JP2017523778A - 遺伝子改変された(r)−乳酸産生好熱性細菌 - Google Patents

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Abstract

本発明は、通性嫌気性である、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、a)内在性の(S)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損;b)(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入;c)内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子の不活化または欠損を含む細胞に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな(R)−乳酸の産生のための好熱細菌細胞の改変、遺伝子改変された細胞、およびエナンチオピュアな(R)−乳酸の産生方法に関する。
乳酸およびその塩(ラクテートとして知られている)は、医薬、生物分解性ポリマーおよび食品加工を含む種々の分野において有用な、商業的に採算の取れる産物である。通性嫌気性である好熱性細菌、例えばGeobacillus属の種は、乳酸の工業生産にとって理想的な生物であると思われる。それらは、37〜75℃の温度で増殖することができ、最適温度は55〜65℃であり(Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446)、50℃を超える温度で嫌気性の工業的発酵を許す。この高い温度は、工業規模で発酵させる場合に、いくつかの利点を有する。すなわち、感染のリスクがより低く、したがってエナンチオマー純度がより高い、反応がより速い、冷却コストがより低い等である。Geobacillus属の通性嫌気性は、嫌気性条件下での、または少なくとも低酸素分圧下での発酵を可能にし、このことは、工業的規模にとって望ましい。なぜなら、比較的安価な装置および加工を可能にするからである。さらに、これらの細菌の栄養要求量は、これもまた比較的安価な工業プロセスを可能にする乳酸菌、例えばLactobacillus属の種の栄養要求量よりも少ない。
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、嫌気性条件下で、または少なくとも低酸素分圧下で増殖される場合に乳酸を産生することが知られている。例として、G. caldotenax、G. caldoxylosilyticus、G. debilis、G. kaustophilus、G. pallidus、G. stearothermophilus、G. tepidimans、G. thermodenitrificans、G. thermoglucosidans、G. thermoleovorans、G. toebii、G. tropicalisが挙げられる。
G. thermoglucosidansは、キシロース、アラビノース、グルコース、フルクトース、スクロースおよびセロビオースから乳酸を産生することが知られている(Greenら、2003、国際公開第03/008601号)。工業用途にとって、スクロース、グルコース、キシロースもしくはアラビノース、またはそれらの混合物を含有する供給原料が最も関係する。グルコースおよびキシロースを同時に利用する能力(Greenら、2003、国際公開第03/008601号)は、リグノセルロース系供給原料に由来する発酵性の糖を用いる場合に、G. thermoglucosidansの重要な利点である。
通性嫌気性である公知のGeobacillus属の種の1の不利な点は、主に(S)−乳酸を産生し、(R)−乳酸をほんの少ししか産生しないという事実である。生物分解性の乳酸ポリマーの適用の成否は、安価な(S)−乳酸および安価な(R)−乳酸の両方の入手可能性に依存するので、両方のエナンチオマーの対費用効果の高い産生が必要とされる。現在知られている(R)−乳酸産生菌は、中温性の細菌(例えばBacillus laevolacticus)であるか、栄養要求量が大きい細菌(例えばLactobacillus delbrueckii)であり、これらは、(R)−乳酸の製造を(S)−乳酸の製造よりもかなり高価にする。
通性嫌気性である公知のGeobacillus属の種の別の不利な点は、それらが通常、混合酸発酵を行って、乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を主な発酵産物として産生するという事実である。本願において、有機酸の用語が意味するところは、その対応する塩も含む。
工業用途にとって魅力的な特性、例えば低い栄養要求、広い糖の消費能力、炭水化物加水分解(carbohydrolytic)酵素を産生する能力、高い増殖速度、高い生産性、浸透圧ストレスに対する耐性および遺伝的アクセシビリティを有する細菌株(例えばGeobacillus株)を、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな乳酸の産生に用いることができることが、明らかに必要とされている。
本発明の目的の1つは、通性嫌気性であり、かつホモ乳酸発酵によって(R)−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。(R)−乳酸のための他の用語が、D−乳酸またはD(−)−乳酸であると理解されるべきである。本願において、これらの用語は互換的に用いられる。同様に、用語(S)−乳酸、L−乳酸およびL(+)−乳酸が互換的に用いられる。
本発明の別の目的は、通性嫌気性であり、かつエナンチオピュアな(R)−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。
G. thermoglucosidansは、好熱性のBacillus属の種として記載されている(Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495;Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446;Coorevitsら、2012、Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485)。G. thermoglucosidansは以前、Bacillus thermoglucosidasiusとして知られており(Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495)、2001年にNazinaらによってG. thermoglucosidasiusに改名され(Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446)、後にCoorevitsらによってG. thermoglucosidansに改名された(Coorevitsら、2012、Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485)。基準株は、土壌から単離された(Suzukiら、1976、Appl. Environ. Microbiol. 31:807-812)。当初は絶対好気性と報告されていたが、後の研究が通性嫌気性増殖および(S)−乳酸産生を報告している(Greenら、2003、国際公開第03/008601号;Fongら、2006、Extremophiles 10:363-372)。温度範囲は42〜69℃であり、最適温度は62℃である(Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495)。エタノール産生のためのG. thermoglucosidans株の遺伝的改変が報告されている(Greenら、2001、国際公開第01/49865号;Atkinsonら、2008、国際公開第08/038019号)。これは、G. thermoglucosidans DSM 2542のための遺伝的ツール、およびL−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)遺伝子を破壊する方法の記載を含む(Atkinsonら、2006、国際公開第2006/117536号、および2008、国際公開第2008/038019号)。キシロースおよびグルコース上で増殖された細胞についての代謝経路および流量が、G. thermoglucosidans M10EXGについて報告されている(Tangら、2009、Biotechnol. Lett. 102: 1377-1386)。
Geobacillus属の種における乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhL)の不活化が、エタノール産生を最適化することが示された(Paytonら、1985、FEMS Microbiol. Lett. 26:333-336;Greenら、2001;Atkinsonら、2006、国際公開第2006/117536号;Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408)。Crippsらは、G. thermoglucosidans NCIMB 11955のldhL誘導体が、バッチ発酵における乳酸産生の激減を示すが、完全な排除を示さない一方で、エタノール、ギ酸およびピルビン酸の産生が増大することを示している。ldhLおよびpflB(ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする)の一緒にされた突然変異が、ギ酸産生を排除する(Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408)。
異種遺伝子発現は、G. thermoglucosidansにおいて問題があると思われる。Zymomonasmobilisピルビン酸デカルボキシラーゼの機能的酵素は、G. thermoglucosidansにとって最適状態に及ばない温度である52℃にて増殖される場合にのみ産生され、54℃、56℃または58℃では産生されない(Thompsonら、2008、Biotechnol. Lett. 30:1359-1365)。Gluconobacter oxydansピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の異種発現は、G. thermoglucosidansにおいて45℃にて活性を得るのにコドン調和(codon harmonization)を必要とするが、52℃では活性を実現できない(van Zylら、2014、Appl. Microbiol. Biotechnol. 98:1247-1259)。
