表される１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、前記一般式（１）で表される１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルのケトン基を還元することによって得ることができる。ここで、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは２つの不斉炭素を有するため、ｔｒａｎｓ−（３Ｒ，４Ｒ）、ｔｒａｎｓ−（３Ｓ，４Ｓ）、ｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）、又はｃｉｓ−（３Ｓ，４Ｒ）の４つの異性体が存在する。本発明の製造方法では、これらの異性体を立体選択的に製造することができる。

１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルにおける、アルキル基は炭素数１〜４の直鎖、又は分岐鎖のアルキル基であり、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基（ｎ−プロピル基、又はイソプロピル基）、又はブチル基（ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基）を挙げることができる。

《微生物》
本発明における微生物としては、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを著量生成し、蓄積する能力を有する、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であればその種及びその起源は何ら問わない。

（クルトバクテリウム属に属する微生物）
本発明における微生物として好ましくは、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を挙げることができる。更に好ましくは、クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）を挙げることができる。本菌株は平成２４年７月４日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに上記受託番号で国内寄託されている。

本発明において使用することのできるクルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的性質（＋は陽性、−は陰性を表す）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．８〜０．９μｍ
（３）長さ：１．５〜２．０μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
１−２．コロニー形態（＋は陽性、−は陰性を表す）
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地、３０℃ ２４時間
（１）直径：１．０ｍｍ
（２）色調：黄色
（３）形：円形
（４）隆起状態：レンズ状
（５）周縁：全縁
（６）表面の形状など：スムーズ
（７）透明度：不透明
（８）粘調度：バター様
１−３．生理学的性質（＋：陽性、−：陰性）
（１）グラム染色：＋
（２）生育の範囲 温度
３７℃：＋
４５℃：−
（３）カタラーゼ反応：＋
（４）オキシダーゼ反応：−
（５）グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：＋／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
（７）硝酸塩還元：−
（８）ピラジンアミダーゼ：＋
（９）ピロリドニルアリルアミダーゼ：＋
（１０）アルカリフォスファターゼ：＋
（１１）β−グルクロニダーゼ：−
（１２）β−ガラクトシダーゼ：＋
（１３）α−グルコシダーゼ：＋
（１４）Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：＋
（１５）エスクリン（β−グルコシダーゼ）：＋
（１６）ウレアーゼ：−
（１７）ゼラチン加水分解：−
（１８）ブドウ糖：＋
（１９）リボース：−
（２０）キシロース：−
（２１）マンニトール：−
（２２）マルトース：−
（２３）乳糖：−
（２４）グリコーゲン：−
（２５）カタラーゼ：＋
（２６）嫌気条件下での生育：−
（２７）でんぷんの加水分解：−
（２８）カゼインの加水分解：−

１−４．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ７．０）に対する相同性検索の結果、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、クルトバクテリウム・シトレウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｃｉｔｒｅｕｍ）ＤＳＭ２０５２８株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ７７４３６〕の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し相同率９９．９％の最も高い相同性を示した。また、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果においても、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の１６S ｒＤＮＡ塩基配列に対して高い相同性を示し、クルトバクテリウム・シトレウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｃｉｔｒｅｕｍ）ＤＳＭ２０５２８株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ７７４３６〕の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し相同率９９．９％の最も高い相同性を示した。
本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ７．０）に対する相同性検索上位１０株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統解析の結果、本菌株はクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の種で形成されるクラスター内に含まれたが、本菌株はクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のクラスター内において、いずれの既知種ともやや異なり、独立した分子系統学的位置を示した。
形態的性質とコロニーの形状、生理学的性質においては、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の性状に類似するものの、完全に一致する既知種は見当たらなかった。
以上のように、本菌株はクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に含まれると考えられるが、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果及び生理・生化学性状試験の結果は、ともに本菌株がクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の既知種とは異なることを示唆した。
これらのことから、本菌株をクルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．）であると判定した。

前記クルトバクテリウム属の微生物によって主反応生成物として得られる１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体異性体は、ｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）である。また、その立体異性体の立体選択率は７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上が更に好ましく、９０％以上が最も好ましい。なお、前記立体選択率の百分率は、ＨＰＬＣ分析ピークの面積百分率である。

（キャンディダ属に属する微生物）
本発明における微生物として好ましくは、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を挙げることができ、より好ましくはキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）であり、更に好ましくは、キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０９６０株を挙げることができる。キャンディダ属に属する微生物は、後述のように１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素、すなわちメナディオンレダクターゼを有している。このメナディオンレダクターゼにより、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを立体選択的にケトン還元することができる。

前記キャンディダ属の微生物によって主反応生成物として得られる１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体異性体は、ｃｉｓ−（３Ｓ，４Ｒ）である。また、その立体異性体の立体選択率は８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい。前記立体選択率の百分率は、ＨＰＬＣ分析ピークの面積百分率である。

（バチルス属に属する微生物）
本発明における微生物として好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を挙げることができ、更に好ましくは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、更に好ましくはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３株を挙げることができる。また、別のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物として、好ましくはバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）を挙げることができる。バチルス属に属する微生物は、後述のように１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素、すなわちグルコースデヒドロゲナーゼを有している。このグルコースデヒドロゲナーゼにより、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを立体選択的にケトン還元することができる。

前記バチルス属の微生物によって主反応生成物として得られる１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体異性体は、ｔｒａｎｓ体、又はｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）である。また、立体異性体の立体選択率は８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい。前記立体選択率の百分率は、ＨＰＬＣ分析ピークの面積百分率である。

