JP2022546825A - バチルス属細胞におけるシアリル化オリゴ糖の生産 - Google Patents
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Abstract
シアリル化オリゴ糖を生産するための非芽胞形成性バチルス属細胞であって、ラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されたバチルス属細胞、ならびに前記バチルス属細胞を使用してシアリル化オリゴ糖を生産するための方法が開示されている。【選択図】図1
Description
本発明は、遺伝子操作の技術分野、特にバチルス属細胞(Bacillus cell)においてシアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞の遺伝子操作、前記バチルス属細胞を使用するシアリル化オリゴ糖の発酵生産、およびそのように生産されたシアリル化オリゴ糖の使用に関する。
人乳は、健全な成長と発達に必要なすべての栄養素を乳幼児に提供する。人乳中に存在する糖類はその主成分であり、脂肪およびタンパク質がそれに続く。人乳は、エネルギー源となるラクトースのほかに、より複雑な糖類分子、すなわちオリゴ糖を含んでいる。これまでに、約200種の構造的に異なるオリゴ糖が人乳において同定されている。これらのオリゴ糖は、人乳中にのみ有意な濃度で確認されており、総称してヒトミルクオリゴ糖(HMO)として知られている。前記HMOは、二糖ラクトース(グルコース(Glc)部分およびガラクトース(Gal)部分からなる)をベースとし、N-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)、フコース(Fuc)、シアル酸/N-アセチルノイラミン酸(NeuNAc)、および/またはガラクトース(Gal)をベースとするさらなる単糖残基を有する。人乳中のHMOの濃度および組成は、個人差で変化し、初乳で最大20g/Lから成熟乳で5~10g/Lまで授乳期によって変化する。
相当数のHMOが少なくとも1つのNeuNAc部分を有している。これらのシアリル化ヒトミルクオリゴ糖(SHMO)のうち、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、シアリルラクト-N-テトラオースa、シアリルラクト-N-テトラオースb、シアリルラクト-N-テトラオースc、およびジシアリル-ラクト-N-テトラオースは人乳中で最も多く含まれているメンバーである。
シアル酸(Sia)は、炭素9個の骨格を持つ負に帯電した単糖のファミリーである。これらのα-ケト酸の50種を超える形態が自然界で確認されている。最も豊富なシアル酸は、N-アセチルノイラミン酸(NANA、NeuNAc、Neu5Ac)のようである。
シアル酸は、脊椎動物および高等無脊椎動物の細胞表面上の複合糖質(糖タンパク質および糖脂質)に存在するグリカンの末端単糖部分として存在する。シアル酸は、大腸菌(Escherichia coli)K1、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、パスツレラ・マルトシダ(Pateurella multocida)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、およびストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)を含む病原細菌のリポ多糖および莢膜多糖の成分である。
シアリル化HMOは、腸病原性細菌およびウイルスに対する乳児の抵抗性をサポートすることが観察された。興味深いことに、最近の研究では、早産児において最も一般的であり致死的な疾患の一つである壊死性腸炎に対する長鎖SHMOの保護効果がさらに実証された。また、シアリル化オリゴ糖は、大腸菌、コレラ菌(Vibrio cholerae)、サルモネラ菌(Salmonella)を含む様々な病原性微生物のエンテロトキシンを中和することが知られている。さらに、シアリル化オリゴ糖は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)による腸のコロニー形成を阻害し、それにより胃潰瘍および十二指腸潰瘍を予防または抑制することが明らかとなった。さらに、SHMOは乳児の脳の発達およびその認知能力をサポートすると考えられている。
HMO、特にシアリル化HMOの既知の利点によって、これらのシアリル化オリゴ糖またはこれらのシアリル化オリゴ糖の少なくとも一部を乳児用調合乳用の補充物として利用することができるように、それらを生産するための経済的に価値のあるプロセスが望まれている。
乳児への授乳以外の目的で人乳を利用することが制限されていること、また天然源から個々のヒトミルクオリゴ糖の純粋な画分を得ることが困難であることから、それらを合成するための化学的経路が開発されるに至った。しかし、化学合成や生体触媒のin vitroアプローチでは、商業的に持続可能であることが証明されていない。さらに、ヒトミルクオリゴ糖の化学合成には、最終製品が汚染されるリスクのある、いくつかの有害な化学物質の使用が含まれる。
化学的および生体触媒的なin vitro合成の代替として、HMOの発酵生産が開発されてきた。これまで、工業的規模でのいくつかのHMOの微生物生産に組換え大腸菌細胞が使用されている。
しかし、大腸菌属は病原性のメンバーと非病原性のメンバーを含んでいる。HMOの微生物生産に非病原性大腸菌株が使用されているが、そのような非病原性大腸菌は、様々な法域において、人による消費を目的とした製品の製造にとって安全であるとは認識されていない。このことにより、前記法域では、人が消費するための現在のバイオテクノロジー手法によって製造されたHMOの規制当局の承認が妨げられている。したがって、このような法域で人が消費するための化合物の生産に使用される場合に、人が消費するのに安全であると認められるか、または安全であると認められる属の微生物細胞が、人の消費を目的とする糖類の製造で、特に乳児が消費するための、例えばヒトミルクオリゴ糖の製造には必要とされている。安全であると認められた生産菌株を使用することにより、人の健康に及ぼす糖質のリスクの可能性に関して、少なくとも疑われる懸念が減り、ほとんどの法域において規制当局による承認が容易になる。
この問題は、シアリル化オリゴ糖、特にシアリル化HMOの生産にバチルス属の細菌細胞を使用することによって解決される。バチルス属のいくつかの種の細菌細胞は、既に、人による消費に対して、または人により消費される化合物/食品の生産に対して安全であることが認められている。したがって、一般に安全であると認められる種および/または菌株のバチルス属細胞が、シアリル化オリゴ糖の生産、特にシアリル化ヒトミルクオリゴ糖の生産に提供される。
バチルス属の細菌は、好気性種または通性嫌気性種のいずれかのグラム陽性、桿状の内生胞子形成性微生物細胞である。バチルス属はファーミキューテス門に属する。バチルス属のメンバーのゲノムは、そのコドン使用頻度におけるA-T塩基対への偏りを有する。バチルス属の種は、自然界にほぼ遍在している。それらは、例えば、土壌中(枯草菌(B.subtilis))で確認されるだけでなく、極端な環境、例えば高pH(バチルス・アルカロフィラス(B.alcalophilus))、高温(バチルス・サーモフィラス(B.thermophilus))、または高塩分(バチルス・ハロヂュランス(B.halodurans))などにおいても存在し得る。
バチルス属には、自由生活種と寄生性病原種を含む266の命名された種が含まれる。医学的には2つのバチルス種:炭疽病を引き起こす炭疽菌(B.anthracis)および食中毒を引き起こすバチルス・セレウス(B.cereus)が重要であると考えられる。3番目の種であるバチルス・チューリンゲンシス(B.thuringiensis)は、昆虫を死滅させることができる毒素を産生する重要な昆虫病原体である。そのため、それは害虫を防除するための殺虫剤として使用される。
それらのGRAS(食品医薬品局合格証、Generally Recognized as Safe)ステータスにより、いくつかのバチルス属の種、例えばバチルス・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)、および枯草菌は、食品業界および製薬業界で使用される各種タンパク質および化合物のバイオテクノロジー生産に使用されている。
バチルス・アミロリクエファシエンスは制限酵素BamHIの供給源であり、天然の抗生物質タンパク質バルナーゼも合成する。さらに、バチルス・アミロリクエファシエンスは、炭疽菌に対して選択的な活性を持つ抗生物質であるプランタゾリシンを産生する。バチルス・アミロリクエファシエンス由来のアルファ-アミラーゼは、多くの場合、デンプンの加水分解に使用される。バチルス・アミロリクエファシエンスはまた、タンパク質の分解を触媒するサブチリシンの供給源でもある。
バチルス・アミロリクエファシエンスは、細菌および真菌の病原体に対して作用するので、農業、水産養殖および水耕栽培で一部の植物の根の病原体に対処するために使用される根コロニー形成細菌であり、望ましくない病原体を競合排除するか、または撃退することによって感染を防ぐことができる。
アルカリ性セリンプロテアーゼを分泌するその能力が高いことにより、バチルス・リケニフォルミスは、工業用酵素生産において最も重要な細菌の1つになっている。バチルス・リケニフォルミスによって分泌されるサブチリシンカールスバーグ(Subtilisin Carlsberg)は、界面活性剤プロテアーゼとして使用されており、Alcalase(登録商標)という商品名で販売されている。
枯草菌は、土壌ならびに反芻動物およびヒトの消化管で確認されるカタラーゼ陽性細菌である。枯草菌およびこのエンドトキシンを含まない細菌に由来する物質は、食品におけるそれらの安全かつ有益な使用について、様々な権威ある機関によって評価されている。米国では、枯草菌由来のカルボヒドラーゼ酵素およびプロテアーゼ酵素は、米国食品医薬品局(FDA)により一般的に安全(GRAS)と認められている。枯草菌はまた、欧州食品安全機関より「安全性適格推定(Qualified Presumption of Safety)」のステータスも付与されている。
さらに、枯草菌株の非毒素株および非病原性株は、一般的に食品において使用されている。例えば、納豆という形態の発酵大豆が日本では頻繁に消費されており、1グラム当たり108個もの枯草菌生細胞が含まれている。納豆は、健康な腸内フローラおよびビタミンK2の摂取に寄与することが認められている。
納豆製品とその主成分である枯草菌変種の納豆菌(B. subtilis var. natto)は、健康維持に有効であると日本厚生労働省により「特定保健用食品(FOSHU)」として認められている。
枯草菌は取り扱いが容易で、増殖が速く、培養条件がシンプルである。組換え枯草菌株は、ポリヒドロキシアルカノレート、ヒアルロン酸、ならびに様々な酵素、例えばアミラーゼおよびプロテアーゼの生産に使用されている。
枯草菌の野生型天然分離株は、突然変異誘発および選択の順化プロセスを経た実験室株と比較すると、取り扱いが困難である。これらの順化された株は、多くの場合、自然なコンピテンス発達(環境DNAの取り込みおよび組込み)を受ける能力が向上し、増殖能力が向上し、「野生で」必要とされる能力は喪失する。枯草菌では、直鎖状DNAおよび多量体型のプラスミドDNAが天然コンピテント細胞に活発に取り込まれる。
ある特定の生理学的条件下では、枯草菌細胞の小さな亜集団がコンピテントになる。枯草菌では、天然コンピテンスは複雑な制御ネットワークによって制御されている。このネットワークでの重要な制御因子は、とりわけ、コンピテンスマスター制御因子ComKおよび芽胞形成の転写マスター制御因子Spo0Aである。枯草菌細胞の形質転換効率、およびおそらくDNAをそれらのゲノムに組み込むための有効性は、遺伝子工学によって改善することができる。これは、制御プロモーター(例えば、マンニトール誘導性PmtlAプロモーター)ならびにcomK遺伝子およびcomS遺伝子を含む発現カセットを、枯草菌のゲノムに異所的に組み込むことによって達成することができる。さらに、この方策により、複合培地(例えばLB)を使用して天然コンピテンスにより枯草菌を形質転換することが可能になる。
シアリル化オリゴ糖を生産するために、バチルス属細胞は様々な方法で遺伝子操作され得る。
本明細書で使用される用語「遺伝子操作された」とは、分子生物学的方法を使用してバチルス属細胞の遺伝子構成を修飾することを意味する。バチルス属細胞の遺伝子構成の修飾には、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターならびに遺伝子発現を媒介および/または調節する他のヌクレオチド配列を挿入、欠失、置き換えおよび/または修飾する、種の境界内および/または種の境界を越えた遺伝子の導入が含まれ得る。バチルス属細胞の遺伝子構成の修飾は、特定の所望する特性を有する遺伝子修飾されたバチルス属細胞を生成することを目的とする。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞の天然の(遺伝子操作されていない)形態には存在しない1つまたは複数の遺伝子を含むことができる。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入、欠失または変更するために、バチルス属細胞の遺伝情報に外因性核酸分子を導入する、および/または外因性核酸分子(組換え、異種)を挿入する技術は、当業者には公知である。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞の天然形態で存在する1つまたは複数の遺伝子を含むことができ、前記遺伝子は人工的な手段によって修飾され、バチルス属細胞に再導入される。また用語「遺伝子操作された」とは、細胞に対して内因性である核酸分子を含み、細胞から核酸分子を除去することなく修飾されたバチルス属細胞を包含する。このような修飾には、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技術によって得られるものが含まれる。
本明細書で使用される用語「遺伝子操作された」とは、分子生物学的方法を使用してバチルス属細胞の遺伝子構成を修飾することを意味する。バチルス属細胞の遺伝子構成の修飾には、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターならびに遺伝子発現を媒介および/または調節する他のヌクレオチド配列を挿入、欠失、置き換えおよび/または修飾する、種の境界内および/または種の境界を越えた遺伝子の導入が含まれ得る。バチルス属細胞の遺伝子構成の修飾は、特定の所望する特性を有する遺伝子修飾されたバチルス属細胞を生成することを目的とする。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞の天然の(遺伝子操作されていない)形態には存在しない1つまたは複数の遺伝子を含むことができる。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入、欠失または変更するために、バチルス属細胞の遺伝情報に外因性核酸分子を導入する、および/または外因性核酸分子(組換え、異種)を挿入する技術は、当業者には公知である。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞の天然形態で存在する1つまたは複数の遺伝子を含むことができ、前記遺伝子は人工的な手段によって修飾され、バチルス属細胞に再導入される。また用語「遺伝子操作された」とは、細胞に対して内因性である核酸分子を含み、細胞から核酸分子を除去することなく修飾されたバチルス属細胞を包含する。このような修飾には、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技術によって得られるものが含まれる。
遺伝子の組込みおよび/または破壊もしくは欠失による(同時の)遺伝子不活性化は、相同組換えにより達成することができる。効率的な相同組換えのためには、枯草菌では少なくとも400~500bpの相同性アームが必要である。
標的ゲノム操作の別の方法は、CRISPR-Cas9システムである。この迅速なマーカーレスゲノム編集ツールは、大規模なゲノム欠失、大小のDNA挿入、終止コドンの導入による遺伝子サイレンシング、および点突然変異の導入に使用することができる。CRISPR-Cas9によるスカーレスゲノム編集には、これまでのゲノム修飾は必要とされない。
遺伝子のランダムな染色体組込みおよび挿入変異は、修飾されたマリナー由来のトランスポゾンを使用して実施することができる。このシステムは、枯草菌のホットスポット(hotpot)に偏ることなく、ランダムな異所性組込みにおいて高い効率を示す。
バチルス属の種は酵素の工業規模生産に使用されているが、これまで、バチルス属細胞はオリゴ糖の工業規模生産、特にシアリル化オリゴ糖の工業規模生産では実施されてはいない。
中国特許出願CN108410787Aは、ラクチル-N-ネオテトラオースを合成する組換え枯草菌細胞を開示している。前記組換え枯草菌細胞は、細胞のゲノムに組み込まれたラクトースパーミアーゼ遺伝子を有している。さらに、前記バチルス属細胞はβ-1,3-N-グルコサミントランスフェラーゼ遺伝子およびβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを有する。この枯草菌細胞は外因性ラクトースの存在下で培養することができ、最大約1g/Lの力価でラクチル-N-ネオテトラオースを合成するが、これは経済的に合理的な工業規模生産にとっては少量すぎる。
中国特許出願CN109735479Aは、2’-フコシルラクトースを合成するための組換え枯草菌細胞であって、ラクトース輸送酵素の発現が増強され、フコースキナーゼ、リン酸グアニントランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼを発現する組換え枯草菌細胞を開示している。発酵培地中の2’-フコシルラクトースの収量は、0.424g/L~1.042g/Lであると報告された。
様々な特許出願が、中性オリゴ糖、例えば、ラクト-N-ネオテトラオースまたは2’-フコシルラクトースの生産に適していると考えられる属としてバチルス属について言及しているが、シアリル化オリゴ糖、特にシアリル化ヒトミルクオリゴ糖の生産にバチルス属を使用することは、おそらくは、バチルス属でのHMO生産に必要な生合成経路の実現に必要とされる代謝工学において多大な労力を要することから、まだ実現されていない。LNnTを生産する上記枯草菌が枯草菌細胞内で自然に生じるドナー基質に依存するのに対し、バチルス属でのシアリル化オリゴ糖の生産は、シアリル化オリゴ糖の合成に不可欠なドナー基質、すなわちCMP-NeuNAcを提供するために細胞内で異種代謝経路が実行されることが必要とされる。