van Kranenburgらは、中程度に好熱性のBacillus coagulansは、天然のL−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させ、そしてLactobacillus delbrueckiiから得られた異種D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置き換えることによって、45℃〜54℃の温度での(R)−乳酸産生に用いられ得ることを示している(van Kranenburgら、2007、国際公開第2007/085443号)。しかしながら、52℃を超える温度で活性である異種タンパク質の例は、G. thermoglucosidansにおけるピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の異種発現実験において見出されることができず、一方、この種に最適の温度は通常、およそ60℃である。さらに、L. delbrueckii由来のD−乳酸デヒドロゲナーゼが60℃で活性があるかどうかは、知られていない。
本発明者らは、内在性L−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ldhLを破壊し、そしてD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子を導入することによって、好熱細菌細胞が(R)−乳酸の産生に用いられることができることを今見出した。本発明者らは、L. delbrueckii単離体のldhA遺伝子(配列番号35)およびhdhD遺伝子(配列番号37)(双方ともD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする)を独立して導入した。当業者は、その代わりとして、G. thermoglucosidansにおいて機能的に発現される、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする他の遺伝子が用いられ得ることを知っている。
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、主な産物としての乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を伴う混合酸発酵を示す。副産物の産生における必須酵素をコードする遺伝子の破壊が、所望の産物の産生を向上させる一般的なアプローチである。しかしながら、特定の遺伝子の破壊の影響は、宿主の代謝全体に応じて、様々な副作用を有し得る。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードするEscherichia coli pflA、および二機能性アセトアルデヒド−CoA/アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするadhEにおける単一突然変異が、改善された乳酸産生を、増加されたピルビン酸副産物形成、残留酢酸およびエタノール産生、ならびに非常に低下されたバイオマス収率と共に結果し(pflA)、または主な発酵産物としての酢酸を伴う改善された乳酸産生を結果する(adhE)(Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7:104-115)。いくつかのE. coli株では、focA−pflAB遺伝子座が破壊されて、ギ酸の産生を排除している(Zhouら、2003、Appl. Environ. Microbiol. 69:2237-2244;Liuら、2011、Appl. Biochem. Biotechnol. 164:162-169)。培地中での乳酸蓄積における、ギ酸チャネルタンパク質をコードするfocAの重要性が、最近示されたので(Beyerら、2013、J. Bacteriol. 195:1428-1435)、それは、focA−pflAB欠損を有するE. coli株の表現型に寄与しているだろう。緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiでは、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のノックアウトが、乳酸発酵を向上させたが、細胞外グリセリンおよび酢酸の濃度をも増大させた(Catalanottiら、2012、PlantCell 24:692-707)。
G. thermoglucosidansにおいて、pflBA遺伝子は集中的にadhE遺伝子に向けられている。実際的な理由のために、本発明者らは、一改変において、pflBAとadhEの一部とを欠損させることによって、pflA、pflBおよびadhEを破壊することに決めた。驚くべきことに、本発明者らは、他の副産物に影響を与えることなく、そして乳酸発酵性能に影響を与えることなく、エタノール、酢酸およびギ酸副産物の形成をほぼ排除することができた。例えば、本願において、副産物形成がほぼ排除されるとは、本明細書中に記載されているように遺伝子操作された細胞を発酵させることによって、産生された乳酸の総量に対する副産物(例えばエタノール、酢酸およびギ酸)の重量が、10%(w/w)以下、特に5%、4%、3%または2%(w/w)以下であることを意味する。乳酸および副産物の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー(GLC)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による誘導体化および分析によって決定され得る。
文献に記載された乳酸産生においてキラル不純度をもたらし得るいくつかのオプションがある。(R)−乳酸は、D−乳酸デヒドロゲナーゼの活性によってピルビン酸から形成されることができ、乳酸ラセマーゼの活性によって(S)−乳酸から形成されることができ、またはメチルグリオキサール経路を介して形成されることができる。(S)−乳酸は、L−乳酸デヒドロゲナーゼの活性によってピルビン酸から形成されることができ、乳酸ラセマーゼの活性によって(R)−乳酸から形成されることができ、またはメチルグリオキサール経路を介して形成されることができる。
メチルグリオキサールシンターゼ(E.C. 4.2.99.11)は、メチルグリオキサール経路の最初の工程におけるジヒドロキシアセトンリン酸のメチルグリオキサールおよびオルトリン酸への転化を触媒する。次に、メチルグリオキサールは、2つの異なる経路を介して(S)−乳酸または(R)−乳酸に転化され得る。したがって、メチルグリオキサール経路は、(S)−乳酸および(R)−乳酸双方の産生に関してキラル不純物の源であり得る。グラム陰性中温細菌Escherichia coliでは、メチルグリオキサールシンターゼをコードするmgsA遺伝子の破壊が、(S)−乳酸および(R)−乳酸双方の産生に関してキラル純度を向上させた(Grabarら、2006、Biotechnol. Lett. 28:1527-1535)。グラム陽性菌では、メチルグリオキサール経路の活性に関してはほとんど知られていない。中温性のBacillus subtilisでは、mgsA遺伝子が、バシリチオール生合成における最初の2つの酵素をコードする遺伝子と一緒にオペロン中にコードされている(Gaballaら、2010、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:6482-6486;Helmann、2011、Antioxidants & Redox signaling 15:123-133)。最近、Chandrangsuらは、バシリチオールがメチルグリオキサールの無毒化に関与していることを実証した(Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715)。バシリチオール依存性メチルグリオキサール経路は、グリオキサラーゼI(GlxA)およびグリオキサラーゼII(FlxB)を利用して、メチルグリオキサールを(R)−乳酸に転化する(Chandrangsuら、2014)。また、メチルグリオキサールは、グリオキサラーゼIIIの予測される相同物であるYdeA、YraAおよびYfkMの活性によって、(R)−乳酸に転化されることができる(Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715)。グラム陽性細菌におけるメチルグリオキサール経路による(S)−乳酸の産生についての報告はない。
ゲノム情報に基づくと、(S)−乳酸産生は、乳酸ラセマーゼ(この相同物は見出されていない)によっても、またメチルグリオキサール経路(これは、グラム陽性生物において、不完全であると考えられ、かつ(S)−乳酸を産生することが知られていない)によっても引き起こされないと予想されるであろう。驚くべきことに、内在性L−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ldhLを破壊し、そしてD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子を導入することによって改変された(R)−乳酸産生Geobacillus株において産生される微量の(S)−乳酸は、メチルグリオキサールシンターゼをコードすると予測されるmgsA遺伝子を破壊することによってさらに低減されることができた。
胞子形成の欠損が、Bacillus属の種の工業用途に所望される特性である。遺伝子改変された微生物の封じ込め使用に関する2009年5月6日の欧州議会および理事会の指令2009/41/ECによれば、遺伝子改変された微生物の封じ込め使用は、上記微生物がヒトの健康および環境に対して呈するリスクに関して分類されるべきである。Bacillus属の種が胞子形成欠損表現型を有することは、環境中に広がるリスクを最小にする手段と考えられる。胞子形成欠損表現型を得るための様々な方法が知られており、例えば、自然発生的な胞子形成欠損誘導体を選択すること(Greenら、2001、国際公開第01/49865号)、または、例えばspo0A(Gonzy-Treboulら、1992、J.Mol. Biol. 244:967-979;Atkinsonら、2010、国際公開第2010/052499号)もしくはsigF(Flemingら、1995、Appl. Environ. Microbiol. 61:3775-3780;Wangら、2005、J. Appl. Microbiol. 98:761-767;Kovacsら、2010、Appl. Environ. Microbiol. 76:4085-4088)を破壊することにより胞子形成経路の破壊に向けることが挙げられる。
すなわち、本発明は、第1の局面において、通性嫌気性である、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、
a)内在性(S)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損;
b)(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入;
c)内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子の不活化または欠損
を含む細胞を開示する。
内在性遺伝子は、微生物中に存在する遺伝子である。言うまでもなく、遺伝子が不活化されまたは欠損しているところの、本明細書中に記載される細菌は、上記遺伝子が上記細菌中に本来は存在することを必要とする。反対の指摘が無ければ、本願において、遺伝子へのあらゆる言及は、内在性遺伝子を意味する。微生物中に導入される遺伝子、例えば本明細書中に記載される細菌細胞に導入される(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、内在性遺伝子でない。
本明細書において、(S)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ldhL)のヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号47で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号48で提供される。
ldhLに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、下流プライマー配列番号11および12、ならびに上流プライマー配列番号13および14によって同定されることができる。
(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする適切な遺伝子は、配列番号36もしくは38のアミノ酸配列をコードする遺伝子、または、配列番号36もしくは38のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性、好ましくは95%、より好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を示すアミノ酸配列をコードする相同遺伝子である。(R)−乳酸活性は、適切な宿主における上記遺伝子の過剰発現およびその後の、酵素アッセイを用いた細胞抽出物中の(R)−乳酸酵素活性の定量化によって実証され得、または、E. coli ldhA突然変異体、例えばE. coli FMJ144を補完する能力によって実証され得る。そのような相同配列は、種々の集団に由来する複数の細胞に存在し得る、または自然の変異もしくは株内変異故にある集団内に存在しうる多型を包含しうる。相同体はさらに、特定のDNAまたはアミノ酸配列が由来するところの種以外の種に由来してもよいし、人工的に設計されかつ合成されてもよい。配列番号36および38によって同定されるタンパク質は、Lactobacillus delbrueckiiのldhA遺伝子およびhdhD遺伝子によってコードされる。双方の遺伝子は、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする。
本発明に従う一実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号38のアミノ酸配列、または少なくとも90%、好ましくは95%の同一性、より好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のhdhD遺伝子である(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号36のアミノ酸配列、または少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のldhA遺伝子である(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
さらに別の実施形態では、本発明に従う細胞中のhdhD遺伝子が、配列番号38のアミノ酸配列をコードする。
別の実施形態では、本発明に従う細胞中のldhA遺伝子が、配列番号36のアミノ酸配列をコードする。
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号37のヌクレオチド配列に従うhdhD遺伝子を含む。
また別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号35におけるヌクレオチド配列に従うldhA遺伝子を含む。
好ましい実施形態では、内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座pflBA−adhEの不活化または欠損によって不活化される。あるいは、内在性ピルビン酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子と内在性アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhEが、別々の工程において不活化または欠損されることができる。pflBA−adhEに隣接するヌクレオチド領域は、配列番号19〜21のPCRプライマーによって同定されることができる。
本明細書において、pflBAは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼをそれぞれコードするピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子AおよびBを意味する。
plfAは、ピルビン酸ギ酸リアーゼA遺伝子(ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする)を指し、その配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号39で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号40で提供される。plfBは、ピルビン酸ギ酸リアーゼB遺伝子(ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする)を指し、そのヌクレオチド配列は、配列番号41で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号42で提供される。本発明において、adhEは、二機能性アセトアルデヒド−CoA/アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子Eを指し、そのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号43で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号44で提供される。
好ましい実施形態では、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子による不活化が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座pflBA−adhEの不活化または欠損によって不活化される。あるいは、ピルビン酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子、ならびにアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhEは、別々の工程において不活化または欠損され得る。
本発明において、adhEに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、PCRプライマー配列番号9および10によって同定されることができる。
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞において、内在性メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子(mgsA)もまた、不活化されまたは欠損している。
本明細書において、mgsAに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、PCRプライマー配列番号21〜24によって同定されることができる。
mgsAのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号45で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号46で提供される。
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された細胞において、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子(pta)もまた、不活化されまたは欠損している。ptaのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号49で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号50で提供される。pta(ホスホトランスアセチラーゼをコードする)の不活化または欠損はさらに、内在性pta活性に関連するレムナント(remnant)酢酸産生を最小にする。得られた株(ptaが不活化されまたは欠損している)は、酢酸について栄養要求性である。したがって、この遺伝子操作された細胞を発酵させる場合には、酢酸が増殖培地に補われなければならない。