《立体選択的ケトン還元活性を有する酵素》
本発明に用いる立体選択的ケトン還元活性を有する酵素は、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する限りにおいて、特に限定されるものではないが、メナディオンレダクターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

（メナディオンレダクターゼ）
本発明におけるメナディオンレダクターゼとしては、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する限りにおいて、その由来は限定されるものではないが、好ましくはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属由来メナディオンレダクターゼを、更に好ましくはキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）由来メナディオンレダクターゼを、最も好ましくはキャンディダ・マセドニエンシスＮＢＲＣ０９６０株由来のメナディオンレダクターゼを挙げることができる。
メナディオンレダクターゼとしては、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する限りにおいて、市販の酵素であってもよい。

本発明で使用することのできるキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）由来メナディオンレダクターゼについて説明する。キャンディダ属由来メナディオンレダクターゼは、メナディオン（別称２−メチル−１，４−ナフトキノン）の１位のケトンを還元する酵素タンパク質であり、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質である。

また、本発明で使用されるメナディオンレダクターゼは、メナディオンレダクターゼ活性を有し、且つ１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素タンパク質であれば限定されないが、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるものでもよく、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１つ若しくは複数（一般的には数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、且つメナディオンレダクターゼ活性を有する酵素タンパク質でもよい。

本発明で使用されるメナディオンレダクターゼをコードする遺伝子は、配列番号３で示される塩基配列を含み、前述のメナディオンレダクターゼの性質を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡでもよい。本発明においては、キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）からクローニングされたメナディオンレダクターゼ遺伝子を用いたが、メナディオンレダクターゼ遺伝子はどのような生物からクローニングされたものであってもよい。
本発明で使用されるメナディオンレダクターゼ遺伝子は、該遺伝子の塩基配列において１つ若しくは複数（一般的に数個）のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、かつメナディオンレダクターゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を含むものであってもよい。更に、本発明で使用されるメナディオンレダクターゼ遺伝子は、上記メナディオンレダクターゼをコードする遺伝子と標準的な条件下でハイブリダイズする塩基配列若しくは該塩基配列を含む組換えＤＮＡ配列も含み得る。

別の側面において、本発明で使用されるメナディオンレダクターゼをコードする遺伝子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数（一般的には数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、メナディオンレダクターゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子でもよい。

本発明は、微生物におけるメナディオンレダクターゼをコードする単離ＤＮＡ配列を提供する。本発明の前記ＤＮＡは、対象となる酵素タンパク質をコードする遺伝子の発現に関与するプロモーター及びターミネーターなどの調節配列を含む塩基配列を意味する。また、メナディオンレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列の５’−及び３’−非翻訳領域の間に含まれるｃＤＮＡを意味する。更に本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、並びに、前記ベクターを含有する形質転換体を提供する。
本発明に用いられるメナディオンレダクターゼの遺伝子、組換え発現ベクター及び組換え微生物は、下記の手順によって得ることができる。
（１）本発明のメナディオンレダクターゼを提供しうる微生物からの染色体ＤＮＡの単離、及びこの染色体ＤＮＡによる遺伝子ライブラリーの構築、
（２）コロニー又はプラークハイブリダイゼーション、ＰＣＲクローニング、インバースＰＣＲ、サザンブロットハイブリダイゼーションなどによる、染色体ＤＮＡからのメナディオンレダクターゼ遺伝子のクローニング、
（３）得られたメナディオンレダクターゼ遺伝子の塩基配列の決定及びメナディオンレダクターゼ遺伝子を効率的に含有し発現する組換え発現ベクターの構築、
（４）形質転換、形質導入、接合及び電気穿孔による、組換え発現ベクター上又は染色体上にメナディオンレダクターゼ遺伝子を有する組換え微生物の作成。

本発明のメナディオンレダクターゼをコードするＤＮＡの単離又はクローニングに用いる技術は、当技術分野では公知であり、これにはゲノムＤＮＡからの単離が含まれる。このようなゲノムＤＮＡからの本発明のＤＮＡ配列のクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって行うことができる。

メナディオンレダクターゼ遺伝子のクローニングを行うためには、メナディオンレダクターゼのアミノ酸配列に関する知識が必要であり、従来の方法によってメナディオンレダクターゼタンパク質を精製し、部分アミノ酸配列を決定することにより得ることができる完全なアミノ酸配列を決定する必要はなく、適切なアミノ酸配列が同定されたら、前記の部分アミノ酸配列に関する情報に基づき、ＰＣＲ用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチドを合成することができる。本発明において、ＰＣＲによるメナディオンレダクターゼ遺伝子のクローニングを用いるプライマーは、キャンディダ属に属する微生物、好ましくはキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０９６０のアミノ酸配に基づく。メナディオンレダクターゼに関するＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ配列）は、前記プライマー及びキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０９６０の染色体ＤＮＡのテンプレートを用いるＰＣＲ増幅によって精製され得る。増幅されたＤＮＡ断片は、キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０９６０のメナディオンレダクターゼの全体をコードするゲノム断片をクローニングするためのプローブとして用いることができる。

