CN109554385A - 一种基因工程菌制备2-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基因工程菌，是在原始菌株基础上通过敲除和/或增强与2‑岩藻糖基乳糖代谢途径有关的基因获得的。该基因工程菌能够更好地积累体内高浓度的乳糖和GDP‑Fuc，进而能够提高终产物2‑岩藻糖基乳糖的产量。本发明还提供了利用该基因工程菌生产2‑岩藻糖基乳糖的方法和应用。

Description

一种基因工程菌制备2-岩藻糖基乳糖的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体来说，涉及一种关于2-岩藻糖基乳糖生产的基因工程菌及其生产方法和应用。
背景技术
人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是一种低度聚合糖，是母乳中第三大固体成分。因缺少相关的酶，它不会在人的肠道内被消化，但可被肠道内的微生物特别是有益微生物降解，从而起到营养肠道上皮细胞作用，同时可降低结肠pH值，抑制有害细菌的增殖。并且人乳寡糖具有与肠黏膜细胞表面的多糖类似的抗原表位，从而可竞争性的抑制致病菌的结合并抵御病原微生物的侵袭。2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-FL)，是人乳中最丰富的寡糖之一。在婴儿体内，2'-FL不会被消化，可到达结肠后表现为可溶性益生元。研究表明，含有2'-FL强化配方奶粉具有类似于母乳喂养的卡路里密度，类似于母乳喂养的对照组，喂食2'-FL配方奶粉的婴儿表现出较低的血浆和离体炎症细胞因子表征。基于上述研究，美国食品药品监督管理局(FDA)于2016年、欧盟食品安全局(EFSA)于2017年批准2'-FL作为新食品成分使用，且雅培公司和雀巢公司新进推出了添加2'-FL的婴儿奶粉。
目前有两种方法可大量生产2'-FL，(1)化学法；(2)微生物体内合成法。化学法工艺繁琐，副产物多，且环保压力大，因此微生物体内合成法是目前公认的更好的选择。通过微生物发酵方法得到2'-FL，主要考虑如下三个方面进行优化：①作为合成2'-FL的受体乳糖的含量；②作为合成2'-FL的供体鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)的含量；③2'-FL合成酶(FucT)的活性。下面分别从上述三个方面分析如何优化从而高效合成2'-FL。
受体乳糖的摄取：乳糖价格低廉，Abramson等，证明大肠杆菌K12中的乳糖通透酶(LacY)能够协助乳糖从培养基进入到细胞质中，但在大肠杆菌体内存在β-半乳糖苷酶(LacZ)可降解乳糖，因此为维持大肠杆菌胞内高浓度的乳糖，需要敲除LacZ基因(Microb.Cell Fact.2013，12,40.；Microb.Cell Fact.2012，11,48.；Glycobiology.2002,12,235.)。乳糖乙酰化酶(LacA)使体内高浓度的乳糖转化为乙酰乳糖，从而抑制大肠杆菌的生长，因此为了更好的保持体内高浓度的乳糖，证明敲除LacA基因有利于高浓度乳糖的维持(Bioessays.2009,31,769.)。
供体GDP-Fuc的生成：GDP-Fuc是大肠杆菌的天然中间体荚膜异多糖酸生物合成的中间体，但体内的GDP-Fuc含量较低不足以满足合成2'-FL的供体需求。GDP-Fuc可以通过两条途径合成：(1)一个是天然存在于大肠杆菌中的从头合成途径(de novo pathway)，该方法利用五种重组酶(Man A，ManB，ManC，Gmd，WcaG/Fcl)从果糖-6-磷酸合成GDP-Fuc，从而进一步合成2'-FL(Microb.Cell Fact.2013,12,40.；Biotechnol.Bioeng.2016,113,2443.)。(2)另外一种补救途径(salvage pathway)天然存在于一些拟杆菌菌株和哺乳动物细胞中，在此途径中，通过重组表达一种来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的双功能酶，L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)，可以利用L-岩藻糖合成GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)，从而通过2'-FL合成酶进一步合成2'-FL(Biotechnol Bioeng.2016,113,2443)。Seo等证明敲除大肠杆菌BL21(DE3)菌种岩藻糖异构酶(FucI)和核酮糖激酶(FucK)等基因更有利于体内GDP-Fuc的积累和2'-FL的合成(Biotechnol Bioeng,2016,113,2443).