本目的は、外因性ラクトースを細胞内に取り込むためのラクトースパーミアーゼ、シアル酸部分のドナー基質としてのヌクレオチド活性化シアル酸、すなわちシチジンモノホスフェートN-アセチルノイラミン酸(CMP-NeuNAc)を細胞内形成するためのCMP-NeuNAc生合成経路、およびCMP-NeuNAcからアクセプター基質へシアル酸部分を転移させるためのシアリルトランスフェラーゼを有するバチルス属細胞を提供することによって達成された。外因性ラクトースの存在下でそのようなバチルス属細胞を培養することによって、所望するシアリル化オリゴ糖を生産することができる。
概要
第1の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属の非芽胞形成性細菌細胞であって、バチルス属細胞がラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有する、細菌細胞が提供される。
第1の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属の非芽胞形成性細菌細胞であって、バチルス属細胞がラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有する、細菌細胞が提供される。
第2の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するための、第1の態様に記載のバチルス属の非芽胞形成性細菌細胞の使用が提供される。
第3の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するための方法であって、
- バチルス属細胞がラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有する、バチルス属の非芽胞形成性細菌細胞を提供するステップと;
- ラクトースを含む培地中で、バチルス属細胞がシアリル化オリゴ糖を生産することが許容される条件下で、バチルス属細胞を培養するステップと;
- 任選選択的に、培養培地および/またはバチルス属細胞からシアリル化オリゴ糖を回収するステップ
を含む、方法が提供される。
第3の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するための方法であって、
- バチルス属細胞がラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有する、バチルス属の非芽胞形成性細菌細胞を提供するステップと;
- ラクトースを含む培地中で、バチルス属細胞がシアリル化オリゴ糖を生産することが許容される条件下で、バチルス属細胞を培養するステップと;
- 任選選択的に、培養培地および/またはバチルス属細胞からシアリル化オリゴ糖を回収するステップ
を含む、方法が提供される。
第4の態様によれば、ラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有するバチルス属細胞によって生産されたシアリル化オリゴ糖が提供される。
第5の態様によれば、栄養組成物を製造するための、ラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有するバチルス属細胞によって生産されたシアリル化オリゴ糖の使用が提供される。
第6の態様によれば、ラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有するバチルス属細胞によって生産された少なくとも1つのシアリル化オリゴ糖を含む栄養組成物が提供される。
詳細な説明
第1の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属の非芽胞形成性細菌細胞が提供される。シアリル化オリゴ糖を生産することができるようにするために、バチルス属細胞は、シアル酸部分を含むドナー基質と、二糖またはオリゴ糖であるアクセプター基質をシアル酸トランスフェラーゼに提供しなければならず、その結果、シアル酸トランスフェラーゼはドナー基質から前記アクセプター基質にシアル酸部分を転移し、それによりシアリル化オリゴ糖が生産される。
第1の態様によれば、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属の非芽胞形成性細菌細胞が提供される。シアリル化オリゴ糖を生産することができるようにするために、バチルス属細胞は、シアル酸部分を含むドナー基質と、二糖またはオリゴ糖であるアクセプター基質をシアル酸トランスフェラーゼに提供しなければならず、その結果、シアル酸トランスフェラーゼはドナー基質から前記アクセプター基質にシアル酸部分を転移し、それによりシアリル化オリゴ糖が生産される。
当然のことながら、前記バチルス属細胞が生産することを意図しているシアリル化オリゴ糖は所望するシアリル化オリゴ糖であるが、一方、バチルス属細胞での所望するシアリル化オリゴ糖の生産中にシアリルトランスフェラーゼの多様性(promiscuity)により生成され得る他のシアリル化オリゴ糖は望ましくないシアリル化オリゴ糖または副産物と考えられる。
シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、非芽胞形成性バチルス属細胞である。野生型バチルス属細胞は、芽胞を形成することが可能である。細菌における芽胞形成、すなわち芽胞を形成するプロセスは、異なる形態および運命の娘細胞の形成に至る発生プログラムを開始する細菌細胞の反応であると考えられる。バチルス属の芽胞形成は、細胞分化の基本モデルとして研究された。芽胞形成中に、桿状のバチルス属細胞は非対称に分裂し、それによって形態および運命が異なる2つの遺伝的に同一の細胞が生じる。
しかし、工業生産では、細菌生産株が所望する生成物の発酵生産中に芽胞形成することは望ましくない。したがって、芽胞を形成することができない、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞を使用することが好ましい。このようなバチルス属細胞は、「非芽胞形成性」と呼ばれる。
一実施形態では、シアリル化オリゴ糖を生産するための非芽胞形成性バチルス属細胞は、表1に列挙した枯草菌株のうちの1つに由来する。
一部の実施形態では、バチルス属細胞は、例えばSpo0Aの欠失または機能的不活性化によって、非芽胞形成性になるように遺伝子操作されている。Spo0Aは、芽胞形成の初期段階の際に500を超える遺伝子の発現に直接的または間接的に影響を及ぼすDNA結合タンパク質である。Spo0Aの適切な機能的不活性化には、Spo0FホスホトランスフェラーゼおよびSpo0BホスホトランスフェラーゼがSpo0Aをリン酸化するリン酸化部位の欠失が含まれる。Spo0FホスホトランスフェラーゼおよびSpo0Bホスホトランスフェラーゼリン酸化部位の欠失または機能的不活性化は、Spo0Aの機能的不活性化につながり、それによってバチルス属細胞の芽胞形成能が損なわれる。あるいは、Spo0Aをコードする遺伝子もしくはヌクレオチド配列、またはSpo0Aをコードする遺伝子もしくはヌクレオチド配列の一部がバチルス属細胞のゲノムから欠失していてもよい。
追加および/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、シグマ因子SigE(sigE)および/またはシグマ因子SigF(sigF)をコードする遺伝子の欠失または機能的不活性化によって遺伝子操作されている。シグマ因子SigEおよびSigFは、芽胞形成の初期段階に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現に関与する転写因子である。
Spo0A、SigEおよび/またはSigFの欠失または機能的不活性化は、バチルス属細胞の芽胞形成能を損なわせる。そのような非芽胞形成性バチルス属細胞は、シアリル化オリゴ糖を生産することができるバチルス属細胞を生成するための前駆体として使用され得る。
野生型バチルス属細胞は、細胞内でラクトースを合成することも、外因性ラクトースを内在化(内部移行、internalize)することもない。しかし、ラクトースは、いくつかのシアリル化オリゴ糖、例えば、3’-シアリルラクトース(3-SL)または6’シアリルラクトース(6-SL)などの形成におけるラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼによるシアル酸部分のアクセプター基質である。したがって、そのようなシアリル化オリゴ糖を生産することができるようにするためには、バチルス属細胞は、細胞内でラクトースを生成することによって、および/または外因性ラクトースを内在化することによって、ラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼにラクトースを提供する能力を有していなければならない。さらに、ラクトースは、典型的には、すべてとは言わないにしても、ほとんどのシアリル化HMOが有する二糖部分である。したがって、ラクトースの内部移行(内在化、internalization)はまた、三糖以外のシアリル化HMOの生合成にも、すなわち、NeuNAc部分のアクセプター基質が二糖であるラクトースではなくオリゴ糖である場合にも必要とされる。
一実施形態では、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、外因性ラクトースを内在化するためのラクトースパーミアーゼを有する。したがって、バチルス属細胞は外因性ラクトースを内在化することができる。あるいは、バチルス属細胞は、グルコースおよびガラクトースから細胞内でラクトースを合成するように遺伝子操作されていてもよく、それによりシアリル化オリゴ糖の生産にラクトースの外因性供給は不要となり得る。
本明細書で使用されるラクトースに関する用語「外因性(exogenous)」とは、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞に由来しない、すなわち、前記バチルス属細胞によって細胞内で合成されないが、前記バチルス属細胞の外部に由来するラクトースを意味し、これは、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞を増殖させてシアリル化オリゴ糖を生産する培地に添加される。
一部の実施形態では、バチルス属細胞は、外因性ラクトースを内在化することができるように遺伝子操作されており、すなわち、ラクトースパーミアーゼを有するように遺伝子操作されている。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、異種ラクトースパーミアーゼを有する。適切な異種ラクトースパーミアーゼは、大腸菌LacYまたはその機能的バリアントである。
タンパク質、ポリペプチド、酵素およびトランスポーターに関して、また核酸分子、ヌクレオチド配列および/または遺伝子に関して本明細書で使用される用語「異種」とは、ある分子を含むバチルス属細胞の種にとって、その分子が非天然の分子であること意味する。用語「非天然の」とは、前記分子が、天然に存在するか、または野生型の前駆体バチルス属細胞に、すなわち、自然界で最も一般的に発生する同じ種のバチルス属細胞に存在しないことを示す。したがって、本明細書で使用される「異種配列」または「異種核酸」または「異種ポリペプチド」は、バチルス属細胞にとって外来の供給源に由来する(例えば、異なる種に由来する)もの、または、同じ供給源に由来する場合、その元の形態から修飾されたものである。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換、接合または形質導入によって、宿主微生物宿主細胞のゲノムに安定的に導入することができ、したがって、遺伝子修飾された宿主細胞を示す。配列が導入される宿主細胞に依存する技術が適用され得る。様々な技術が当業者には公知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)に開示されている。したがって、「異種ポリペプチド」は、細胞内では天然には生じないポリペプチドであり、「異種シアリルトランスフェラーゼ」は、微生物細胞内では天然には生じないシアリルトランスフェラーゼである。
酵素および/または輸送分子に関して本明細書で使用される用語「機能的バリアント」とは、参照された酵素または輸送体と同じ活性(酵素的、触媒的または輸送性)を持つが、参照された酵素または輸送体分子とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。したがって、タンパク質/ポリペプチドの典型的なバリアントは、参照タンパク質/ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。バリアントおよび参照タンパク質/ポリペプチドは、任意の組合せにおける1つまたは複数の置換、付加、および/または欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。したがって、用語「機能的バリアント」とは、参照タンパク質/ポリペプチドと同じ活性を持つ参照されたタンパク質/ポリペプチドの短縮型バージョンを含む。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであってもよく、そうでなくてもよい。タンパク質/ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどのように天然に存在するものであってよく、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。タンパク質/ポリペプチドの非天然バリアントは、突然変異誘発技術、直接合成、および当業者に公知の他の組換え方法によって作製することができる。本開示の範囲内において、タンパク質および種間相同体はまた、好ましくは、参照されたポリペプチドに対して少なくとも約25、50、100、200、500、1000、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約60%を超えるアミノ酸配列同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、より好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する用語「バリアント」によって構成される。
本明細書で使用される用語「同じ活性」とは、定性的な方法においてのみ、タンパク質/ポリペプチドの酵素活性、触媒活性、または輸送活性を意味する。したがって、「機能的バリアント」はまた、参照されたタンパク質/ポリペプチドの活性と比較して、増加または減少した活性を持つバリアントを含む。
様々な実施形態では、バチルス属細胞は、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、大腸菌ラクトースパーミアーゼLacY(UniProtKB-P02920)またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
大腸菌ラクトースパーミアーゼLacYは、大腸菌lacY遺伝子(GenBank acc.no:NP_414877.1)のタンパク質コード領域(すなわち、オープンリーディングフレーム)によってコードされている。
したがって、一部の実施形態では、バチルス属細胞は、大腸菌lacYのタンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
一部の実施形態では、異種ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。枯草菌のコドン使用頻度は、全体的なGC含量が約45%未満であり、コドンの1番目の文字のGC含量が約51%を超え、コドンの2番目の文字のCG含量が約36.1%未満であり、コドンの3番目の文字のCG含量が約46%未満であるという点で特有である。
一部の実施形態では、異種ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。枯草菌のコドン使用頻度は、全体的なGC含量が約45%未満であり、コドンの1番目の文字のGC含量が約51%を超え、コドンの2番目の文字のCG含量が約36.1%未満であり、コドンの3番目の文字のCG含量が約46%未満であるという点で特有である。
ラクトースパーミアーゼを発現させるために、バチルス属細胞は、組換えラクトースパーミアーゼ遺伝子を含み、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を媒介する発現制御配列に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される用語「作動可能に連結された(operably linked)」とは、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列(典型的には、「タンパク質コード領域」、「オープンリーディングフレーム」、時には「遺伝子」とも呼ばれる)と、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する第2のヌクレオチド配列(プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位の配列などの発現制御配列)との間の機能的連結を意味するものとする。したがって、用語「プロモーター」とは、通常、DNAポリマー内のオープンリーディングフレームに「先行」し、mRNAへの転写の開始部位を提供するデオキシリボ核酸(DNA)配列を指す。「レギュレーター」DNA配列はまた、通常、所定のDNAポリマー内のオープンリーディングフレームの「上流」(すなわち先行)であり、転写開始の頻度(または速度)を決定するタンパク質に結合する。「プロモーター/レギュレーター」または「制御」DNA配列と総称して呼ばれる、機能的DNAポリマー内の選択されたオープンリーディングフレーム(または一連のオープンリーディングフレーム)に先行するこれらの配列は、オープンリーディングフレームの転写(および最終的な発現)が起こるかどうかを協同して決定する。DNAポリマー中の遺伝子を「追跡」し、mRNAへの転写の終結のシグナルを提供するDNA配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。