コード領域に加えてプロモーター又はターミネーターなどの調節配列を含む遺伝子全体は、上記のＰＣＲによって得られた部分ＤＮＡ断片を標識した後にプローブとして用いることにより、適切な宿主内でファージベクター又はプラスミドベクター内に作成したゲノムライブラリーのスクリーニングによって染色体からクローニングすることができる。また、ゲノムＤＮＡを制限酵素処理した後、自己環化させた遺伝子断片に対してインバース−ＰＣＲを行うことにより、部分ＤＮＡ断片の上流及び下流を増幅し、配列を解読、連結することにより、遺伝子全体を得ることができる。一般にライブラリーの作成、及びシークエンシング、制限酵素処理、連結などの遺伝子操作には、宿主株としての大腸菌、及び大腸菌ベクター、λファージベクターなどのファージベクター、プラスミドベクター又は酵母ベクターがしばしば用いられる。プラスミド又はファージライブラリーからの望ましいクローンの同定は、望ましい遺伝子が適切なストリンジェンシー条件化で望ましい遺伝子の一部を有するプローブとハイブリダイズすることによってなされる。

目的遺伝子の塩基配列は、ジデオキシチェーンターミネーター法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７４巻、５４６３〜５４６７頁、１９７７年）などの周知の方法によって決定できる。本発明の単離されたＤＮＡ配列を、技術分野で周知の方法に従って、異なる属又は種の他の菌株から、メナディオンレダクターゼ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡを同定及びクローニングするために用いてもよい。本発明では、メナディオンレダクターゼをコードする配列を含む組換えＤＮＡ、好ましくはベクター及び／又はプラスミドに関する。前記の組換えＤＮＡのオープンリーディングフレームに加えて、プロモーター又はターミネーターなどの調節領域を含んでもよい。

メナディオンレダクターゼをコードする塩基配列の発現に必要又は有利なすべての構成要素を含む適切な転写及び翻訳調節要素有する発現ベクターの作成に用いるために、同業者に周知の方法を用いてもよい。メナディオンレダクターゼをコードする配列の翻訳をより効率的に行えるように、特定の転写開始及び転写終結シグナルを用いてもよい。メナディオンレダクターゼをコードする単離ＤＮＡ配列は、ポリペプチドの発現をもたらすような様々な様式で操作できる。発現ベクターによっては、前記メナディオンレダクターゼをコードする塩基配列をベクターに挿入する前に操作することが望ましい又は必要と思われる。クローニング法を用いて塩基配列を改変するための技法は当技術分野では公知である。メナディオンレダクターゼをコードする配列を含有及び発現させるためには、様々な宿主／ベクター系を用いることができる。

これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドベクターによる形質転換を受けた細菌などの微生物、酵母発現ベクターによる形質転換を受けた酵母、ウイルス発現ベクター若しくは細菌発現ベクターによる形質転換を受けた植物細胞系、又は、動物細胞が含まれるが、これらに制限されない。メナディオンレダクターゼの使用目的に応じて発現ベクターを選択してもよい。たとえば大量のメナディオンレダクターゼが必要な場合には、導入したＤＮＡの高レベルの発現をもたらすベクターを用いるとよい。このようなベクターには、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＰＬ−Ｌａｍｂｄａ、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＴ−２１−ｄ（＋）などの大腸菌クローニング及び発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。メナディオンレダクターゼをコードする塩基配列により形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件化で培養することが可能である。

（メナディオンレダクターゼの調製）
本発明で使用されるメナディオンレダクターゼは、例えばキャンディダ属に属する微生物に含まれているものでもよく、その微生物から分離及び精製されたものでもよい。また、前記メナディオンレダクターゼを含むベクターにより形質転換された組換え微生物に含まれているものでもよく、その組換え体から分離及び精製されたメナディオンレダクターゼでもよい。具体的には、後述の［ｉ］培養された微生物を含む培養液、［ii］培養液から回収した微生物、又は［iii］前記微生物の調製物、例えば、破砕物、破砕物から固形分を除いた無細胞抽出物、粗酵素、又は精製酵素を用いることができる。

前記メナディオンレダクターゼによって主反応生成物として得られる１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体異性体は、ｃｉｓ−（３Ｓ，４Ｒ）である。また、その立体異性体の立体選択率は８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい。前記立体選択率の百分率は、ＨＰＬＣ分析ピークの面積百分率である。

（グルコースデヒドロゲナーゼ）
本発明におけるグルコースデヒドロゲナーゼとしては、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する限りにおいて、その由来は限定されるものではないが、好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来グルコースデヒドロゲナーゼを、更に好ましくはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ−２と称することがある）を挙げることができる。更に、別の好ましいグルコースデヒドロゲナーゼとして、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ−１と称することがある）を挙げることができる。
グルコースデヒドロゲナーゼとしては、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する限りにおいて、市販の酵素であってもよい。具体的には、ＧＤＨ−１としては、天野エンザイム社製のバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来グルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。

本発明で使用されるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来グルコースデヒドロゲナーゼについて説明する。バチルス・メガテリウム由来グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースを酸化してグルコン酸を生成する酵素タンパク質であり、例えば配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質である。
また、本発明で使用されるＧＤＨ−２は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、且つ１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに対する立体選択的ケトン還元活性を有する酵素タンパク質であれば限定されないが、例えば配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるものでもよく、配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１つ若しくは複数（一般的には数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素タンパク質でもよい。

本発明で使用されるＧＤＨ−２をコードする遺伝子は配列番号７で示される塩基配列を含み、前述のグルコースデヒドロゲナーゼの性質を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡでもよい。本発明においては、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からクローニングされたＧＤＨ−２遺伝子を用いたが、ＧＤＨ−２遺伝子はどのような生物からクローニングされたものであってもよい。