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された好熱細菌細胞がまた、内在性胞子形成遺伝子の不活化または欠損によって、胞子形成欠損型にされている。
別の実施形態では、不活化または欠損された胞子形成遺伝子が、sigFである。
sigFは、胞子形成遺伝子を指し、そのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号51で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号52で提供される。sigFに隣接するヌクレオチド配列は、配列番号3〜6のPCRプライマーによって同定されることができる。
さらに別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞である。好ましくは、該細胞は、Bacillus属、より好ましくはGeobacillus属に属する。
また別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、Geobacillus thermoglucosidansである。
本発明の目的の1つは、通性嫌気性であり、かつ、ホモ乳酸発酵によって(R)−乳酸を産生するGeobacillus株を作出することである。
すなわち、本発明は、一局面において、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のGeobacillus属の種を遺伝子工学によって遺伝子改変する方法を開示する。
本発明において、ホモ乳酸発酵とは、炭化水素源から乳酸を、15%(w/w)(%(w/w):重量%)以下、好ましくは10%(w/w)以下、より好ましくは5%、4%、3%または2%(w/w)以下の副産物、例えばギ酸、酢酸およびエタノールの形成を伴って産生することと定義される。このパーセンテージは、乳酸((R)−乳酸および存在しうる(S)−乳酸を含む)の総重量に対する副産物の総重量に関する。乳酸と、エタノール、酢酸およびギ酸の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー(GLC)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による誘導体化および分析によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、ギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも1つの形成量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、5%(w/w)以下、特に2%、1%、0.25%または0.1%(w/w)以下である。言い換えると、ホモ乳酸発酵において形成されるギ酸の重量は、乳酸の総重量に対して、例えば、5%(w/w)以下、より特に2%、1%、0.25%または0.1%(w/w)以下でありうる。同様に、エタノールの重量は、5%、2%、1%、0.25%または0.1%(w/w)以下であり得、また、酢酸の量は、5%、2%、1%、0.25%または0.1%(w/w)以下でありうる。
キラル純度は、ポリ乳酸ポリマーの製造にとって重要な局面である。したがって、商業的な用途のためにエナンチオピュアな(R)−乳酸を産生することが不可欠である。
すなわち、本発明はまた、少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99.5%、99.8%または99.9%のエナンチオマー純度を有する(R)−乳酸を産生する遺伝子操作された好熱細菌細胞を提供する。
本発明の一局面において、エナンチオピュアな乳酸を産生する方法が提供される。該方法は、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて本発明に従う好熱細菌細胞を培養する工程と、(R)−乳酸を単離する工程とを含む。
別の局面では、本発明は、エナンチオピュアな乳酸の産生方法であって、炭素含有供給原料がキシロース、グルコースまたはスクロースを含むところの方法を提供する。
培養の温度は好ましくは、50℃〜70℃、より好ましくは55〜65℃の温度で実行される。
本発明の文脈において、遺伝子の不活化または欠損は、上記細胞によって産生され得る所望のポリペプチドをコードする遺伝子、および/または上記細胞による一次代謝物もしくは二次代謝物の産生に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の改変でありうる。原則として、これは、コードされるタンパク質の細胞レベルを引き下げることによってなされることができる。細胞レベルの引下げは、例えば、関心のある酵素をコードする遺伝子の標的不活化によって達成され得る。遺伝子は、その全体が除去されることができる。しかしながら、代替案として、遺伝子の一部の欠損もまた、コードされるタンパク質の活性の低減をもたらしうる。代わりに、または追加的に、遺伝子の調節または発現の原因となるヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサーおよび翻訳開始部位などが改変または除去されることができる。関心のあるタンパク質の活性に影響を与える別の方法が、必要であるならば、輸送シグナルの改変、またはアンチセンスRNAの導入でありうる。
染色体改変は、子孫細胞にわたって遺伝子の機能性の安定した分布を確実にするので、好ましい。染色体における所望の機能性の欠損は、非相同組換えによってならびに相同組換えによってなされることができる。相同組換えは、機能性を導入するための、除去するための、または同時に導入かつ除去するための機会を開いているので、好ましい。
相同組換えが意図される場合には、形質転換DNAはさらに、操作される特定の細胞のゲノム標的配列に相同であるDNA配列を含有する。当業者であれば、相同組換えを得るのに100%の同一性は必要とされないことを理解するであろう。80%、好ましくは90%、95%または98%の同一性も十分であろう。最も好ましいのは99%である。通常、相同組換えによって染色体中に挿入され得る、関心のあるDNA配列は、相同組換えを可能にするのに十分な長さを有する相同配列によって隣接される。そのような長さは、少なくとも約200bp、例えば約200〜約1500bp、好ましくは約200〜約1000bpでありうる。
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の同一性は、上記2つの配列間で同じであるアミノ酸のパーセンテージを指す。同一性は、BLASTアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアが、National Center for Biotechnology Informationを通じて一般に利用可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。Blastpアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Expect thresholdが10、Word sizeが3、Max matches in a query rangeが0であり、MatrixがBLOSUM62であり、Gap Costsが11のExistenceおよび1のExtensionであり、Compositional adjustmentsがConditional compositional score matrix adjustmentである。
本発明の目的のために、2つのヌクレオチド配列間の同一性は、上記2つの配列間で同じであるヌクレオチドのパーセンテージを指す。同一性は、BLASTアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアが、National Center for Biotechnology Informationを通じて一般に利用可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。Blastnアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Expect thresholdが10、Word sizeが28、Max matches in a query rangeが0、Match/Mismatch Scoresが1、−2、Gap CostsがLinearである。
上述したように、Geobacillus thermoglucosidansにおける上記遺伝子を同定する配列はいずれも、関心のある遺伝子を遺伝子工学によって改変するのに100%同じである必要はない。さらに、他の種に由来する関連する好熱細菌細胞において、遺伝子はこれらの配列から逸脱しうる。しかしながら、Geobacillus thermoglucosidans遺伝子を使用することにより、これらの遺伝子と相同でありかつ同じ機能性を有する配列が当業者によって容易に同定されることができ、そして相同組換えをこれらの菌株において実行するための対応するプライマーが作製され得る。したがって、たとえ上記同定された遺伝子の配列からの逸脱が、ある特定の菌株に存在しても、相同遺伝子は容易に同定されることができる。そのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知の技術を用いて決定されることができ、そして必要ならば、隣接する遺伝子配列と同じであるまたは相補的である新しいプライマーセットが定義されることができる。
本発明に従う細胞は、当該技術分野において公知の技術を用いて作製され得る。特に、エレクトロポレーションによる好熱細菌中へのDNA導入方法が、Van Kranenburgら、2007、国際公開第2007/085433号、およびCrippsら、2009、Metab. Eng. 11:398-408に記載されている。
エレクトロポレーションによるこれらBacillus属の種の形質転換は、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のBacillus属の種と、所望の機能性および/または特定のBacilliのゲノム配列に相同であるDNA配列を含む適切な形質転換DNAとを含有する懸濁物を通る高電圧放電によって達成されることができる。