2'-FL合成酶：如果大肠杆菌体内存在乳糖和GDP-Fuc，通过重组表达的2'-FL合成酶可以大量合成2'-FL。这已被国际上多个实验室证明(Metabol.Eng.2017,41,23.；Biotechnol.Bioeng.2016,113,2443.；Microb.Cell Fact.2013,12,40.；Microb.CellFact.2012,11,48.；Angew.Chem.2006,45,1810.)。但目前仍没有对2'-FL合成酶改构提高2'-FL产量的研究。
发明内容
本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，并根据对其代谢途径的分析，敲除2-岩藻糖基乳糖分解代谢途径相关的基因，增强2-岩藻糖基乳糖合成途径相关的基因，并通过对合成途径相关基因进行改构优化，获得能够高效生产累积2-岩藻糖基乳糖的生产菌株，具有广泛的工业应用价值。
本发明的第一方面，提供了一种2-岩藻糖基乳糖基因工程生产菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)敲除原始菌株中与2-岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为：LacA、FucI和FucK；
(2)增强步骤(1)中所述基因敲除菌株中与2-岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因，所述增强的基因为L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)和2-岩藻糖基乳糖合成酶(FucT)。具体来说，增强步骤(1)中所述基因敲除菌株中与二岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因的方法包括如下步骤：(1)构建包含过表达FKP和FucT的重组载体：(2)将步骤(1)中所述重组载体导入基因敲除菌株中，获得2-岩藻糖基乳糖生产菌株。
在一种优选情况下，过表达的2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT选自幽门螺旋杆菌FucT、鼬鼠螺杆菌FucT或嗜热聚球藻FucT，优选为幽门螺旋杆菌FucT；过表达的FKP为脆弱拟杆菌FKP。在另一种优选情况下，过表达的2-岩藻糖基乳糖合成酶为2个或2个以上串联重复，优选为2个，所述串联重复序列之间可通过连接多肽连接，所述连接多肽优选为柔性多肽，序列为GGGGS或GGGGSGGGGS。具体地，过表达FKP的蛋白序列如SEQ ID No 1所示，基因序列如SEQ ID No 2所示；过表达2-岩藻糖基乳糖合成酶的蛋白序列如SEQ ID No 3所示，基因序列如SEQ ID No 4所示；连接肽4连接的两个串联重复的FucT基因序列如SEQ ID No 5所示。
FKP蛋白序列：
MQKLLSLPSN LVQSFHELER VNRTDWFCTS DPVGKKLGSG GGTSWLLEECYNEYSDGATFGEWLEKEKRI LLHAGGQSRR LPGYAPSGKI LTPVPVFRWE RGQHLGQNLLSLQLPLYEKIMSLAPDKLHT LIASGDVYIR SEKPLQSIPE ADVVCYGLWV DPSLATHHGVFASDRKHPEQLDFMLQKPSL AELESLSKTH LFLMDIGIWL LSDRAVEILM KRSHKESSEELKYYDLYSDFGLALGTHPRI EDEEVNTLSV AILPLPGGEF YHYGTSKELI SSTLSVQNKVYDQRRIMHRKVKPNPAMFVQ NAVVRIPLCA ENADLWIENS HIGPKWKIAS RHIITGVPENDWSLAVPAGVCVDVVPMGDK GFVARPYGLD DVFKGDLRDS KTTLTGIPFG EWMSKRGLSYTDLKGRTDDLQAVSVFPMVN SVEELGLVLR WMLSEPELEE GKNIWLRSEH FSADEISAGANLKRLYAQREEFRKGNWKAL AVNHEKSVFY QLDLADAAED FVRLGLDMPE LLPEDALQMSRIHNRMLRARILKLDGKDYR PEEQAAFDLL RDGLLDGISN RKSTPKLDVY SDQIVWGRSPVRIDMAGGWTDTPPYSLYSG GNVVNLAIEL NGQPPLQVYV KPCKDFHIVL RSIDMGAMEIVSTFDELQDYKKIGSPFSIP KAALSLAGFA PAFSAVSYAS LEEQLKDFGA GIEVTLLAAIPAGSGLGTSSILASTVLGAI NDFCGLAWDK NEICQRTLVL EQLLTTGGGW QDQYGGVLQGVKLLQTEAGFAQSPLVRWLP DHLFTHPEYK DCHLLYYTGITRTAKGILAE IVSSMFLNSSLHLNLLSEMKAHALDMNEAI QRGSFVEFGR LVGKTWEQNK ALDSGTNPPA VEAIIDLIKDYTLGYKLPGAGGGGYLYMVA KDPQAAVRIR KILTENAPNP RARFVEMTLS DKGFQVSRS
FKP基因序列(SEQ ID No 2)
ATGCAAAAAC TACTATCTTT ACCGTCCAAT CTGGTTCAGT CTTTTCATGAACTGGAGAGGGTGAATCGTA CCGATTGGTT TTGTACTTCC GACCCGGTAG GTAAGAAACTTGGTTCCGGTGGTGGAACAT CCTGGCTGCT TGAAGAATGT TATAATGAAT ATTCAGATGGTGCTACTTTTGGAGAGTGGC TTGAAAAAGA AAAAAGAATT CTTCTTCATG CGGGTGGGCAAAGCCGTCGTTTACCCGGCT ATGCACCTTC TGGAAAGATT CTCACTCCGG TTCCTGTGTTCCGGTGGGAGAGAGGGCAAC ATCTGGGACA AAATCTGCTT TCTCTGCAAC TTCCCCTATATGAAAAAATCATGTCTTTGG CTCCGGATAA ACTCCATACA CTGATTGCGA GTGGTGATGTCTATATTCGTTCGGAGAAAC CTTTGCAGAG TATTCCCGAA GCGGATGTGG TTTGTTATGGACTGTGGGTAGATCCGTCTC TGGCTACCCA TCATGGCGTG TTTGCTTCCG ATCGCAAACATCCCGAACAACTCGACTTTA TGCTTCAGAA GCCTTCGTTG GCAGAATTGG AATCTTTATCGAAGACCCATTTGTTCCTGA TGGACATCGG TATATGGCTT TTGAGTGACC GTGCCGTAGAAATCTTGATGAAACGTTCTC ATAAAGAAAG CTCTGAAGAA CTAAAGTATT ATGATCTTTATTCCGATTTTGGATTAGCTT TGGGAACTCA TCCCCGTATT GAAGACGAAG AGGTCAATACGCTATCCGTTGCTATTCTGC CTTTGCCGGG AGGAGAGTTC TATCATTACG GGACCAGTAAAGAACTGATTTCTTCAACTC TTTCCGTACAGAATAAGGTT TACGATCAGC GTCGTATCATGCACCGTAAAGTAAAGCCCAATCCGGCTAT GTTTGTCCAAAATGCTGTCG TGCGGATACCTCTTTGTGCCGAGAATGCTG ATTTATGGAT CGAGAACAGT CATATCGGAC CAAAGTGGAAGATTGCTTCACGACATATTA TTACCGGGGT TCCGGAAAAT GACTGGTCAT TGGCTGTGCCTGCCGGAGTGTGTGTAGATG TGGTTCCGAT GGGTGATAAG GGCTTTGTTG CCCGTCCATACGGTCTGGACGATGTTTTCAAAGGAGATTT GAGAGATTCC AAAACAACCC TGACGGGTATTCCTTTTGGTGAATGGATGT CCAAACGCGG TTTGTCATAT ACAGATTTGAAAGGACGTACGGACGATTTACAGGCAGTTT CCGTATTCCC TATGGTTAAT TCTGTAGAAG AGTTGGGATTGGTGTTGAGGTGGATGTTGT CCGAACCCGA ACTGGAGGAA GGAAAGAATA TCTGGTTACGTTCCGAACATTTTTCTGCGG ACGAAATTTC GGCAGGTGCC