本発明で使用されるＧＤＨ−２遺伝子は、該遺伝子の塩基配列において１つ若しくは複数（一般的に数個）のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を含むものであってもよい。更に、本発明で使用されるＧＤＨ−２遺伝子は、上記ＧＤＨ−２をコードする遺伝子と標準的な条件下でハイブリダイズする塩基配列若しくは該塩基配列を含む組換えＤＮＡ配列も含み得る。

別の側面において、本発明で使用されるＧＤＨ−２をコードする遺伝子は、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数（一般的には数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子でもよい。

本発明は、微生物におけるＧＤＨ−２をコードする単離ＤＮＡ配列を提供する。本発明の前記ＤＮＡは、対象となる酵素タンパク質をコードする遺伝子の発現に関与するプロモーター及びターミネーターなどの調節配列を含む塩基配列を意味する。また、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列の５’−及び３’−非翻訳領域の間に含まれるｃＤＮＡを意味する。更に本発明は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、並びに、前記ベクターを含有する形質転換体を提供する。

本発明に用いられるＧＤＨ−２の遺伝子、組換え発現ベクター及び組換え微生物は、キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）由来メナディオンレダクターゼの説明で記載したものと同様の手順によって得ることができる。

（グルコースデヒドロゲナーゼの調製）
本発明で使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、例えばバチルス属に属する微生物に含まれているものでもよく、その微生物から分離及び精製されたものでもよい。また、前記グルコースデヒドロゲナーゼを含むベクターにより形質転換された組換え微生物に含まれているものでもよく、その組換え微生物から分離及び精製されたグルコースデヒドロゲナーゼでもよい。具体的には、後述の［ｉ］培養された微生物を含む培養液、［ii］培養液から回収した微生物、又は［iii］前記微生物の調製物、例えば、破砕物、破砕物から固形分を除いた無細胞抽出物、粗酵素、又は精製酵素を用いることができる。

前記グルコースデヒドロゲナーゼによって主反応生成物として得られる１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの立体異性体に関して、ＧＤＨ−２は、ｔｒａｎｓ体に選択性を示す。またＧＤＨ−１は、ｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）に選択性を示す。
また、立体異性体の立体選択率は８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい。前記立体選択率の百分率は、ＨＰＬＣ分析ピークの面積百分率である。

《微生物の培養方法》
次に、本発明で使用されるクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物又は組換え微生物の培養方法について説明する。前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸、無機窒素、有機酸、又は糖類などを使用することができる。また、必要に応じて、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、又は無機塩類などを添加することもできる。

更に、培養の際に、前記微生物が有する、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを生成する能力を最大限に引き出すために、糖類、有機酸又はアミノ酸を添加して培養することもできる。特に効果が得られる物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、マンニトール、グリセロール、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトース、Ｌ−リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、グルコン酸、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミンなどであり、培地に対して０．１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２．０ｗ／ｖ％である。なお、本明細書で記載するｗ／ｖは質量／容積を、ｖ／ｖは容積／容積を意味する。

前記微生物の培養温度は１０〜３７℃、好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは６．０〜１０．０であり、好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。培養時間は１０時間〜１週間であり、好ましくは１〜３日間であり、より好ましくは１〜２日である。

組換え微生物を培養するための培地は、本発明の微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としては微生物が資化可能なものであればよく、グルコース、マンノース、キシロース、フルクトース、サッカロース、グリセロール、オリゴ糖、多糖類、又はこれらを含有する糖蜜等が挙げられるが、グルコース又はグリセロールが好ましく用いられ、グルコースが更に好ましく用いられる。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はリン酸アンモニウム等の無機酸塩若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等を用いることができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、又は炭酸カルシウム等を用いることができる。ビタミン類としては、ビタミンＢ１２等が挙げられる。

培養は、静置培養、振とう培養、深部通気攪拌培養のいずれで行ってもよいが、静置培養が好ましく用いられる。また、窒素ガスや二酸化炭素等を供給して培養する嫌気的培養を行ってもよい。培養温度は通常１５〜４０℃であり、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやカナマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。培養の進行とともに、酵素生産量も増加していくが、培養の後半には、生育速度の低下とともに、炭素源及び窒素源の消費速度、酵素生産速度も低下し、培養を終了する。炭素源及び窒素源の総添加量、培養時間、菌体の濃度、酵素生産量などから本培養の終了を判断することもできる。

以上のようにして、前記微生物の培養菌体を培養液中に蓄積させ、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの蓄積反応に用いることができる。
［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる蓄積反応に使用してもよいし、
［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に
［iii］微生物の調製物（例えば、破砕物、破砕物から固形分を除いた無細胞抽出物、粗酵素、及び／又は精製酵素など）を反応に使用することもできる。

続いて、前記微生物又はその調製物により、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを生成する反応を行うことができる。この反応は、バッチ式でも、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から１０日間で行うことができる。

上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルと糖類、有機酸、又はアルコール類などを加え、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを系内に蓄積させる反応を開始させることができる。
反応のｐＨは５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜８．０である。反応温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。基質の１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの添加量は、反応液に対して０．１〜１０．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜５．０ｗ／ｖ％である。１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。