(R)−乳酸は、本明細書に記載された遺伝子操作された好熱細菌細胞を、炭水化物源(例えばグルコースおよび/またはキシロース)の存在下で、当該技術分野において公知の方法によって発酵させることによって得られることができる。発酵の間に、微生物によって分泌された乳酸は通常、塩基、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩基性塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび/またはカルシウムの水酸化物、炭酸塩および/または炭酸水素塩を用いて中和される。マグネシウム塩基、例えば水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび/または炭酸水素マグネシウムが通常好ましい。したがって、いくつかの局面では、本発明は特に、エナンチオピュアな(R)−乳酸の産生方法に関し、上記方法は、本明細書に記載された好熱細菌細胞を、マグネシウム塩基(例えば、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび炭酸水素マグネシウムの少なくとも1つから選択される)の存在下で、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて培養すること、そして(R)−乳酸を単離することを含む。
発酵後、(R)−乳酸(またはその塩)は、乳酸および/またはラクテートを水性溶液から分離するために知られている多くの従来技術のいずれかによって発酵ブロスから分離される。分離効率を高めるために、分離前に、基質または微生物(バイオマス)の粒子が除去され得る。上記分離は、遠心分離、濾過、フロキュレーション(flocculation)、フロテーション(flotation)または膜濾過によって行われうる。これは、例えば、発酵による乳酸の調製のための連続方法が記載されている国際公開第01/38283号から知られている。本明細書における発酵の検討は通常、バッチ法を指すが、方法全体の一部または全てが連続的に実行されうる。
発酵ブロスからの(R)−乳酸(またはその塩)の分離後、上記産物は、1つまたは複数の精製工程、例えば抽出、蒸留、結晶化、電気透析、濾過、活性炭による処理、イオン交換等にかけられうる。種々の残留物流は、任意的に処理された後に、発酵容器へまたは先に実行された任意の精製工程へリサイクルされうる。
材料および方法
菌株およびプラスミド
本研究において用いられた菌株およびプラスミドが、表1に記載される。
Escherichia coliが、好気的条件下で37℃にてLBブロス(Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)中でルーチン的に培養された。適切な場合には、クロラムフェニコールおよび/またはアンピシリンが、それぞれ20mg/Lおよび100mg/Lの濃度で用いられた。
L. lactisが、嫌気的条件下で30℃にて、0.5%グルコースで補充されたM17ブロス(登録商標)(BD Biosciences)中でルーチン的に培養された。適切な場合には、クロラムフェニコールが、5mg/Lの濃度で用いられた。
G. thermoglucosidansが、特に明記されない限り、好気的条件下で52℃、55℃または60℃にて、TGP培地中でルーチン的に増殖された。TGP培地(Taylorら、2008、Plasmid 60:45-52)は、17g/Lのトリプトン、3g/Lのダイズペプトン、5g/LのNaCl、2.5g/LのKHPOをpH7.0にて含有し、そしてオートクレーブ後に4ml/Lのグリセリンおよび4g/Lのピルビン酸Naが添加された。TGPプレートについて、10g/Lのアガーが用いられた。適切な場合には、培地がクロラムフェニコール(8μg/mL)で補充された。
Figure 2017523778
Figure 2017523778
DNA操作技術
標準的なDNA操作技術が、SambrookおよびRussell(Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)によって記載されているように実行された。
pNW33N誘導体の構築が、E. coliにおいて実行された。
100mL培養物からの大規模E. coliプラスミドDNA単離が、Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit(登録商標)(Genomed)を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。1mL培養物からの小規模E. coliプラスミドDNA単離が、Nucleospin Plasmid Quick Pure(登録商標)(Macherey−Nagel)キットを用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
E. coliコンピテント細胞が、SambrookおよびRussell(Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)によって記載されているように、塩化カルシウムを用いて作製され、そしてヒートショックによって形質転換された。
pNZ124誘導体の構築が、L. lactisにおいて実行された。
100mL培養物からのL. lactisプラスミドDNA単離が、Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit(登録商標)(Genomed)を用いて実行された。細胞ペレットが、10mlの改質されたE1バッファー(10mMのトリス/HCL pH8;50mMのNaCl;10mMのEDTA;20%スクロース;4g/Lのリゾチーム(Sigma Aldrich))中に再懸濁され、そして50℃にて1時間インキュベートされた。続いて、メーカーの説明書にしたがって、細胞溶解から先が行われた。
L. lactisが、HoloおよびNes(Holo, H., and I. F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123)によって記載されたエレクトロポレーションによって形質転換された。
クローニング目的のPCR反応が、ハイフィデリティPwoポリメラーゼ(Roche)を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
コロニー−PCR分析のために、コロニーが爪楊枝で採集され、そして少量の細胞物質がPCR反応チューブに移された。細胞が、電子レンジにおける1000Wでの1分間のインキュベーションによって破壊された。DreamTaq(商標)DNA Polymerase(Thermo Scientific(商標))を有する25μLのPCR反応混合物が、メーカーによって推奨されるように調製され、そして破壊された細胞を有する上記反応チューブに加えられた。
G. thermoglucosidansのエレクトロポレーション
G. thermoglucosidansが、Crippsら(Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408)によって記載されたプロトコルに基づいて、エレクトロポレーションによって形質転換された。G. thermoglucosidansは、55℃で一晩増殖され、そして1mLが、バッフルを備えた250ml三角フラスコ中の予め温められた50mlのTGP培地に接種するために用いられた。OD600が約1.0となるまで、細胞が60℃(180rpm)にてインキュベートされた。フラスコは10分間氷上で冷却され、そして細胞が遠心分離(4℃)によってペレット化された。次に、細胞が、氷冷されたエレクトロポレーションバッファー(0.5Mソルビトール、0.5Mマンニトール、10%(v/v)グリセリン)で4回洗浄された。洗浄工程の容量は、50ml、25ml、10mlおよび10mlであった。最終ペレットは、1.3mlの氷冷されたエレクトロポレーションバッファー中に再懸濁され、そしてエレクトロコンピテントセルの60μlのアリコートが−80℃にて貯蔵され、またはエレクトロポレーションに直接用いられた。
エレクトロコンピテントセルの60μlのアリコート(解凍済み)が、1〜2μgのプラスミドDNAと混合され、次いで、冷却されたエレクトロポレーションキュベット(ギャップ幅0.1cm)に移された。Bio−Rad遺伝子パルサーエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーション条件は、2.5kV、10μFおよび600Ωであった。エレクトロポレーション後に、細胞は、50mlプラスチックチューブ中の1mlの予め温められた(52℃)TGPに移され、そして52℃で180rpmにて2時間、回収された。回収された細胞懸濁物はペレット化され、そして150μlを除く全ての上清が破棄された。ペレットは、残りの上清中に再懸濁された。1/10および9/10の容量が、8μg/Lのクロラムフェニコールを含有するTGPプレート上にプレーティングされた。プレートは、52℃で24〜48時間インキュベートされた。プレート上に現れたコロニーは、8μg/Lのクロラムフェニコールを含有する新鮮なTGPプレートに移され、そして55℃にて一晩インキュベートされた。増殖したものが、プライマー1およびプライマー2(表2)を用いたコロニーPCRによって、プラスミドの存在について試験された。
組込み