組換えラクトースパーミアーゼ遺伝子は、バチルス属染色体に組み込まれて存在してもよく、またはバチルス属細胞内の追加のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在してもよい。
バチルス属細胞で異種ラクトースパーミアーゼ遺伝子を発現させると、得られたバチルス属細胞は、培養培地から外因的に供給されたラクトースを内在化することができるようになる。次いで、内在化されたラクトースは、例えば3’-SLまたは6’-SLの形成において、ラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼ(本明細書の下記を参照)によって転移されるシアル酸部分のアクセプター基質として機能することができる。
シアリル化オリゴ糖を生産するためには、バチルス属は、NeuNAc部分をアクセプター基質に転移するためのドナー基質を提供することができなければならない。NeuNAc部分の例示的なドナー基質は、CMP-NeuNAcである。したがって、バチルス属細胞は、シアリル化オリゴ糖を生産するために、細胞内でCMP-NeuNAcを生産できなければならない。CMP-NeuNAcを細胞内生合成するために、バチルス属細胞はCMP-NeuNAc生合成経路を有する(図1)。したがって、バチルス属細胞は、CMP-NeuNAc生合成経路を持つように遺伝子操作されている。
CMP-NeuNAc生合成経路は、NeuNAcサルベージ経路またはNeuNAcの細胞内de novo生合成のためのシアル酸生合成経路を含む。したがって、バチルス属細胞は、NeuNAcサルベージ経路および/またはシアル酸生合成経路を含むCMP-NeuNAc生合成経路を有する。
NeuNAcサルベージ経路は、バチルス属細胞による外因性シアル酸の内在化、および内在化されたシアル酸のCMP-NeuNAcへの変換を含む。外因性NeuNAcを内在化するために、バチルス属細胞はシアル酸トランスポーターを有する。一部の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、外因性NeuNAcを内在化するためのシアル酸輸送を有するように遺伝子操作されている。適切なシアル酸トランスポーターは、大腸菌NanT(UniProtKB P41036)である。大腸菌NanTは、シアル酸のプロトン依存性共輸送を触媒する。NanTは、NeuNAcならびに関連するシアル酸N-グリコリルノイラミン酸(NeuNGc)および3-ケト-3-デオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノナン酸(KDN)を輸送することができる。一実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、大腸菌NanTまたはその機能的バリアントを有する。
一部の実施形態では、バチルス属細胞は、外因性NeuNAcを内在化するためのシアル酸トランスポーターをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、大腸菌NanTまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
大腸菌NanTは、大腸菌nanT遺伝子のタンパク質コード領域によってコードされている。したがって、一部の実施形態では、バチルス属細胞は、大腸菌シアル酸トランスポーターNanTまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
シアル酸トランスポーターを発現するためには、バチルス属細胞は、組換えシアル酸トランスポーター遺伝子を含み、シアル酸トランスポーターをコードするヌクレオチド配列は、シアル酸トランスポーターをコードするヌクレオチド配列の発現を媒介する発現制御配列に作動可能に連結されている。
組換えシアル酸トランスポーター遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれているように存在し得るか、またはバチルス属細胞内の追加のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
一部の実施形態では、シアル酸トランスポーターをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
様々な実施形態では、CMP-NeuNAc生合成経路は、シアル酸生合成経路を含む。したがって、バチルス属細胞は、N-アセチルノイラミン酸を細胞内生合成するためのシアル酸生合成経路を含み得る。シアル酸生合成経路は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ(図1:(1))およびN-アセチル-ノイラミン酸シンターゼ(=シアル酸シンターゼ)(図1:(10))の酵素活性を含む。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼおよびN-アセチルノイラミン酸シンターゼを有する。
様々な実施形態では、CMP-NeuNAc生合成経路は、シアル酸生合成経路を含む。したがって、バチルス属細胞は、N-アセチルノイラミン酸を細胞内生合成するためのシアル酸生合成経路を含み得る。シアル酸生合成経路は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ(図1:(1))およびN-アセチル-ノイラミン酸シンターゼ(=シアル酸シンターゼ)(図1:(10))の酵素活性を含む。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼおよびN-アセチルノイラミン酸シンターゼを有する。
酵素グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.16)は、グルタミンを使用するフルクトース-6-リン酸(Frc-6P)のグルコサミン-6-リン酸(GlcN-6P)への変換を触媒する(図1:(1))。この酵素反応は、典型的には、ヘキソサミン生合成経路における第1のステップであると考えられる。グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼの別名は、D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、GFAT、グルコサミン-6-リン酸シンターゼ、ヘキソースリン酸アミノトランスフェラーゼ、およびL-グルタミン-D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼである。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、好ましくは異種グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼを有する。適切な異種グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼの例は、大腸菌に由来する。大腸菌グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ(UniProtKB-P17169)はGlmSと呼ばれる。したがって、バチルス属細胞は、大腸菌GlmSまたは大腸菌GlmSの機能的バリアントを有する。好ましくは、大腸菌GlmSの機能的バリアントは、野生型酵素と比較して、グルコサミン-6-リン酸阻害に対する感受性が有意に低下したバージョンである。大腸菌GlmSの機能的バリアントの例は、グルコサミン-6-リン酸阻害に対して有意に低下した感受性を示す。グルコサミン-6-リン酸阻害に対する感受性が有意に低下した大腸菌GlmSの機能的バリアントの例は、国際出願番号第PCT/EP2019/063669(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているGlmS*54およびGlmS*である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、好ましくは大腸菌グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼGlmSをコードするヌクレオチド配列、または、野生型酵素と比較して、グルコサミン-6-リン酸阻害に対する感受性が有意に低下した大腸菌GlmSの機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼを発現するためには、バチルス属細胞は、組換えグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含み、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼのオープンリーディングフレームの発現を媒介する発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シアル酸シンターゼを含む。シアル酸シンターゼは、N-アセチルノイラミン酸(NeuNAc)へのN-アセチルマンノサミン(ManNAc)とホスホエノールピルビン酸(PEP)の縮合を触媒する(図1:(10))。NeuNAcの酵素的形成は、シアル酸生合成経路の最終ステップである。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シアル酸シンターゼまたはその機能的バリアント、好ましくは異種シアル酸シンターゼを含む。シアル酸シンターゼの例は、様々な細菌の種、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス(Butyrivibrio proteoclasticus)、メタノブレビバクター・ルミナティウム(Methanobrevibacter ruminatium)、アセトバクテリウム・ウッディ(Acetobacterium woodii)、デスルフォバクラ・トルオリカ(Desulfobacula toluolica)、大腸菌、プレボテラ・ニグレセンス(Prevotella nigescens)、ハロルハブヅス・ティアマテ(Halorhabdus tiamatea)、デスルフォティグヌム・ホスフィトキシダンス(Desulfotignum phosphitoxidans)、またはカンディダツス・スカリンドゥアの種(Candidatus Scalindua sp.)、イディオマリナ・ロイヒエンシス(Idomarina loihiensis)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)またはナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)に由来するものが公知である。適切なシアル酸シンターゼの例は、C.ジェジュニのneuB遺伝子によってコードされるC.ジェジュニのN-アセチルノイラミン酸シンターゼNeuBである。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、N-アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内N-アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内でN-アセチルノイラミン酸シンターゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えN-アセチルノイラミン酸シンターゼ遺伝子は、バチルス染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
一実施形態では、シアル酸生合成経路は、中間化合物としてウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)を含む。中間化合物としてUDP-GlcNAcを含むシアル酸生合成経路を含むバチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼ(図1:(2))、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(図1:(3))、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジントランスフェラーゼ(図1(4))、およびUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ(図1:(4))をさらに有する。
ホスホグルコサミンムターゼは、グルコサミン-6-リン酸(GlcN-6P)をグルコサミン-1-リン酸(GlcN-1P)に変換する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼを有するように遺伝子操作されている。適切なホスホグルコサミンムターゼは、大腸菌ホスホグルコサミンムターゼGlmMまたはその機能的バリアントである。前記大腸菌GlmMは、大腸菌glmM遺伝子によってコードされている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼを有するように遺伝子操作されている。適切なホスホグルコサミンムターゼは、大腸菌ホスホグルコサミンムターゼGlmMまたはその機能的バリアントである。前記大腸菌GlmMは、大腸菌glmM遺伝子によってコードされている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、大腸菌GlmMまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
大腸菌ホスホグルコサミンムターゼGlmMは、大腸菌glmM遺伝子のタンパク質コード領域によってコードされている。したがって、バチルス属細胞は、大腸菌GlmMをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、ホスホグルコサミンムターゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内ホスホグルコサミンムターゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内でホスホグルコサミンムターゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種ホスホグルコサミンムターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えホスホグルコサミンムターゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
組換えホスホグルコサミンムターゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼは、アセチル補酵素Aからグルコサミン-1-リン酸(GlcN-1-P)へのアセチル基の転移を触媒してN-アセチルグルコサミン-1-リン酸(GlcNAc-1-P)を生成する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内でグルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えグルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、ウリジン5-一リン酸の(ウリジン5-三リン酸からの)転移により、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸(GlcNAc-1-P)をUDP-GlcNAcに変換する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内でN-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えN-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性およびN-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性は、二機能性酵素によって提供される。このような二機能性酵素の例は、大腸菌GlmUである。大腸菌GlmUは、グルコサミン-1-リン酸をUDP-GlcNAcに変換する最終の2つの連続反応を触媒する(図1:(3))。C末端ドメインは、アセチル補酵素Aからグルコサミン-1-リン酸(GlcN-1-P)へのアセチル基の転移を触媒してN-アセチルグルコサミン-1-リン酸(GlcNAc-1-P)を生産し、これは、N-末端ドメインによって触媒される反応である、ウリジン5-一リン酸の(ウリジン5-三リン酸からの)転移によってUDP-GlcNAcへと変換される。
このような二機能性酵素はまた、枯草菌およびインフルエンザ菌由来のものも公知である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、異種二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。適切な例は、大腸菌GlmUまたはその機能的バリアント(インフルエンザ菌GlmUを含む)である。前記大腸菌GlmUは、大腸菌glmU遺伝子によってコードされている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、異種二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。適切な例は、大腸菌GlmUまたはその機能的バリアント(インフルエンザ菌GlmUを含む)である。前記大腸菌GlmUは、大腸菌glmU遺伝子によってコードされている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、前記二機能性酵素をコードするヌクレオチド配列、好ましくは、大腸菌GlmUまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性およびN-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内で二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種二官能性グルコサミン-1-リン酸/N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換え二機能性グルコサミン-1-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ/N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、シアル酸生合成経路は、UDP-GlcNAcのN-アセチルマンノサミン(ManNAc)への変換を含む。この変換は、UDP-N-アセチルグルコサミンをUDP-N-アセチルマンノサミンに変換するだけでなく、同時にUDPを放出するUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼによって触媒され得る(図1:(4))。