一般的に、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステル不斉還元酵素は、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの不斉還元反応において、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルと等量の還元型補酵素（還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（略称ＮＡＤＨ）、又は還元型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（略称ＮＡＤＰＨ）を還元剤として要求するとされている。１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの還元反応後は、補酵素はそれぞれ酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（略称ＮＡＤ^＋）又は酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（略称ＮＡＤＰ^＋）へと変換される。

また、一般的に、補酵素を再生する酵素の供給源として、市販酵素を使用したり、遺伝子組み替えにより補酵素を再生する酵素を生産させることが行われるが、本発明において、補酵素を再生する酵素を添加することなく、糖類、有機酸、アルコール類などを添加するのみで、効率よく１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルへの変換を行うこともできる。

糖類、有機酸、アルコール類などとしては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトースなどの糖類、又はクエン酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類などを挙げることができる。糖類、有機酸、アルコール類などの添加量は、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを還元して１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを生成する反応液に対して０．１〜１５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜１０．０ｗ／ｖ％である。糖類、有機酸、又はアルコール類などの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の糖類、有機酸、又はアルコール類などによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。

１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培地に１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを添加して、微生物の増殖と１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの蓄積反応を同時に行うことができる。

また、上述の［ii］の場合には、上記の培養方法で増殖させた微生物をろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルと糖類、有機酸、アルコール類などを含む生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルと糖類、有機酸、アルコール類などの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。

更に、上述の［iii］の場合には、前記培養方法で増殖させ、回収した微生物の調製物（例えば、破砕物、破砕物から固形分を除いた無細胞抽出物、粗酵素、及び／又は精製酵素）は、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルと糖類、有機酸、及び／又はアルコール類などとを含む水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。あるいは、微生物又はその調製物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。前記微生物又はその調製物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。反応条件は［ｉ］の場合と同様である。

以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、遠心分離などにより微生物を除去した後、溶媒で１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを抽出して、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを回収することができる。粗酵素、又は精製酵素などの調製物を使用した場合などでは微生物除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを回収することもできる。

《作用》
前記のように、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの４位のケトンを非立体選択的に還元した場合、４種の異性体が生成する。すなわち、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、下記一般式（１）と下記一般式（１’）に記載のようにケト−エノール互変異性のある化合物であり、水溶液中でラセミ化が生じる。

（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示し、そして＊は不斉炭素を示す。）
前記１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、通常生体内に存在するエステルではない。例えば、本発明に用いることのできるグルコースデヒドロゲナーゼは、生体内ではグルコースを酸化してグルコン酸を生成する酵素として働いている。このグルコースデヒドロゲナーゼが、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから立体選択的に１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを生成できることは、その対象となる基質の違いから驚くべきことである。
同様に、本発明に用いることのできるメナディオンレダクターゼは、生体内では、メナディオン（別称２−メチル−１，４−ナフトキノン）の１位のケトンを還元する酵素として働いている。メナディオンと、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルとの構造は全く異なるものであり、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルから立体選択的に１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを生成できることは、予想できることではない。
本発明者らは、この他に多数の酵素について、検討を行ったが、立体選択的にケトン還元できた酵素は前記の２つの酵素のみであった。
また、クルトバクテリウム・エスピーは、多数の土壌分離菌から見出したものであるが、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルは、通常生体内に存在するエステルではないため、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを基質として、立体選択的にケトン還元できる酵素を有する微生物属は、非常に少ないものと考えられる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例における培地組成などの諸条件を以下に記載する。
（１）培地［Ａ］
脱塩水１．０Ｌ中にトリプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。

（２）培地［Ｂ］
脱塩水１．０Ｌ中にグルコース５０．０ｇ、コーンスティープリカー５０．０ｇ、酵母エキス３０．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．０に調整した培地。

（３）培地［Ｃ］
脱塩水１．０Ｌ中にトリプトン２０．０ｇ、酵母エキス１０．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。

（４）寒天培地［Ｄ］
脱塩水１．０Ｌ中にトリプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇ、アガロース１５．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。

（５）培地［Ｅ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス５．０ｇ、トリプトン２ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。

（６）培地［Ｆ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス２０．０ｇ、シュクロース２０．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを７．０に調整した培地。

（７）反応液［Ｇ］
１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステル（和光純薬工業製）：５０ｍＭ
ＮＡＤＨ：６０ｍｇ／ｍＬ
ＮＡＤＰＨ：６０ｍｇ／ｍＬ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）：５０ｍＭ

（８）ＨＰＬＣ分析条件（立体選択率の測定）
生成物の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを下記条件で分析した。
カラム：キラルパックＡＤ−ＲＨ（ダイセル化学工業製）４．６×１５０ｍｍ
溶離液Ａ：０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水／メタノール＝８０／２０（ｖ／ｖ）
溶離液Ｂ：０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水／メタノール／アセトニトリル＝５／２０／７５（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：０．５ｍＬ／分
溶離液Ｂグラジエント： ６０％→７０％ １５分
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