AATCTGAAGC GTTTGTATGCACAACGTGAAGAGTTCAGAA AAGGAAACTG GAAAGCATTG GCCGTTAATC ATGAAAAAAGTGTTTTTTATCAACTTGATT TGGCCGATGC AGCTGAAGAT TTTGTACGTC TTGGTTTGGATATGCCTGAATTATTGCCTG AGGATGCTCT GCAGATGTCA CGCATCCATA ACCGGATGTTGCGTGCGCGTATTTTGAAAT TAGACGGGAA AGATTATCGT CCGGAAGAAC AGGCTGCTTTTGATTTGCTTCGTGACGGCT TGCTGGACGG GATCAGTAAT CGTAAGAGTA CCCCAAAATTGGATGTATATTCCGATCAGA TTGTTTGGGG ACGTAGCCCC GTGCGCATCG ATATGGCAGGTGGATGGACCGATACTCCTC CTTATTCACT TTATTCGGGA GGAAATGTGG TGAATCTAGCCATTGAGTTGAACGGACAAC CTCCCTTACA GGTCTATGTG AAGCCGTGTA AAGACTTCCATATCGTCCTGCGTTCTATCG ATATGGGTGC TATGGAAATA GTATCTACGT TTGATGAATTGCAAGATTATAAGAAGATCG GTTCACCTTT CTCTATTCCG AAAGCCGCTC TGTCATTGGCAGGCTTTGCACCTGCGTTTT CTGCTGTATC TTATGCTTCA TTAGAGGAAC AGCTTAAAGATTTCGGTGCAGGTATTGAAG TGACTTTATT GGCTGCTATT CCTGCCGGTT CCGGTTTGGGCACCAGTTCCATTCTGGCTT CTACCGTACT TGGTGCCATT AACGATTTCT GTGGTTTAGCCTGGGATAAAAATGAGATTT GTCAACGTAC TCTTGTTCTT GAACAATTGC TGACTACCGGAGGTGGATGGCAGGATCAGT ATGGAGGTGT GTTGCAGGGT GTGAAGCTTC TTCAGACCGAGGCCGGCTTTGCTCAAAGTC CATTGGTGCG TTGGCTACCC GATCATTTAT TTACGCATCCTGAATACAAAGACTGTCACT TGCTTTATTA TACCGGTATA ACTCGTACGG CAAAAGGGATCTTGGCAGAAATAGTCAGTT CCATGTTCCT CAATTCATCG TTGCATCTCA ATTTACTTTCGGAAATGAAGGCGCATGCAT TGGATATGAA TGAAGCTATA CAGCGTGGAA GTTTTGTTGAGTTTGGCCGTTTGGTAGGAA AAACCTGGGA ACAAAACAAA GCATTGGATA GCGGAACAAATCCTCCGGCTGTGGAGGCAA TTATCGATCT GATAAAAGAT TATACCTTGG GATATAAATTGCCGGGAGCCGGTGGTGGCG GGTACTTATA TATGGTAGCG AAAGATCCGC AAGCTGCTGTTCGTATTCGTAAGATACTGA CAGAAAACGC TCCGAATCCG CGGGCACGTT TTGTCGAAATGACGTTATCTGATAAGGGAT TCCAAGTATC ACGATCA TAA
2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT蛋白序列(SEQ ID No 3)
MAFKVVQICG GLGNQMFQYA FAKSLQKHSN TPVLLDITSF DWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQ HLPKLVRDAL KCMGFDRVSQ EIVFEYEPKL LKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTF TLPPPPENNK NNNKKEEEYQ CKLSLILAAK NSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEY MAKRVPNMEL FVFCEDLEFT QNLDLGYPFM DMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANST YSWWAAYLIE NPEKIIIGPK HWLFGHENIL CKEWVKIESH FEVKSQKYNA
2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT基因序列(SEQ ID No 4)
ATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATACGCTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAACACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCACTTCTTTTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAATTAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCCTATGCGAGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCAACACCTCCCCAAGCTAGTAAGAGACGCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGAAATCGTTTTTGAATACGAGCCTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTTCCAAGATCCACGATACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCACCACCACCAGAAAATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAAGCTTTCTTTGATTTTAGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGATTATGTGGGGATTGGCTGTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAGCGCGTGCCAAACATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCACGCAAAATCTTGATCTTGGCTACCCTTTTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAAGAGGCGTATTGGGACATGCTGCTCATGCAATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATAGCACTTATAGCTGGTGGGCGGCCTATTTGATAGAAAATCCAGAAAAAATCATTATTGGCCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCATGAGAATATCCTTTGTAAGGAGTGGGTGAAAATAGAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAAAAGTATAACGCTTAA
带有连接多肽4的双重复2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT基因序列(SEQ ID No 5)
ATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATACGCTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAACACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCACTTCTTTTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAATTAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCCTATGCGAGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCAACACCTCCCCAAGCTAGTAAGAGACGCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGAAATCGTTTTTGAATACGAGCCTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTTCCAAGATCCACGATACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCACCACCACCAGAAAATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAAGCTTTCTTTGATTTTAGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGATTATGTGGGGATTGGCTGTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAGCGCGTGCCAAACATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCACGCAAAATCTTGATCTTGGCTACCCTTTTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAAGAGGCGTATTGGGACATGCTGCTCATGCAATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATAGCACTTATAGCTGGTGGGCGGCCTATTTGATAGAAAATCCAGAAAAAATCATTATTGGCCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCATGAGAATATCCTTTGTAAGGAGTGGGTGAAAATAGAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAAAAGTATAACGCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCTAAGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATACGCTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAACACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCACTTCTTTTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAATTAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCCTATGCGAGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCAACACCTCCCCAAGCTAGTAAGAGACGCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGAAATCGTTTTTGAATACGAGCCTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTTCCAAGATCCACGATACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCACCACCACCAGAAAATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAAGCTTTCTTTGATTTTAGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGATTATGTGGGGATTGGCTGTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAGCGCGTGCCAAACATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCACGCAAAATCTTGATCTTGGCTACCCTTTTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAAGAGGCGTATTGGGACATGCTGCTCATGCAATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATAGCACTTATAGCTGGTGGGCGGCCTATTTGATAGAAAATCCAGAAAAAATCATTATTGGCCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCATGAGAATATCCTTTGTAAGGAGTGGGTGAAAATAGAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAAAAGTATAACGCTTAA
本发明的第二方面，提供了一种通过上述方法构建获得的基因工程菌。优选情况下，该基因工程菌的原始菌株为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为JM109(DE3)。
在本发明的第三方面，提供了一种2-岩藻糖基乳糖的生产方法，通过发酵上述的基因工程菌生产。优选地，所述生产方法还包括在发酵之后利用LacZ重组菌降解多余的乳糖。在一种优选情况下，发酵中所用到的种子培养基组成为KH2PO4 7.8g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,2.33g/L,Trace metal solution 1ml/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,卡那霉素50mg/L；发酵培养基组成为KH2PO4 2.2g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,4.5g/L,Tracemetal solution 1ml/L,微生素B 210mg/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl240mg/L,消泡剂204 75μL/L,卡那霉素50mg/L
本发明第四方面还提供了上述基因工程菌用于生产2-岩藻糖基乳糖的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的基因工程菌，通过敲除和/或增强表达与2-岩藻糖基乳糖代谢相关的基因，能够更好地积累体内高浓度的乳糖和GDP-Fuc，进而能够提高终产物2-岩藻糖基乳糖的产量；而且在菌种发酵之后向发酵液中添加重组表达LacZ的冻融的大肠杆菌降解生产结束后未利用的乳糖，从而得到高于99％转化的2-岩藻糖基乳糖，有利于后续的终产物纯化。
附图说明
图1是用于2-岩藻糖基乳糖生产的基因工程菌构建模式图。
图2是(FucT)n-FKP过表达载体构建模式图。
图3是检测发酵液中2-岩藻糖基乳糖产量质谱图。
图4是不同连接多肽的双串联FucT和单FucT菌株生产2-岩藻糖基乳糖产量的比较。
图5是单FucT、双串联FucT和三串联FucT菌株生产2-岩藻糖基乳糖产量的比较。
图6是单FucT和双串联FucT菌株在高密度发酵条件下生产2-岩藻糖基乳糖产量的比较。
图7是HPLC检测冻融的LacZ重组菌消化后的乳糖水平。
图8是双串联FucT-JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK菌和FucT-JM109(DE3)菌在高密度发酵条件下生产2-岩藻糖基乳糖产量的比较
具体实施方式
本发明实施例公开了一种构建生产2-岩藻糖基乳糖的基因工程菌株的方法以及该菌株的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
本发明涉及的基因名称解释如下：
LacA：半乳糖苷O-乙酰转移酶
LacZ：β-半乳糖苷酶
FucI：岩藻糖异构酶
FucK：墨角藻糖激酶
FKP：L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶
FucT：岩藻糖基转移酶
实施例1、合成2'-FL的基因工程菌构建大肠杆菌JM109(DE3)购自Promega公司，pRSFDuet-1购自Novagen公司.内切酶、PCR酶等购自天根生化科技(北京)有限公司，pKD3，pKD46和pCP20质粒购自Biovector公司。
