CN114317384B

CN114317384B - 生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114317384B
Application number: CN202011061807.8A
Authority: CN
Inventors: 孙俊松; 纪明华; 刘云辉; 谢雨康; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN114317384A

Abstract

本发明公开了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL‑fcoA2、164FL‑fcoA1；所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6‑磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖‑1‑磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA‑xylB位点整合编码GDP‑甘露糖脱水酶、GDP‑L‑岩藻糖合成酶、α‑1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；所述重组枯草芽孢杆菌164FL‑fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得；所述重组枯草芽孢杆菌164FL‑fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。本发明的重组枯草芽孢杆菌能够利用比较廉价的碳源高产量生产2’‑FL。

Description

生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术领域，具体涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

母乳对于婴幼儿的生长发育和健康至关重要，而母乳中的母乳寡糖(human milkoligosaccharides, HMOs)在其中起到关键的作用，它们的生理功能包括抑制病原菌生长，促进益生菌生长，促进婴幼儿免疫系统的发育，促进婴幼儿大脑发育，保护呼吸系统及泌尿系统，预防过敏性疾病，等等。2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose，2’-FL)是其中含量最为丰富的一种三糖分子，可用于添加到母乳替代品中缩小其与母乳的功能差距，兼具医学和营养学价值。

2’-FL可以通过在人乳中分离出来，也可以通过化学手段合成，但这两种方法成本较高。近年来有文献报道可以通过代谢工程和发酵工程技术，利用微生物生产2’-FL，极具工业化的潜力。在生物体内，2’-FL可以以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物，在α1,2-岩藻糖基转移酶（α1,2-fucosyltransferase）的催化下合成。所以，代谢工程的工作集中在构建或优化GDP-L-岩藻糖的合成途径，乳糖转运途径的优化及消耗途径的敲除，以及筛选表达特异高效的α1,2-岩藻糖基转移酶基因。其中，在微生物体内GDP-L-岩藻糖的合成可以通过两种途径实现，一种是从头合成途径，主要包括果糖-6-磷酸经由5个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖，这个途径在培养基中添加廉价的碳源，如甘油、葡萄糖等。另一种是补救合成途径，可以由岩藻糖经2个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖，这个途径需要往培养基中添加相对昂贵的岩藻糖作为底物。

目前，在大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌中已成功实现2’-FL的合成。作为GRAS（Generally Regarded As Safe）菌种，枯草芽孢杆菌不产致热源、内毒素，无毒副作用，可以减轻后续的分离纯化成本，天然适合用来表达生产人乳寡糖。目前还没有实现利用枯草芽孢杆菌进行2’-FL从头合成的技术或报道。

发明内容

本发明的目的是，提供一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用；提供一种利用枯草芽孢杆菌进行2’-FL从头合成的技术方案。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌为：重组枯草芽孢杆菌164FL、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。

作为优选实施方案，所述编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：1所示的序列，或者是与SEQ ID NO：1具有85%以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：2所示的序列，或者是与SEQ IDNO：2具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。

作为优选实施方案，所述在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO：3所示的序列或者与SEQ ID NO：3具有85%以上同源性且具有相同功能的序列；在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO：4所示的序列或者与SEQ ID NO：4具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。

作为优选实施方案，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。

本发明还提供生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤1，在枯草芽孢杆菌的基因组manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列；消除抗性基因后，在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列，得到重组枯草芽孢杆菌164FL；

步骤2，将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点上，得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA2；

步骤3，将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点上，得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA1。

作为优选实施方案，所述步骤1中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a；所述编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

作为优选实施方案，所述步骤2中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述步骤3中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了所述生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖。

作为优选实施方案，所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖。

作为优选实施方案，所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的培养基中包含18-22 g/L的乳糖和24-26 g/L的甘油。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明技术方案通过培养重组枯草芽孢杆菌，利用比较廉价的碳源生产2’-FL，能够减轻后续的分离纯化成本。

2，在摇瓶发酵实验中，2’-FL发酵产量达到5.5 g/L，补料发酵2’-FL 产量达到27.8 g/L。该技术在人乳寡糖的生产、食品药物开发等方面具有非常好的应用前景。

3，与国外2’-FL的主流生产菌株大肠杆菌相比，本发明的生产菌株枯草芽孢杆菌为食品安全菌株，产品不会受内毒素污染，更适合奶粉配方原料的生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组枯草芽孢杆菌164FL的构建示意图。

图2为本发明实施例4中重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1摇瓶发酵生产2’-FL的结果示意图。

图3为本发明实施例4中重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1补料发酵生产2’-FL时产物随时间变化的结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中未注明具体条件的操作，按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下各实施例中使用的生物材料来源如下：

枯草芽孢杆菌ATCC 6051a为美国模式培养物收藏库（American type culturecollection）的模式菌株，6051a为其收藏号，可从美国ATCC保藏中心购买获得。

大肠杆菌BL21（DE3）为常用大肠杆菌实验菌株，可直接购买获得。

pUC57-futC为生工生物工程(上海)股份有限公司合成的futC片段连接在pUC57载体上。

各实施例中使用的2 × Phanta Master Mix（货号P511-01）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶QuickCut™ Dpn I（货号1609）购自TaKaRa；红霉素（货号E808819）、氯霉素（货号C804169）和D-木糖（货号D856756）购自上海麦克林生化科技有限公司，2’-FL标准品购自上海惠诚生物科技有限公司。