（９）立体異性体の保持時間
４種の立体異性体の保持時間は、還元試薬であるソディウムボロハイドライドを用いて、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルを非立体選択的に還元して合成した、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸の４種の立体異性体混合物を用いて確認した。
（９．１）１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの保持時間
立体異性体１［推定立体配置はｔｒａｎｓ−（３Ｒ，４Ｒ）又はｔｒａｎｓ−（３Ｓ，４Ｓ）のいずれか一方である。］：６．６分
立体異性体２［推定立体配置はｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）］：７．２分
立体異性体３［推定立体配置はｃｉｓ−（３Ｓ，４Ｒ）］：８．１分
立体異性体４［推定立体配置はｔｒａｎｓ−（３Ｒ，４Ｒ）又はｔｒａｎｓ−（３Ｓ，４Ｓ）のいずれか一方である。但し、上記立体異性体１の立体配置とは異なる。］：８．７分、
（９．２）１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの保持時間
立体異性体１［推定立体配置はｔｒａｎｓ−（３Ｒ，４Ｒ）又はｔｒａｎｓ−（３Ｓ，４Ｓ）のいずれか一方である。］：６．３分
立体異性体２［推定立体配置はｃｉｓ−（３Ｒ，４Ｓ）］：７．１分
立体異性体３［推定立体配置はｃｉｓ−（３Ｓ，４Ｒ）］：９．６分
立体異性体４［推定立体配置はｔｒａｎｓ−（３Ｒ，４Ｒ）又はｔｒａｎｓ−（３Ｓ，４Ｓ）のいずれか一方である。但し、上記立体異性体１の立体配置とは異なる。］：１０．４分、

（１０）立体選択率の算出
上記分析条件によって得られたそれぞれの立体異性体のピーク面積を用いて、下記の計算式により算出する。
立体選択率（％）＝（立体異性体のピーク面積）／（４種の立体異性体のピーク面積合計）×１００（％）

（１１）ＨＰＬＣ分析条件（基質と反応生成物の定量、反応収率の測定）
カラム：カプセルパックＣ１８ＭＧII（資生堂製）４．６×２５０ｍｍ
溶離液:アセトニトリル／３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＝５０／５０（ｖ／ｖ）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ＝２１０ｎｍ
保持時間
１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステル：６．６分、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステル：１６．６分

《実施例１》
クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの蓄積反応

（１）培養
培地［Ａ］２ｍＬを１０ｍＬ容の試験管に入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この試験管に、寒天培地に維持したクルトバクテリウム・エスピー ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振とう培養し、種培養液とした。
次に、５０ｍＬ三角フラスコに培地［Ａ］１０ｍＬを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、上記前培養液２００μＬを加え、２８℃で２４時間振とう培養を行った。

（２）蓄積反応
上記培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、沈殿物として回収した菌体をリン酸カリウム緩衝液１０ｍＬで縣濁後、グラスビーズで菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収し酵素溶液とした。上記酵素溶液１００μＬを反応液［Ｇ］１ｍＬに添加し、３７℃で３時間、静置反応した。メタノール１ｍＬを添加し、反応を停止した。
ＨＰＬＣにより分析した結果、主反応生成物として１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの立体異性体２を得た。その立体選択率は８５％であった。

《実施例２》
キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ０９６０由来メナディオンレダクターゼ遺伝子のクローニング
（１）キャンディダ・マセドニエンシス ＮＢＲＣ ０９６０の培養
キャンディダ・マセドニエンシス ＮＢＲＣ ０９６０は１５ｍＬの培地［Ｂ］に植菌し、２８℃で３日間振とう培養を行った。培養後、３，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離することにより集菌し、キャンディダ・マセドニエンシス ＮＢＲＣ ０９６０の菌体を得た。

（２）ゲノムＤＮＡの取得
キャンディダ・マセドニエンシス ＮＢＲＣ ０９６０の菌体を少量のＴＥＳ緩衝液（０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（略称ＥＤＴＡ−Ｎａ）、２５％（ｗ／ｖ）シュクロース、ｐＨ７．０）に懸濁後、最終濃度０．５ＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、リゾチーム、プロテアーゼ Ｋを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。その後最終濃度１％のドデシル硫酸ナトリウム（略称ＳＤＳ）を添加し、更にインキュベートすることで細胞破砕液を得た。細胞破砕液に等量のフェノール／クロロホルム溶液（１：１）を加えゆっくりと完全に混合した。その後、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。続いて、再度等量のフェノール／クロロホルム溶液（１：１）を加えゆっくりと完全に混合し、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。これに２倍量のエタノールと最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムを加え、完全に混合し、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿を２０分間真空デシケーターにて乾燥した後、少量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解し、ゲノムＤＮＡを得た。

（３）メナディオンレダクターゼ発現大腸菌株の作成
キャンディダ・マセドニエンシス ＮＢＲＣ ０９６０のゲノムＤＮＡを鋳型にして、センスプライマー（配列番号４）とアンチセンスプライマー（配列番号５）を用いたＰＣＲ法によりメナディオンレダクターゼ遺伝子（配列番号３）を増幅した。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で４分を３５サイクル繰り返すことで行った。ＰＣＲの結果増幅された遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断処理後、同様に処理したｐＥＴ２１ａベクターに挿入することでメナディオンレダクターゼ発現ベクターｐＥＴＭＲを構築した。ｐＥＴＭＲを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、形質転換株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＭＲ（ＮＩＴＥ Ｐ−１４０２）を得た。本菌株は平成２４年８月９日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに上記受託番号で国内寄託されている。

《実施例３》
キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ０９６０由来メナディオンレダクターゼを用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの蓄積反応

（１）培養
培地［Ａ］２ｍＬを１０ｍＬ容の試験管に入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この試験管に、アンピシリンを添加後、寒天培地に維持したエシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＭＲ（ＮＩＴＥ Ｐ−１４０２）を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振とう培養し、種培養液とした。
次に、５０ｍＬ三角フラスコに培地［Ａ］１０ｍＬを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、アンピシリンを添加後、上記前培養液２００μＬを加え、２８℃で振とう培養を開始した。培養１時間後最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、２４時間振とう培養を継続した。

