CN109735479A - 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种合成2'‑岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过在基因组上强化表达乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'‑岩藻糖基乳糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方 法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1,2糖苷键与半乳糖相连，形成2'-岩藻糖基乳糖。

随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中，GDP-L-fucose以L-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由HBr、Ag₂CO₃、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用能力有限。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2'-岩藻糖基乳糖，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成2'-岩藻糖基乳糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因是不表达的，通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'-岩藻糖基乳糖的合成。其中，将P43表达的大肠杆菌乳糖运输酶基因lacY重组在枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶amyE位点，来在枯草芽孢杆菌168的基因组中插入外源乳糖运输酶基因。强启动子P43在枯草芽孢杆菌168中过表达了外源乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度。

进一步的，将P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。所述乳糖运输酶基因如NCBI中Gene ID:949083所示。

进一步的，岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为脆弱拟杆菌9343的fkp基因。所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如NCBI上GenBank:AY849806.1所示，所述所述岩藻糖基转移酶为幽门螺旋杆菌futC基因，幽门螺旋杆菌futC基因如NCBI上GenBank:KY499613所示。

第二方面，本发明还提供了一种所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)构建包含淀粉酶基因amyE位点的上下游序列、乳糖运输酶基因、P43启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；

(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。

进一步的，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，步骤(1)中，将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框的添加量为100-300ng。

进一步的，步骤(2)中，将脆弱拟杆菌中的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因序列，幽门螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pP43NMK进行克隆连接。

第三方面，本发明还提供了所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2'-岩藻糖基乳糖。

本发明的有益效果为：

本发明的重组枯草芽孢杆菌，是在重组枯草芽孢杆菌168的基础上在基因组上整合外源乳糖运输酶基因，并在此基础上表达岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的，通过改造获得了可高效合成2'-岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.042g/L。本发明通过在基因组上强化表达乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2'-岩藻糖基乳糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3得到的2'-岩藻糖基乳糖的气质联用色谱图；

图2为本发明得到的lacY转化框PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明得到的表达fkp和futC的质粒转化PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。

实施例1

引入并强化表达乳糖运输酶基因lacY

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的α-淀粉酶基因amyE的上下游序列、乳糖运输酶基因lacY、P43启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。

将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为25μg/mL博来霉素抗性的LB平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

由于替换框中存在α-淀粉酶基因amyE的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE的上下游序列同源，通过同源重组，替换框中的P43启动子、乳糖运输基因lacY和博来霉素抗性基因替换枯草芽孢杆菌168α-淀粉酶基因amyE位点。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认乳糖运输酶基因(lacY)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，琼脂糖凝胶电泳图见图2，菌落PCR验证有特殊条带，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即乳糖运输酶基因(lacY)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认乳糖运输酶基因(lacY)强化表达成功后，得到枯草芽孢杆菌168L。

实施例2

外源表达脆弱拟杆菌和幽门螺旋杆菌外源基因

根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，ATCC No.26695)的岩藻糖基转移酶futC基因序列，通过基因futC,fkp和质粒pP43NMK的PCR线性扩增以及使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)一步克隆连接，构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒pP43-fkp-futC。

使用KpnI和PstI内切酶双酶切fkp、futC基因序列和质粒pP43-mpd，使用50μl体系在37℃反应30min，纯化回收后使用连接酶进行连接，使用10μl反应体系在16℃反应2h。构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒pP43-fkp-futC。

将构建好的重组质粒电转化枯草芽孢杆菌168L的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，琼脂糖凝胶电泳图见图3，菌落PCR验证有特殊条带，且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到枯草芽孢杆菌168L-FF。

实施例3

发酵生产2'-岩藻糖基乳糖

将上述枯草芽孢杆菌168L-FF制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH₄)SO₄6g/L,K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L、KH₂PO₄2.5g/L、CaCO₃5g/L、微量元素溶液10ml/L；微量元素溶液含有：MnSO₄·5H₂O 1.0g/L、CoCl₂·6H₂O0.4g/L、NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.2g/L、AlCl₃·6H₂O 0.1g/L、CuCl₂·H₂O0.1g/L、H₃BO₄0.05g/L、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养20h。

发酵结束时，使用液-质联用色谱仪测定发酵上清液中的2'-岩藻糖基乳糖的含量，2'-岩藻糖基乳糖的气质联用色谱图如图1所示，测定的2'-岩藻糖基乳糖的含量达到1.042g/L。