(1)基因敲除：大肠杆菌JM109(DE3)是敲除了LacZ基因的大肠杆菌K12的衍生菌，因敲除了LacZ基因从而消除了β-半乳糖苷酶降解乳糖的活性，且该菌株中存在岩藻糖(Fuc)转运蛋白，而大肠杆菌BL21(DE3)中不存在这个转运蛋白，因此该菌更有利于岩藻糖进入到体内合成高浓度的GDP-Fuc。FucI和FucK分别为体内代谢岩藻糖的两个酶(图1)。为了更好的积累大肠杆菌体内高浓度的乳糖和GDP-Fuc，利用RED重组技术基因敲除系统，敲除JM109(DE3)中的LacA、FucI和FucK基因，从而构建JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK基因工程菌。
①取出制备的pKD46质粒及目标菌株感受态，冰上放置5min左右，待感受态刚刚融化，取1μL(≤50ng)质粒加入100μL感受态细胞中，轻弹混匀。冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mL SOC(LB亦可)培养基，30℃，180rpm培养1h。取200μL复苏菌液(或浓缩的菌液)，均匀涂布于LB平板(Amp)上，30℃倒置培养过夜。第二天挑取大肠杆菌JM109(DE3)/pKD46平板上单一菌斑，验证菌株。
②PCR扩增线性敲除基因LacA、FucI和FucK基因片段。敲除LacA引物(F1：TGCGGCGCGAGCGCCTTATCCGACCAACATATCATAACGG AGTGATCGCATCCTCCTTAGTTCCTATTCC，R1：GCTGAACTTGTAGGCCTGATAAGCGCAGCGTATCAGGCAATTTTTATAATCAGCATTACACGTCTTGAG)；敲除FucI和FucK基因簇的引物(F1:CAAACGGCAACTAACTGAACATATTTTCCGAATAAAGTGAGGAATCTGTATCCTCCTTAGTTCCTATTCC，R1:GCACTTTCAATAGTTCGGGAGAAATTAACG GCGAAATTGTTTTCAGCATTCAGCATTACACGTCTTGAG),以pKD3为模板PCR得到目标产物，胶回收后得到纯的敲除基因片段。
③接大肠杆菌JM109(DE3)/pKD46于30℃培养，OD600达到0.1时，加入终浓度0.2％的L-阿拉伯糖贮存液，诱导pKD46-λ-red系统表达，当OD600达到0.3-0.4时，制备感受态。加入敲除基因片段到感受态中，电转后，陆续敲除LacA基因和FucI和FucK基因簇。经PCR验证后，保存阳性克隆菌株。
④42℃培养，去除pKD46质粒。
⑤将pCP20质粒转入去除掉pKD46质粒的阳性菌中，30℃培养后，去除掉抗性基因，并保存阳性菌。42℃过夜培养后，去除pCP20质粒。最终得到JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK基因工程菌。
(2)重组表达载体的构建：①重组FKP表达载体的构建：将GDP-Fuc合成酶FKP构建于RSFDuet-1质粒中，制备表达FKP载体，具体构建方法如下：将pRSFDuet-1质粒与FKP-pUC15质粒分别进行Sac I与BamH I双酶切；琼脂糖凝胶电泳分离，并胶回收FKP基因片段以及RSFDuet-1载体片段；通过T4DNA连接酶，将基因片段与载体片段连接后，化学法转化DH5α感受态细胞，从而获得载体FKP-pRSFDuet-1，并进行测序验证，并保存序列正确的菌株。②单个和串联2'-FL合成酶(FucT)表达载体的构建：将来源于幽门螺杆菌的FucT构建到载体FKP-pRSFDuet-1上获得表达FKP和FucT蛋白的载体。pRSFDuet-1载体为两个独立的T7启动子载体，因此FKP和FucT蛋白分别表达，而不是形成融合蛋白。本研究为了得到更高的产量的2'-FL，设计了带有螺旋式多肽或者柔性多肽的两个或三个串联的FucT表达菌株，从而验证串联FucT是否会提高2'-FL产量。具体构建方法如下：将合成单个/两个/三个FucT与FKP-pRSFDuet-1质粒分别进行Nde I和EcoR V双酶切；琼脂糖凝胶电泳分离，并胶回收单个或串联的FucT基因片段以及FKP-pRSFDuet-1载体片段；通过T4DNA连接酶，将基因片段与载体片段连接后，化学法转化DH5α感受态细胞，从而获得载体(FucT)n-FKP-pRSFDuet-1，并进行测序验证(图2)。将验证正确的载体(FucT)n-FKP-pRSFDuet-1转化宿主大肠杆菌JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK，通过卡那抗性LB平板，筛选得到阳性克隆。
表1：连接多肽序列信息:
实施例2、摇瓶发酵含有串联FucT工程菌合成2'-FL产量的比较
比较含有不同连接多肽的两个串联的FucT和单个FucT的重组菌的2'-FL的产量，从而检测哪个连接多肽活性最好，2'-FL产量最佳，具体方法如下：
(1)取不同的双串联FucT的菌株(FucT)2-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK，按1:1000(V/V)接种于LB液体培养基(Kan+)中，37℃，180rpm培养。
(2)待500ml菌液OD600达到0.6-0.8时，降温至18℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG，诱导酶表达，3h后加入5g/L的乳糖和5g/L的岩藻糖(Fuc)，18℃培养，分别于24h，36h，48h,60h,72h,84h,96h取样。
(3)所得样品100℃煮沸30min后，12000rpm离心后，取上清利用HPLC-HILIC-ELSD分析2'-FL的产量。
(4)MALDI-TOF的结果显示(图3)，构建的菌株发酵后可产生2'-FL，计算分子量(M+Na):511.161，发现分子量(M+Na):511.233，(M+K):527.248，其中发现分子量(M+Na):364.943为乳糖。通过不同菌株的发酵结果显示(图4)，双串联FucT的菌株比单个FucT菌株可产生更大量的2'-FL，带有连接多肽4的两个串联FucT工程菌合成2'-FL的产量更高，可达到2.2g/L，证明柔性多肽比螺旋式多肽更适合双串联FucT的活性的发挥，重复的柔性多肽比单个柔性多肽效果更好。因此设计合成带有柔性多肽4的三个串联FucT工程菌合成2'-FL。选择连接多肽4串联FucT，比较单个、两个和三个串联FucT工程菌合成2'-FL的产量，具体方法见上。
结果显示(图5)，在乳糖和GDP-Fuc过量的条件下，三个串联FucT工程菌(FucT)3-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK合成2'-FL的产量低于两个串联FucT工程菌(FucT)2-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK，原因可能为三个串联的FucT体内活性不高于两个串联的FucT，或者是含有三个串联FucT的重组菌将更多的氮源和碳源用在合成重组酶上，不利于2'-FL的生产。因此选择带有连接肽4的双串联FucT菌株进行Fed-batch高密度发酵实验。
实施例3、含有单个和双串联FucT工程菌的分批补料(Fed-batch)高密度发酵法合成2'-FL产量的比较通过分批补料的高密度发酵的方式比较含有单个或者双个串联FucT工程菌合成2'-FL的能力，具体方法如下：
(1)取单个或两个串联的(FucT)n-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK菌株，按1:1000接种于50ml无机盐液体培养基(KH2PO4 7.8g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,2.33g/L,Trace metal solution 1ml/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,卡那霉素50mg/L)中，37℃，180rpm过夜培养；