实施例中的缩写符号说明：

manA：甘露糖6-磷酸异构酶

manB：磷酸甘露糖变位酶

manC：甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶

gmd：GDP-甘露糖脱水酶

wcaG: GDP-L-岩藻糖合成酶

futC: α-1,2岩藻糖基转移酶

实施例1：重组枯草芽孢杆菌164FL的构建

重组枯草芽孢杆菌164FL是在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上整合了两段DNA序列，即在manA位点整合了manA-manB-manC cassette（SEQ ID NO:1），消除红霉素抗性基因后，在xylA-xylB位点整合了gmd-wcaG-futC cassette（SEQ ID NO:2），参见图1，为重组枯草芽孢杆菌164FL的构建示意图。重组枯草芽孢杆菌164FL的具体构建方法如下：

首先制备线性DNA片断manA-manB-manC，由6个片段经过融合PCR获得，这6个片段分别是U-manA、ermC、t7m、manB、manC和D-manA。以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板，扩增U-manA和D-manA；以大肠杆菌BL21（DE3）为模板，扩增manB和manC；以合成的抗性基因DNA片断ermC为模板，扩增ermC；以通过的大肠杆菌表达质粒pET28a为模板，扩增t7m。其中，扩增U-manA的F端引物序列（SEQ ID NO:5）：5’- GCGACGTTTTTGAAAAAGAAAATTCAG -3’；扩增U-manA的R端引物序列（SEQ ID NO:6）：5’-CCTGCTTCTTTTTAGGATCCAGGAAAATCCCCCGCTTTATTCGTTC -3’；扩增ermC的F端引物序列（SEQ ID NO:7）：5’-GAAATCGAATAAAGCGGGATTTTCCTGCAGGGCCTAAAAAGAAGCAGG -3’；扩增ermC的R端引物序列（SEQ ID NO:8）：5’-CCGATGGGGAAGATCCGCCACGAATTCGGTACCCCCGCATATGTAC -3’；扩增t7m的F端引物序列（SEQ ID NO:9）：5’-GTACATATGCCCGGGGCCGAATTCGTGGGCCCGATCTTCCCCATCGG -3’；扩增t7m的R端引物序列（SEQID NO:10）：5’-CTGGATAGAGTTTCGACTGCATGGTATATCTCCTTTCTTAAAGTTAAAC -3’；扩增manC的F端引物序列（SEQ ID NO:11）：5’-GTTTAA CTTTAAGAAAGGAGGATAATGGCCAGTCGAAACTCTATCCAG -3’；扩增manC的R端引物序列（SEQ ID NO:12）：5’-TTAAAGCAGGTTAA TTTTTTCATAGTAGTTCCTCCTTACCGTAGCGATCCGC -3’；扩增manB的F端引物序列（SEQ ID NO:13）：5’-GCGGATCGCTACGG ACGGGTGTAAGGACTATGAAAAAATTAACCTGCTTTAA -3’；扩增manB的R端引物序列（SEQ ID NO:14）：5’-AAAAAG TTCAGTCGTCATAGTAGTTCCTCCTTGTTCCAACGTCAGCAG -3’；扩增D-manA的F端引物序列（SEQ ID NO:15）：5’-CTGCTGACG TTGCTGAACGAGTAAGACTACTATGACGACCCGTTATTTTT -3’；扩增D-manA的R端引物序列（SEQ ID NO:16）：5’- TTACGGGAGACGATACATTCTGC -3’。

使用2 × Phanta Master Mix扩增上述6个DNA片段，PCR配置体系为25μL 2 ×Phanta Master Mix，2.5 μL F端引物（10 μM）， 2.5 μL R端引物（10 μM），0.5 μL 模板，19.5 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性95℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃X min（因为酶的延伸效率为2 kb/min，所以X为所扩增片段长度kb除以2），循环数30。上述PCR产物使用QuickCut™ Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 测定DNA片段的浓度。

使用融合PCR的方法将上述6个片段融合，融合PCR的方法如下：

PCR反应配置体系为10 μL 2 × Phanta Master Mix，6个片段各200 ng，添加ddH₂O至体系为20 μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性95 ℃ 15S，退火60 ℃ 15S，延伸72 ℃ 3 min，循环数10；再进行二轮融合PCR，反应配置体系为25 μL 2 × Phanta Master Mix，2.5 μL U-manA 的F端引物（10 μM）， 2.5 μL D-manA的R端引物（10 μM），1 μL 第一轮PCR反应产物，19 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性95 ℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃ 3 min，循环数30，从而获得融合片段manA-manB-manC。

再将获得的manA-manB-manC转化到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中，并均匀涂在含有10 μg/mL红霉素抗性平板上，置于37 ℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，阳性转化子为manA-manB-manC cassette整合到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上的菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2 × Phanta Master Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的转化子命名为枯草芽孢杆菌164M。