したがって、バチルス属細胞は、UDPを同時に放出するUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼエピメラーゼを含む。
UDPを同時に放出する適切なUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼエピメラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのneuC遺伝子によってコードされるC.ジェジュニのUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼNeuCである。
UDPを同時に放出する適切なUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼエピメラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのneuC遺伝子によってコードされるC.ジェジュニのUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼNeuCである。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、UDPを同時に放出するUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼを有するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、UDPを同時に放出するUPD-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように、好ましくは、C.ジェニュニのNeuCまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
C.ジェジュニのUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼNeuCは、C.ジェジュニのneuC遺伝子のタンパク質コード領域によってコードされている。したがって、バチルス属細胞は、C.ジェジュニのNeuCをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ManNAcを放出する酵素反応中に、UDPを同時に放出するUPD-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、UDPを同時に放出するUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内に前記UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、UDPを同時に放出する異種UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
別の実施形態では、シアル酸生合成経路は、中間体としてN-アセチルグルコサミン-6-リン酸(GlcNAc-6-P)を利用するが、UDP-GlcNAcは利用しない。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、中間体としてGlcNAc-6-Pを使用し、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼを含む、N-アセチルノイラミン酸の細胞内生合成のためのシアル酸生合成経路を含む(図1:(5))。N-アセチルノイラミン酸の細胞内生合成にグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼを使用するシアル酸生合成経路は、シアル酸の生合成にUDP-GlcNAcを利用しない。
GlcNAc-6Pを使用したシアル酸生合成経路は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性(図1:(1))およびN-アセチルノイラミン酸シンターゼの酵素活性(図1:(10))を含む。前記シアル酸生合成経路は、a)グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(図1:(5))、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼ(図1:(6))およびN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ(図1:(8))の酵素活性をさらに含むか、またはb)グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(図1:(5))、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼ(図1:(7))およびN-アセチル-マンノサミン-6-リン酸ホスファターゼ(図1:(9))の酵素活性をさらに含む。したがって、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞内シアル酸生合成に、ホスホグルコサミンムターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、およびUDPを同時に放出するUDP N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼの酵素活性を含むことは必要ではない。したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、シアル酸を合成可能であるように遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ホスホグルコサミンムターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、およびUDPを同時に放出するUDP N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼの酵素活性からなる群から選択される1つまたは複数の酵素活性を含まない。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する。前記グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性は、GlcN-6PをN-アセチルグルコサミン-6-リン酸(GlcNAc-6P)に変換する。グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼの例は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGna1(UniProtKB-P43577)である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ、好ましくは異種グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ、より好ましくはS.セレビシエ由来のGna1またはその機能的バリアントを含む。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ、好ましくは、S.セレビシエのGna1をコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含み、前記ヌクレオチド配列は、細胞内グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を提供するように、遺伝子操作されたバチルス属細胞内で前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳が達成される少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼ活性を有する。前記N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼ活性は、GlcNAc-6PをN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)に変換する。N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼの例は、GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼである。酵素のHAD様スーパーファミリーは、細菌酵素のハロ酸デヒドロゲナーゼにちなんで命名され、ホスファターゼを含む。GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの適切なホスファターゼは、フルクトース-1-リン酸ホスファターゼ(YqaB、UniProtKB-P77475)およびアルファ-D-グルコース1-リン酸ホスファターゼ(YihX、 UniProtKB-P0A8Y3)からなる群から選択することができる。大腸菌YqaBおよび大腸菌YihXの酵素は、GlcNAc6Pにも作用すると考えられる(Lee, S.-W.およびOh, M.-K. (2015) Metabolic Engineering 28:143~150頁)。
追加のおよび/または代替の実施形態では、GlcNAc-6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、遺伝子操作されたバチルス属細胞の異種酵素である。追加のおよび/または代替の実施形態では、GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、大腸菌YqaB、大腸菌YihX、およびそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。追加のおよび/または代替の実施形態では、GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。追加のおよび/または代替の実施形態では、GlcNAc6PからGlcNAcへの変換を触媒するHAD様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌YqaBもしくは大腸菌YihXまたはこれら2つの酵素のうちの1つの機能的バリアントをコードする。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えN-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ活性を有する。N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ(EC 5.1.3.8)は、N-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)からN-アセチルマンノサミン(ManNAc)への変換を触媒する酵素である。この酵素は、炭水化物およびそれらの誘導体に作用するラセマーゼである。この酵素のクラスの系統名は、N-アシル-D-グルコサミン2-エピメラーゼである。この酵素は、アミノ糖代謝およびヌクレオチド糖代謝、好ましくは異種N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼに関与する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ、好ましくは異種N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼを含む。N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼの例としては、アナベナ・バリアビリス(Anabena variabilis)、アカリオクロリス属の種(Acaryochloris sp.)、ノストック属の種(Nostoc sp.)、ノストック・パンクテフォルメ(Nostoc punctiforme)、バクテロイデス・オバタス(Bacteroides ovatus)またはシネコシスティス属の種(Synechocystis sp.)に由来するものが挙げられる。適切なN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼの例は、遺伝子BACOVA_01816によってコードされているB.オバタスATCC 8483(UniProtKB-A7LVG6)のN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼである。別の例は、シネコシスティス属の種(PCC 6803株)(UniProtKB-P74124)のN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼであり、これはレニン結合タンパク質としても公知であり、slr1975遺伝子によってコードされている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ、好ましくは、B.オバタス ATCC 8483もしくはシネコシスティス属の種(PCC 6803株)またはその機能的バリアントのN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
したがって、N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内でN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えN-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼ活性およびN-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼ活性を有する。N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼは、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸(GlcNAc-6P)をN-アセチルマンノサミン-6-リン酸(ManNAc-6P)に変換するが、N-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼは、ManNAc-6Pを脱リン酸化して、N-アセチルマンノサミン(ManNAc)をもたらす。N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼ活性およびN-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼ活性を有することにより、Neu5Acを生産するためのManNAcを提供する追加のまたは代替の方法が提供される。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼを含む。適切なN-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼの一例は、大腸菌nanE遺伝子によってコードされている大腸菌NanE(UniprotKB P0A761)である。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは大腸菌NanEまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含み、前記ヌクレオチド配列は、細胞内N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸エピメラーゼ活性を提供するように、遺伝子操作された微生物細胞内で前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルグルコサミン-6-リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ManNAc-6PをManNAcに変換するN-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼを含む。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、N-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。したがって、N-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内N-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼ活性を提供するように、遺伝子操作されたバチルス属細胞内でN-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種N-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えN-アセチルマンノサミン-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シチジン5’-一リン酸をN-アセチルノイラミン酸に転移してCMP活性化N-アセチルノイラミン酸(CMP-NeuNAc)を生成するためのシチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼ(図1:(11))活性を有する。いくつかの5’-モノホスホ-(CMP)-シアル酸シンテターゼは当技術分野で公知であり、例えば、大腸菌、ナイセリア・メニンギティディス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス属の種由来の5’-モノホスホ-(CMP)-シアル酸シンテターゼが記載されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼ、好ましくは異種シチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼ、より好ましくは、C.ジェジュニ由来のN-アセチルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼNeuAを含む。C.ジェジュニNeuAは、C.ジェジュニneuA遺伝子によってコードされている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含み、前記ヌクレオチド配列は、N-アセチルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼ活性を提供するように遺伝子操作された微生物細胞内で前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの核酸発現制御配列に作動可能に連結されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種シチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用頻度は、バチルス属のコドン使用頻度に適合する。
