JP2003047490A - 宿主微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 胞子形成中期から後期において胞子の形
成に関与する遺伝子群から選ばれた１以上の遺伝子を削
除又は不活性化した微生物及び当該微生物を用いた目的
生産物（タンパク質）の製造方法。 【効果】 本発明の微生物を用いれば、胞子が形成され
ないことから、目的生産物（タンパク質）を生産する場
合において、エネルギーロス、副産物の生産や比生産速
度の低下等、培地の浪費が大幅に減少でき、また、生産
期間の長期化などによって効率よく目的生産物（タンパ
ク質）を生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、有用なタンパク質
又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、及び組換
え微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】微生物
による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味
噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、
核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、
その種類は多岐に渡っており、またその用途についても
食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化
成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

【０００３】こうした微生物による有用物質の工業生産
においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであ
り、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による
生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺
伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え
技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるよ
うになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開
発が進められている。例えば、枯草菌Marburg No.168
系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められ
た微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されてい
る。

【０００４】しかしながら、微生物は元来、自然界にお
ける環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有
しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質
等の工業的生産においては、必ずしも生産性が効率的で
あるとは言えない状況であった。

【０００５】また、ある種の微生物については、胞子形
成初期に関わる遺伝子を単独に削除又は不活性化した菌
株が構築されているが、生産性向上の効果が十分とはい
えものではない。

【０００６】従って、本発明はタンパク質又はポリペプ
チドの生産に不要或いは有害な遺伝子をゲノム上から削
除又は不活性化することにより、タンパク質又はポリペ
プチドの生産性向上を可能とする宿主微生物を提供する
ことを目的とする。また、本発明は当該宿主微生物に転
写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル
領域の下流に結合したタンパク質又はポリペプチドをコ
ードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更
に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプ
チドの製造法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物ゲ
ノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタン
パク質又はポリペプチドの生産にとって不要或いは有害
な働きをする遺伝子群を鋭意探索したところ、胞子形成
に関与する特定の遺伝子をゲノム上から削除又は不活性
化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコード
する遺伝子を適当な転写開始制御領域、翻訳開始制御領
域又は分泌シグナル領域を結合して導入することによ
り、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、削
除又は不活性化前と比較して向上することを見出した。

【０００８】すなわち本発明は、胞子形成中期から後期
において胞子の形成に関与する遺伝子群から選ばれた１
以上の遺伝子を削除又は不活性化した微生物、当該微生
物に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シ
グナル領域の下流に結合したタンパク質又はポリペプチ
ドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生
物、並びに当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポ
リペプチドの製造方法を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の微生物を構築するための
親微生物としては、胞子形成に関与する遺伝子を有する
ものであればよく、胞子を形成する微生物がより好まし
い。これらは、野生型のものでも変異を施したものでも
のよい。具体的には、枯草菌などのバチルス(Bacillus)
属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或
いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス(Bacillus)属細
菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺
伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタ
ンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有する点から
特に枯草菌が好ましい。

【００１０】本発明の微生物を用いて生産する目的タン
パク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬
品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用
等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポ
リペプチドが挙げられる。

【００１１】胞子の形成にはゲノム上に散在する２５０
遺伝子以上が関与することが知られているが、本発明に
おいて削除又は不活性の対象となる遺伝子群は、胞子形
成期特異的σ因子をコードする遺伝子群や当該σ因子遺
伝子群の発現、及びσ因子の活性化に関わる遺伝子群
等、胞子の形成を促進する遺伝子群が好ましい。また、
当該σ因子によって転写され、胞子形成の促進に関与す
る遺伝子群も包含されるが、胞子形成期の初期（胞子形
成第０期〜第Ｉ期）は、対数増殖期に比較してプロテア
ーゼやアミラーゼなどの各種菌体外酵素の生産が高まる
ことが知られているため、削除又は不活性化する遺伝子
としては、胞子形成期の中期から後期にかけて特異的に
発現し、胞子形成に関与するものが望ましい。具体的に
は、胞子形成第II期、第III期、第IV期、或いは第Ｖ期
に関与する遺伝子群が好ましく、特に、胞子形成第II期
又は第III期、最適には胞子形成期第II期に関与する遺
伝子群が好ましい。斯かる遺伝子群は、目的タンパク質
の生産には直接関与しておらず、また、通常の工業的生
産培地における微生物の生育にも不要であることが本発
明者らによって見出された。枯草菌における当該遺伝子
の一例を下記表１及び表２に示す。尚、本明細書の各遺
伝子の名称、位置、塩基番号及び機能は、Nature, 390,
249-256, (1997) で報告され、JAFAN: Japan Function
al Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF D
B)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.
jp/)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載してい
る。