（２）蓄積反応
上記培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、沈殿物として回収した菌体をリン酸カリウム緩衝液１０ｍＬで縣濁後、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収し酵素溶液とした。上記酵素溶液１００μＬを反応液［Ｇ］１ｍＬに添加し、３７℃で３時間、静置反応した。メタノール１ｍＬを添加し、反応を停止した。
ＨＰＬＣにより分析した結果、主反応生成物として１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの立体異性体３を得た。その立体選択率は９５％であった。

《実施例４》
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−２）遺伝子のクローニング

（１）バチルス・メガテリウム ＩＷＧ３の培養
バチルス・メガテリウム ＩＷＧ３は１５ｍＬの培地［Ｃ］に植菌し、２８℃で３日間振とう培養を行った。培養後、３，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離することにより集菌し、バチルス・メガテリウム ＩＷＧ３の菌体を得た。

（２）ゲノムＤＮＡの取得
バチルス・メガテリウム ＩＷＧ３の菌体を少量のＴＥＳ緩衝液（０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液、０．０１ＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、２５％（ｗ／ｖ）シュクロース、ｐＨ７．０）に懸濁後、最終濃度０．５ＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、リゾチーム、プロテアーゼ Ｋを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。その後最終濃度１％のＳＤＳを添加し更にインキュベートすることで細胞破砕液を得た。細胞破砕液に等量のフェノール／クロロホルム溶液（１：１）を加えゆっくりと完全に混合した。その後、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。続いて、再度等量のフェノール／クロロホルム溶液（１：１）を加えゆっくりと完全に混合し、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。これに２倍量のエタノールと最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウムを加え、完全に混合し、３，５００×ｇにて２０分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿を２０分間真空デシケーターにて乾燥した後、少量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解し、ゲノムＤＮＡを得た。

（３）グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−２）発現大腸菌株の作成
Ｍａｋｉｎｏらの報告（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、２６４巻、６３８１〜６３８５頁、１９８９年）に基づき、下記に示す手法にて実施した。バチルス・メガテリウム ＩＷＧ３のＤＮＡ２４０μｇをとり、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩそれぞれ１５０単位と３７℃、３時間反応させた。反応液の全量を１％アガロースゲル電気泳動に供し、３−４Ｋｂの大きさに相当するＤＮＡを含む部分を切出して、電気抽出法によりゲルからＤＮＡ断片を溶出させた。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェノール／クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた後、ＴＥ緩衝液１００μＬに溶かした。ベクターｐＢＲ３２２ ２０μｇをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで完全分解して得られた直鎖状ベクターＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μＬに溶解し、上記工程で得られたＤＮＡ断片と１：１０の割合に混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを１４℃で一夜反応させた。上記工程で得られた組換えＤＮＡを形質転換により大腸菌Ｃ６００に導入し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む寒天培地［Ｄ］上で生育してきたコロニーを集めてバチルス・メガテリウム ＩＷＧ３のＤＮＡライブラリーと称した。ＤＮＡプローブ（配列番号８）をＩｎｇｌｉａらの方法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）、９巻、１６２７〜１６４２頁、１９８２年） に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−^３２Ｐ−ＡＴＰを用いてラベルした。次に前記工程で得られた大腸菌をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む寒天培地［Ｄ］上でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によって、ナイロンメンブレンへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでＤＮＡ変性させ、塩酸による中和処理を行った後、前記プロープとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは６倍濃度のＳＳＣ緩衝液（原液組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５倍濃度のデンハルト液（０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン）、０．５％ＳＤＳ、牛胸腺ＤＮＡ２０μｇ／ｍＬ（終濃度）及びラベルしたＤＮＡプロープ約５×１０^５ｃｐｍ／ｍＬを用いてプレハイプリダイゼーションを４５℃、３時間行った後、４５℃で一夜のハイブリダイゼーションを行った。この後、５倍濃度のＳＳＣを用いて４５℃で２回、続いて５倍濃度のＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを含む）を用いて４５℃で２回、４倍濃度のＳＳＣで２回ナイロンメンプランを洗浄した。この後ナイロンメンプランを乾燥させ、オートラジオグラフィー（−８０℃、一夜）に供した。その結果、ハイブリダイゼーション陽性のコロニーが見出された。そこで陽性のコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ラベルしたＤＮＡプローブとサザンハイプリダイゼーション（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、９８巻、５０３〜５１７頁、１９７５年）を行った。その結果、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ切断で生成する約３．６ＫｂのＤＮＡ断片にＤＮＡプロープが強くハイブリダイズすることが見出されたため、このプラスミドをｐＧＤＡ１と命名した。プラスミドｐＧＤＡ１ １０μｇをＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで切断し、１％アガロース電気泳動に供し、約１．５Ｋｂの大きさの断片を回収した。得られた断片１μｇにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを終濃度各１ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント ４単位を加え、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトールの反応液２０μＬ中で、３０℃、２０分間反応させた。これにより両端が平滑末端にされたＤＮＡ断片を精製し、その約０．５μｇにＰｓｔＩリンカーとＴ４ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え、６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭアデノシン三リン酸（略称ＡＴＰ）の反応液２０μＬ中で、１４℃、一夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、ＢａｎＩＩで切断後、この断片にマングピーンヌクレアーゼ １Ｕを加え、４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化亜鉛、１０％グリセロールの反応液５０μＬ中で、３０℃、３０分間反応させた。この操作によりＢａｎＩＩの突出末端を平滑末端にし、更に上述したのと同様の方法でＥｃｏＲＩリンカーを連結した。反応後ＤＮＡ断片を精製し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで両端を切断し、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片として回収した。発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した後、回収したＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合反応を行わせた。その反応液を用いて大腸菌ＪＭＩ０５を形質転換した。この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐＧＤＡ２と命名した。ｐＧＤＡ２を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＧＤＡ株（ＮＩＴＥ Ｐ−１４０１）を得た。本菌株は平成２４年８月９日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに上記受託番号で国内寄託されている。