Geobacillus-E.coliシャトルベクターpNW33nが、先に記載されたように(Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408)、G. thermoglucosidansにおける組込み型ベクターとして用いられた。8μg/mLのクロラムフェニコールを含有する20mLのTGPに、グリセリンストックからの形質転換された菌株が接種された。55℃、180rpmにて一晩の増殖後、適切な希釈物が、8μg/mLのクロラムフェニコールを含有するTGPプレート上にプレーティングされた。その後、これらのプレートは、68℃にて24時間インキュベートされた。シングルコロニーが、新鮮なプレート(52℃でインキュベートされた)に画線され、これらのコロニーにおいてコロニーPCRが行われて、シングルクロスオーバーを有するコロニーを同定した。適切なプライマー組合せが、上流断片または下流断片を介したシングルクロスオーバーを同定するのに用いられた(表2;それぞれ、pRM3の組込みのための655−170および656−571のプライマー組合せ、pRM12の組込みのための744−170および808−571のプライマー組合せ、pFS3の組込みのための629−170および630−571のプライマー組合せ、pJS43の組込みのための754−170および991−571のプライマー組合せ)。次に、陽性コロニーの染色体DNAが、Masterpure Gram Positive DNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies)を用いて単離され、そして、コロニーPCRの結果を確かめるために、上記PCRが、単離された染色体DNAに関して繰り返された。上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーおよび下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーが、第2の組換え工程のために選択された。
ダブルクロスオーバーを得るために、一次組込み体が、クロラムフェニコールを有しないTGP中で複数回継代培養された。適切な希釈物(10−4、10−5、10−6)がTGPプレート上にプレーティングされた。単離されたコロニーが、8μg/mLのクロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。ダブルクロスオーバー突然変異体は、クロラムフェニコール感受性である。適切なプライマー組合せ(表2;ΔsigFのための655−656、ΔpflBA−adhEのための744−808およびΔmgsAのための754−991のプライマー組合せ)を用いたPCR分析を使用して、野生型を欠損突然変異体から識別し、そしてプラスミドの不在を確認した。全ての改変が、PCR産物の配列決定によって確かめられた。
LactococcusクローニングベクターpNZ124が、ldhAのためのG. thermoglucosidansにおける組込み型ベクターとして用いられた。形質転換効率が比較的高い(pNW33n1μgにつき少なくとも10CFU)、新しく作製されたG. thermoglucosidansコンピテント細胞が、2μgのpJS65プラスミドDNAで形質転換された。形質転換プレートは、60℃にて16時間、68℃にて8時間、および55℃にて20時間インキュベートされた。シングルコロニーが、新鮮なプレート(52℃でインキュベートされた)に画線され、これらのコロニーについてコロニーPCRが行われて、シングルクロスオーバーを有するコロニーを同定した。適切なプライマー組合せが、上流断片または下流断片を介したシングルクロスオーバーを同定するのに用いられた(表2;1539−205および204−630のプライマー組合せ)。
Figure 2017523778
発酵
TMM培地は、Fongら(Fongら、2006)から改変され、そして1Lにつき、60g/Lのグルコース;30g/Lのキシロース;8.37gのMOPS、0.23gのKHPO;0.51gのNHCl;0.50gのNaCl;1.47gのNaSO;0.08gのNaHCO;0.25gのKCl;1.87gのMgCl・6HO;0.41gのCaCl・2HO;16.0mgのMnCl・4HO;1.0mgのZnSO・7HO;2.0mgのHBO;0.1mgのCuSO・5HO;0.1mgのNaMoO・2HO;1.0mgのCoCl・6HO;7.0mgのFeSO・7HO;0.1mgのチアミン;0.1mgのリボフラビン;0.5mgのニコチン酸;0.1mgのパントテン酸;0.5mgのピリドキサミンHCl;0.5mgのピリドキサールHCl;0.1mgのD−ビオチン;0.1mgの葉酸;0.1mgのp−アミノ安息香酸;0.1mgのコバラミンを含んでいた。pHはpH7.2に調整された。グルコース、キシロース、金属およびビタミンは、フィルター滅菌された。培地はオートクレーブ処理された。TMM1、TMM2.5およびTMM5はそれぞれ、1g/L、2.5g/Lおよび5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)で補充されていた。
STMMは、KHPO(1.00g/L)、NHCl(2.50g/L)、NaCl(5.00g/L)およびCaCl・2HO(50mg/L)の濃度がTMMと異なり、そしてD,L−メチオニン(68.5mg/L)およびベタイン(0.14g/L)で補充された。スクロース(90g/L)が、グルコースおよびキシロースの代わりに用いられた。STMM5は、5g/Lの酵母抽出物(Biospringer)で補充されていた。
TMM5またはSTMM5中の100mLの前培養物が、コンデンサー(おおよそ15℃の水道水を流すことにより冷却される)を装備した0.75LのMultifors発酵装置(Infors)において、(10v/v%)400mLのTMM1、TMM2.5またはSTMM5に接種するために用いられた。pHは、滅菌した2.5MのKOHまたは滅菌した75g/LのCa(OH)の添加によって、pH7.2に調整された。温度は60℃であった。撹拌速度は300rpmであった。
サンプルが、(R)−乳酸および(S)−乳酸ならびに生じうる副産物の測定のために、上記発酵物から抜き出された。サンプルは遠心分離され、そして残渣が、Millex GP 0.22μmフィルター(登録商標)(Millipore)を用いた濾過によって除去された。濾液が、さらなる分析まで−21℃にて貯蔵された。
糖が、Thermo CarboPac SA−10カラム(Dionex)を用いたHPLCによって測定された。ギ酸が、Bio−Rad Aminex HPX−87Cカラム(Bio−Rad)を用いたHPLCによって測定された。他の有機酸(乳酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、ピルビン酸)およびエタノールが、誘導体化および気液クロマトグラフィー(GLC)を用いて測定された。(R)−ラクテートおよび(S)−ラクテートが乳酸メチルにメチル化され、そしてキラルカラム上でのヘッドスペース分析によって測定された。
実施例1
G. thermoglucosidansによるホモ乳酸型の乳酸産生
G. thermoglucosidans中のsigF遺伝子を欠損させるために、組込み型プラスミドpRM3が構築された。sigF遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、ならびに上流断片を得るための653と654のプライマー組合せ(表2)および下流断片を得るための651と652のプライマー組合せ(表2)を用いたPCRによって生成された。最初に、下流断片が、KpnI−SalI断片として、同じ酵素で切断されたpNW33n中にクローニングされた。次に、上流断片が、SalI−HindIII断片として、同じ酵素で切断されたこの構築物中にクローニングされて、プラスミドpRM3を結果した。pRM3の構築は、E. coli TG90においてなされた。pRM3配列の完全性(integrity)は、DNA配列決定によって確かめられた。
プラスミドpRM3が、G. thermoglucosidans DSM 2542にエレクトロポレーションされた。シングルクロスオーバー突然変異体を得るために、材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられた。2つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた60のコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。15のコロニーが、クロラムフェニコールに感受性であった。12のコロニーが所望の改変を有し、3のコロニーが野生型に戻っていた。1のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigFと命名された。欠損が、配列決定によって確かめられた。
Figure 2017523778
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigFが、TMM2.5を用いたpH制御された(KOH)発酵において評価された。発酵物が4回移され、そして最終発酵物が分析された。結果が表3に要約されている。G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigFは、キシロースおよびグルコースを同時に消費した。
実施例2
hdhDを用いた(R)−乳酸産生G. thermoglucosidans誘導体の構築
L. delbrueckiiに由来し、かつD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードするhdhD遺伝子による、天然のldhL遺伝子の遺伝子置き換えを促進するためのプラスミドpFS3が構築された。構築物は、hdhD開始コドンおよび終止コドンが、元のldhL開始コドンおよび終止コドンの位置に取って代わり、そしてldhLプロモーターへのhdhDの翻訳融合を結果するものであった。ldhL遺伝子の下流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、および624と631のプライマー組合せを用いたPCRによって生成された。産物は、SalIおよびSphIで切断され、そしてSalIおよびSphIで切断されたpNW33n中に連結された。得られたプラスミドは、pFS2と命名された。pFS2の構築は、E. coli DH5αにおいてなされた。
ldhL遺伝子の上流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、および1057と1203のプライマー組合せを用いたPCRによって生成された。hdhD遺伝子(配列番号37)は、鋳型としてのL. delbrueckiiゲノムDNA、および1202と1189のプライマー組合せを用いたPCRによって生成された。上記遺伝子はまた、配列番号37に基づいて合成され得る。得られた2つのPCR産物は、続いて、これらを一緒に融合するために、1057と1189のプライマー組合せを用いたオーバーラップPCRにおいて鋳型として用いられる。産物は、BamHIおよびXhoIで切断され、そしてBamHIおよびSalIで切断されたpFS2中に連結された。得られたプラスミドは、pFS3と命名された。pFS3の構築は、E. coli TG90においてなされた。pFS3ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