【００１２】

【表１】

【００１３】

【表２】

【００１４】また、表１及び表２に示される枯草菌の各
遺伝子と同じ機能を有するか又は表１の各遺伝子と７０
％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％
以上の相同性を有する、他の微生物由来、好ましくはバ
チルス属細菌の由来の遺伝子は、表１に記載の遺伝子に
相当する遺伝子と考えられ、本発明において削除又は不
活性化すべき遺伝子に含まれる。尚、アミノ酸配列の相
同性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (198
5))によって計算される。

【００１５】斯かる遺伝子群の中から選ばれる１又は複
数の遺伝子を削除又は不活性化することにより胞子形成
に関与する化学エネルギーの消費が減ること、また、タ
ンパク質又はポリペプチドの生産期間が長期化すること
に等により、当該タンパク質又はポリペプチドの生産に
おいて、その生産性の向上が達成される。尚、削除又は
不活性化する遺伝子は１以上であればよく、３以上でも
５以上でもよいが、２又は３が好ましく、特に２が好ま
しい。

【００１６】更に本発明の微生物の構築には、上記以外
の遺伝子群の削除又は不活性化を組み合わせることも可
能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待さ
れる。

【００１７】遺伝子群の削除又は不活性化の方法は、公
知の方法、例えば標的遺伝子を順次削除又は不活性化す
る方法や、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を
与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及
び遺伝子解析を行うことによって遺伝子群の削除又は不
活性化する方法等を用いることができる。

【００１８】標的とする遺伝子を削除又は不活性化する
には、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。す
なわち、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミ
ドベクターにクローニングした後、通常の遺伝子工学技
術を用いて遺伝子の全領域又は一部領域を両側のＤＮＡ
断片を残した形で削除する、塩基置換やフレームシフト
等によって構造遺伝子中にナンセンス変異を与える、或
いはクローニングやＰＣＲなどにより単離した目的遺伝
子断片中に他のＤＮＡ断片を挿入する等の改変を行った
後、改変遺伝子を含むＤＮＡ断片を、親微生物に取り込
ませて、親微生物ゲノムとの間で目的遺伝子の外側の両
領域で相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の
標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換
することが可能である。

【００１９】特に、本発明微生物を構築するための親微
生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的
遺伝子を削除又は不活性化する方法については、既にい
くつかの報告例があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268
(1990)等）、こうした方法を繰り返すことによって、本
発明の宿主微生物を得ることができる。また、ランダム
な遺伝子の削除又は不活性化についてもランダムにクロ
ーニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相
同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射
すること等によっても実施可能である。

【００２０】かくして得られた胞子形成中期から後期に
おいて胞子の形成に関与する遺伝子群から選ばれた１以
上の遺伝子を削除又は不活性化した微生物（宿主微生
物）に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコー
ドする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え
微生物を得ることができる。

【００２１】目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は
特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医
療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなど
が含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元
酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水
分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(I
somerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれる
が、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアー
ゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的に
は、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309
(1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げら
れ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセル
ラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号
１又は２に示される配列を有するバチルス属細菌由来の
アルカリセルラーゼや、配列番号１又は２に示される配
列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上の相
同性を有する配列のセルラーゼが挙げられる。尚、アミ
ノ酸配列の相同性はLipman-Pearson法 (Science, 227,
1435, (1985))によって計算される。また、α−アミラ
ーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが
挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼ
が好ましい。また、プロテアーゼの具体例としては、微
生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアー
ゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。

