BR112017000846B1 - Bactérias termofílicas do gênero geobacillus geneticamente modificadas que produzem ácido (r)-láctico e método para produzir ácido (r)- láctico enantiomérico puro - Google Patents

Abstract

bactérias termofílicas geneticamente modificadas que produzem ácido (r)-láctico e método de produção do mesmo. a presente invenção refere-se a uma célula bacteriana termofílica modificada por engenharia genética que é anaeróbica facultativa compreendendo a) inativação ou deleção do gene endógeno de (s)-lactato desidrogenase; b) introdução de um gene de (r)-lactato desidrogenase; c) inativação ou deleção do gene endógeno de piruvato formiato liase a e / ou b.

Description

[001] A presente invenção refere-se à modificação de uma célula bacteriana termofílica para produção de ácido (R)-láctico homoláctico e enantiopuro, uma célula geneticamente modificada, e um método para produzir ácido (R)-láctico enantiomérico puro.

[002] Ácido láctico e seus sais, conhecidos como lactatos, são produtos comercialmente viáveis úteis em vários campos incluindo medicina, polímeros biodegradáveis e processamento de alimentos. Bactérias termofílicas, como espécie Geobacillus, que são anaeróbias facultativas, parecem ser organismos ideais para a fabricação industrial de ácido láctico. São capazes de se desenvolver em temperaturas entre 37-75°C, com um ponto ótimo a 55-65°C (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446) e permitem fermentação industrial anaeróbica a temperaturas acima de 50°C. Esta alta temperatura tem várias vantagens quando da fermentação em escala industrial: menos risco de infecções e portanto, maior pureza enantiomérica, reações mais rápidas, menores custos de resfriamento, etcetera. A natureza anaeróbica facultativa das Geobacilli permite fermentação em condições anaeróbicas, ou pelo menos em uma pressão parcial baixa de oxigênio, que para escala industrial é desejável porque permite equipamento e processamento relativamente baratos. Além disso, as necessidades de nutrientes destas bactérias são menos exigentes do que as de bactérias de ácido láctico como espécies de Lactobacillus, o que também permite processos industriais relativamente baratos.

[003] Espécies Geobacillus que são anaeróbicas facultativas são conhecidas por produzir ácido láctico quando desenvolvidas em condições anaeróbicas, ou pelo menos em uma baixa pressão parcial de oxigênio. Exemplos são G. caldotenax, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. kaustophilus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. tepidimans, G. thermodenitrificans, G. thermoglucosidans, G. thermoleovorans, G. toebii, G. tropicalis.

[004] G. thermoglucosidans é conhecida por produzir ácido láctico a partir de xilose, arabinose, glicose, frutose, sacarose e celobiose (Green et al., 2003, WO03/008601). Para aplicações industriais matérias-primas que contêm sacarose, glicose, xilose ou arabinose, ou suas misturas, são as mais relevantes. A capacidade de utilizar simultaneamente glicose e xilose (Green et al., 2003, WO03/008601) é uma vantagem importante de G. thermoglucosidans quando se utilizam açúcares fermentáveis derivados de matérias-primas lignocelulósicas.

[005] Uma desvantagem das espécies Geobacillus conhecidas que são anaeróbicas facultativas é o fato de que elas produzem principalmente ácido (S)- láctico e muito pouco ácido (R)- láctico. Uma vez que a aplicação bem sucedida de polímeros lácticos biodegradáveis dependerá da disponibilidade de ácido (S)-láctico barato e ácido (R)- láctico barato, é necessária uma produção rentável de ambos os enantiômeros. Atualmente bactérias de produção de ácido (R)-láctico conhecidas são mesofílicas (e.g. Bacillus laevolacticus) ou têm exigências de nutrientes exigentes (por exemplo, Lactobacillus delbrueckii), o que torna o fabrico de ácido (R)-láctico muito mais caro do que o de ácido (S)-láctico.

[006] Outra desvantagem das espécies Geobacillus conhecidas que são anaeróbicas facultativas é o fato de que elas geralmente têm uma fermentação ácida mista, produzindo ácido láctico, etanol, ácido acético, e ácido fórmico como produtos principais de fermentação. Neste pedido o termo "ácidos orgânicos" inclui também seus sais correspondentes.

[007] Existe uma clara necessidade de se poderem utilizar cepas bacterianas (por exemplo, cepas de Geobacillus) para produção de ácido láctico homoláctico e enantiopuro que tenham características atraentes para aplicação industrial, tais como baixas necessidades de nutrientes, capacidades amplas de consumo de açúcar, capacidade de produzir enzimas carbo-hidrolíticas, alta taxa de crescimento, alta produtividade, resistência ao estresse osmótico e acessibilidade genética.

[008] Um dos objetivos da presente invenção é produzir uma cepa de bactérias termofílicas que são anaeróbicas facultativas e produzem ácido (R)-láctico por fermentação homoláctica. Deve ser entendido que outros termos para ácido (R)-láctico são ácido D-láctico ou ácido D(-)- láctico. Neste pedido estes termos são usados intercambiavelmente. Similarmente, os termos ácido (S)-láctico, ácido L-láctico e ácido L(+)- láctico são usados intercambiavelmente.

[009] Outro objetivo da presente invenção é produzir uma cepa de bactérias termofílicas que são anaeróbicas facultativas e que produzem ácido (R)- láctico enantiopuro.

[0010] G. thermoglucosidans é descrita como uma espécie Bacillus termofílica (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495; Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446; Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485). G. thermoglucosidans foi previamente conhecida como Bacillus thermoglucosidasius (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495), que foi renomeada como G. thermoglucosidasius por Nazina et al. em 2001 (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446), e mais tarde renomeada G. thermoglucosidans por Coorevits et al. (Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485). A cepa tipo foi isolada do solo (Suzuki et al., 1976, Appl. Environ. Microbiol. 31:807-812). Embora originalmente reportada como estritamente aeróbica, estudos posteriores reportam crescimento anaeróbico facultativo e produção de ácido (S)-láctico (Green et al., 2003, WO 03/008601; Fong et al., 2006, Extremophiles 10:363-372). A faixa de temperatura é de 42 a 69°C, com um ponto ótimo de 62°C (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495). Modificação genética de cepas de G. thermoglucosidans para produção de etanol foi reportada (Green et al., 2001, WO 01/49865; Atkinson et al., 2008, WO08/038019). Isto inclui descrição das ferramentas genéticas para G. thermoglucosidans DSM 2542T e um método para romper o gene de L-lactato desidrogenase (ldh) (Atkinson et al., 2006, WO2006/117536 e 2008, WO2008/038019). Rotas e fluxos metabólicos para células cultivadas em xilose e glicose foram reportados para G. thermoglucosidans M10EXG (Tang et al. 2009, Biotechnol. Lett. 102: 1377-1386).

[0011] Inativação de lactato desidrogenase (ldhL) em espécies Geobacillus mostrou otimizar a produção de etanol (Payton et al., 1985, FEMS Microbiol. Lett. 26:333-336; Green et al., 2001; Atkinson et al., 2006, WO 2006/117536; Cripps et al., 2009, Metab. Eng. 11:398-408). Cripps et al. mostram que derivados ldhL- de G. thermoglucosidans NCIMB 11955 mostram forte redução, mas não eliminação complete da produção de ácido láctico em fermentações em batelada, enquanto a produção de etanol, formiato e piruvato é aumentada. Uma mutação combinada de ldhL e pflB, codificando piruvato formiato liase, elimina a formação de formiato (Cripps et al., 2009, Metab. Eng. 11:398-408).

[0012] A expressão gênica heteróloga parece ser problemática em G. thermoglucosidans. Uma enzima funcional de piruvato descarboxilase de Zymomonas mobilis foi produzida apenas quando cultivada a 52 ° C, uma temperatura subótima para G. thermoglucosidans, mas não a 54 ° C, 56 ° C ou 58 ° C (Thompson et al., 2008, Biotechnol, Lett 30: 1359-1365). Expressão heteróloga do gene de piruvato descarboxilase de Gluconobacter oxydans requer harmonização do códon para obter atividade em G. thermoglucosidans a 45 ° C, mas não proporciona atividade a 52° C (van Zyl et al., 2014, Appl. Microbiol, Biotechnol, 98: 1247-1259).

[0013] Van Kranenburg et al. mostram que o Bacillus coagulans moderadamente termofílico pode ser utilizado para a produção de ácido (R)-láctico em temperaturas entre 45° C e 54° C através da eliminação do gene de L-lactato desidrogenase nativo e sua substituição por um gene de D-lactato desidrogenase heterólogo obtido a partir de Lactobacillus delbrueckii (van Kranenburg et al., 2007, WO2007 /085443). No entanto, não se podem encontrar exemplos de proteínas heterólogas ativas em temperaturas superiores a 52° C em experimentos de expressão heteróloga de genes de piruvato descarboxilase em G. thermoglucosidans, enquanto que a temperatura ótima para esta espécie é geralmente de cerca de 60°C. Além disso, não se sabe se a D-lactato desidrogenase de L. delbrueckii é ativa em 60 ° C.

[0014] Verificou-se agora que pode ser utilizada uma célula bacteriana termofílica para a produção de ácido (R)-láctico através do rompimento do gene endógeno da L-lactato desidrogenase LdhL e da introdução de um gene que codifica a atividade da D-lactato desidrogenase. Introduzimos independentemente o gene ldhA (SEQ ID NO: 35) e o gene hdhD (SEQ ID NO: 37) de um isolado de L. delbrueckii, ambos codificando a atividade da D-lactato desidrogenase. Os especialistas na arte sabem que podem ser utilizados outros genes, que codificam a atividade de D-lactato desidrogenase que são funcionalmente expressos em G. thermoglucosidans ao invés destes.

[0015] Espécies Geobacillus que são anaeróbicas facultativas apresentam fermentações ácidas mistas com ácido láctico, etanol, ácido acético, e ácido fórmico como produtos principais. O rompimento de genes que codificam enzimas essenciais na produção de subprodutos é uma abordagem comum para melhorar a produção de um produto desejado. No entanto, os efeitos do rompimento de um gene específico podem ter efeitos secundários diferentes dependendo do metabolismo geral do hospedeiro. Mutações únicas em Escherichia coli pflA, que codificam a enzima ativadora de piruvato-formiato liase, e adhE, codificando complexo bifuncional de acetaldeído-CoA / álcool desidrogenase, resultam numa melhor produção de ácido láctico com concomitante aumento da formação de subprodutos de piruvato, produção residual de ácido acético e etanol e rendimento de biomassa fortemente reduzido (pflA-) ou melhora da produção de ácido láctico com ácido acético como principal produto de fermentação (adhE-) (Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7: 104-115). Em várias cepas de E. coli o locus focA-pflAB foi rompido para eliminar a produção de ácido fórmico (Zhou et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol 69: 2237-2244, Liu et al., 2011, Appl. Biochem. Biotechnol, 164: 162-169). A importância de focA, que codifica uma proteína de canal de formiato, na acumulação de ácido láctico no meio, foi recentemente demonstrada (Beyer et al., 2013, J. Bacteriol 195: 1428-1435), pelo que contribuirá para os fenótipos de E. Coli com deleções focA-pflAB. Na alga verde Chlamydomonas reinhardtii knockouts de genes que codificam piruvato formiato liase e álcool desidrogenase melhoraram a fermentação de ácido láctico, mas também aumentaram as concentrações de glicerol e acetato extracelular (Catalanotti et al., 2012, Plant Célula 24: 692-707).