プラスミドpFS3が、G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigFにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたシングルクロスオーバー突然変異体を得るために、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられた。試験された多数のコロニーにおいて、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバー突然変異体のみが得られた。これらの1つが、さらなる研究のために選択された。
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られたコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の17のコロニーが、PCRによってチェックされた。1のコロニーが所望の改変を有し、16のコロニーが野生型に戻っていた。ldhLがhdhDによって交換されたコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhDと命名された。
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhDをさらに最適化するために、ギ酸、酢酸およびエタノール副産物の形成を排除したいという願望があった。pflAおよび/またはpflBならびにadhEの突然変異が、多くの細菌においてギ酸およびエタノールの産生に影響を与えることが知られているが、これらの遺伝子を破壊することの副作用は予測できない。
これらの遺伝子の破壊の影響を評価するために、G. thermoglucosidansにおける遺伝子pflB、pflAおよびadhEを(部分的に)欠損させるためのプラスミド(pRM12)が構築された。pflBAの上流隣接領域、および収束的に向きを定められるadhEの上流隣接領域が、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、ならびに上流pflBA断片を得るための739と805のプライマー組合せおよび上流adhE断片を獲得するための806と807のプライマー組合せを用いたPCRによって生成された。続いて、得られた2つのPCR産物は、これらを一緒に融合するために、739と807のプライマー組合せを用いたオーバーラップPCRにおいて、鋳型として用いられた。産物は、BamHI−PstI断片として、BamHIおよびPstIで切断されたプラスミドpNW33n中にクローニングされて、プラスミドpRM12を結果した。pRM12の構築は、E. coli TG90においてなされた。pRM12ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
プラスミドpRM12が、G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhDにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。2つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流pflBA隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、上流adhE隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた120のコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の5のコロニーが、PCRによってチェックされた。2のコロニーが所望の改変を有し、3のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有する1のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhEと命名された。
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhEが、5g/Lの酵母抽出物および90g/Lのスクロースを含有するSTMM5培地を用いた、pH制御された(Ca(OH))発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が、ホモ乳酸型の(R)−乳酸の産生について分析された。G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhEは、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、ホモ乳酸型の(R)−乳酸を産生することができた。すなわち、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ複合遺伝子の破壊と組み合わせた、HdhD D−乳酸デヒドロゲナーゼの導入が、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、60℃でのホモ乳酸型(R)−乳酸発酵を結果する。
実施例3
ldhAを用いた(R)−乳酸産生G. thermoglucosidans誘導体の構築
E. coliにおけるLactobacillus属の種に由来するldhA遺伝子のクローニングは、問題があることが知られている(Bernardら、1991、FEBS Lett.290:61-64)。起こりうるクローニング問題を回避するために、本発明者らは、中間宿主としてL. lactisを使用し、クローニングベクターとしてpNZ124を使用することに決めた。L. delbrueckiiに由来し、かつD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードするldhAによる、天然のldhL遺伝子の遺伝子置き換えを促進するために、プラスミドpJS65が構築された。構築は、ldhA開始コドンおよび終止コドンが、元のldhL開始コドンおよび終止コドンの位置に取って代わり、そしてldhAのldhLプロモーターへの翻訳融合をもたらすものであった。
ldhL遺伝子の下流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、および1589と957のプライマー組合せを用いたPCRによって生成される。産物は、SacIおよびXhoIで切断され、そしてSacIおよびXhoIで切断されたpNZ124中に連結される。得られたプラスミドは、pJS64と命名される。pJS64の構築は、L. lactis MG1363においてなされる。
ldhL遺伝子の上流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、および1537と676のプライマー組合せを用いたPCRによって生成される。ldhA遺伝子(配列番号35)は、鋳型としてのL. delbrueckiiゲノムDNA、および675と564のプライマー組合せを用いたPCRによって生成される。上記遺伝子はまた、合成遺伝子が好ましくは、pNZ124において、およびL. lactisにおいてクローニングされるべきであることを考慮して、配列番号35に基づいて合成され得る。得られた2つのPCR産物は次いで、これらを一緒に融合するために、1537と564のプライマー組合せを用いたオーバーラップPCRにおいて鋳型として用いられる。産物は、XbaIおよびSalIで切断され、そしてXbaIで切断されかつSalIで部分的に切断されたpJS64に連結される。得られたプラスミドは、pJS65と命名される。pJS65の構築は、L. lactis MG1363においてなされる。
プラスミドpJS65は、直接的組込みのために、G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhEにエレクトロポレーションされた。シングル形質転換体コロニーが、上流ldhL隣接領域を介したシングルクロスオーバーを伴って得られた。G. thermoglucosidansゲノムにおける直接的組込みの達成は、pNW33n1μgにつき少なくとも10CFUの比較的高い形質転換効率を有する、新しく作製されたコンピテント細胞を用いることを必要とした。
ダブルクロスオーバー突然変異体は、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた240のコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の13のコロニーが、PCRによってチェックされた。10のコロニーが所望の改変を有し、3のコロニーが野生型に戻っていた。ldhLがldhAによって交換された1のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::ldhA,ΔpflBA−ΔadhEと命名された。
Figure 2017523778
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::ldhA,ΔpflBA−ΔadhEが、5g/Lの酵母抽出物および90g/Lのスクロースを含有するSTMM5培地を用いた、pH制御された(Ca(OH))発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が分析された。結果が表4に要約されている。これらのデータは明らかに、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ複合遺伝子の破壊と組み合わせた、LdhA D−乳酸デヒドロゲナーゼの導入が、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、ホモ乳酸型(R)乳酸発酵を結果することを実証している。
実施例4
G. thermoglucosidansによるエナンチオピュアのホモ型乳酸産生