組換えシチジン5’-モノホスホ-(CMP)-N-アセチルノイラミン酸シンテターゼ遺伝子は、バチルス属の染色体に組み込まれ得るか、またはバチルス属細胞内のプラスミド上にエピソームバージョンとして存在し得る。
遺伝子操作されたバチルス属細胞は、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくは異種シアリルトランスフェラーゼ、より好ましくはα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性および/またはα-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択されるシアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアルトランスフェラーゼ活性は、N-アセチルノイラミン酸部分をCMP-NeuNAcから糖分子であるアクセプター分子に転移して、シアリル化糖を提供することができる。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、少なくとも1つのシアリルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくとも1つの異種シアリルトランスフェラーゼを含み、前記シアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質としてのCMP-NeuNAcからアクセプター糖にNeuNAc部分を転移させるためのα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性および/またはα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性および/またはα-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である。例示的なシアリルトランスフェラーゼおよびそれらの遺伝子は表2に同定されている。
本明細書で使用される用語「シアリルトランスフェラーゼ」とは、シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能なポリペプチドを意味する。「シアリルトランスフェラーゼ活性」は、ドナー基質からアクセプター分子へのシアル酸残基、好ましくはN-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基の転移を意味する。用語「シアリルトランスフェラーゼ」とは、本明細書に記載されているシアリルトランスフェラーゼの機能的断片、本明細書に記載されているシアリルトランスフェラーゼの機能的バリアント、および機能的バリアントの機能的断片を含む。この点に関し「機能的」とは、断片および/またはバリアントがシアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能であることを意味する。シアリルトランスフェラーゼの機能的断片は、天然に存在する遺伝子によってコードされているシアリルトランスフェラーゼの切断型バージョンを包含し、その切断型バージョンはシアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である。切断型バージョンの例は、典型的にはポリペプチドを特定の細胞内局在化に導く、いわゆるリーダー配列を含まないシアリルトランスフェラーゼである。典型的には、そのようなリーダー配列は、その細胞内輸送の間にポリペプチドから除去され、天然に存在する成熟シアリルトランスフェラーゼにも存在しない。
異種シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることが可能である。異種シアリルトランスフェラーゼに関して用語「可能である」とは、異種シアリルトランスフェラーゼのシアリルトランスフェラーゼ活性を指し、また異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を有するために適切な反応条件が必要とされるという条件を指す。適切な反応条件が存在しない場合、異種シアリルトランスフェラーゼはその酵素活性を有さないが、その酵素活性を保持し、適切な反応条件が回復した場合にその酵素活性を有する。適切な反応条件には、適切なドナー基質の存在、適切なアクセプター分子の存在、例えば一価イオンまたは二価イオンなどの必須補因子の存在、適切な範囲のpH値、適切な温度などが含まれる。異種シアリルトランスフェラーゼの酵素反応を達成するあらゆる因子の最適値が満たされる必要はないが、反応条件は異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を成し遂げるようなものでなければならない。したがって、用語「可能である」とは、異種シアリルトランスフェラーゼの酵素活性が不可逆的に損なわれたあらゆる条件を除外し、また異種シアリルトランスフェラーゼのそのような条件への曝露も除外される。代わりに、「可能である」とは、許容反応条件(シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を成し遂げるために必要とされるすべての要件)がシアリルトランスフェラーゼに提供される場合、シアリルトランスフェラーゼが酵素的に活性である、すなわち、そのシアリルトランスフェラーゼ活性を有することを意味する。
シアリルトランスフェラーゼは、それらが形成する糖結合のタイプで区別することができる。本明細書で使用される場合、用語「α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ」および「α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性」とは、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミンまたはアクセプター分子のガラクトース残基もしくはN-アセチルガラクトサミン残基にα-2,3結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチドおよびそれらの酵素活性を意味する。同様に、用語「α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ」および「α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性」とは、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミンまたはアクセプター分子のガラクトース残基もしくはN-アセチルガラクトサミン残基にα-2,6結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチドおよびそれらの酵素活性を意味する。同様に、用語「α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ」および「α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性」とは、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミンまたはアクセプター分子のガラクトース残基もしくはN-アセチルガラクトサミン残基にα-2,8結合を有するシアル酸残基を付加するポリペプチドおよびそれらの酵素活性を意味する。
さらに、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現するように遺伝子操作されている。この目的のために、異種シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、細胞内シアリルトランスフェラーゼ活性を提供するように遺伝子操作されたバチルス属細胞内で異種シアリルトランスフェラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を達成する少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結されている。
別の実施形態では、異種シアリルトランスフェラーゼは、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である前記異種シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、発現する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である前記異種シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、発現する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、異種シアリルトランスフェラーゼは、α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である。α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である異種シアリルトランスフェラーゼの例は、カンピロバクター・ジェジュニOH4384のシアリルトランスフェラーゼCstIIである。
シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸残基、例えばN-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基を、ドナー基質、例えばCMP-Neu5Acからアクセプター分子に転移することが可能である。アクセプター分子は糖分子であり、好ましくは表3に示す糖分子である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが可能である前記異種シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含む。
追加のおよび/または代替の実施形態では、アクセプター分子は単糖であり、好ましくは、N-アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびN-アセチルガラクトサミンからなる群から選択される単糖である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、アクセプター分子は二糖であり、好ましくは、ラクトース、ラクツロース、N-アセチルラクトサミン、ラクト-N-ビオース、ラクツロースおよびメリビオースからなる群から選択される二糖である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、アクセプター分子は三糖であり、好ましくは、ラフィノース、ラクト-N-トリオースII、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、3’-シアリル-N-アセチルラクトサミン、6’-シアリル-N-アセチルラクトサミン、3’-ガラクトシルラクトースおよび6’-ガラクトシルラクトースからなる群から選択される三糖である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、アクセプター分子は四糖であり、好ましくは、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、2’3-ジフコシルラクトース、3-フコシル-3’-シアリルラクトースおよび3-フコシル-6’-シアリルラクトースからなる群から選択される四糖である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、アクセプター分子は五糖であり、好ましくは、シアリルラクト-N-テトラオースa、シアリルラクト-N-テトラオースb、シアリルラクト-N-テトラオースc、ラクト-N-フコペンタオースI、ラクト-N-フコペンタオースII、ラクト-N-フコペンタオースIII、ラクト-N-フコペンタオースV、ラクト-N-ネオフコペンタオースIおよびラクト-N-ネオフコペンタオースVからなる群から選択される五糖である。
前記酵素をコードする1つまたは複数の遺伝子を既に保有し、NeuNAc、CMP-NeuNAcおよび/またはシアリル化糖を生産するのに十分な方法で前記遺伝子を発現するバチルス属細胞は、シアル酸生合成を完了し、シアル酸部分を糖アクセプターに転移するように遺伝子操作される必要はないが、それにもかかわらず、例えば、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸ホスファターゼ、N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼおよび/またはN-アセチルノイラミン酸シンターゼの量などの、前記1つまたは複数の遺伝子産物の細胞内レベルを増加させるように、前記遺伝子の1つまたは複数の発現レベルを変化させるように遺伝子操作されてもよく、それにより、遺伝子操作された細胞においてNeu5Ac生合成速度を増加させ、結果としてシアリル化糖の速度を増加させることができる。
一部の実施形態では、バチルス属細胞は、3’-SLの生産に使用するためのものであり、ラクトースパーミアーゼ、中間体としてGlcN-1Pを使用するCMP-NeuNAc生合成経路、およびα-2,3-シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。
様々な実施形態では、バチルス属細胞は、6’-SLの生産に使用するためのものであり、ラクトースパーミアーゼ、中間体としてGlcN-1Pを使用するCMP-NeuNAc生合成経路、およびα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、細胞の野生型よりも多くのPEPを合成する。追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、増強されたPEP生合成経路を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子をコードするppsA遺伝子が過剰発現される点、および/または天然に存在しない微生物がホスホエノールピルビン酸シンターゼまたはその機能的バリアントを発現させるヌクレオチド配列の少なくとも1つの追加のコピーを含むという点で、増加したホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を有するように遺伝子操作されている。ppsAの過剰発現により、細胞内PEP合成が促進され、シアル酸の生産により多くのPEPが利用できるようになる。例えば、適切なホスホエノールピルビン酸シンターゼは大腸菌のPpsAである。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、大腸菌PpsAまたはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。大腸菌PpsAまたはその機能的バリアントをコードする前記ヌクレオチド配列は、大腸菌ppsA遺伝子に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性を有する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、PEPを消費しない機構を介して前記唯一の炭素源を細胞内に転移することが可能なようにさらに修飾される。
追加のおよび/または代替の実施形態では、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞は、同じ種の野生型バチルス属細胞として、β-ガラクトシダーゼ活性を欠いているか、または低下したβ-ガラクトシダーゼ活性を有する。
シアリル化オリゴ糖の細胞内生合成には、ラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質としてのラクトースの取り込みが必要である。内在化されたラクトースを加水分解するいかなる細胞内酵素活性も、細胞内ラクトースのプールが減少するので、シアリルラクトース形成の有効性に影響を及ぼす。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するためのバチルス属細胞が、野生型バチルス属細胞と比較して、ベータ-ガラクトシダーゼ活性を欠いているか、または低下したベータ-ガラクトシダーゼ活性を少なくとも有する場合には、それは有利である。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性を消失させるか、または少なくとも低下させるように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ganA遺伝子の欠失または機能的不活性化によって遺伝子操作されている。別の実施形態では、バチルス属細胞は、野生型バチルス属細胞と比較して、ganA遺伝子の発現レベルを低下させるように遺伝子操作されている。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ganA遺伝子の欠失または機能的不活性化によって遺伝子操作されている。別の実施形態では、バチルス属細胞は、野生型バチルス属細胞と比較して、ganA遺伝子の発現レベルを低下させるように遺伝子操作されている。
バチルス属ganA遺伝子は、yvfNまたはlacAとも呼ばれる。これはガラクタンの利用に関与する酵素をコードする遺伝子を含むGanRレギュロンの遺伝子である。ganA遺伝子は、バチルス属のガラクタン利用に関与するベータ-ガラクトシダーゼをコードしている。