《実施例５》
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−２）を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの蓄積反応

（１）培養
培地［Ａ］２ｍＬを１０ｍＬ容の試験管に入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この試験管に、アンピシリンを添加後、寒天培地に維持したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＧＤＡ（ＮＩＴＥ Ｐ−１４０１）を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振とう培養し、種培養液とした。
次に、５０ｍＬ三角フラスコに培地［Ａ］１０ｍＬを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、アンピシリンを添加後、上記前培養液２００μＬを加え、２８℃で振とう培養を開始した。培養１時間後最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、２４時間振とう培養を継続した。

（２）蓄積反応
上記培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、沈殿物として回収した菌体をリン酸カリウム緩衝液１０ｍＬで縣濁後、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収し酵素溶液とした。上記酵素溶液１００μＬを反応液［Ｇ］１ｍＬに添加し、５０℃で１８時間、静置反応した。メタノール１ｍＬを添加し、反応を停止した。
ＨＰＬＣにより分析した結果、主反応生成物として１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの立体異性体４を得た。その立体選択率は９５％であった。

《実施例６》
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−１）を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの蓄積反応

（１）蓄積反応
天野エンザイム社製バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−１）を２０ｍｇ含む酵素溶液１００μＬ（溶媒：５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））を反応液［Ｇ］１ｍＬに添加し、５０℃で１８時間、静置反応した。メタノール１ｍＬを添加し、反応を停止した。
ＨＰＬＣにより分析した結果、主反応生成物として１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルの立体異性体２を得た。その立体選択率は９５％であった。

表１は、実施例１、実施例３、実施例５及び実施例６における生成した１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸メチルエステルのそれぞれの立体異性体の割合を示す。

《実施例７》
クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの蓄積反応
反応の基質に１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルを用いた以外、実施例１と同様に行った。得られた主反応生成物は１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの立体異性体２であり、その立体選択率は１００％であった。

《実施例８》
キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ０９６０由来メナディオンレダクターゼを用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの蓄積反応
反応の基質に１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルを用いた以外、実施例３と同様に行った。得られた主反応生成物の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステル立体異性体３の立体選択率は９５％であった。

《実施例９》
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＷＧ３由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−２）を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの蓄積反応
反応の基質に１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルを用いた以外、実施例５と同様に行った。得られた主反応生成物は１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの立体異性体４であり、その立体選択率は９３％であった。

《実施例１０》
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−１）を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの蓄積反応
反応の基質に１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルを用いた以外、実施例６と同様に行った。得られた主反応生成物は１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの立体異性体２であり、その立体選択率は９５％であった。

表２は、実施例７、実施例８、実施例９及び実施例１０における生成した１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルのそれぞれの立体異性体の割合を示す。

《実施例１１》
クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０を用いた１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの蓄積反応

（１）培養
培地［Ｅ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したクルトバクテリウム・エスピー ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）の菌体を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振とう培養し、種培養液とした。
次に、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｆ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液１０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２８℃及びｐＨ７．０で、２９時間培養を行った。上記培養を合計２回行った。

（２）蓄積反応
上記培養液１，６００ｍＬを遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え８００ｍＬとした。次に、グルコースを２４ｇ添加し、１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの５％（ｗ／ｗ）水溶液を少しずつ添加しながら、ｐＨ６．８、２５℃で２２時間反応を行った。１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの５％水溶液を合計２６０．４ｇ添加した。得られた反応液を分析した結果、１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルを蓄積濃度１０．３ｇ／Ｌ、収率８３％で得た。
また、得られた主反応生成物は１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸エチルエステルの立体異性体２であり、その立体選択率は９９％であった。

本発明の製造方法は、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルの中間体として重要な１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの合成に用いることができる。

Claims (8)

1. 下記一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示す）
   で表される１−ベンジル−４−オキソ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルに、
   （ｉ）クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、又は前記微生物の調製物、又は
   （ii）メナディオンレダクターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ、
   を作用させ、立体選択的にケトン還元を行うことを特徴とする、
   下記一般式（２）
   

   

   （式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基を示し、そして＊は不斉炭素を示す）
   で表される１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法。
2. 前記メナディオンレダクターゼがキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物由来であり、グルコースデヒドロゲナーゼがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来である、請求項１に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法。
3. 前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物がキャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ・ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）である、請求項１又は２に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法。
4. 前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）又はバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ．）である、請求項１又は２に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法。
5. 前記クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物がクルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０（ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５）である、請求項１に記載の１−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法。
6. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３８５である、クルトバクテリウム・エスピー（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｐ．） ＹＧＫ−１３０。
7. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４０２であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＭＲ。
8. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４０１である、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＧＤＡ。