JP2008259432A - 組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築され、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子をゲノムから欠失又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物。
【選択図】なし
Description
また、枯草菌におけるタンパク質輸送システム(Sec経路)は、分泌タンパク質を細胞外へ押し出すモーターの役割を担うSecA、また分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの3つのタンパク質のほか、輸送チャネルの補助因子であるSecDF等によって、その機能が担われているが、このうち、SecGタンパク質をコードするsecG遺伝子を過剰発現し得る発現ベクター(特許文献2)や、secG遺伝子のリボソーム結合部位を改変することによりsecG遺伝子の発現を変化させたグラム陽性菌(特許文献3)に関する報告がなされており、secG遺伝子を破壊した枯草菌の生育が、異種タンパク質生産時に阻害されること等が示されている。また大腸菌において、secY遺伝子の変異が低温での生育やタンパク質の分泌を阻害することが報告されている(非特許文献3)。
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress]記載の方法が挙げられ、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5% SDS、5xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
なお、ここで、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり1コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合、生産培養中に一部のプラスミドが脱落しても、その影響を受け難い。
ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片(以下、断片(1))と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片(以下、断片(2))の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片(以下、断片(3))、secY遺伝子断片(以下、断片(4))、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片(以下、断片(5))を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片(1)〜断片(5)の5断片を調製する。この際、例えば、断片(1)の下流末端に断片(3)の上流側10〜30塩基対配列、断片(4)の上流末端に断片(3)の下流側10〜30塩基対配列、断片(4)の下流末端に断片(5)の上流側10〜30塩基対配列、更に断片(2)の上流側に断片(5)の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる(図1)。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片(1)の上流側プライマーと断片(2)の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、断片(1)の下流末端に付加された断片(3)の配列に於いて断片(3)とのアニールが生じ、同様に、断片(4)の上流末端に付加された断片(3)の配列に於いて断片(3)とのアニールが生じ、断片(4)の下流末端に付加された断片(5)の配列に於いて断片(5)とのアニールが生じ、断片(2)の上流側に付加された断片(5)の配列において断片(5)とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片(1)〜断片(5)の5断片が、(1)(3)(4)(5)(2)の順に結合したDNA断片を得ることが出来る(図1)。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。
尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。
本発明において、胞子形成関連遺伝子とは、胞子形成期特異的シグマ因子をコードする遺伝子群や当該シグマ因子遺伝子群の発現、及びシグマ因子の活性化に関わる遺伝子群等、胞子の形成を促進し、それらの各遺伝子を欠失又は不活性化することにより実質的に胞子形成過程が阻害される遺伝子群が挙げられる。また、当該シグマ因子によって転写され、胞子形成の促進に関与する遺伝子群も包含される
バチルス属細菌のうち、枯草菌については17個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子(ハウスキーピングシグマ因子)であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている(Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))。
sigF遺伝子は、胞子形成期において、枯草菌細胞内の非対称隔膜が形成されたII期以降に娘細胞側で起こる遺伝子発現を司るシグマ因子をコードする遺伝子であり、sigE遺伝子は、胞子形成期において、枯草菌細胞内の非対称隔膜が形成されたII期以降に母細胞側で起こる遺伝子発現を司るシグマ因子をコードする遺伝子である。
また、phrA遺伝子は、外部の生育環境の変化を感知して様々な応答を行う際に要する細胞間情報伝達機構に関与する遺伝子の一つであり、その遺伝子産物はひとまず細胞外へ分泌される。そして細胞外でプロセッシングを受けた後、ペンタペプチドとして細胞内に取り込まれ、胞子形成開始シグナルを伝達するフォスフォリレー系のSpo0Fのリン酸化を制御するRapAタンパク質に結合して、胞子形成開始のシグナル伝達に関与することが報告されている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,8612,(1997))。
上記各遺伝子の遺伝子番号及び機能を表6にまとめて示した。
プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus clausii KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のプロテアーゼが挙げられる。Bacillus clausii KSM-K16株株由来のアルカリプロテアーゼのより具体的な例としては、配列番号4のアミノ酸番号1〜380のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類(Biochem.J.,280,309,1991)中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)、やバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-64株(FERM BP-2886)由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号6のアミノ酸番号1〜795のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号8のアミノ酸番号1〜793のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
また、α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
次いで調製したコンピテントセル懸濁液(SPII培地における培養液)100μLに各種DNA断片を含む溶液(SOE−PCRの反応液等)5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天)に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl)、2xYT培地(1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%NaCl)、2xL−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物)、或いはCSL発酵培地(2%酵母エキス、0.5%コーンスティープリカー(CSL)、0.05%塩化マグネシウム七水和物、0.6%尿素、0.2%L-トリプトファン、10%グルコース、0.15%リン酸二水素ナトリウム、0.35%リン酸水素二ナトリウム、pH7.2)を用いた。
以下の様に、secY遺伝子を過剰発現する変異株の構築を行った(図3参照)。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したPVG-FWとPVG-R、及びsecY/PVG-FとsecY/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片(A)、及びsecY遺伝子を含む1.3kb断片(B)をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194(J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982))を鋳型として、表1に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール(Cm)耐性遺伝子を含む0.9kb断片(C)をPCRにより増幅した。
次いで、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(A)(B)(C)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がsecY遺伝子の上流に連結し(spoVG遺伝子の開始コドンの位置にsecY遺伝子の開始コドンが位置する様に連結)、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片(D)を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片(E)、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片(F)をPCRにより増幅した。
次いで、得られた(E)(F)(D)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(E)(D)(F)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.2kbのDNA断片(G)を得た。
得られた4.2kbのDNA断片(G)を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示すamyEfw2とsecY/Cm-R、及びsecY/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.5kb及び3.1kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をsecY-K株と命名した。
図4に基づいて、ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したsigF-FW及びsigF/Sp-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、sigF/Sp-F及びsigF-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片(B)をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpDG1727(Gene, 167, 335, (1995))DNAを鋳型とし、表1に示したspf及びsprのプライマーセットを用いて、1.2kbのスペクチノマイシン(Sp)耐性遺伝子領域(C)をPCRにより調製した。
次に、図4に示すように、得られた1.0kb断片(A)、1.0kb断片(B)及びSp耐性遺伝子領域(C)の3断片を混合して鋳型として、表1に示したsigF-FW2及びsigF-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片(A)、Sp耐性遺伝子領域(C)、1.0kb断片(B)の順に含まれる2.8kbのDNA断片(D)を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片(D)を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、スペクチノマイシン(100μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってsigF遺伝子がSp耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、sigF遺伝子欠失株(ΔsigF株)を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例1にて構築したsecY-K株を用いることによりsecY-K株ゲノム中のsigF遺伝子をSp耐性遺伝子にて置換した菌株(secYKΔsigF株)を構築した。
実施例2に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のsigE遺伝子及びphrA遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換を行い、sigE遺伝子欠失株(ΔsigE株)及びphrA遺伝子欠失株(ΔphrA株)を構築した。各菌株の構築には表1に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表2に示した。
実施例1〜3にて得られたsecY-K株、secYKΔsigF株、secYKΔsigE株、及びsecYKΔphrA株の異種タンパク質生産性評価として、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼの生産性を指標として以下の様に行った。対照として枯草菌168株、ΔsigF株、ΔsigE株、及びΔphrA株についても評価を行った。即ち、バチルス クラウジ(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERM BP-3376)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ(Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995))をコードする1.3kbのDNA断片(W)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片(X)を増幅した。
次いで、得られた(W)(X)の2断片を混合して鋳型とし、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片(Y)を得た。得られた1.8 kbのDNA断片(Y)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。
構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM CaCl2溶液で適宜希釈した培養上清50μLに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液(pH10.5)を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。
他の異種タンパク質生産性評価として、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)断片(3.1 kb)を表1に示した237UB1と237DB1のプライマーセットを用いて増幅した後BamHI制限酵素処理し、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を実施例4と同様の条件にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
枯草菌168株ゲノム上のrsiX遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子への置換を、実施例2に示したsigF遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換と同様にして行い、ΔrsiX株を構築した。使用したプライマーを表1に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表2に示した。また実施例2にて構築したΔsigF株のゲノム上のrsiX遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、ΔsigFΔrsiX株を構築した。尚、rsiX遺伝子は枯草菌のECF(extracytoplasmic function)ファミリーに属するシグマ因子の一つであるSigXの機能を抑制するアンチシグマ因子(anti-SigX)をコードする遺伝子である。SigXは、熱ストレス等、細胞周囲の環境が変化すると活性化され、その認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導することによって環境変化に対応する機能を有する(J. Bacteriol., 179, 2915, (1997))。
比較例1にて構築したΔsigFΔrsiX株のアルカリプロテアーゼ分泌生産性評価を、実施例4と同様に行った。対照として枯草菌168株、ΔrsiX株及び実施例1にて構築したΔsigF株についても評価を行った。
その結果、表5に示した様に、rsiX遺伝子を欠失したΔrsiX株のプロテアーゼ生産性が野生株168株より高いにも関わらず、sigF遺伝子欠失と組み合わせたΔsigFΔrsiX株の生産性はΔsigF株よりむしろ低下していた。即ち、胞子形成に関連する遺伝子の欠失を組み合わせた際の異種タンパク質生産に対する相乗的な効果の発揮は、rsiX遺伝子欠失に対しては認められないことが確認された。
枯草菌168株ゲノム上のyacP遺伝子、yvdE遺伝子、yurK遺伝子、yhdQ遺伝子、glcT遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子への置換を、実施例2に示したsigF遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換と同様にして行い、ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株、及びΔglcT株を構築した。使用したプライマーを表1に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表2に示した。また実施例2にて構築したΔsigF株のゲノム上のyacP遺伝子、yvdE遺伝子、yurK遺伝子、yhdQ遺伝子、glcT遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、ΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株、及びΔsigFΔglcT株を構築した。
本発明に関連のある遺伝子について、遺伝子番号及び機能を表6に示した。
比較例3にて構築したΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株、及びΔglcT株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例5と同様に行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表7に示した様に、ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、及びΔglcT株にて野生株以上の生産性が認められ、ΔyhdQ株については若干低下した。
つづいて比較例3にて構築したΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株、及びΔsigFΔglcT株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例5と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例1にて構築したΔsigF株についても評価を行った。その結果、表8に示した様に、構築したいずれの株についてもそのセルラーゼ生産性はΔsigF株を下回っていた。即ち、胞子形成に関連する遺伝子の欠失を組み合わせた際の異種タンパク質生産に対する相乗的な効果の発揮は、secY遺伝子発現強化との組み合わせにおける特徴であることが強く示唆された。
Claims (12)
- 枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築され、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子をゲノムから欠失又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物。
- 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入し、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
- 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子由来のものである請求項2記載の組換え微生物。
- 胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子が、kinA遺伝子、kinB遺伝子、kinC遺伝子、spo0F遺伝子、spo0B遺伝子、spo0A遺伝子、kapB遺伝子、kipA遺伝子、phrA遺伝子、spo0J遺伝子、sigH遺伝子、sigF遺伝子、sigE遺伝子、spoIIAA遺伝子、spoIIAB遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIIR遺伝子、spoIIGA遺伝子、sigG遺伝子、spoIIIC遺伝子、spoIVCB遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子である請求項1〜3の何れか1項記載の組換え微生物。
- 胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子が、sigF遺伝子、sigE遺伝子、phrA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子である請求項1〜4の何れか1項記載の組換え微生物。
- 微生物がバチルス属(Bacillus)細菌である請求項1〜5のいずれか1項記載の組換え微生物。
- バチルス(Bacillus)属細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項6記載の組換え微生物。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか1以上の領域を結合した請求項1〜7のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した請求項8記載の組換え微生物。
- 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項8又は9記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号5で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号7で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項8〜10のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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