然后再进行线性片断gmd-wcaG-futC的制备，它主要由6个片段经过融合PCR获得，分别是U-xylAB、ermC、t7g、gmd-wcaG、futC和D-xylAB。分别以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板，扩增U-xylAB和D-xylAB；以大肠杆菌BL21（DE3）为模板，扩增gmd-wcaG；以人工合成的DNA片断为模板，扩增ermC；以常用质粒pET28a为模板，扩增t7g，以futC的人工合成DNA片断为模板，扩增futC。PCR扩增的引物序列如下：扩增U-xylAB的F端引物序列（SEQ IDNO:17）：5’- GCATCCTCGGTTTCCGCAACTGCATTTAGG -3’；扩增U-xylAB的R端引物序列（SEQ IDNO:18）：5’-CCTGCTTCTTTTTAGGATCCCTGCA GGTTTCCCCCTTAAAAATAAATTC -3’；扩增ermC的F端引物序列（SEQ ID NO:19）：5’-GAATTTATTTTTAAGGGAAATCA CCTGCAGTCCTAAAAAGAAGCAGG-3’；扩增ermC的R端引物序列（SEQ ID NO:20）：5’-CCGATGGGGTCGGGCTCGCCACGAATTCGGTACCCCCGGGCATATGTAC -3’；扩增t7g的F端引物序列（SEQ ID NO:21）：5’-GTACATATGCCGGGTACCGTTCGTGGCGAG CCCGATCTTCCCCATCGG -3’；扩增t7g的R端引物序列（SEQ ID NO:22）：5’-CCGGTATGAGAGCGACTTTTGGGTATATCCTCCTT TCTTAAAGTTAAAC -3’；扩增gmd-wcaG的F端引物序列（SEQ ID NO:23）：5’-GTTTAACTTAAAGGAGGATATACCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCGG -3’；扩增gmd-wcaG的R端引物序列（SEQ ID NO:24）：5’-CTTTGAAAGCCATAGTTCCTCCTTACCCCCGAAAGCGG TCTTGATTC -3’；扩增futC的F端引物序列（SEQ ID NO:25）：5’-GAATCAAGACCGCTTTCGGGGTAGGAACTACTATGGCTTTCAAAG -3’；扩增futC的R端引物序列（SEQ ID NO:26）：5’-GTTCTTCGGTTGATCTCCAGACAATAACATCAAGCGTTGTATTTCTGAGATTTAAC -3’；扩增D-xylAB的F端引物序列（SEQ ID NO:27）：5’-GTTAAATCTCAGAAATACAACGCTTAATGATGTTATCTGGAGATCAACCGAAGAAC -3’；扩增D-xB的R端引物序列（SEQ ID NO:28）：5’-GTATGATCGCATTTAAGTATTAC -3’。使用2 × Phanta Master Mix扩增上述6个DNA片段，PCR配置体系为25 μL 2 × Phanta Master Mix，2.5 μL F端引物（10 μM）， 2.5 μL R端引物（10 μM），0.5μL 模板，19.5 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性 95℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃X min（因为酶的延伸效率为2 kb/min，所以X为所扩增片段长度kb除以2），循环数30。上述PCR产物使用QuickCut™ Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 测定DNA片段的浓度。再利用融合PCR的方法将上述6个片段融合，融合PCR的方法如下：首轮PCR反应配置体系为10 μL 2 × Phanta Master Mix，6个片段各200ng，添加ddH₂O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火60 ℃ 15S，延伸72 ℃ 3 min，循环数10。二轮PCR中，反应配置体系为25 μL 2 × Phanta Master Mix，2.5 μL U-xylAB 的F端引物（10 μM）， 2.5 μL D-xylAB的R端引物（10 μM），1 μL 第一轮PCR反应产物，19 μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95 ℃ 5 min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃ 3 min，循环数30，从而获得融合片段gmd-wcaG-futC。

获得的gmd-wcaG-futC转化到164M后，即可完成枯草芽孢杆菌164FL的构建，主要步骤如下：将gmd-wcaG-futC转化164M中，均匀涂在含有10 μg/mL红霉素抗性平板上，置于37 ℃恒温箱培养过夜；通过菌落PCR鉴定所长出的转化子；以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2 × Phanta Master Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2的构建

重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2是在枯草芽孢杆菌164FL的基础上，将编码大肠杆菌BL21(DE3)乳糖渗透酶的lacY（SEQ ID NO:3）整合到164FL的fcoA2位点。重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2的构建的具体操作如下：

首先构建fcoA2-PxylA-lacY，它由５个片断（U-fcoA2、Cmg、PxylA、lacYg和D-fcoA2）构成。U-fcoA2和D-fcoA2分别以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板扩增而来；lacYg以大肠杆菌BL21（DE3）为模板； PxylA和Cmg由人工合成片断为模板扩增。其中，PCR扩增的引物序列如下：扩增U-fcoA2的F端引物序列（SEQ ID NO:29）：5’-GTATTTCCATGCCCACCATC -3’；扩增U-fcoA2的R端引物序列（SEQ ID NO:30）：5’-CAACTTTTTTTATTGTCTTTGTGAAAGCTGATGCTCC GCTCGATATGGGCG -3’；扩增Cmg的F端引物序列（SEQ IDNO:31）：5’-CGCCCATATCGAGCGCATCAGCTTTCACAAACTATGACAATAAAAAAAGTTG -3’；扩增Cmg的R端引物序列（SEQ ID NO:32）：5’-GTTATAATATTAGATTCTAGTCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAG -3’；扩增PxylA的F端引物序列（SEQ ID NO:33）：5’-CTAACCTGCCC CGTTAGTTGAAGAAGAATTCTATCTAATATTATAAC -3’；扩增PxylA的R端引物序列（SEQ ID NO:34）：5’-AGTTTGTGTTTTTTAAATAGTATTTTTATTCCTCCTTGTCGGGTTGATTTAAG -3’；扩增lacYg的F端引物序列（SEQ ID NO:35）：5’-CTTAAATCAACCCG GGAACAAGGAGGAATAAAAATTATTTAAAAAACACAAACT-3’；扩增lacYg的R端引物序列（SEQ ID NO:36）：5’-GCTAAGAGAA CAAGGAGGAGAATGTGTTACTTCATTCACCTGACGAC-3’；扩增D-fcoA2的F端引物序列（SEQ ID NO:37）：5’-GTCGTCAAATGA AGTCGCTTAACACATTCTCCTCCTTGTTCTCTTAGC -3’；扩增D-fcoA2的R端引物序列（SEQ ID NO:38）：5’-GATTTATAAATTGACA ATGTCCAGC -3’。分别使用2 × Phanta Master Mix扩增上述5个DNA片段，PCR配置体系为25 μL 2 × Phanta Master Mix，2.5 μL F端引物（10 μM）， 2.5 μL R端引物（10 μM），0.5μL 模板，19.5 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5 min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃X min（因为酶的延伸效率为2 kb/min，所以X为所扩增片段长度kb除以2），循环数30。上述PCR产物使用QuickCut™ Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 测定DNA片段的浓度。