实施例4

发酵生产2'-岩藻糖基乳糖

将上述枯草芽孢杆菌168L-FF制成种子液，种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

将种子液以OD值为0.3的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH₄)SO₄6g/L,K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L、KH₂PO₄2.5g/L、CaCO₃5g/L、微量元素溶液10ml/L；微量元素溶液含有：MnSO₄·5H₂O 1.0g/L、CoCl₂·6H₂O0.4g/L、NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.2g/L、AlCl₃·6H₂O 0.1g/L、CuCl₂·H₂O0.1g/L、H₃BO₄0.05g/L、5M HCl，于40℃、250rpm条件下培养25h。

发酵结束时，发酵上清液中2'-岩藻糖基乳糖含量达到0.827g/L。

对比例1

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的α-淀粉酶基因amyE的上下游序列、乳糖运输酶基因lacY、P43启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。

将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为25μg/mL博来霉素抗性的LB平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

由于替换框中存在α-淀粉酶基因amyE的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的P43启动子和乳糖运输基因lacY替换枯草芽孢杆菌168α-淀粉酶基因amyE位点。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认乳糖运输酶基因(lacY)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即乳糖运输酶基因(lacY)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认乳糖运输酶基因(lacY)强化表达成功后，得到枯草芽孢杆菌168L。

用枯草芽孢杆菌168L发酵生产2'-岩藻糖基乳糖，发酵条件与实施例3相同，发酵结束时，离心收集获得细胞，发酵上清液中未检测到2'-岩藻糖基乳糖。

对比例2

根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，ATCCNo.26695)的岩藻糖基转移酶futC的序列、构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒。

将构建好的重组质粒电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。

通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，测序后确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到枯草芽孢杆菌168-FF。

用重组枯草芽孢杆菌168-FF发酵生产2'-岩藻糖基乳糖，发酵条件与实施例3相同，发酵结束时，发酵上清液中2'-岩藻糖基乳糖含量达到0.424g/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4681

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

acccgacatc cggcgttctc atggcggtgc ttgccgccag cggtattccg tatgtcaagt 60

ggctgcggtt tatggtgccg cttgctctga tttggttctt gatcgggctt gtctttatcg 120

tgatcggagt catgatcaat tgggggccgt tttaacgatt gctgcccgcc ggcttgtacg 180

gcgggctttt gagttattca ttgcagaagc gcaggctgtt attgtaacat gtaagccata 240

agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc atgaataatc tgcgtaatag actttcaggc 300

gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa aaagaacaaa aaatctggtc ggagattggg 360

atgatagcgg gagcatttgc gctgcttgat gtgatcatcc gcggcattat gtttgaattt 420

ccgtttaaag aatgggctgc aagccttgtg tttttgttca tcattatctt atattactgc 480

atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg ccgagaatag acaccaaaga agaactgcaa 540

aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca attgcggtcg cctttgcggt agtggtgctt 600

acgatgtacg acagggggat tccccataca ttcttcgctt ggctgaaaat gattcttctt 660

tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg cttcggtatg tgattgtgaa gctggcttac 720

agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag aaatcatctt ttttgtttgg aaagcgaggg 780

aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt ataggaacat tgatttgtat tcactctgcc 840

aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat tttaaatgta agcgttaaca aaattctcca 900

gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg gaagaatgaa gtaagaggga tttttgactc 960

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aataaaatta actaaaataa ttattatcta gataaaaaat ttagaagcca atgaaatcta 1260

taaataaact aaattaagtt tatttaatta acaactatgg atataaaata ggtactaatc 1320

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tattaactgt cagcacatat ttggacgggc aatacggtgc agatgacgtg tacatcggtg 4680

t 4681

<210> 2

<211> 9586

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420

gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480

cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540

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atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780

aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840

cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900

ggaaaagtga gaccatggag agaaaagaaa atcgctaatg ttgattactt tgaacttctg 960

catattcttg aatttaaaaa ggctgaaaga gtaaaagatt gtgctgaaat attagagtat 1020

aaacaaaatc gtgaaacagg cgaaagaaag ttgtatcgag tgtggttttg taaatccagg 1080

ctttgtccaa tgtgcaactg gaggagagca atgaaacatg gcattcagtc acaaaaggtt 1140

gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200

aaaaatgttt atgatggcga agaattaaat aagagtttgt cagatatggc tcaaggattt 1260

cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320

gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380

gtggaaccaa cttattttaa gaatacagaa aactacgtga atcaaaaaca atggattcaa 1440

ttttggaaaa aggcaatgaa attagactat gatccaaatg taaaagttca aatgattcga 1500

ccgaaaaata aatataaatc ggatatacaa tcggcaattg acgaaactgc aaaatatcct 1560

gtaaaggata cggattttat gaccgatgat gaagaaaaga atttgaaacg tttgtctgat 1620

ttggaggaag gtttacaccg taaaaggtta atctcctatg gtggtttgtt aaaagaaata 1680

cataaaaaat taaaccttga tgacacagaa gaaggcgatt tgattcatac agatgatgac 1740

gaaaaagccg atgaagatgg attttctatt attgcaatgt ggaattggga acggaaaaat 1800

tattttatta aagagtagtt caacaaacgg gccagtttgt tgaagattag atgctataat 1860

tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920

ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980

agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040

attaaggaac gaatattgga taaatatggg gatgatgtta aggctattgg tgtttatggc 2100

tctcttggtc gtcagactga tgggccctat tcggatattg agatgatgtg tgtcatgtca 2160

acagaggaag cagagttcag ccatgaatgg acaaccggtg agtggaaggt ggaagtgaat 2220

tttgatagcg aagagattct actagattat gcatctcagg tggaatcaga ttggccgctt 2280

acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340

gtgtatcaaa ctgctaaatc ggtagaagcc caaacgttcc acgatgcgat ttgtgccctt 2400

atcgtagaag agctgtttga atatgcaggc aaatggcgta atattcgtgt gcaaggaccg 2460

acaacatttc taccatcctt gactgtacag gtagcaatgg caggtgccat gttgattggt 2520

ctgcatcatc gcatctgtta tacgacgagc gcttcggtct taactgaagc agttaagcaa 2580

tcagatcttc cttcaggtta tgaccatctg tgccagttcg taatgtctgg tcaactttcc 2640

gactctgaga aacttctgga atcgctagag aatttctgga atgggattca ggagtggaca 2700

gaacgacacg gatatatagt ggatgtgtca aaacgcatac cattttgaac gatgacctct 2760

aataattgtt aatcatgttg gttacgtatt tattaacttc tcctagtatt agtaattatc 2820

atggctgtca tggcgcatta acggaataaa gggtgtgctt aaatcgggcc attttgcgta 2880

ataagaaaaa ggattaatta tgagcgaatt gaattaataa taaggtaata gatttacatt 2940

agaaaatgaa aggggatttt atgcgtgaga atgttacagt ctatcccggc attgccagtc 3000

ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060

catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120

agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180

ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240

atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300

aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360

aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420

cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480

cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540

gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600

aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660

aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720

aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780

aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840

atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900

aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960

gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020

aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080

gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140

tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200

attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260

gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320

atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380

tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcatt ataggtaaga 4440

gaggaatgta cacatggcat ttaaggttgt tcagatttgc ggggggttag ggaatcagat 4500

gtttcaatat gcgtttgcga aaagcctgca aaaacactca aatacgccgg ttctgctgga 4560

tattacgtcg tttgattggt cagatagaaa aatgcaactg gaactgtttc cgatcgatct 4620

gccatatgca agcgaaaaag aaattgcaat cgcaaaaatg caacatctgc ctaaactggt 4680

gagagatgcg ctgaaatgca tgggattcga ccgcgtttca aaagaaattg tttttgaata 4740

cgagccggaa ctgctgaaac cgtcaagact gacatacttc tatggttact tccaagatcc 4800

gagatatttt gatgcgatca gtcctctgat taaacaaaca tttacactgc cgccgccgcc 4860

gcctgaaaat ggcaacaata aaaagaaaga agaggaatat caccgcaaat tagcactgat 4920

tctggcagca aaaaattcag tttttgttca tattagaaga ggcgattatg ttggcattgg 4980

ctgccaactg ggcattgatt atcaaaaaaa agcactggaa tatatggcaa aaagagttcc 5040

gaatatggaa ctgtttgttt tttgcgaaga tctgacattt acacaaaatc tggatctggg 5100

ctatccgttt atggatatga caacaagaga taaagaagaa gaagcatatt gggatatgct 5160

gctgatgcaa tcatgccaac atggcattat tgcaaattca acatattcat ggtgggcagc 5220

atatctgatt aataatccgg aaaaaattat tattggcccg aaacattggc tgtttggcca 5280

tgaaaatatt ctgtgcaaag aatgggttaa aattgaatca cattttgaag ttaaatcaca 5340

aaaatataat gcataaacta gtgtagcggt accgagctcg gctttcaagt aagtcggtcc 5400

taaactagta aaggaggtga aatgtacaca tggcacacgt tcgggggtta caactgccgg 5460

gctgcttagc gttggcggcg ttgtgcagct tagttcactc ccaacacgtt tttttagcgc 5520