(2)传代到500ml无机盐液体培养基中，直至OD600＝1，并转移全部500ml种子菌液至7L培养基(KH2PO4 2.2g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,4.5g/L,Trace metal solution 1ml/L,微生素B 210mg/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,消泡剂204 75μL/L,卡那霉素50mg/L)的发酵罐中，维持37℃，pH 7.0，溶氧30％至甘油耗尽。调整温度至28℃，补加15g/L乳糖、15g/L Fuc和0.5mM IPTG，同时63h内匀速加入补料培养基3L(KH2PO4 1.5g L-1,(NH4)2HPO4 10g/L,NaH2PO4 4g/L,(NH4)2SO4 5g/L,柠檬酸1g/L,Trace metal solution6ml/L(EDTA 5g/L,FeSO4·7H2O 10g/L,ZnSO4·7H2O 2g/L,MnSO4·H2O 2g/L,CoCl2·6H2O0.2g/L,CuSO4·H2O 0.1g/L,ZnSO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.1g/L),微生素B 50mg/L,甘油200g/L,MgSO4 4.6g/L,CaCl2 2mg/L,消泡剂-204 75μL/L,乳糖100g/L，Fuc100g/L)。
整个发酵时间为81h，每三小时取样，分析菌体干重和利用HPLC-HILIC-ELSD分析2'-FL产量，每个样做三个重复。结果显示(图6)，双串联FucT工程菌(FucT)2-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK合成2'-FL的产量高于单FucT工程菌(FucT)2-FKP-pRSFDuet-1/JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK，可达到37.03±0.78g/L。
实施例4、冻融LacZ重组菌消化乳糖的优化构建来源大肠杆菌的LacZ酶的重组载体LacZ-pET15b，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达后，将菌体重悬于缓冲液【100mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)，100mM NaCl,1％Triton X-100(v/v)】中，放置于-20℃过夜冻存后，从冰箱拿出置于25℃解冻，通过此方法可以大大增强菌的通透性，使得大分子进入到胞内，经此方法冻融过的菌基本不再有增殖能力，但可保证菌体内重组酶的活性。经此方法冻融过的LacZ菌悬液，在25℃时，每升诱导表达的重组菌LacZ可消化811.99±40.60g乳糖。向2'-FL发酵后的发酵罐(7L)中加入400ml冻融后的LacZ重组菌，在25℃过夜培养后，100℃，30min灭菌后，离心后用HPLC-HILIC-ELSD检测2'-FL和未被利用的乳糖，结果显示胞内胞外未被利用的乳糖均已被LacZ重组菌降解，仅剩下目标产物2'-FL(图7)。
实施例5、双串联(FucT)2-JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK菌和FucT-JM109(DE3)菌在高密度发酵条件下生产2-岩藻糖基乳糖产量的比较通过分批补料的高密度发酵的方式比较双串联(FucT)2-JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK菌和单个FucT在原始JM109(DE3)菌中合成2'-FL的能力，具体方法如下：
(1)分别取双串联(FucT)2-FKP-pRSFDuet-1-JM109(DE3)ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK菌和FucT-FKP-pRSFDuet-1-JM109(DE3)菌株，按1:1000接种于50ml无机盐液体培养基(KH2PO4 7.8g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,2.33g/L,Trace metal solution 1ml/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,卡那霉素50mg/L)中，37℃，180rpm过夜培养；
(2)传代到500ml无机盐液体培养基中，直至OD600＝1，并转移全部500ml种子菌液至7L培养基(KH2PO4 2.2g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,4.5g/L,Trace metal solution 1ml/L,微生素B 210mg/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,消泡剂204 75μL/L,卡那霉素50mg/L)的发酵罐中，维持37℃，pH 7.0，溶氧30％至甘油耗尽。调整温度至28℃，补加15g/L乳糖、15g/L Fuc和0.5mM IPTG，同时63h内匀速加入补料培养基3L(KH2PO4 1.5g L-1,(NH4)2HPO4 10g/L,NaH2PO4 4g/L,(NH4)2SO4 5g/L,柠檬酸1g/L,Trace metal solution6ml/L(EDTA 5g/L,FeSO4·7H2O 10g/L,ZnSO4·7H2O 2g/L,MnSO4·H2O 2g/L,CoCl2·6H2O0.2g/L,CuSO4·H2O 0.1g/L,ZnSO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.1g/L),微生素B 50mg/L,甘油200g/L,MgSO4 4.6g/L,CaCl2 2mg/L,消泡剂-204 75μL/L,乳糖100g/L，Fuc100g/L)。
整个发酵时间为81h，每三小时取样，分析菌体干重和利用HPLC-HILIC-ELSD分析2'-FL产量，每个样做三个重复。结果显示(图8)，转入单FucT的原始菌株JM109(DE3)【FucT-JM109(DE3)】在高密度发酵条件下生产2'-FL产量的仅为14.67±0.15g/L，由此证明串联FucT和敲除掉ΔLacA/ΔFucI/ΔFucK三个基因的组合设计，可提升2'-FL 2.5倍的产量达到37.03±0.78g/L。
序列表
<110> 石家庄葛兰德生物科技有限公司
<120> 一种基因工程菌制备2-岩藻糖基乳糖的方法
<130> 2018001
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
SEQ ID No 1：
MQKLLSLPSN LVQSFHELER VNRTDWFCTS DPVGKKLGSG GGTSWLLEEC YNEYSDGATF
GEWLEKEKRI LLHAGGQSRR LPGYAPSGKI LTPVPVFRWE RGQHLGQNLL SLQLPLYEKI
MSLAPDKLHT LIASGDVYIR SEKPLQSIPE ADVVCYGLWV DPSLATHHGV FASDRKHPEQ
LDFMLQKPSL AELESLSKTH LFLMDIGIWL LSDRAVEILM KRSHKESSEE LKYYDLYSDF
GLALGTHPRI EDEEVNTLSV AILPLPGGEF YHYGTSKELI SSTLSVQNKV YDQRRIMHRK
VKPNPAMFVQ NAVVRIPLCA ENADLWIENS HIGPKWKIAS RHIITGVPEN DWSLAVPAGV
CVDVVPMGDK GFVARPYGLD DVFKGDLRDS KTTLTGIPFG EWMSKRGLSY TDLKGRTDDL
QAVSVFPMVN SVEELGLVLR WMLSEPELEE GKNIWLRSEH FSADEISAGA NLKRLYAQRE
EFRKGNWKAL AVNHEKSVFY QLDLADAAED FVRLGLDMPE LLPEDALQMS RIHNRMLRAR
ILKLDGKDYR PEEQAAFDLL RDGLLDGISN RKSTPKLDVY SDQIVWGRSP VRIDMAGGWT
DTPPYSLYSG GNVVNLAIEL NGQPPLQVYV KPCKDFHIVL RSIDMGAMEI VSTFDELQDY
KKIGSPFSIP KAALSLAGFA PAFSAVSYAS LEEQLKDFGA GIEVTLLAAI PAGSGLGTSS
ILASTVLGAI NDFCGLAWDK NEICQRTLVL EQLLTTGGGW QDQYGGVLQG VKLLQTEAGF
AQSPLVRWLP DHLFTHPEYK DCHLLYYTGI TRTAKGILAE IVSSMFLNSS LHLNLLSEMK
AHALDMNEAI QRGSFVEFGR LVGKTWEQNK ALDSGTNPPA VEAIIDLIKD YTLGYKLPGA
GGGGYLYMVA KDPQAAVRIR KILTENAPNP RARFVEMTLS DKGFQVSRS
SEQ ID No 2：
5’-ATGCAAAAACTACTATCTTTACCGTCCAATCTGGTTCAGTCTTTTCATGAACTGGAGAGG