再使用融合PCR的方法将上述5个片段融合，融合PCR的方法如下：首先运行首轮PCR，配置体系为10 μL 2 × Phanta Master Mix，6个片段各200 ng，添加ddH₂O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性 95℃ 5min，然后变性 95℃ 15S，退火60℃ 15S，延伸72℃ 2.5 min，循环数10。再进行第二轮PCR反应，配置体系为25 μL 2 ×Phanta Master Mix，2.5 μL U-fcoA2 的F端引物（10 μM）， 2.5 μL D-fcoA2的R端引物（10μM），1 μL 第一轮PCR反应产物，19 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃ 2.5 min，循环数30。获得融合片段fcoA2-PxylA-lacY。

得到的fcoA2-PxylA-lacY转化至164FL，过程如下：将PCR产物fcoA2-PxylA-lacY转化到实施例1构建的枯草芽孢杆菌164FL中，均匀涂在含有10 μg/mL氯霉素抗性平板上，置于37 ℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，阳性转化子为fcoA2-PxylA-lacY cassette整合到枯草芽孢杆菌164FL的基因组上的菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2 × Phanta Master Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1的构建

重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1将乳糖渗透酶lacY整合到枯草芽孢杆菌164FL上，将一个DNA片断（SEQ ID NO:4）整合到164FL的fcoA1位点。首先是制备线性DNA fcoA1-PxylA-lacY，它是由5个片段经过融合PCR获得，这5个片段分别是U-fcoA1、Cmy、PxylA、lacYy和D-fcoA1。其中，U-fcoA1和D-fcoA1以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板扩增；lacYy以大肠杆菌BL21（DE3）为模板；PxylA和Cmy以人工合成的DNA片断为模板。PCR扩增的引物序列如下。扩增U-fcoA1的F端引物序列（SEQ ID NO:39）：5’-CTATACAACAATCTCACCCGCC -3’；扩增U-fcoA1的R端引物序列（SEQ ID NO:40）：5’-CTTTTTTTATTGTCATAGTTTGTGAAACCTTTGATGATCGATTCTGTC -3’；扩增Cmy的F端引物序列（SEQ ID NO:41）：5’-GACAGAATCGATCATCAAAGAAAG GTTTCACAAACTATGACAAAAAAAG -3’；扩增Cmy的R端引物序列（同Cmg的R端引物SEQ ID NO:32）：5’-GTTATAATATTAGATTCTAGAATTCTTCTTCAACTAACGGCAGGTTAG -3’；扩增PxylA的F端引物序列（SEQ ID NO:33）：5’-CTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGAA TTCTAGAATCTAATATTATAAC -3’；扩增PxylA的R端引物序列（SEQ ID NO:34）：5’-AGTTTGTGTTAAATAGTACATTTTTTATTCCT CCTTGTTCCCGGGTTGATTTAAG-3’；扩增lacYy的F端引物序列（SEQ ID NO:35）：5’-CTTAAATCCGGGAACAAGGAGGAATAAAAAATGTACTATTTAAAAAACACAAACT -3’；扩增lacYy的R端引物序列（SEQ ID NO:42）：5’-GAAATGATTCGATACAAAGAATCATTAA GCGACTTCATTCACCTGACGA -3’；扩增D-fcoA1的F端引物序列（SEQ ID NO:43）：5’-TCGTCAGATGAAGTCGCTTAATGATTCTTTGTATCG AATCAGCTTTTTTC -3’；扩增D-fcoA1的R端引物序列（SEQ ID NO:44）：5’- CTTTTCCGGTCCGTTGACAGGCTG -3’。再使用2 × Phanta Master Mix扩增上述5个DNA片段，PCR配置体系为25 μL 2 × PhantaMaster Mix，2.5 μL F端引物（10 μM）， 2.5 μL R端引物（10 μM），0.5 μL 模板，19.5 μLddH₂O。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5 min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72℃X min（因为酶的延伸效率为2 kb/min， X为所扩增片段长度kb除以2），循环数30。上述PCR产物使用QuickCut™ Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 测定DNA片段的浓度。再使用融合PCR的方法将上述5个片段融合，先进行首轮PCR反应，配置体系为10 μL 2 × Phanta Master Mix，6个片段各200 ng，添加ddH₂O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火60 ℃ 15S，延伸72 ℃ 2.5 min，循环数10。再进行第二轮PCR反应，配置体系为25 μL 2 × Phanta MasterMix，2.5 μL U-fcoA1 的F端引物（10 μM）， 2.5 μL D-fcoA1的R端引物（10 μM），1 μL 第一轮PCR反应产物，19 μL ddH₂O。PCR反应条件为预变性 95 ℃ 5min，然后变性 95 ℃ 15S，退火55 ℃ 15S，延伸72 ℃ 2.5 min，循环数30，从而得到融合片段fcoA1-PxylA-lacY。

得到的fcoA1-PxylA-lacY片段转化至重组枯草芽孢杆菌164FL后，得到重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1。过程如下：先将fcoA1-PxylA-lacY转化到实施例1构建的枯草芽孢杆菌164FL中，并均匀涂在含有10 μg/mL氯霉素抗性平板上，置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2 × PhantaMaster Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1。