ganA遺伝子の欠失または機能的不活性化により、バチルス属細胞におけるGanA媒介性β-ガラクトシダーゼ活性が消失し、一方、ganA発現の低下により、バチルス属細胞におけるGanAの量が低下し、その結果、シアリル化オリゴ糖の生合成を阻害し得るβ-ガラクトシダーゼ活性が低下する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、yesZ遺伝子の欠失または機能的不活性化によって遺伝子操作されている。バチルス属yesZ遺伝子はベータ-ガラクトシダーゼYesZをコードしており、これは植物細胞壁に由来するラムノガラクツロナンの分解において機能を果たす。バチルスyesZ遺伝子の発現は、ラムノガラクツロナンIによって誘導される。別の実施形態では、バチルス属細胞は、野生型バチルス属細胞と比較して、yesZ遺伝子の発現レベルを低下させるように遺伝子操作されている。
yesZ遺伝子の欠失または機能的不活性化により、バチルス属細胞におけるYesZ媒介性β-ガラクトシダーゼ活性が消失し、一方、yesZ発現の低下により、バチルス属細胞におけるYesZの量が低下し、その結果、シアリル化オリゴ糖の生合成を阻害し得るβ-ガラクトシダーゼ活性が低下する。
枯草菌が指数関数的後期増殖期に入ると、それらは大量の細胞外プロテアーゼを生産する(生産を開始する)。外来タンパク質は、多くの場合、プロテアーゼ感受性である。したがって、異種タンパク質の安定性を高め、高レベルの外来タンパク質が蓄積できるようにするためには、エキソプロテアーゼを含まない株が望まれる。
バチルス属のゲノムは、少なくとも8つの細胞外プロテアーゼ、すなわち、nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr、およびwprAをコードしている。したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、細胞外プロテアーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子が欠失または機能的に不活性化されている、好ましくは、nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr、およびwprAからなる群から選択される遺伝子の少なくとも1つが欠失または機能的に不活性化されている点で遺伝子操作されている。好ましくは、nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vprおよびwprAからなる群から選択される遺伝子のうちの2、3、4、5、6、7または8つが欠失されているか、または機能的不活性化されている。
枯草菌は、グルコースまたはラクトースなどの炭水化物を含む培地中で増殖させる場合、プルケリミン酸(pulcherriminic acid)を合成する。排出されたプルケリミン酸は、鉄が増殖培地中に存在する場合、プルケリミン酸の塩(鉄キレート)である赤色色素プルケリミンを形成する。発酵プロセス中のこの望ましくない副産物の形成は、遺伝子yvmCおよび/またはcypXの欠失または破壊によって回避/消失させることができる。遺伝子yvmCはシクロジペプチドシンターゼをコードしており、遺伝子cypXはシトクロムP450シクロ-l-ロイシル-l-ロイシルジペプチドオキシダーゼをコードしている。
したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、遺伝子yvmCおよびcypXの少なくとも1つが欠失されているか、または機能的不活性化されているという点で遺伝子操作されている。
根圏菌(rhizobacterium)の枯草菌は、20種を超える抗生物質を合成する遺伝子を有する。それらの中には、枯草菌ランチビオティックスおよびランチビオティック様ペプチド(サブチリン、エリシンS、メルサシジン、サブランシン168、サブチロシンA)のようなペプチド抗生物質と、非リボソーム合成(ペプチド)抗生物質(サーファクチン、イツリン、バシロマイシン、マイコサブチリン、コリネバクチン/バチリバクチン、フェンギシンプリパスタチン、マイコバシリン、TL-119、バシライシン、バシリソシン、アミコウマシン(amicoumacin)、3,3’-ネオトレハロサジアミン、ジフィシジン、リゾクチシン)がある。
シアリル化オリゴ糖を生産するためには、抗生物質を生産しないバチルス属細胞を使用することが好ましい。したがって、追加のおよび/または代替の実施形態では、バチルス属細胞は、ランチビオティックスおよびランチビオティック様ペプチド、例えば、サブチリン、エリシンS、メルサシジン、サブランシン168、サブチロシンA;非リボソーム合成(ペプチド)抗生物質、例えば、サーファクチン、イツリン、バシロマイシン、マイコサブチリン、コリネバクチン/バチリバクチン、フェンギシンプリパスタチン、マイコバシリン、TL-119、バシライシン、バシリソシン、アミコウマシン、3,3’-ネオトレハロサジアミン、ジフィシジンおよびリゾクチシンからなる群から選択される1つまたは複数の抗生物質を合成しない。バチルス属細胞は、1つまたは複数の前記抗生物質を合成するそれらの能力を損なうか、または消失するように遺伝子操作されている可能性がある。
シアリル化オリゴ糖を生産することができる遺伝子操作されたバチルス属細胞は、任意選択的に、追加の特徴を含むことができ、これらの追加の特徴を有するように遺伝子操作され得る。これらの追加の特徴は、天然に存在しない微生物の生産性を改善し、シアリル化オリゴ糖の収量を高めるようにするものと考えられる。
本発明のバチルス属細胞は、培地中で、バチルス属細胞がシアリル化オリゴ糖を生産することが許容される条件下で、ラクトースの存在下において培養される場合、シアリル化オリゴ糖を生産することができる。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するための、本明細書で前述したような遺伝子操作されたバチルス属細胞の使用も提供される。
一態様では、シアリル化オリゴ糖を生産するための方法が提供される。この方法は、(i)本明細書で前述したようなバチルス属細胞を提供するステップと、(ii)前記バチルス属細胞を培養培地または発酵ブロス中で、シアリル化オリゴ糖の生産が許容される条件下で培養するステップを含む。この方法は、培養培地/発酵ブロスから、および/またはバチルス属細胞からシアリル化オリゴ糖を回収するステップをさらに含み得る。
発酵ブロスは、バチルス属細胞の代謝のための少なくとも1つの炭素源を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、グリセロール、およびそれらの組合せからなる群から選択される。炭素源はバチルス属細胞によって内在化される可能性があり、バチルス属細胞の代謝によって使用されて、エネルギーに富んだ三リン酸の形態のバイオマスおよび/またはエネルギーが生成され得る。
一部の実施形態では、特にバチルス属細胞がそれ自身によりラクトースを合成することが不可能である場合、発酵ブロスはラクトースを含む。ラクトースは、発酵ブロスに外因的に供給され得る。ラクトースは、いくつかのシアリル化オリゴ糖の生成において、特にシアリルラクトースの生成において、NeuNAc部分のアクセプター基質として機能し得る。
様々な実施形態では、特に、シアル酸生合成経路を有さず、シアル酸サルベージ経路を有するバチルス属細胞がシアリル化オリゴ糖の生産に使用される場合、発酵ブロスはシアル酸を含む。
一部の実施形態では、シアリル化オリゴ糖の生産は、発酵ブロスにN-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミンおよび/またはN-アセチルノイラミン酸を添加すること、ならびに/あるいはシアリル化オリゴ糖の細胞内生合成のためにN-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミンおよび/またはN-アセチルノイラミン酸の存在下で遺伝子操作された微生物細胞を培養することを必要としないが、その理由は、NeuNACの細胞内生合成のためのde novoシアル酸生合成経路を有するバチルス属細胞がシアル化オリゴ糖の生産に使用されるからである。
この方法では、少なくとも1つの遺伝子操作されたバチルス属細胞が、発酵ブロス中で、少なくとも1つのN-アセチルノイラミン酸部分を含む糖の生産が許容される条件下で培養される。
このプロセスは、遺伝子操作されたバチルス属細胞の発酵ブロスに炭素源を使用するが、バチルス属細胞が細胞内でN-アセチルノイラミン酸を生産することが可能な場合、グルコサミンおよび/またはN-アセチルノイラミン酸および/またはN-アセチルグルコサミンおよび/またはN-アセチルマンノサミンの発酵ブロスへの添加は必要ではない。したがって、シアリル化オリゴ糖を生産するための様々な実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミンおよびN-アセチルノサミン酸からなる群から選択される1つまたは複数の非存在下で、および/または添加なしで培養される。遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ガラクトースがシアリルトランスフェラーゼ反応のアクセプター基質として供給されない限り、ガラクトースの非存在下で、および/または添加なしで培養され得る。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、1つまたは複数の単糖(例えばガラクトース)、二糖(例えばラクトース)、三糖(例えばラクト-N-トリオースII)、四糖(例えばラクト-N-テトラオース)および/または五糖(例えばシアリルラクト-N-テトラオースa)の存在下で培養される。
追加のおよび/または代替の実施形態では、遺伝子操作されたバチルス属細胞は、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、ラクトース、ラクツロース、N-アセチルラクトサミン、ラクト-N-ビオース、ラクト-N-トリオース、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、3’-シアリル-N-アセチルラクトサミン、6’-シアリル-N-アセチルラクトサミン、3’-ガラクトシルラクトース、6’-ガラクトシルラクトース、ラクト-N-トリオースII、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、2’3-ジフコシルラクトース、3-フコシル-3’-シアリルラクトースおよび3-フコシル-6’-シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも1つのアクセプター基質の存在下で培養される。これらの基質は細胞に取り込まれ、細胞内でアクセプター分子として使用される。
この方法は、発酵ブロス中でのその培養および増殖中に、遺伝子操作されたバチルス属細胞によって生産されたシアリル化オリゴ糖を回収する任意のステップを含む。シアリル化オリゴ糖は、遺伝子操作されたバチルス属細胞が、例えば遠心分離もしくは濾過によって除去された後に発酵ブロスから回収することができ、および/または、例えば細胞が遠心分離により発酵ブロスから採取され、細胞溶解ステップにかけられるという点で、細胞から回収することができる。続いて、シアリル化オリゴ糖は、当業者に公知の適切な技術によって、発酵ブロスおよび/または細胞溶解物からさらに精製することができる。適切な技術としては、精密濾過、限外濾過、透析濾過、模擬移動床式クロマトグラフィー、電気透析、逆浸透、ゲル濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
この方法およびこの方法で用いられる遺伝子操作された微生物細胞は、シアリル化オリゴ糖の生産に使用される。用語「シアリル化オリゴ糖」とは、少なくとも1つのN-アセチルノイラミン酸部分を含むオリゴ糖分子を意味する。
追加のおよび/または代替の実施形態では、シアリル化糖はオリゴ糖である。本明細書で使用される用語「オリゴ糖」とは単糖残基のポリマーを意味し、前記ポリマーは、少なくとも2つの単糖残基を含むが、単糖残基は10を超えず、好ましくは、単糖残基は7を超えない。オリゴ糖は単糖の直鎖であるか、または分岐している。さらに、オリゴ糖の単糖残基は、多くの化学修飾を特徴とし得る。したがって、オリゴ糖は、1つまたは複数の非糖部分を含み得る。本明細書で使用される場合の用語「シアリル化オリゴ糖」とは、1つまたは複数のN-アセチルノイラミン酸部分を含むオリゴ糖を意味する。
追加のおよび/または代替の実施形態によれば、シアリル化オリゴ糖は、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、シアリルラクト-N-テトラオースa、シアリルラクト-N-テトラオースb、シアリルラクト-N-テトラオースc、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースa、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースb、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースc、ジシアリルラクト-N-テトラオース、フコシルジシアリルラクト-N-テトラオースI、フコシルジシアリルラクト-N-テトラオースII、3’-シアリルガラクトース、6’-シアリルガラクトース、3’-シアリル-N-アセチルラクトサミンおよび6’-シアリル-N-アセチルラクトサミンからなる群から選択される。
本発明の別の態様では、全細胞発酵プロセスにおける、シアリル化オリゴ糖を生産するための本明細書で前述した遺伝子操作されたバチルス属細胞の使用が提供され、すなわち、シアリル化オリゴ糖は、遺伝子操作されたバチルス属細胞によって、およびその細胞中で合成される。
本発明の別の態様では、この方法によって、および/または本明細書で前述した遺伝子操作されたバチルス属細胞を使用することによって生産されたシアリル化オリゴ糖が提供される。
本発明の別の態様では、栄養組成物を製造するための、本明細書で前述した方法によって、および/または本明細書で前述した遺伝子操作されたバチルス属細胞を使用することによって生産されたシアリル化オリゴ糖の使用が提供される。
したがって、この方法によって、および/または本明細書で前述した遺伝子操作されたバチルス属細胞によって生産された少なくとも1つのシアリル化オリゴ糖を含む栄養組成物が提供される。
追加のおよび/または代替の実施形態では、シアリル化オリゴ糖は、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、シアリルラクト-N-テトラオースa、シアリルラクト-N-テトラオースb、シアリルラクト-N-テトラオースc、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースa、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースb、フコシル-シアリルラクト-N-テトラオースc、ジシアリルラクト-N-テトラオース、フコシルジシアリルラクト-N-テトラオースI、フコシルジシアリルラクト-N-テトラオースII、3’-シアリルガラクトース、6’-シアリルガラクトース、3’-シアリル-N-アセチルラクトサミンおよび6’-シアリル-N-アセチルラクトサミンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、栄養組成物は、少なくとも1つの中性HMO、好ましくは、遺伝子操作されたバチルス属細胞を使用することによって生産された少なくとも1つの中性HMOをさらに含む。少なくとも1つの中性HMOは、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、2’3-ジフコシルラクトース、ラクト-N-トリオースII、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、ラクト-N-フコペンタオースI、ラクト-N-ネオフコペンタオースI、ラクト-N-フコペンタオースII、ラクト-N-フコペンタオースIII、ラクト-N-フコペンタオースV、ラクト-N-ネオフコペンタオースV、ラクト-N-ジフコヘキサオースI、ラクト-N-ジフコヘキサオースII、ラクト-N-ネオジフコヘキサオースI、ラクト-N-ヘキサオース、ラクト-N-ネオヘキサオース、パラ-ラクト-N-ヘキサオース、およびパラ-ラクト-N-ネオヘキサオースからなる群から選択される。
追加の実施形態では、栄養組成物は、医療用組成物、薬剤組成物、栄養補助製剤、乳児用調製粉乳および栄養補助食品からなる群から選択される。
栄養組成物は、限定するものではないが粉末、顆粒、フレークおよびペレットを含む、液体形態または固体形態で存在し得る。
栄養組成物は、限定するものではないが粉末、顆粒、フレークおよびペレットを含む、液体形態または固体形態で存在し得る。
本発明は、特定の実施形態に関して説明されるが、本発明は、それに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本説明および特許請求の範囲における用語の第1、第2などは、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも時間的、空間的、ランク付けまたは他のいずれかの方法で順序を説明するために使用されるわけではない。このように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されている以外の順序で操作することが可能であることを理解されたい。
尚、特許請求の範囲で使用される用語「含む」とは、その後に列挙された手段に限定されると解釈されるべきではない。それは他の要素またはステップを除外しない。したがって、記載した特徴、整数、ステップまたは言及された構成要素の存在を特定するものとして解釈されるが、1つまたは複数の他の特徴、整数、ステップもしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。したがって、「手段AおよびBを含む装置」という表現の範囲は、構成要素AおよびBのみからなる装置に限定されるべきではない。これは、本発明に関しては、装置の唯一の関連する構成要素がAおよびBであることを意味する。