【００２２】また、目的タンパク質又はポリペプチド遺
伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳及び分泌に
関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を
含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コ
ドンを含む翻訳開始領域、又は分泌用シグナルペプチド
領域が適正な形で結合されていることが望ましい。例え
ば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等
に記載されているバチルス属細菌由来のセルラーゼ遺伝
子、及び当該セルラーゼ遺伝子の上流１ｋｂ以内、好ま
しくは０．６ｋｂ以内にある領域に由来する上記制御領
域、より具体的には配列番号１又は２に示される配列又
はこれらとある程度の相同性を有し同様の制御機能を有
する塩基配列等が結合されていることが望ましい。

【００２３】上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺
伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結
合た組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって
宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の
組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断
片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤ
ＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むこと
によっても本発明の組換え微生物を得ることができる。

【００２４】本発明の組換え微生物を用いた目的タンパ
ク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭
素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、
通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク
質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えば
よい。

【００２５】以上より、目的とする胞子形成関与の遺伝
子を削除又は不活性化した宿主微生物、及び当該宿主微
生物を用いて組換え微生物を構築することができ、これ
を用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的
に生産することができる。以下に、枯草菌を用いてα−
アミラーゼ又はセルラーゼを生産する場合について具体
的に説明する。

【００２６】例えば、枯草菌において胞子形成の第II期
以降にフォアスポア内で発現するＲＮＡポリメラーゼの
サブユニットσＦ因子をコードするｓｉｇＦ遺伝子（７
６８ｂｐ）を削除する場合、以下の様に行えばよい。ま
ず、宿主とする枯草菌株から抽出したゲノム遺伝子を鋳
型としてＳＯＥ（splicing by overlap extention）−
ＰＣＲ法（Gene, 77, 61, (1989)）等により、ｓｉｇＦ
遺伝子の開始コドンより上流側のＤＮＡ断片と終止コド
ンより下流側のＤＮＡ断片が、その間にクロラムフェニ
コール耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挿入した形で結
合したＤＮＡ断片を調製する。

【００２７】次に、得られたＤＮＡ断片によって宿主枯
草菌株をコンピテント法により形質転換し、クロラムフ
ェニコール耐性等を指標として形質転換体を分離するこ
とによって、ｓｉｇＦ遺伝子の上流側と下流側で相同組
換えが起こり、ゲノム上のｓｉｇＦ遺伝子がクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子等のマーカー遺伝子と置換した形
質転換体を取得することができる。

【００２８】続いて、得られた形質転換体及び対照とし
て元の枯草菌株に、α−アミラーゼ又はセルラーゼをコ
ードする遺伝子が含まれるプラスミドを導入して、得ら
れる組換え体を適当な条件、例えば栄養培地における振
とう培養などを行った後、培養液上清液のα−アミラー
ゼ活性又はセルラーゼ活性を測定し元の宿主枯草菌株の
生産性と比較することによって、ｓｉｇＦ遺伝子の削除
による目的生産物の高生産化を確認することができる。
また、この培養液から採取・精製することによって、α
−アミラーゼ又はセルラーゼを得ることができる。

【００２９】

【実施例】実施例１ 枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として
増幅した、ゲノム上のｓｉｇＦ遺伝子（塩基番号：2442
658←2443425）の上流に隣接する１．５ｋｂ断片
（Ａ）、及び下流に隣接する１．５ｋｂ断片（Ｂ）と、
プラスミドｐＣ１９４を鋳型として増幅したクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を含む０．９ｋｂ断片（Ｃ）を、
（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様にＳＯＥ−ＰＣＲ法に
よって結合させ、３．９ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この
ＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法により枯草菌１６
８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬ
Ｂ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分
離した。この結果得られた形質転換体ではゲノム上のｓ
ｉｇＦ遺伝子を含む領域（2442632-2443318）が削除さ
れ、クロラムフェニコール遺伝子に置換していることを
ＰＣＲ及びシークエンシングにより確認された。一方、
上記と同様にして、ゲノム上のｓｉｇＥ遺伝子（160416
6→1604885）を含む領域（1604136-1604976）、ｓｐｏI
IＳＢ遺伝子（1347913←1348083）の大部分を含む領域
（1347781-1348081）、ｓｐｏIIＥ（70536→73019）遺
伝子の大部分を含む領域（70537-73018）、ｓｉｇＧ遺
伝子（1605025→1605807）の大部分を含む領域（160508
3-1605877）、ｓｐｏIVＣＢ遺伝子（2652262→265273
2）を含む領域（2652156-2652723）、又は、ｓｐｏIVＣ
Ｂ遺伝子からｓｐｏIIIＣ遺伝子までの領域（2652262→
2701023）を含む領域（2652156-2701031）が削除され、
クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した胞子形成遺
伝子削除株をそれぞれ得た。