实施例4：重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵产2’-FL

发酵培养基选择为LB培养基，组分为10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母粉和10 g/LNaCl。将制备的重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2或164FL-fcoA1分别在LB固体板上划线活化，然后挑取单菌落培养在装有3 mL LB的试管，在37℃恒温振荡培养箱中200 rpm过夜培养。取过夜培养物0.5 mL接种到装有50 mL新鲜LB培养基的500 mL摇瓶中，继续在37℃恒温振荡培养箱中200 rpm培养。待细胞长到OD600 0.8~1.0（4 h左右），添加终浓度1%（m/V）的木糖诱导。在细胞生长12 h后，添加不同浓度的乳糖和碳源（甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖等）。然后每隔12 h 取样检测细胞生长状况，同时通过液相检测2’-FL生产情况。方法如下：使用岛津HPLC设备，型号为20AVP，使用Aminex HPX-87H column (300×7.8mm) (Bio-Rad, USA)柱子，流动相5 mM H₂SO₄，流速控制为0.6 mL/min，柱子温度控制为65℃，为开启视差检测器（型号RID-10A）进行检测。

摇瓶发酵结果显示，以甘油为碳源时164FL能生产2’-FL，产量为120 mg/L。在fcoA2位点敲入lacY，所构建的164FL-fcoA2可以使产量提高26.06倍，而在fcoA1位点敲入lacY，所构建的164FL-fcoA1可以使产量提高40.35倍。参见图2，为重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1摇瓶发酵生产2’-FL的结果示意图。菌种164FL-fcoA1的碳源实验结果显示：使用甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖等都能产生2’-FL，甘油为最佳碳源。乳糖浓度实验确定乳糖最佳添加量为20 g/L。摇瓶发酵实验结果，当使用碳源为甘油浓度为25g/L，乳糖浓度为20 g/L时，164FL-fcoA1达到最大产量，为5.56 g/L。

实施例5：重组枯草芽孢杆菌补料发酵产2’-FL

以164FL-fcoA1菌种为例补料发酵产2’-FL。首先是制备发酵的种子培养液。过程如下：首先将制备的重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1在LB固体板上划线活化，然后挑取单菌落培养在装有3 mL LB的试管，在37℃恒温振荡培养箱中200 rpm过夜培养。取过夜培养物0.5 mL接种到装有50 mL新鲜LB培养基的500 mL摇瓶中，继续在37℃恒温振荡培养箱中200rpm培养8h。将种子培养物接种到发酵培养基中，接种量为7.5%。发酵培养基的组分为：甘油25 g/L、酵母粉5 g/L、乳糖20 g/L、蛋白胨 30 g/L、磷酸二氢钾12 g/L、硫酸铵14 g/L、六水合氯化镁3g/L、玉米浆10 g/L以及消泡剂 1 g/L。5L发酵罐的装液量为3L，115℃灭菌20min使用。发酵初始pH为6.5。发酵控制参数为：通气量控制在5 L/min，转速为700 rpm，温度控制在37℃，发酵3h后加入终浓度1%的木糖；流加甘油和氨水控制发酵罐的pH在6.5左右。发酵过程中甘油控制>20%，乳糖控制>10%。定时取样，通过液相测定所生成2’-FL产量以及检测甘油和乳糖消耗情况。液相检测方法与实施例4中一致。参见图3，为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1补料发酵生产2’-FL时产物随时间变化的结果示意图。补料发酵结果显示，在培养过程中2’-FL产量一直在积累，并在发酵的144 h达到最高产量，为27.8 g/L。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgacgtttt taggaaaaag aaaattcgag gcatctcaaa gagaaatggg gaaagcggca 60

tttacgatgg ggctcttcgg cattactgaa ggagcgattc catttgcggc gcaggaccct 120

ctgcgcgtta ttccaagtat tatggcaggc tcaatgacag gttctgtgat agccatgatt 180

ggcaatgtgg gagacagagt ggcgcacggc ggacctatcg ttgcagtgct tggcgcagtt 240

gatcatgtct tgatgttttt tattgctgtg attgcaggat ctcttgtcac tgctctgttc 300

gtcaatgtac taaaaaagga tattacggcg tctcctgtgc tcagtgaaac tgcaccgacc 360

tccgcgccaa gtgaagctgc ggcagcaaat gaaataaagc agccaattca aagccaaaaa 420

gctgagatgt cggaatttaa aaaactgaca gacattatca gcccggaatt aattgaacca 480

aatttatcgg gggaaacgag tgatgacatc atagatgaat tgattcagaa attgtcacga 540

agaggtgcgc tgctttcaga gagcgggttt aaacaagcca ttttgaatcg tgaacaacag 600

ggaacaacgg cgattggcat gaatatcgcg attccgcacg gaaagtctga ggcggtcagg 660

gagccgagtg ttgcctttgg gatcaaacga tcaggcgttg attggaatag cctggatgga 720

tcagaagcta aattaatctt tatgattgct gtaccgaaag agagcggggg aaaccagcat 780

ctcaaaatac tgcagatgct atctcgaaag ctaatggatg acaattatag ggagcggctg 840

ctctccgtgc aaacaacaga agaagcatac aagctgctag aagaaatcga ataaagcggg 900

ggattttcct gcagggatcc taaaaagaag caggttcctc catacctgct tctttttaag 960

cttaagcttg cggccgctac cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta tttaaaccgt 1020