本明細書全体にわたっての「一実施形態」または「実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載した特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたっての様々な箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではないが、それが可能でもあり得る。さらに、特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者に明らかであるように、1つまたは複数の実施形態で、任意の適切な方法において組み合わせることができる。
同様に、本発明の例示的な実施形態の説明では、本発明の様々な特性は、開示を合理化し、1つまたは複数の様々な発明の態様の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、またはその説明に時にはまとめられることがあることを理解されたい。しかし、開示のこの方法は、特許請求された発明がそれぞれの特許請求の範囲において明示的に記載されているものよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が表すように、前述の単一の実施形態のすべての特徴よりも少ない特徴に発明の態様はある。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、これにより、この詳細な説明に明示的に組み込まれ、それぞれの特許請求の範囲は、本発明の個々の実施形態としてそれ自体で主張する。
さらに、本明細書に記載の一部の実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、当業者によって理解されるように、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲では、特許請求された実施形態のいずれかを任意の組合せで使用することができる。
さらに、一部の実施形態は、本明細書では、コンピュータシステムのプロセッサーによって、または機能を実行する他の手段によって実施することができる方法または方法の要素の組合せとして記載されている。したがって、そのような方法または方法の要素を実施するために必要な指示を有するプロセッサーは、方法または方法の要素を実施するための手段を形成する。さらに、装置の実施形態の本明細書に記載の要素は、本発明を実施する目的で、要素によって実行される機能を実施するための手段の一例である。
本明細書で提供された説明および図面には、多数の特定の詳細が示されている。しかし、本発明の実施形態は、これらの特定の詳細なしで実施され得ることは理解されよう。他の例では、理解を不明確にしないように、周知の方法、構造、および技術は詳細に示されていない。本発明は、ここでは、本発明の一部の実施形態の詳細な説明によって説明される。本発明の他の実施形態は、本発明の真の趣旨または技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識によって設定することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されることは明白である。
実施例
実施例1:枯草菌の形質転換
枯草菌は、様々な技術によって遺伝子操作することができる。枯草菌を形質転換するために、コンピテント細胞を二段階法の修正プロトコルにより調製した(Anagnostopoulos, C.およびSpizizen, J.(1961) J Bacteriol 81 (5):741~746頁)。一晩培養物をMG1培地に接種し、37℃で振盪した。MG1培地はSpizizenの最小培地であり、これには0.5%グルコース、5mM MgSO4、および0.02%カザミノ酸(任意選択的にビオチンおよび/またはL-トリプトファンを追加補充)が補充されている。翌朝、この培養物を新鮮なMG1培地で1:20に希釈し、37℃で約6時間インキュベートした。培養物の1mlを、カザミノ酸の濃度がMG1培地と異なる(0.02%ではなく0.01%)8mlのMG2培地で希釈した。短縮プロトコルでは、一晩培養物はMG2培地で直接希釈される。さらに90分間インキュベートした後、培養物の1ml部分を1~3μgの多量体プラスミドDNAまたは直鎖DNAと混合し、37℃で30~60分間振盪しながらインキュベートした。多量体プラスミドDNAは、プラスミドDNAの増殖に大腸菌NM538株を使用することによって、または骨格内で切断する単一カッター制限酵素で消化し、続いてT4DNAリガーゼで再ライゲーションすることによって、プラスミドを直鎖状化することにより得られた。
枯草菌は、様々な技術によって遺伝子操作することができる。枯草菌を形質転換するために、コンピテント細胞を二段階法の修正プロトコルにより調製した(Anagnostopoulos, C.およびSpizizen, J.(1961) J Bacteriol 81 (5):741~746頁)。一晩培養物をMG1培地に接種し、37℃で振盪した。MG1培地はSpizizenの最小培地であり、これには0.5%グルコース、5mM MgSO4、および0.02%カザミノ酸(任意選択的にビオチンおよび/またはL-トリプトファンを追加補充)が補充されている。翌朝、この培養物を新鮮なMG1培地で1:20に希釈し、37℃で約6時間インキュベートした。培養物の1mlを、カザミノ酸の濃度がMG1培地と異なる(0.02%ではなく0.01%)8mlのMG2培地で希釈した。短縮プロトコルでは、一晩培養物はMG2培地で直接希釈される。さらに90分間インキュベートした後、培養物の1ml部分を1~3μgの多量体プラスミドDNAまたは直鎖DNAと混合し、37℃で30~60分間振盪しながらインキュベートした。多量体プラスミドDNAは、プラスミドDNAの増殖に大腸菌NM538株を使用することによって、または骨格内で切断する単一カッター制限酵素で消化し、続いてT4DNAリガーゼで再ライゲーションすることによって、プラスミドを直鎖状化することにより得られた。
その後、細胞を、適切な抗生物質を含む2×YT寒天プレートに広げた。抗生物質は次の濃度で添加した:5μg・mL-1エリスロマイシン、5μg・mL-1クロラムフェニコール、10μg・mL-1カナマイシン、100μg・mL-1スペクチノマイシン。
あるいは、プロトプラスト形質転換(Romero, D.ら(2006) Journal of Microbiological Methods 66:556~559頁)のため、20mlのPenassayブロス(PAB)中、37℃で増殖の定常期が始まるまで細胞を増殖させた(OD600=1.7~2)。次いで細胞をペレット化し、10mlのSMPP培地(0.3%ウシ血清アルブミン、5% 2Mスクロース、25% 4×PAB、50% 2×SMM)に再懸濁したが、2×SMMの組成は1Mスクロース、0.04Mマレイン酸二ナトリウム塩水和物および0.04M MgCl2(pH6.5)であった。リゾチーム(10mg ml-1)およびムタノリシン(75U ml-1)を添加した後、混合物を37℃で振盪しながらインキュベートし、プロトプラストを生成させた。プロトプラスト形成は顕微鏡によりチェックした。次いで、プロトプラストを5200×g、4℃で5分間、遠心分離することにより注意深く回収し、氷冷洗浄電気変換バッファー(1×SMM)で2回洗浄し、最後にこの溶液中に懸濁させた。プラスミドDNA(1~3μg)を120μlのプロトプラスト懸濁液に添加し、この混合物を少なくとも5分間、氷上で保持した。形質転換混合物を0.2cmのキュベットに移し、25μF、400Ω、0.7kVで単一エレクトロポレーションパルスを印加した。エレクトロポレーションショックの直後、1mlの回収培地(等量の4×PABおよび2×SMM、使用前に新しく調製したもの)をキュベットに加えた。次いで、形質転換反応物を2mlのチューブに移し、37℃で12時間振盪しながらインキュベートした。再生のため、細胞懸濁液をDM3寒天プレート(Chang, S.およびCohen, S.(1979) MGG 168(1):111~115頁)に広げ、37℃で48時間インキュベートした。DM3再生培地は、1リットル当たり次の滅菌溶液:200ml 4%寒天、100ml 5%カザミノ酸、50ml 10%酵母エキス、100ml 3.5%K2HPO4および1.5%KH2PO4、25ml 20%グルコース、20ml 1M MgCl2、500ml 0.5Mソルビトール、および5mlフィルター滅菌した2%ウシ血清アルブミン(温度が55℃未満の場合に、混合物に添加)を含んでおり、また適切な抗生物質を補充した。
枯草菌のエレクトロポレーションは、MoBiTec GmbHから提供されたZhangら(2011)の修正プロトコルに従って実施した(Zhang,G.、Bao,P.、Zhang,Y.、Deng,A.、Chen,N.およびWen,T.(2011) Anal. Biochem.,409:130~137頁)。2×YTの一晩培養物を新鮮な2×YT培地で100倍に希釈し、その培養物をロータリーシェーカーで37℃にてOD600が0.2になるまで増殖させた。次いで、培養物に1%DL-スレオニン、2%グリシン、0.1%トリプトファン、および0.03%Tween80を補充した。さらに60分間培養した後、細胞懸濁液を氷上で20分間冷却し、5000×gで10分間、4℃にて遠心分離し、エレクトロポレーションバッファー(0.5Mトレハロース、0.5Mソルビトール、0.5Mマンニトール、0.5mM MgCl2、0.5mM K2HPO4、0.5mM KH2PO4、pH7.4、フィルター滅菌および凍結保存)で2回洗浄した。最後に、細胞を元の培養量の1/100でエレクトロポレーションバッファーに再懸濁し、100μlの細胞懸濁液をDNAと混合した。形質転換混合物を0.1cmキュベットに移し、MicroPulser(商標)装置(Bio-Rad)を用いて送達される単一パルスにより1.8kVでエレクトロポレーションを実施した。パルス送達直後に、0.5Mソルビトールおよび0.38Mマンニトールを含む1mlの2×YTブロスをキュベットに添加した。形質転換懸濁液を2mlチューブに移し、ロータリーシェーカーで、37℃にて3時間インキュベートした。細胞を選択的2×YT寒天プレートに広げ、37℃で一晩インキュベートした。
代替のエレクトロポレーションプロトコル(Xue, G. P.、J. S.Johnson、およびB. P. Dalrymple:1999;Journal of Microbiological Methods 34:183~191頁)を使用して、0.5Mグルシトールを含む5mlのLB培地に枯草菌を接種し、37℃にて一晩インキュベートした。続いて、一晩培養物を、0.5Mグルシトールを含む75mlのLBで希釈し(1:16)、0.85~0.95のOD600が得られるまでインキュベートした。次いで、細胞を4℃で10分間、5.000×gで遠心分離することによりペレット化し、氷冷エレクトロポレーションバッファー(10%グリセロール、0.5Mグルシトール、0.5Mマンニトール)により4回洗浄した。最後に、細胞を1~2mlのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁した。エレクトロポレーションは、冷却したエレクトロポレーションキュベット(電極間隙1mm)中、コンピテント細胞60μlをDNAとともに使用して実施した。細胞・DNA混合物に、25μF、200Ω、および21kV/cmの単一電気パルスを与えた。最後に、1mlの回収ブロス(0.5Mグルシトールおよび0.38マンニトールを含むLB)を電気透過処理細胞に添加し、細菌培養物を37℃で3時間インキュベートし、続いて抗生物質を補充したLB寒天培地にプレーティングした。
2種の異なるリッチ培地、すなわち、Luriaブロス(LB)および2×YTを使用した。
Luriaブロス(LB)培地は、1%トリプトン、0.5%酵母エキス、および0.5%NaCl(pH7.2)から構成されていた。
Luriaブロス(LB)培地は、1%トリプトン、0.5%酵母エキス、および0.5%NaCl(pH7.2)から構成されていた。
2×YT培地は、1.6%トリプトン、1%酵母エキス、および0.5%NaCl(pH7.5)から構成されていた。
リッチ培地寒天プレートを調製するため、15g L-1寒天を添加した。
リッチ培地寒天プレートを調製するため、15g L-1寒天を添加した。
振盪フラスコ実験については、Spizizenの最小培地(Spizizen, J. 1958 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44(10):1072~1078頁)を使用した。
Spizizenの最小培地は、次の塩を含む:2g/Lの(NH4)2SO4、14g/LのK2HPO4、6g/LのKH2PO4、1g/Lのクエン酸Na3×2・H2Oおよび0.2g/LのMgSO4×7・H2O。
前培養培地は、2%D-グルコース、0.05%カザミノ酸、および最終濃度2mMのMgSO4を補充した(任意選択的にビオチンおよび/またはL-トリプトファンを追加補充)Spizizenの最小塩で構成されていた。
主培養培地は、2%D-グルコース、0.05%カザミノ酸、最終濃度2mMのMgSO4、および0.5mL・L-1の1000×微量元素溶液(任意選択的にビオチンおよび/またはL-トリプトファンを追加補充)を補充したSpizizenの最小塩から構成されていた。
微量元素溶液(1000×)は、100.6g/LのC6H9NO6、56.4g/Lのクエン酸第二鉄アンモニウム、9.8g/LのMnCl2×4・H2O、1.6g/LのCoCl2×6・H2O、1g/LのCuCl2×2・H2O、1.9g/LのH3BO3、9g/LのZnSO4×7・H2O、1.1g/LのNa2MoO4×2・H2O、1.5g/LのNa2SeO3、1.5g/LのNiSO4×6・H2Oから構成されていた。
必要な場合、適切な抗生物質(複数可)を培地に添加して、それを選択的にした。
枯草菌株を最初にリッチ培地寒天プレート上で増殖させ、単一コロニーを得た。これらのプレートを30~37℃で1日増殖させた。振盪フラスコ実験については、20mlの前培養物に単一コロニーを接種し、ロータリーシェーカーで30~37℃にて一晩培養した。続く20mlの主培養物に、この前培養物を開始OD600が約0.1になるように接種し、ロータリーシェーカーで30~37℃にてインキュベートした。誘導が必要な場合には、誘導の時点で40~60mlの主培養物を20mlの割合で分割した。培養物容量は、振盪フラスコ容量の20%を超えなかった。
枯草菌株を最初にリッチ培地寒天プレート上で増殖させ、単一コロニーを得た。これらのプレートを30~37℃で1日増殖させた。振盪フラスコ実験については、20mlの前培養物に単一コロニーを接種し、ロータリーシェーカーで30~37℃にて一晩培養した。続く20mlの主培養物に、この前培養物を開始OD600が約0.1になるように接種し、ロータリーシェーカーで30~37℃にてインキュベートした。誘導が必要な場合には、誘導の時点で40~60mlの主培養物を20mlの割合で分割した。培養物容量は、振盪フラスコ容量の20%を超えなかった。
実施例2:3’-シアリルラクトースの枯草菌生産株の構築
neuCBA経路を使用した代謝中間体UDP-N-アセチルグルコサミンから3’-シアリルラクトースを合成するため、枯草菌発現プラスミド(配列番号1)を構築した。最初に、遺伝子neuA、neuB、neuC、およびα-2,3-シアリルトランスフェラーゼは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScriptCorpにより合成的に調製された。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuA(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP7)は、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuB(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP9)は、シアル酸シンターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuC(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP8)は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸2-エピメラーゼをコードする。パスツレラ・マルトシダ遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:Q9CLP3)は、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードする。ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌遺伝子lacY(Gen Bankアクセッション番号:NP_414877.1)のオープンリーディングフレームは、染色体DNAからPCRにより増幅した。その後、誘導性プロモーターPgrac100の制御下で必要なすべての遺伝子を含む、発現カセット<Pgrac100-neuBCA-siaT-lacY-ターミネーター>を構築した。このために、枯草菌発現ベクターpHT253(MoBiTec GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ)を骨格として使用した。発現カセット内のそれぞれの遺伝子は、枯草菌RBS配列に連結された。さらに、iGem part repositoryからの適切な枯草菌ターミネーター配列(配列ID:BBa_B0015)を発現カセットの下流に配置した。得られたプラスミド<pHT253-Pgrac100-neuBCA-2,3siaT-lacY-ターミネーター>(配列番号1)を使用して、その自然能力を利することにより、芽胞形成性枯草菌株(表1)を形質転換した。