【００３０】実施例２ 実施例１にて得られた各遺伝子削除株と対照として枯草
菌１６８株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）Ｋ
ＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特
開2000-210081号公報）断片（３．１ｋｂ）がシャトル
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断
点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、
プロトプラスト法によって導入した。これによって得ら
れた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養
を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×
Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキ
ス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ
硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリ
ン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培
養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアル
カリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分
泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結
果、表３に示した様に、胞子形成遺伝子削除株を用いた
場合はいずれも、対照の１６８株（野生型）の場合と比
較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められ
た。

【００３１】

【表３】

【００３２】

【発明の効果】本発明の微生物を用いれば、胞子が形成
されないことから、目的タンパク質又はポリペプチドを
生産する場合において、エネルギーロス、副産物の生産
や比生産速度の低下等、培地の浪費が大幅に減少でき、
また、タンパク質又はポリペプチドの生産期間が長期化
することによって効率よく目的生産物を生産することが
できる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Host microorganisms <130> P02421405 <140> <141> <150> JP P2001-160520 <151> 2001-05-29 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3150 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-S237 <220> <221> CDS <222> (573)..(3044) <220> <221> sig_peptide <222> (573)..(659) <220> <221> mat_peptide <222> (660)..(3044) <400> 1 gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60 taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120 gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180 gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata 240 aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa 300 tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat 360 gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta 420 gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca 480 agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga 540 ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca 593 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr -25 aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta 641 Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu 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Pro Asp Leu Ala 205 210 215 gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc 1361 Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe 220 225 230 tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act 1409 Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr 235 240 245 250 cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta 1457 Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu 255 260 265 gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct 1505 Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala 270 275 280 agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa 1553 Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu 285 290 295 ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat 1601 Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn 300 305 310 aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct 1649 Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser 315 320 325 330 aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa 1697 Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu 335 340 345 gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg 1745 Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val 350 355 360 aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac 1793 Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp 365 370 375 ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca 1841 Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro 380 385 390 aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt 1889 Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val 395 400 405 410 tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct 1937 Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala 415 420 425 aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta 1985 Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu 430 435 440 ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg 2033 Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr 445 450 455 gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat 2081 Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn 460 465 470 cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg 2129 Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr 475 480 485 490 gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct 2177 Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro 495 500 505 aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac 2225 Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn 510 515 520 atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat 2273 Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp 525 530 535 aac att aaa gta att gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat 2321 Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp 540 545 550 cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt 2369 Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg 555 560 565 570 caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca 2417 Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr 575 580 585 att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat 2465 Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr 590 595 600 cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat 2513 Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp 605 610 615 ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt 2561 Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe 620 625 630 gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc 2609 Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile 635 640 645 650 aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca 2657 Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro 655 660 665 aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta 2705 Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val 670 675 680 aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca 2753 Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr 685 690 695 aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca 2801 Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala 700 705 710 gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt 2849 Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg 715 720 725 730 ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat 2897 Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp 735 740 745 cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa 2945 Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu 750 755 760 caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag 2993 Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys 765 770 775 aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa 3041 Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys 780 785 790 aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt 3094 Lys 795 ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag 3150 <210> 2 <211> 3332 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-64 <220> <221> CDS <222> (610)..(3075) <220> <221> sig_peptide <222> (610)..(696) <220> <221> mat_peptide <222> (697)..(3075) <400> 2 agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60 cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120 cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180 acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240 tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300 tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360 atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420 tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480 aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540 aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta 600 ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att 651 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile -25 -20 ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca 699 Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala -15 -10 -5 -1 1 gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac 747 Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp 5 10 15 aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc 795 Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val 20 25 30 gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta 843 Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu 35 40 45 cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat 891 Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn 50 55 60 65 gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att 939 Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile 70 75 80 cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag 987 Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu 85 90 95 tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat 1035 Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn 100 105 110 gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct 1083 Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro 115 120 125 aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca 1131 Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala 130 135 140 145 gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag 1179 Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu 150 155 160 cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa 1227 Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu 165 170 175 ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta 1275 Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu 180 185 190 cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca 1323 Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro 195 200 205 aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat 1371 Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp 210 215 220 225 cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct 1419 His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala 230 235 240 tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac 1467 Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn 245 250 255 gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt 1515 Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe 260 265 270 gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac 1563 Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr 275 280 285 ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att 1611 Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile 290 295 300 305 agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca 1659 Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala 310 315 320 ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca 1707 Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro 325 330 335 ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa 1755 Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu 340 345 350 tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt 1803 Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg 355 360 365 aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa 1851 Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln 370 375 380 385 gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag 1899 Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu 390 395 400 aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat 1947 Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp 405 410 415 gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt 1995 Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly 420 425 430 tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat 2043 Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp 435 440 445 gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa 2091 Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln 450 455 460 465 ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag 2139 Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu 470 475 480 cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act 2187 Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr 485 490 495 ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct 2235 Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala 500 505 510 gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt 2283 Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly 515 520 525 gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt 2331 Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val 530 535 540 545 gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct 2379 Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser 550 555 560 gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct 2427 Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser 565 570 575 ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg 2475 Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala 580 585 590 tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg 2523 Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp 595 600 605 gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt 2571 Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly 610 615 620 625 gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca 2619 Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala 630 635 640 aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac 2667 Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn 645 650 655 ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa 2715 Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu 660 665 670 tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa 2763 Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys 675 680 685 att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt 2811 Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg 690 695 700 705 aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga 2859 Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg 710 715 720 gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg 2907 Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro 725 730 735 gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat 2955 Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp 740 745 750 gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa 3003 Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys 755 760 765 gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca 3051 Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala 770 775 780 785 atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct 3105 Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys 790 aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt 3165 attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct 3225 ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac 3285 ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt 3332