gtgctctacg accaaaacta taaaaccttt aagaactttc tttttttaca agaaaaaaga 1080

aattagataa atctctcata tcttttattc aataatcgca tccgattgca gtataaattt 1140

aacgatcact catcatgttc atatttatca gagctcgtgc tataattata ctaattttat 1200

aaggaggaaa aaatatgggc atttttagta tttttgtaat cagcacagtt cattatcaac 1260

caaacaaaaa ataagtggtt ataatgaatc gttaataagc aaaattcata taaccaaatt 1320

aaggagggaa ataatgaacg agaaaaatat aaaacacagt caaaacttta ttacttcaaa 1380

acataatata gataaaataa tgacaaatat aagattaaat gaacatgata atatctttga 1440

aatcggctca ggaaaaggcc attttaccct tgaattagta aagaggtgta atttcgtaac 1500

tgccattgaa atagaccata aattatgcaa aactacagaa aataaacttg ttgatcacga 1560

taatttccaa gttttaaaca aggatatatt gcagtttaaa tttcctaaaa accaatccta 1620

taaaatatat ggtaatatac cttataacat aagtacggat ataatacgca aaattgtttt 1680

tgatagtata gctaatgaga tttatttaat cgtggaatac gggtttgcta aaagattatt 1740

aaatacaaaa cgctcattgg cattactttt aatggcagaa gttgatattt ctatattaag 1800

tatggttcca agagaatatt ttcatcctaa acctaaagtg aatagctcac ttatcagatt 1860

aagtagaaaa aaatcaagaa tatcacacaa agataaacaa aagtataatt atttcgttat 1920

gaaatgggtt aacaaagaat acaagaaaat atttacaaaa aatcaattta acaattcctt 1980

aaaacatgca ggaattgacg atttaaacaa tattagcttt gaacaattct tatctctttt 2040

caatagctat aaattattta ataagtaagt taagggatgc ataaactgca tcccttaact 2100

tgtttttcgt gtgcctattt tttgtgaatt gattatcgat cttttgcgcc atggataact 2160

tcgtatagca tacattatac gaacggtaca tatgcccggg ggtaccgaat tcgtggcgag 2220

cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc 2280

cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga 2340

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 2400

ttttgtttaa ctttaagaaa ggaggatata ccatggcgca gtcgaaactc tatccagttg 2460

tgatggcagg tggctccggt agccgcttat ggccgctttc ccgcgtactt tatcccaagc 2520

agtttttatg cctgaaaggc gatctcacca tgctgcaaac caccatctgc cgcctgaacg 2580

gcgtggagtg cgaaagcccg gtggtgattt gcaatgagca gcaccgcttt attgtcgcgg 2640

aacagctgcg tcaactgaac aaacttaccg agaacattat tctcgaaccg gcagggcgaa 2700

acacggcacc tgccattgcg ctggcggcgc tggcggcaaa acgtcatagc ccggagagcg 2760

acccgttaat gctggtattg gcggcggatc atgtgattgc cgatgaagac gcgttccgtg 2820

ccgccgtgcg taatgccatg ccatatgccg aagcgggcaa gctggtgacc ttcggcattg 2880

tgccggatct accagaaacc ggttatggct atattcgtcg cggtgaagtg tctgcgggtg 2940

agcaggatat ggtggccttt gaagtggcgc agtttgtcga aaaaccgaat ctggaaaccg 3000

ctcaggccta tgtggcaagc ggcgaatatt actggaacag cggtatgttc ctgttccgcg 3060

ccggacgcta tctcgaagaa ctgaaaaaat atcgcccgga tatcctcgat gcctgtgaaa 3120

aagcgatgag cgccgtcgat ccggatctca attttattcg cgtggatgaa gaagcgtttc 3180

tcgcctgccc ggaagagtcg gtggattacg cggtcatgga acgtacggca gatgctgttg 3240

tggtgccgat ggatgcgggc tggagcgatg ttggctcctg gtcttcatta tgggagatca 3300

gcgcccacac cgccgagggc aacgtttgcc acggcgatgt gattaatcac aaaactgaaa 3360

acagctatgt gtatgctgaa tctggcctgg tcaccaccgt cggggtgaaa gatctggtag 3420

tggtgcagac caaagatgcg gtgctgattg ccgaccgtaa cgcggtacag gatgtgaaaa 3480

aagtggtcga gcagatcaaa gccgatggtc gccatgagca tcgggtgcat cgcgaagtgt 3540

atcgtccgtg gggcaaatat gactctatcg acgcgggcga ccgctaccag gtgaaacgca 3600

tcaccgtgaa accgggcgag ggcttgtcgg tacagatgca ccatcaccgc gcggaacact 3660

gggtggttgt cgcgggaacg gcaaaagtca ccattgatgg tgatatcaaa ctgcttggtg 3720

aaaacgagtc catttatatt ccgctggggg cgacgcattg cctggaaaac ccggggaaaa 3780

ttccgctcga tttaattgaa gtgcgctccg gctcttatct cgaagaggat gatgtggtgc 3840

gtttcgcgga tcgctacgga cgggtgtaag gaggaactac tatgaaaaaa ttaacctgct 3900

ttaaagccta tgatattcgc gggaaattag gcgaagaact gaatgaagat atcgcctggc 3960

gcattggtcg cgcctatggc gaatttctca aaccgaaaac cattgtgtta ggcggtgatg 4020

tccgcctcac cagcgaaacc ttaaaactgg cgctggcgaa aggtttacag gatgcgggcg 4080

ttgacgtgct ggatattggt atgtccggca ccgaagagat ctatttcgcc acgttccatc 4140

tcggcgtgga tggcggcatt gaagttaccg ccagccataa tccgatggat tataacggca 4200

tgaagctggt tcgcgagggg gctcgcccga tcagcggaga taccggactg cgcgacgtcc 4260

agcgtctggc tgaagccaac gactttcctc ccgtcgatga aaccaaacgc ggtcgctatc 4320

agcaaatcaa cctgcgtgac gcttacgttg atcacctgtt cggttatatc aatgtcaaaa 4380

acctcacgcc gctcaagctg gtgatcaact ccgggaacgg cgcagcgggt ccggtggtgg 4440

acgccattga agcccgcttt aaagccctcg gcgcgcccgt ggaattaatc aaagtgcaca 4500

acacgccgga cggcaatttc cccaacggta ttcctaaccc actactgccg gaatgccgcg 4560