GTGAATCGTACCGATTGGTTTTGTACTTCCGACCCGGTAGGTAAGAAACTTGGTTCCGGT
GGTGGAACATCCTGGCTGCTTGAAGAATGTTATAATGAATATTCAGATGGTGCTACTTTT
GGAGAGTGGCTTGAAAAAGAAAAAAGAATTCTTCTTCATGCGGGTGGGCAAAGCCGTCGT
TTACCCGGCTATGCACCTTCTGGAAAGATTCTCACTCCGGTTCCTGTGTTCCGGTGGGAG
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TCGGAGAAACCTTTGCAGAGTATTCCCGAAGCGGATGTGGTTTGTTATGGACTGTGGGTA
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TTGTTCCTGATGGACATCGGTATATGGCTTTTGAGTGACCGTGCCGTAGAAATCTTGATG
AAACGTTCTCATAAAGAAAGCTCTGAAGAACTAAAGTATTATGATCTTTATTCCGATTTT
GGATTAGCTTTGGGAACTCATCCCCGTATTGAAGACGAAGAGGTCAATACGCTATCCGTT
GCTATTCTGCCTTTGCCGGGAGGAGAGTTCTATCATTACGGGACCAGTAAAGAACTGATT
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GTAAAGCCCAATCCGGCTATGTTTGTCCAAAATGCTGTCGTGCGGATACCTCTTTGTGCC
GAGAATGCTGATTTATGGATCGAGAACAGTCATATCGGACCAAAGTGGAAGATTGCTTCA
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GATGTTTTCAAAGGAGATTTGAGAGATTCCAAAACAACCCTGACGGGTATTCCTTTTGGT
GAATGGATGTCCAAACGCGGTTTGTCATATACAGATTTGAAAGGACGTACGGACGATTTA
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GAGTTCAGAAAAGGAAACTGGAAAGCATTGGCCGTTAATCATGAAAAAAGTGTTTTTTAT
CAACTTGATTTGGCCGATGCAGCTGAAGATTTTGTACGTCTTGGTTTGGATATGCCTGAA
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AAGAAGATCGGTTCACCTTTCTCTATTCCGAAAGCCGCTCTGTCATTGGCAGGCTTTGCA
CCTGCGTTTTCTGCTGTATCTTATGCTTCATTAGAGGAACAGCTTAAAGATTTCGGTGCA
GGTATTGAAGTGACTTTATTGGCTGCTATTCCTGCCGGTTCCGGTTTGGGCACCAGTTCC
ATTCTGGCTTCTACCGTACTTGGTGCCATTAACGATTTCTGTGGTTTAGCCTGGGATAAA
AATGAGATTTGTCAACGTACTCTTGTTCTTGAACAATTGCTGACTACCGGAGGTGGATGG
CAGGATCAGTATGGAGGTGTGTTGCAGGGTGTGAAGCTTCTTCAGACCGAGGCCGGCTTT
GCTCAAAGTCCATTGGTGCGTTGGCTACCCGATCATTTATTTACGCATCCTGAATACAAA
GACTGTCACTTGCTTTATTATACCGGTATAACTCGTACGGCAAAAGGGATCTTGGCAGAA
ATAGTCAGTTCCATGTTCCTCAATTCATCGTTGCATCTCAATTTACTTTCGGAAATGAAG
GCGCATGCATTGGATATGAATGAAGCTATACAGCGTGGAAGTTTTGTTGAGTTTGGCCGT
TTGGTAGGAAAAACCTGGGAACAAAACAAAGCATTGGATAGCGGAACAAATCCTCCGGCT
GTGGAGGCAATTATCGATCTGATAAAAGATTATACCTTGGGATATAAATTGCCGGGAGCC
GGTGGTGGCGGGTACTTATATATGGTAGCGAAAGATCCGCAAGCTGCTGTTCGTATTCGT
AAGATACTGACAGAAAACGCTCCGAATCCGCGGGCACGTTTTGTCGAAATGACGTTATCT
GATAAGGGATTCCAAGTATCACGATCATAA-3’
SEQ ID No 3：
MAFKVVQICG GLGNQMFQYA FAKSLQKHSN TPVLLDITSF DWSDRKMQLE LFPIDLPYAS
AKEIAIAKMQ HLPKLVRDAL KCMGFDRVSQ EIVFEYEPKL LKPSRLTYFF GYFQDPRYFD
AISPLIKQTF TLPPPPENNK NNNKKEEEYQ CKLSLILAAK NSVFVHIRRG DYVGIGCQLG
IDYQKKALEY MAKRVPNMEL FVFCEDLEFT QNLDLGYPFM DMTTRDKEEE AYWDMLLMQS
CQHGIIANST YSWWAAYLIE NPEKIIIGPK HWLFGHENIL CKEWVKIESH FEVKSQKYNA
SEQ ID No 4：
5’-ATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATA
CGCTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAACACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCAC
TTCTTTTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAATTAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCC
TATGCGAGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCAACACCTCCCCAAGCTAGT
AAGAGACGCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGAAATCGTTTTTG
AATACGAGCCTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTTCCA
AGATCCACGATACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCA
CCACCACCAGAAAATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAA
GCTTTCTTTGATTTTAGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGAT
TATGTGGGGATTGGCTGTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATA
TGGCAAAGCGCGTGCCAAACATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCAC
GCAAAATCTTGATCTTGGCTACCCTTTTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAA
GAGGCGTATTGGGACATGCTGCTCATGCAATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATA
GCACTTATAGCTGGTGGGCGGCCTATTTGATAGAAAATCCAGAAAAAATCATTATTGG
CCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCATGAGAATATCCTTTGTAAGGAGTGGGTGAAAATA
GAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAAAAGTATAACGCTTAA-3’
SEQ ID No 5：