neuCBA経路を使用した代謝中間体UDP-N-アセチルグルコサミンから3’-シアリルラクトースを合成するため、枯草菌発現プラスミド(配列番号1)を構築した。最初に、遺伝子neuA、neuB、neuC、およびα-2,3-シアリルトランスフェラーゼは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScriptCorpにより合成的に調製された。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuA(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP7)は、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuB(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP9)は、シアル酸シンターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuC(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP8)は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸2-エピメラーゼをコードする。パスツレラ・マルトシダ遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:Q9CLP3)は、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードする。ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌遺伝子lacY(Gen Bankアクセッション番号:NP_414877.1)のオープンリーディングフレームは、染色体DNAからPCRにより増幅した。その後、誘導性プロモーターPgrac100の制御下で必要なすべての遺伝子を含む、発現カセット<Pgrac100-neuBCA-siaT-lacY-ターミネーター>を構築した。このために、枯草菌発現ベクターpHT253(MoBiTec GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ)を骨格として使用した。発現カセット内のそれぞれの遺伝子は、枯草菌RBS配列に連結された。さらに、iGem part repositoryからの適切な枯草菌ターミネーター配列(配列ID:BBa_B0015)を発現カセットの下流に配置した。得られたプラスミド<pHT253-Pgrac100-neuBCA-2,3siaT-lacY-ターミネーター>(配列番号1)を使用して、その自然能力を利することにより、芽胞形成性枯草菌株(表1)を形質転換した。
遺伝子発現は、標的プロテオミクスおよび/またはリアルタイムPCRによって確認した。
形質転換体を、枯草菌が外因性ラクトースの存在下で3’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
形質転換体を、枯草菌が外因性ラクトースの存在下で3’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
実施例3:3’-シアリルラクトースの枯草菌生産株の構築
neuCBA経路を使用して代謝中間体UDP-N-アセチルグルコサミンから3’-シアリルラクトースを合成するために、構成的枯草菌発現プラスミド(配列番号2)を構築した。最初に、遺伝子neuA、neuB、neuC、およびsiaTは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScript Corpにより合成的に調製された。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuA(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP7)は、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuB(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP9)は、シアル酸シンターゼをコードする。
neuCBA経路を使用して代謝中間体UDP-N-アセチルグルコサミンから3’-シアリルラクトースを合成するために、構成的枯草菌発現プラスミド(配列番号2)を構築した。最初に、遺伝子neuA、neuB、neuC、およびsiaTは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScript Corpにより合成的に調製された。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuA(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP7)は、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuB(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP9)は、シアル酸シンターゼをコードする。
カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuC(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP8)は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸2-エピメラーゼをコードする。パスツレラ・マルトシダ遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:Q9CLP3)は、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードする。ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌遺伝子lacY(Gen Bankアクセッション番号:NP_414877.1)のオープンリーディングフレームは、染色体DNAからPCRにより増幅した。その後、2つの強力な構成的枯草菌プロモーターPlepAおよび/またはP43に作動可能に連結された必要なすべての遺伝子を含む、発現カセット<P43-neuBCA-PlepA-siaT-lacY-ターミネーター>を構築した。枯草菌発現ベクターpHT253(MoBiTec GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ)をプラスミド骨格として使用した。発現カセット内のそれぞれの遺伝子は、枯草菌RBS配列に連結された。さらに、iGem part repositoryからの適切な枯草菌ターミネーター配列(配列ID:BBa_B0015)を発現カセットの下流に配置した。
得られたプラスミド<pHT253-P43-neuBCA-PlepA-siaT-lacY-ターミネーター>(配列番号2)を使用して、その自然能力を利用することにより、芽胞形成性および非芽胞形成性の枯草菌株(表1)を形質転換した。
遺伝子発現は、標的プロテオミクスおよび/またはリアルタイムPCRによって確認した。
形質転換体を、枯草菌が外因性ラクトースの存在下で3’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
形質転換体を、枯草菌が外因性ラクトースの存在下で3’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
実施例4:6’-シアリルラクトースの枯草菌生産菌株の構築
枯草菌において6’-シアリルラクトースを生産するために、フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)由来のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを使用した。遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:D0VYB7)のオープンリーディングフレームは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScript Corpにより合成的に調製された。
枯草菌において6’-シアリルラクトースを生産するために、フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)由来のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを使用した。遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:D0VYB7)のオープンリーディングフレームは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScript Corpにより合成的に調製された。
発現プラスミド<pHT253-Pgrac100-neuBCA-2,6siaT-lacY-ターミネーター>(配列番号3)は、実施例2に記載のようにして構築した。得られたプラスミド(配列番号3)を使用して、その自然能力を利用することにより、芽胞形成性および非芽胞形成性の枯草菌株(表1)を形質転換した。遺伝子発現は、標的プロテオミクスおよび/またはリアルタイムPCRによって確認した。形質転換体を、枯草菌が外因性ラクトースの存在下で6’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
実施例5:3’-シアリルラクトースを生産するための枯草菌株の構築
枯草菌の代謝工学(表1)は、異種遺伝子カンピロバクター・ジェジュニneuA、大腸菌nanTおよびヘモフィルス・パラヘモリティクス(Haemophilus parahaemolyticus)siaTの組込みと、相同組換えによる内因性遺伝子ganAの同時欠失により達成された。ガラクタンオペロン内に配置されている枯草菌遺伝子ganA(yvfN、lacA)は、ベータ-ガラクトシダーゼをコードする。
枯草菌の代謝工学(表1)は、異種遺伝子カンピロバクター・ジェジュニneuA、大腸菌nanTおよびヘモフィルス・パラヘモリティクス(Haemophilus parahaemolyticus)siaTの組込みと、相同組換えによる内因性遺伝子ganAの同時欠失により達成された。ガラクタンオペロン内に配置されている枯草菌遺伝子ganA(yvfN、lacA)は、ベータ-ガラクトシダーゼをコードする。
外因性シアル酸/N-アセチルノイラミン酸およびラクトースから3’-シアリルラクトースを生産するために、neuA、nanTおよびsiaTのオープンリーディングフレームは、オペロンとしての枯草菌構成プロモーターP43(iGem part repository:配列ID:BBa_K143013)に作動可能に連結された。この目的のため、最初に、遺伝子neuA、nanT、およびsiaTは枯草菌において発現させるためにコドン最適化され、GenScript Corpにより合成的に調製された。カンピロバクター・ジェジュニ遺伝子neuA(UniProtKBアクセッション番号:Q93MP7)はCMP-Neu5Acシンテターゼをコードし、大腸菌遺伝子nanT(GenBankアクセッション番号:NP_417691.4)はシアル酸トランスポーターをコードし、H.パラヘモリティクス遺伝子siaT(UniProtKBアクセッション番号:I3DHL4)はアルファ-N-アセチルニューラミニル-2,3-ベータ-ガラクトシル-1,3-N-アセチルガラクトサミニド6-アルファ-シアリルトランスフェラーゼ(アルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼ)をコードする。
発現カセット内のそれぞれの遺伝子を枯草菌RBS配列に連結した。さらに、iGem part repositoryからの適切な枯草菌ターミネーター配列(配列ID:BBa_B0015)を発現カセットの下流に配置した。
クローニングベクターpBR322(New England Biolabs GmbH、フランクフルト、ドイツ)をプラスミド骨格として使用した。完全な組込みカセットを構築し、自殺プラスミド<pBR322 flank ganA up-P43-siaT-neuA-nanT-ターミネーター-erm-flank ganA down>(配列番号4)を作製した。その後、枯草菌はその自然能力によりこのプラスミドで形質転換された。細胞を、適切な抗生物質(5μg mL-1エリスロマイシン)を含む2×YT寒天プレートに広げた。枯草菌ゲノムのganA遺伝子座への発現カセット<P43-siaT-neuA-nanT-ターミネーター>の組込みは、コロニーPCRにより確認した。遺伝子発現は、標的プロテオミクスおよび/またはリアルタイムPCRにより確認した。
外因性ラクトースをバチルス属細胞に取り込むために、枯草菌ゲノムの内因性amyE(amyA)遺伝子座(アルファ-アミラーゼをコードする)に大腸菌遺伝子lacYを組み込んだ。この目的のため、ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌lacY遺伝子(Gen Bankアクセッション番号:NP_414877.1)のオープンリーディングフレームを染色体DNAからPCRにより増幅した。組込みカセット<flank amyE up-lox71-aad9-lox66-P43-lacY-flank amyE down>(配列番号5)を構築し、pBR322(New England Biolabs GmbH、フランクフルト、ドイツ)にクローニングした。A株が自然能力により得られた自殺プラスミドで形質転換された。A株のamyE遺伝子座に発現カセット<P43-lacY>が組み込まれ、最終のB株が得られたことをコロニーPCRにより確認した。
遺伝子発現は、標的プロテオミクスおよび/またはリアルタイムPCRにより確認した。B株を、枯草菌が外因性ラクトースおよびシアル酸/N-アセチルノイラミン酸の存在下で3’-シアリルラクトースを生産することが許容される条件下で培養した。
実施例6:代謝的に操作された枯草菌株を使用したシアリルラクトースの生産
前培養物に、(実施例2~5に記載の)シアリルラクトースの生合成に適した、代謝的に操作された枯草菌株を接種した。
前培養物に、(実施例2~5に記載の)シアリルラクトースの生合成に適した、代謝的に操作された枯草菌株を接種した。
前培養物を30~37℃で一晩インキュベートし、次いで新鮮な主培養培地で開始OD600約0.1まで希釈した。主培養物のOD600が約0.5に達したとき、2mMのラクトースを増殖培地に添加した。誘導性プロモーターPgrac100を遺伝子発現に使用した場合、誘導はラクトース(2mM)またはラクトース(2mM)およびIPTG(1mM)の両方を用いて実施した。CMP-N-アセチルノイラミン酸のサルベージ生合成のために、さらに、2mMのシアル酸/N-アセチルノイラミン酸を添加した。培養を誘導後の約24時間/48時間後に中止し、細胞内および細胞外シアリルラクトースを(WO2017/042382AまたはWO2019/008133Aに記載のように)薄層クロマトグラフィーおよび/またはHPLCおよび/または質量分析によって分析した。十分な量のシアリルラクトース(3’-シアリルラクトース/6’-シアリルラクトース)の生合成を検出することができた。
Claims (17)
- シアリル化オリゴ糖を生産するための非芽胞形成性バチルス属細胞であって、ラクトースパーミアーゼ、CMP-NeuNAc生合成経路およびシアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている、バチルス属細胞。
- バチルス属細胞の芽胞形成能が、Spo0A、sigma Eおよびsigma Fをコードする遺伝子の1つまたは複数の欠失または機能的不活性化によって損なわれている、請求項1に記載のバチルス属細胞。
- ラクトースパーミアーゼが大腸菌LacYまたはその機能的バリアントである、請求項1または2に記載のバチルス属細胞。
- CMP-NeuNAc生合成経路が中間体としてGlcN-1PまたはGlcNAc-6Pを使用する、請求項1~3のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- CMP-NeuNAc生合成経路がシアル酸サルベージ経路を使用する、請求項1~4のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- シアリルトランスフェラーゼがラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ、α-2,6-シアリルトランスフェラーゼおよびα-2,8-シアリルトランスフェラーゼからなる群から選択されるシアリルトランスフェラーゼである、請求項1~5のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- 任意のβ-ガラクトシダーゼ活性を欠いているか、または同じ種の野生型前駆バチルス属細胞と比較して低下したβ-ガラクトシダーゼ活性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- yesZおよびganAからなる群から選択される遺伝子の少なくとも1つの欠失または機能的不活性化によって遺伝子操作されている、請求項7に記載のバチルス属細胞。
- 枯草菌細胞である、請求項1~8のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- CMP-NeuNAc生合成経路が中間体としてGlcN-1Pを使用し、シアリルトランスフェラーゼがα-2,3-シアリルトランスフェラーゼである、3’-シアリルラクトース(3’-sialylactose)の生産において使用するための、請求項1~9のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- CMP-NeuNAc生合成経路が中間体としてGlcN-1Pを使用し、シアリルトランスフェラーゼがα-2,6-シアリルトランスフェラーゼである、6’-シアリルラクトース(6’-sialylactose)の生産において使用するための、請求項1~9のいずれか一項に記載のバチルス属細胞。
- シアリル化オリゴ糖を生産するための、請求項1~11のいずれか一項に記載のバチルス属細胞の使用。
- シアリル化オリゴ糖を生産する方法であって、
請求項1~11のいずれか一項に定義された非芽胞形成性バチルス属細胞を提供するステップと;
発酵ブロス中で、シアリル化オリゴ糖の生産が許容される条件下で、前記バチルス属細胞を培養するステップと;任意選択的に、
培地および/またはバチルス属細胞からシアリル化オリゴ糖を回収するステップ
を含む方法。 - 発酵ブロスがラクトースを含む、請求項13に記載の方法。
- 請求項13または14に記載の方法によって生産されるシアリル化オリゴ糖。
- 栄養組成物、好ましくは乳児用調製粉乳を製造するための、請求項15に記載のシアリル化オリゴ糖の使用。
- 請求項15に記載のシアリル化オリゴ糖を含む栄養組成物。
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