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 小澤 忠弘 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 東畑 正敏 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 尾崎 克也 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 井上 恵雄 東京都墨田区文花２−１−３ 花王株式会 社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA11 CA03 DA07 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL02 4B065 AA19X AA19Y AB01 BA02 CA31 CA42

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 胞子形成中期から後期において胞子の形
   成に関与する遺伝子群から選ばれた１以上の遺伝子を削
   除又は不活性化した微生物。
2. 【請求項２】 微生物がバチルス属細菌である請求項１
   記載の微生物。
3. 【請求項３】 バチルス属細菌が枯草菌である請求項２
   記載の微生物。
4. 【請求項４】 遺伝子群が、胞子形成第II期、第III
   期、第IV期、又は第Ｖ期に発現し、胞子形成に関与する
   ものである請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物。
5. 【請求項５】 削除又は不活性化される遺伝子が、枯草
   菌のsigE 、sigF 、spoIIE、spoIISB及びsigGのいずれ
   か、spoIVCBからspoIIICまでの領域に含まれる遺伝子
   群、並びに当該遺伝子又は遺伝子群に相当する遺伝子の
   いずれか１以上から選ばれるものである請求項１〜４の
   いずれか１項記載の微生物。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項記載の微生
   物に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シ
   グナル領域の下流に結合したタンパク質又はポリペプチ
   ドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生
   物。
7. 【請求項７】 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又
   は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺
   伝子又は該セルラーゼ遺伝子の上流１ｋｂ以内にある領
   域に由来するものである請求項６記載の組換え微生物。
8. 【請求項８】 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又
   は分泌シグナル領域が、配列番号１若しくは配列番号２
   又はこれらと７０％以上の相同性を有するセルラーゼ遺
   伝子に由来するものである請求項６又は７記載の組換え
   微生物。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれか１項記載の微生
   物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。