5’-ATGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATACG
CTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAACACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCACTTCTT
TTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAATTAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCCTATGCG
AGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCAACACCTCCCCAAGCTAGTAAGAGAC
GCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGAAATCGTTTTTGAATACGAGC
CTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTTCCAAGATCCACGAT
ACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCACCACCACCAGAAA
ATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAAGCTTTCTTTGATTTTA
GCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGATTATGTGGGGATTGGCT
GTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAGCGCGTGCC
AAACATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCACGCAAAATCTTGATCTTGG
CTACCCTTTTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAAGAGGCGTATTGGGACATGC
TGCTCATGCAATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATAGCACTTATAGCTGGTGGGCGG
CCTATTTGATAGAAAATCCAGAAAAAATCATTATTGGCCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCA
TGAGAATATCCTTTGTAAGGAGTGGGTGAAAATAGAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAA
AAGTATAACGCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCTAAGCTTTTAAGGTGGTG
CAAATTTGCGGAGGGCTTGGGAATCAAATGTTTCAATACGCTTTCGCTAAAAGTTTGCAAAAA
CACTCTAATACGCCTGTGCTGTTAGATATCACTTCTTTTGATTGGAGCGATAGGAAAATGCAAT
TAGAACTTTTCCCTATTGATTTGCCCTATGCGAGCGCGAAAGAAATCGCTATAGCTAAAATGCA
ACACCTCCCCAAGCTAGTAAGAGACGCGCTCAAATGCATGGGATTTGATAGGGTGAGTCAAGA
AATCGTTTTTGAATACGAGCCTAAATTGCTAAAGCCAAGCCGCTTGACTTATTTTTTTGGCTATTT
CCAAGATCCACGATACTTTGATGCTATATCCCCTTTAATCAAGCAAACCTTCACTCTACCACCAC
CACCAGAAAATAATAAGAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAATATCAGTGCAAGCTTTCTTTGA
TTTTAGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTGCATATAAGAAGAGGGGATTATGTGGGGATTGGCT
GTCAGCTTGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAGCGCGTGCCAAAC
ATGGAGCTTTTTGTGTTTTGCGAAGACTTAGAATTCACGCAAAATCTTGATCTTGGCTACCCTT
TTATGGACATGACCACTAGGGATAAAGAAGAAGAGGCGTATTGGGACATGCTGCTCATGCA
ATCTTGTCAGCATGGCATTATCGCTAATAGCACTTATAGCTGGTGGGCGGCCTATTTGATAG
AAAATCCAGAAAAAATCATTATTGGCCCCAAACACTGGCTTTTTGGGCATGAGAATATCCTT
TGTAAGGAGTGGGTGAAAATAGAATCCCATTTTGAGGTAAAATCCCAAAAGTATAACGCTTAA-3’

Claims (10)

1.一种2-岩藻糖基乳糖基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)敲除原始菌株中与2-岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为：LacA、FucI和FucK；
(2)增强步骤(1)中所述基因敲除菌株中与2-岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因，所述增强的基因为L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)和2-岩藻糖基乳糖合成酶(FucT)。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述增强步骤(1)中所述基因敲除菌株中与2-岩藻糖基乳糖合成代谢途径相关的基因的方法包括如下步骤：
(1)构建过表达FKP和2-岩藻糖基乳糖合成酶基因的重组载体；
(2)将步骤(1)中所述重组载体导入基因敲除菌株中，获得2-岩藻糖基乳糖生产菌株。
3.根据权利要求1或2任一项所述的构建方法，其特征在于过表达的2-岩藻糖基乳糖合成酶(FucT)选自幽门螺旋杆菌FucT、鼬鼠螺杆菌FucT或嗜热聚球藻FucT，优选为幽门螺旋杆菌FucT；过表达的FKP为脆弱拟杆菌FKP。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于过表达的2-岩藻糖基乳糖合成酶为1个或1个以上串联重复，优选为2个，所述串联重复序列之间可通过连接多肽连接，所述连接多肽优选为柔性多肽，序列为GGGGS或GGGGSGGGGS，优选为GGGGSGGGGS。
5.权利要求1-4任一项方法构建获得的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述原始菌株为大肠杆菌，优选为大肠杆菌JM109(DE3)。
7.权利要求5-6任一项所述的基因工程菌用于生产2-岩藻糖基乳糖的应用。
8.一种2-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于通过发酵权利要求5-7任一项所述的基因工程菌生产。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于还包括在发酵之后利用β-半乳糖苷酶(LacZ)重组菌降解多余的乳糖。
10.根据权利要求8或9所述的生产方法，其特征在于种子培养基组成为KH2PO4 7.8g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,2.33g/L,Trace metal solution 1ml/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl2 40mg/L,卡那霉素50mg/L；发酵培养基组成为KH2PO4 2.2g/L,柠檬酸1g/L,(NH4)2SO4,4.5g/L,Trace metal solution 1ml/L,微生素B 210mg/L,甘油22g/L,MgSO4 1g/L,CaCl240mg/L,消泡剂204 75μL/L,卡那霉素50mg/L。
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