acgacacccg caatgcggtc atcaaacacg gcgcggatat gggcattgct tttgatggcg 4620

attttgaccg ctgtttcctg tttgacgaaa aagggcagtt tattgagggc tactacattg 4680

tcggcctgtt ggcagaagca ttcctcgaaa aaaatcccgg cgcgaagatc atccacgatc 4740

cacgtctctc ctggaacacc gttgatgtgg tgactgccgc aggtggcacg ccggtaatgt 4800

cgaaaaccgg acacgccttt attaaagaac gtatgcgcaa ggaagacgcc atctatggtg 4860

gcgaaatgag cgcccaccat tacttccgtg atttcgctta ctgcgacagc ggcatgatcc 4920

cgtggctgct ggtcgccgaa ctggtgtgcc tgaaagataa aacgctgggc gaactggtac 4980

gcgaccggat ggcggcgttt ccggcaagcg gtgagatcaa cagcaaactg gcgcaacccg 5040

ttgaggcgat taaccgcgtg gaacagcatt ttagccgtga ggcgctggcg gtggatcgca 5100

ccgatggcat cagcatgacc tttgccgact ggcgctttaa cctgcgcacc tccaataccg 5160

aaccggtggt gcgcctgaat gtggaatcgc gcggtgatgt gccgctgatg gaagcgcgaa 5220

cgcgaactct gctgacgttg ctgaacgagt aaggaggaac tactatgacg actgaaccgt 5280

tatttttcaa gcctgttttc aaagaaagaa tttggggcgg gaccgcttta gctgattttg 5340

gctataccat tccgtcacaa cgaacagggg agtgctgggc ttttgccgcg catcaaaatg 5400

gtcaaagcgt tgttcaaaac ggaatgtata aggggttcac gctcagcgaa ttatgggaac 5460

atcacagaca tttattcgga cagcttgaag gggaccgttt ccctctgctt acaaaaatat 5520

tagatgctga ccaggactta tctgttcagg tgcatccgaa tgatgaatat gccaacatac 5580

atgaaaacgg tgagcttgga aaaacagaat gctggtacat tattgattgc caaaaagatg 5640

ccgagattat ttatggccac aatgcaacaa caaaggaaga actaactacc atgatagagc 5700

gtggagaatg ggatgagctc ttgcgccgtg taaaggtaaa gccgggggat tttttctatg 5760

tgccaagcgg tactgttcat gcgattggaa aaggaattct tgctttggag acgcagcaga 5820

actcagacac aacctacaga ttatatgatt atgaccgaaa agatgcagaa ggcaagctgc 5880

gcgagcttca tctgaaaaag agcattgaag tgatagaggt cccgtctatt ccagaacggc 5940

atacagttca ccatgaacaa attgaggatt tgcttacaac gacattgatt gaatgcgctt 6000

acttttcggt ggggaaatgg aacttatcag gatcagcaag cttaaagcag caaaaaccat 6060

tccttcttat cagtgtgatt gaaggggagg gccgtatgat ctctggtgag tatgtctatc 6120

ctttcaaaaa aggagatcat atgttgctgc cttacggtct tggagaattt aaactcgaag 6180

gatatgcaga atgtatcgtc tcccatctgt aa 6212

<210> 2

<211> 6640

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatcctcgg tttccgcaac tgcatttagg accattaaag tctattgtca tatgtcccat 60

ttctccagag aagccgctta ctcctctata taaatgattg ttgataataa caccgatccc 120

tattcctgtg ctgatactta cgtaaataat gttatcgtga ttttttgcag ctccaaatac 180

tttttctcca tatgcgccag catttgcctc attttcaata aaaacaggca cattgtactt 240

ctcttgtatc gaagatttta agtcaatatc tctccagttg gagttcggag tgaaaacaat 300

tttttgatct ttatcaatga gtccaggcac gcaaatacct ataccaataa gcccgtacgg 360

agattggggc atttgcgtaa taaagtgatg aatcatatca atcaaaatgt ctttcgttat 420

ttctggagaa ttggattcca aatggcggta ttgatcaaga acgattgttc cttcaaggtc 480

tgttaaaatg ccattaatat aatccacacc aacatctatt ccaacggagt atcctgcctt 540

tttattaaaa acaagcatga caggtcttct tccgccactt gattgtcctt gacctatttc 600

aaataccata ctttctttca ttaacgtgtt tacctgtgat gagacagttg atttatttaa 660

tccagtcatt tcagataatt ttgctcttga aataggtgaa tttttaagga tttcttttaa 720

taataacttt tgatttactt ttttgacaaa ggtttgatca gcgatatcca cttcatccac 780

tccatttgtt taatctttaa attaagtatc aacatagtac atagcgaatc ttccctttat 840

tatatctaat gtgttcataa aaaactaaaa aaaatattga aaatactgac gaggttatat 900

aagatgaaaa taagttagtt tgtttaaaca acaaactaat aggtgatgta cttactatat 960

gaaataaaat gcatctgtat ttgaatgaat ttatttttaa gggggaaatc acctgcaggg 1020

atcctaaaaa gaagcaggtt cctccatacc tgcttctttt taagcttaag cttgcggccg 1080

ctaccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatttaaa ccgtgtgctc tacgaccaaa 1140

actataaaac ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa aagaaattag ataaatctct 1200

catatctttt attcaataat cgcatccgat tgcagtataa atttaacgat cactcatcat 1260

gttcatattt atcagagctc gtgctataat tatactaatt ttataaggag gaaaaaatat 1320

gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat caaccaaaca aaaaataagt 1380

ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca aattaaggag ggaaataatg 1440

aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt caaaacataa tatagataaa 1500

ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct ttgaaatcgg ctcaggaaaa 1560

ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat tgaaatagac 1620

cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc acgataattt ccaagtttta 1680

aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat cctataaaat atatggtaat 1740

ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg tttttgatag tatagctaat 1800

gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat tattaaatac aaaacgctca 1860

ttggcattac ttttaatggc agaagttgat atttctatat taagtatggt tccaagagaa 1920

tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca gattaagtag aaaaaaatca 1980

agaatatcac acaaagataa acaaaagtat aattatttcg ttatgaaatg ggttaacaaa 2040

gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt ccttaaaaca tgcaggaatt 2100

gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttttcaatag ctataaatta 2160

tttaataagt aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt aacttgtttt tcgtgtgcct 2220

attttttgtg aattgattat cgatcttttg cgccatggat aacttcgtat agcatacatt 2280

atacgaacgg tacatatgcc cgggggtacc gaattcgtgg cgagcccgat cttccccatc 2340

ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 2400

gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 2460

tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa 2520

gaaaggagga tataccatgt caaaagtcgc tctcatcacc ggtgtaaccg gacaagacgg 2580

ttcttacctg gcagagtttc tgctggaaaa aggttacgag gtgcatggta ttaagcgtcg 2640

cgcatcgtca ttcaacaccg agcgcgtgga tcacatttat caggatccgc acacctgcaa 2700

cccgaaattc catctgcatt atggcgacct gagtgatacc tctaacctga cgcgcatttt 2760

gcgtgaagta cagccggatg aagtgtacaa cctgggcgca atgagccacg ttgcggtctc 2820

ttttgagtca ccagaatata ccgctgacgt cgacgcgatg ggtacgctgc gcctgctgga 2880

ggcgatccgc ttcctcggtc tggaaaagaa aactcgtttc tatcaggctt ccacctctga 2940

actgtatggt ctggtgcagg aaattccgca gaaagagacc acgccgttct acccgcgatc 3000

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌( Bacillus coli)

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<213> 大肠杆菌( Bacillus coli)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggatcgct acggacgggt gtaaggagga actactatga aaaaattaac ctgctttaa 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaaataacg gttcagtcgt catagtagtt cctccttact cgttcagcaa cgtcagcag 59

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgctgacgt tgctgaacga gtaaggagga actactatga cgactgaacc gttattttt 59

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttacagatgg gagacgatac attctgc 27

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcatcctcgg tttccgcaac tgcatttagg 30

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctgcttctt tttaggatcc ctgcaggtga tttccccctt aaaaataaat tc 52

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaatttattt ttaaggggga aatcacctgc agggatccta aaaagaagca gg 52

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccgatgggga agatcgggct cgccacgaat tcggtacccc cgggcatatg tac 53

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtacatatgc ccgggggtac cgaattcgtg gcgagcccga tcttccccat cgg 53

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccggtgatga gagcgacttt tgacatggta tatcctcctt tcttaaagtt aaac 54

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtttaacttt aagaaaggag gatataccat gtcaaaagtc gctctcatca ccgg 54

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctttgaaagc catagtagtt cctccttacc cccgaaagcg gtcttgattc 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaatcaagac cgctttcggg ggtaaggagg aactactatg gctttcaaag 50

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttcttcggt tgatctccag acaataacat cattaagcgt tgtatttctg agatttaac 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gttaaatctc agaaatacaa cgcttaatga tgttattgtc tggagatcaa ccgaagaac 59

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtatgatcgc aatcgtttta agtattac 28

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtatttccat gcccatcgcc atc 23

<210> 30

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caactttttt tattgtcata gtttgtgaaa gctgatgctc cgctcgatat gggcg 55

<210> 31

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgcccatatc gagcggagca tcagctttca caaactatga caataaaaaa agttg 55

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gttataatat tagattctag aattcttctt caactaacgg ggcaggttag 50

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctaacctgcc ccgttagttg aagaagaatt ctagaatcta atattataac 50

<210> 34

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

agtttgtgtt ttttaaatag tacatttttt attcctcctt gttcccgggt tgatttaag 59

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cttaaatcaa cccgggaaca aggaggaata aaaaatgtac tatttaaaaa acacaaact 59

<210> 36

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gctaagagaa caaggaggag aatgtgttaa gcgacttcat tcacctgacg ac 52

<210> 37

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gtcgtcaggt gaatgaagtc gcttaacaca ttctcctcct tgttctctta gc 52

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gatttataaa ttgacaatgc agtccagc 28

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctatacaaca acacatctca cccgcc 26

<210> 40

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ctttttttat tgtcatagtt tgtgaaacct ttctttgatg atcgattctg tc 52

<210> 41

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gacagaatcg atcatcaaag aaaggtttca caaactatga caataaaaaa ag 52

<210> 42

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaaaaaagct gattcgatac aaagaatcat taagcgactt cattcacctg acga 54

<210> 43

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tcgtcaggtg aatgaagtcg cttaatgatt ctttgtatcg aatcagcttt tttc 54

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cttttccggt ccgttttgac aggctg 26

Claims

1.生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌164FL、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；所述编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：1所示的序列；所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：2所示的序列；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得；

所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。

2.如权利要求1所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO：3所示的序列；在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO：4所示的序列。

3.如权利要求1所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。

4.生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤1，在枯草芽孢杆菌的基因组manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列；消除抗性基因后，在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列，得到重组枯草芽孢杆菌164FL；所述编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：1所示的序列；所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO：2所示的序列；

步骤2，将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点上，得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA2；

步骤3，将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点上，得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA1。

5.如权利要求4所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤1中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。

6.如权利要求4所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤2中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述步骤3中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO：4所示。

7.权利要求1-3任一项所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：使用所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖。

8.如权利要求7所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖。

9.如权利要求7所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的培养基中包含18-22g/L的乳糖和24-26g/L的甘油。