G. thermoglucosidans中のmgsA遺伝子(423bp)の267bpを欠損させるためにプラスミドpJS43が構築された。mgsA遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのDSM 2542のゲノムDNA、ならびに、mgsA下流断片を得るための750と999のプライマー組合せおよび上流mgsA断片を獲得するための1000と753のプライマー組合せを用いたPCRによって生成された。得られた2つのPCR産物は次いで、これらを一緒に融合するために、750と753のプライマー組合せを用いたオーバーラップPCRにおいて鋳型として用いられた。産物は、BamHI−PstI断片として、BamHIおよびPstIで切断されたプラスミドpNW33n中にクローニングされて、プラスミドpJS43を結果した。pJS43の構築は、E. coli TG90においてなされた。pJS43ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
プラスミドpJS43が、G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhEにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。2つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた400のコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。これらのうち、213のコロニーがクロラムフェニコールに感受性であり、39のクロラムフェニコール感受性コロニーが、ダブルクロスオーバーについてPCRによってチェックされた。8のコロニーが所望の改変を有し、31のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有するシングルコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::hdhD,ΔpflBA−ΔadhE,ΔmgsAと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
プラスミドpJS43が、G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::ldhA,ΔpflBA−ΔadhEにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。2つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。双方とも、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーは得られなかった。
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないTGP中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた240のコロニーが、クロラムフェニコールを有するTGPプレートおよび有しないTGPプレートに移された。239のコロニーが、クロラムフェニコールに感受性であり、これらのうちの134のコロニーが、ダブルクロスオーバーについてPCRによってチェックされた。1のコロニーが所望の改変を有し、133のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有するシングルコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::ldhA,ΔpflBA−ΔadhE,ΔmgsAと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
Figure 2017523778
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF,ΔldhL::ldhA,ΔpflBA−ΔadhE,ΔmgsAが、5g/Lの酵母抽出物および90g/Lのスクロースを含有するSTMM5培地を用いた、pH制御された(Ca(OH))発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が分析された。結果が表5に要約されている。産生された(R)−乳酸のキラル純度は、低濃度の乳酸(<5g/kg)については>99.0%、より高い濃度の乳酸(>20g/kg)については>99.7%であった。これは、mgsAの破壊のない菌株由来の乳酸よりも純粋である(表5)。これらのデータは明らかに、G. thermoglucosidansにおけるメチルグリオキサール経路の明らかな不完全性にも拘らず、mgsAの破壊が、ホモ乳酸型のキラル的に純粋な(R)−乳酸発酵をもたらすキラル的に純粋な(R)−乳酸を産生する能力をもたらすことを示す。

Claims (20)

  1. 通性嫌気性である、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、下記:
    a)内在性の(S)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損;
    b)(R)−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入;
    c)内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子の不活化または欠損
    を含む細胞。
  2. さらに、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子mgsAが不活化されまたは欠損している、請求項1に記載の細胞。
  3. 前記(R)−乳酸デヒドロゲナーゼが、配列番号38のアミノ酸配列または少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のhdhD遺伝子である、請求項1または2に記載の細胞。
  4. 前記(R)−乳酸デヒドロゲナーゼが、配列番号36のアミノ酸配列または少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のldhA遺伝子である、請求項1または2に記載の細胞。
  5. 前記hdhD遺伝子が、配列番号38のアミノ酸配列をコードする、請求項3に記載の細胞。
  6. 前記ldhA遺伝子が、配列番号36のアミノ酸配列をコードする、請求項4に記載の細胞。
  7. さらに、内在性のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子(pta)が不活化されまたは欠損している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞。
  8. 内在性の胞子形成遺伝子の不活化または欠損故の胞子形成欠損誘導体である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞。
  9. 前記胞子形成遺伝子がsigFである、請求項8に記載の細胞。
  10. 前記ピルビン酸ギ酸リアーゼAおよび/またはB遺伝子が、内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼ/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座pflBA−adhEの不活化または欠損によって不活化されている、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞。
  11. 少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、99.5%、99.8%または99.9%のエナンチオマー純度を有する(R)−乳酸を産生する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞。
  12. 前記遺伝子が、相同組換えによって改変されている、請求項1〜11のいずれか1項に記載の細菌細胞。
  13. グラム陽性細菌細胞である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の細胞。
  14. Geobacillus属に属する、請求項13に記載の細胞。
  15. 前記Geobacillus属の種がGeobacillus thermoglucosidansである、請求項14に記載の細胞。
  16. エナンチオマー的に純粋な(R)−乳酸の産生方法であって、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて、請求項1〜15のいずれか1項に記載の好熱細菌細胞を培養すること、そして(R)−乳酸を単離することを含む方法。
  17. 前記炭素含有供給原料が、キシロース、グルコースまたはスクロースを含む、請求項16に記載の方法。
  18. 前記培養が、50℃〜70℃の温度で行われる、請求項16または17に記載の方法。
  19. 産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、15重量%以下、特に10重量%以下、または5重量%、4重量%、3重量%もしくは2重量%以下の副産物が形成される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
  20. ギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも1つの形成量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、5重量%以下、特に2重量%、1重量%、0.25重量%または0.1重量%以下である、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。
JP2017502827A 2014-07-23 2015-07-13 遺伝子改変された(r)−乳酸産生好熱性細菌 Active JP6637026B2 (ja)

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