[0016] Em G. thermoglucosidans os genes pflBA são convergentemente orientados para o gene adhE. Por razões práticas, decidimos romper pflA, pflB e adhE, excluindo pflBA e parte de adhE em uma modificação. Surpreendentemente, conseguimos quase abolir a formação dos subprodutos etanol, ácido acético e ácido fórmico sem impactar outros subprodutos e sem impactar o desempenho da fermentação de ácido láctico. Por exemplo, no presente pedido de patente a afirmação de que a formação de subproduto está praticamente abolida significa que fermentando uma célula geneticamente modificada tal como aqui descrita a quantidade em peso de subprodutos (como etanol, ácido acético e ácido fórmico) em relação à quantidade total de ácido láctico produzido não é superior a 10% (p/p) e, em particular, não superior a 5%, 4%, 3% ou 2% (p/p). A quantidade de ácido láctico e de subprodutos pode ser determinada por métodos conhecidos na arte, por exemplo por derivatização e análise por cromatografia gás-líquido (GLC) ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[0017] Existem várias opções que podem resultar em impureza quiral na produção de ácido láctico descrita na literatura. Ácido R-láctico pode ser formado a partir de piruvato pela atividade de uma D-lactato desidrogenase, pode ser formado a partir de ácido (S) -láctico pela atividade de uma lactato racemase, ou pode ser formado através da via metilglioxal. Ácido (S)-láctico pode ser formado a partir de piruvato pela atividade de uma L-lactato desidrogenase, pode ser formado a partir de ácido (R)-láctico pela atividade de uma lactato racemase, ou pode ser formado através da via metilglioxal.

[0018] Metilglioxal sintase (E.C. 4.2.99.11) catalisa a conversão do fosfato de di-hidroxiacetona em metilglioxal e ortofosfato na primeira etapa do bypass metilglioxal. Em seguida, o metilglioxal pode ser convertido através de duas vias diferentes em ácido (S)- ou (R)- láctico. Portanto, o bypass metilglioxal poderia ser uma fonte de contaminação quiral para a produção de ambos ácidos (S)- e (R)-láctico. Na bactéria mesofílica Gram-negativa Escherichia coli, o rompimento do gene mgsA que codifica a metilglioxal sintase melhorou a pureza quiral para a produção tanto de ácido (S)-láctico como do ácido (R)- láctico (Grabar et al., 2006, Biotechnol. 1527-1535). Nas Gram-positivas pouco se sabe sobre a atividade da via metilglioxal. No Bacillus subtilis mesófilo, o gene mgsA é codificado em um operon juntamente com genes que codificam as duas primeiras enzimas na biossíntese de bacillitiol (Gaballa et al., 2010, Proc.Natl Acad. Sci. USA 107: 6482-6486; Helmann, 2011,Antioxidants & Redox signaling (Antioxidantes & sinalização redox) 15: 123-133). Recentemente, Chandrangsu et al. demonstraram que o bacillitiol está envolvido na destoxificação do metilglioxal (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715). A via metilglioxal dependente de bacillitiol utiliza glioxalase I (GlxA) e glioxalase II (FlxB) para converter metilglioxal em ácido (R)-láctico (Chandrangsu et al., 2014). Além disso, o metilglioxal pode ser convertido em ácido (R)-láctico pela atividade de YdeA, YraA e YfkM, os homólogos previstos de glioxalase III (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol 91: 706-715). Não há relatos de produção de ácido (S)-láctico pela via metilglioxal em bactérias Gram-positivas.

[0019] Com base na informação do genoma seria de se esperar que a produção de ácido (S)-láctico não fosse causada por uma lactato racemase, para a qual não se encontra nenhum homólogo, nem pela via metilglioxal, que parece incompleta e pela qual não se conhece a produção de ácido (S)-láctico em organismos Gram-positivos. Surpreendentemente, a quantidade mínima de ácido (S)-láctico produzido numa cepa de Geobacillus produtora de ácido (R)-láctico que foi modificada por rompimento do gene endógeno de L-lactato desidrogenase ldhL e introdução de um gene que codifica a atividade de D-lactato desidrogenase poderia ser ainda mais reduzida por rompimento do gene mgsA, previsto para codificar a metilglioxal sintase.

[0020] A deficiência de esporulação é uma propriedade desejadapara a aplicação industrial de espécies Bacillus. Nos termos da Directiva 2009/41 / CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 6 de Maio de 2009, relativos à utilização confinada de microrganismos geneticamente modificados, as utilizações confinadas de microrganismos geneticamente modificados devem ser classificadas em função do risco que apresentam à saúde humana e ao ambiente. Ter um fenótipo de esporulação deficiente para espécies Bacillus é visto como um meio para minimizar o risco de propagação no ambiente. São conhecidos diferentes métodos para obter fenótipos deficientes em esporulação, incluindo a seleção de derivados espontâneos deficientes em esporulação (Green et al., 2001, WO01 / 49865) ou o rompimento direcionado da via de esporulação, por exemplo, por rompimento de spo0A (Gonzy-Tréboul et al. 1992, J. Mol. Biol. 244: 967-979 Atkinson et al., 2010, WO2010 / 052499) ou sigF (Fleming et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol 61: 3775-3780; Wang et ai. , 2005, J. Appl. Microbiol. 98: 761-767, Kovács et al., 2010, Appl. Environ. Microbiol., 76: 40854088).

[0021] Deste modo, num primeiro aspecto, a invenção divulga uma célula bacteriana termofílica modificada por engenharia genética que é anaeróbica facultativa compreendendo

[0022] a) inativação ou deleção do gene endógeno de (S)-lactato desidrogenase;

[0023] b) introdução de um gene de (R)-lactato desidrogenase;

[0024] c) inativação ou deleção do gene endógeno de piruvato formiato liase A e / ou B.

[0025] Genes endógenos são genes que estão presentes num microrganismo. É evidente que uma bactéria como aqui descrita, em que um gene é inativado ou eliminado, requer que o gene esteja inerentemente presente na bactéria. Na ausência de uma indicação em contrário, no presente pedido qualquer referência a um gene significa um gene endógeno. Genes que são introduzidos num microrganismo, tal como um gene de (R)-lactato desidrogenase introduzido em células bacterianas como aqui descrito, não são genes endógenos.

[0026] No presente relatório a sequência de nucleotídeos do gene de (S)-lactato desidrogenase (ldhL) é fornecida na SEQ ID NO: 47 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência codificada de aminoácidos é fornecida em SEQ ID NO. 48:

[0027] As regiões de nucleotídeos flanqueando ldhL podem ser identificadas pelos iniciadores (primers) a jusante SEQ ID NOs 11 e 12 e os iniciadores a montante SEQ ID NOs 13 e 14 para Geobacillus thermoglucosidans.

[0028] Os genes adequados que codificam a atividade de (R) - lactato desidrogenase são os genes que codificam uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36 ou 38, ou genes homólogos que codificam uma sequência de aminoácidos que apresenta um grau de identidade de pelo menos 90%, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36 ou 38, de preferência 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de grau de identidade. Atividade de (R)-lactato pode ser demonstrada por sobre-expressão do gene num hospedeiro adequado e quantificação subsequente da atividade da enzima de (R)-lactato no extrato celular utilizando um ensaio enzimático ou pode ser demonstrada pela capacidade de complementar um mutante de E. Coli ldhA-, tal como E. coli FMJ144. Tais sequências homólogas podem abranger polimorfismos que podem existir em células de diferentes populações ou dentro de uma população devido à variação natural ou intracepa. Um homólogo pode ainda ser derivado de espécies diferentes das espécies nas quais a sequência especificada de DNA ou de aminoácido se origina ou pode ser artificialmente concebido e sintetizado. As proteínas identificadas pelas SEQ ID NOs: 36 e 38 são codificadas pelos genes ldhA e hdhD de Lactobacillus delbrueckii. Ambos os genes codificam uma atividade de D-lactato desidrogenase.

[0029] Em uma modalidade de acordo com a presente invenção a célula geneticamente engenheirada inclui um gene de (R)-lactato desidrogenase que é o gene hdhD de Lactobacillus delbrueckii que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:38 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, preferivelmente 95% de identidade com a mesma, mais preferivelmente pelo menos 98%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99% de grau de identidade.