cgcaacaggc acgctcgctg ctgcaacgcg ttagaagggc aaatactttt ctggaagaag 5580

tgagaaaggg caatcttgag cgtgaatgcg ttgaagaaac atgctcgtat gaagaagcat 5640

ttgaagcact ggaatcatca acagcaacag acgtgttttg ggcaaagtat acagcatgtg 5700

aaacagcacg gacaccgaga gataaactgg cagcatgcct ggaaggaaac tgcgcagagg 5760

gactgggcac gaactataga ggacatgtaa atattacgag atcaggaatt gaatgccaac 5820

tgtggagaag cagatacccg cacaaaccgg aaattaattc aacaacacat ccgggcgcag 5880

atctgcaaga aaatttttgc agaaatccgg acagctcaac aacaggcccg tggtgctaca 5940

cgacagaccc gaccgttaga agacaagaat gctcaatccc ggtctgcggc caagatcaag 6000

tgacagtagc aatgacgcca cgctcagaag gatcatcagt taatttaagc ccgccgctgg 6060

aacaatgcgt tcctgataga ggccaacaat accaaggccg tctggcagtt acaacacatg 6120

gcctgccgtg cctggcatgg gcatcagcac aagcaaaggc actgtcaaaa caccaagatt 6180

tcaattcagc agtgcaactg gtcgaaaatt tttgtagaaa cccggatggc gatgaagaag 6240

gcgtttggtg ctacgttgca ggcaaaccag gagattttgg ctattgcgac ctcaattatt 6300

gcgaggaagc agtcgaagaa gaaacaggcg atggactgga tgaagattca gatagggcaa 6360

ttgaaggtag aacagcaaca tcagaatatc aaacattttt caacccgcga acctttggca 6420

gtggagaagc agactgcgga ttaagaccgc tgtttgaaaa aaaatcactg gaagataaaa 6480

cagaaagaga actgctggaa tcatatattg atggcagaat tgttgaaggc tcagatgcag 6540

aaattggcat gtcaccgtgg caagttatgc tgtttagaaa atcaccgcaa gaactgctgt 6600

gcggcgcatc actgatttca gatagatggg ttctgacagc agcacattgc ctgctgtatc 6660

cgccgtggga taaaaatttt acagaaaatg atctgctggt tagaattggc aaacattcaa 6720

gaacaagata tgaaagaaat attgaaaaaa tttcaatgct ggaaaaaatt tatattcatc 6780

cgagatataa ttggagagaa aatctggata gagatattgc actgatgaaa ctgaaaaaac 6840

cggttgcatt ttcagattat attcatccgg tttgcctgcc ggatagagaa acagcagcat 6900

cactgctgca agcaggctat aaaggcagag ttacaggctg gggcaatctg aaagaaacat 6960

ggacagcaaa tgttggcaaa ggccaaccgt cagttctgca agttgttaat ctgccgattg 7020

ttgaaagacc ggtttgcaaa gattcaacaa gaattagaat tacagataat atgttttgcg 7080

caggctataa accggatgaa ggcaaaagag gcgatgcatg cgaaggcgat tcaggcggcc 7140

cgtttgttat gaaatcaccg tttaataata gatggtatca aatgggcatt gtttcatggg 7200

gcgaaggctg cgatagagat ggcaaatatg gcttttatac acatgttttt agactgaaaa 7260

aatggattca aaaagttatt gatcaatttg gcgaataact cgagcccggg tctagactgc 7320

agaagattgc tagctctaga ctgcagaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 7380

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 7440

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 7500

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 7560

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 7620

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 7680

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 7740

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 7800

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 7860

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 7920

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 7980

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 8040

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 8100

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 8160

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 8220

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 8280

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 8340

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 8400

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 8460

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 8520

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 8580

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 8640

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 8700

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 8760

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 8820

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 8880

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 8940

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 9000

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 9060

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 9120

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 9180

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 9240

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 9300

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 9360

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 9420

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 9480

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 9540

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 9586

Claims (9)

1.一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

2.根据权利要求1所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。

4.一种权利要求1所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：

(1)构建包含淀粉酶基因amyE位点的上下游序列、乳糖运输酶基因、P43启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；

(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求4所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框的添加量为100-300ng。

7.根据权利要求4所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将脆弱拟杆菌中的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因序列，幽门螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pP43NMK进行克隆连接。

8.根据权利要求4所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。

9.权利要求1所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2'-岩藻糖基乳糖。