[0030] Em outra modalidade de acordo com a presente invenção a célula geneticamente engenheirada inclui um gene de (R)-lactato desidrogenase que é o gene ldhA de Lactobacillus delbrueckii que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, preferivelmente 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 98%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99% com a mesma.

[0031] Em ainda outra modalidade o gene hdhD da célula de acordo com a invenção codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:38.

[0032] Em outra modalidade o gene ldhA da célula de acordo com a invenção codfica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:36.

[0033] Em outra modalidade de acordo com a presente invenção a célula geneticamente engenheirada inclui o gene hdhD de acordo com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:37.

[0034] Em ainda outra modalidade a célula geneticamente engenheirada inclui o gene ldhA de acordo com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:35.

[0035] Numa modalidade preferida, o gene endógeno de piruvato- formiato liase é inativado por inativação ou deleção do locus piruvato- formiato liase / álcool desidrogenase pflBA-adhE. Alternativamente, o gene endógeno de piruavato liase A e / ou B e os genes endógenos de álcool desidrogenase adhE podem ser inativados ou eliminados em etapas separadas. As regiões nucleotídicas flanqueando pflBA-adhE podem ser identificadas pelos iniciadores de PCR das SEQ ID NO: 1921.

[0036] No presente relatório com pflBA entende-se os genes A e B da piruvato-formiato liase, que codificam a enzima ativadora de piruvato- formiato-liase e piruvato formiato liase, respectivamente.

[0037] PlfA refere-se ao gene piruvato formiato liase A (que codifica a enzima ativadora de piruvato-formiato liase) cuja sequência é fornecida na SEQ ID NO: 39 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO: 40. PlfB refere-se ao gene piruvato formiato liase B (codificando piruvato formiato liase) cuja sequência nucleotídica é fornecida na SEQ ID NO: 41. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO: 42. Na presente invenção, adhE refere-se ao gene álcool desidrogenase E, codificando complexo bifuncional de acetaldeído-CoA / álcool desidrogenase, cuja sequência nucleotídica é fornecida na SEQ ID NO: 43 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO: 44.

[0038] Numa modalidade preferida, inativação pelo gene piruvato- formiato liase é inativado por inativação ou deleção do locus piruvato- formiato liase / álcool desidrogenase pflBA-adhE. Alternativamente, o gene piruvato liase A e / ou B e os genes álcool desidrogenase adhE podem ser inativados ou eliminados em etapas separadas.

[0039] Na presente invenção, as regiões nucleotídicas que flanqueiam adhE podem ser identificadas pelos iniciadores de PCR SEQ ID NOs 9 e 10 para Geobacillus thermoglucosidans.

[0040] Em outra modalidade de acordo com a presente invenção na célula geneticamente modificada também o gene endógeno de metilglioxal sintase (mgsA) é inativado ou eliminado.

[0041] No presente relatório, as regiões nucleotídicas que flanqueiam mgsA podem ser identificadas pelos iniciadores de PCR SEQ ID NOs: 21-24 para Geobacillus thermoglucosidans.

[0042] A sequência nucleotídica de mgsA é fornecida em SEQ ID NO: 45 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO: 46.

[0043] Em ainda outra modalidade de acordo com a presente invenção, na célula geneticamente modificada também o gene da fosfotransacetilase (pta) é inativado ou eliminado. A sequência nucleotídica de pta é fornecida em SEQ ID NO. 49 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO. 50. A inativação ou deleção de pta (que codifica fosfotransacetilase) minimiza ainda mais a produção de acetato remanescente associada à atividade endógena de pta. A cepa resultante (com pta inativado ou eliminado) é auxotrófica para ácido acético. Assim, ao fermentar esta célula geneticamente modificada ácido acético tem de ser suplementado ao meio de crescimento.

[0044] Ainda em outra modalidade de acordo com a presente invenção, a célula bacteriana termofílica geneticamente modificada, além disso, é produzida com deficiência de esporulação por inativação ou deleção de um gene de esporulação endógeno.

[0045] Em outra modalidade o gene de esporulação inativado ou eliminado é sigF.

[0046] SigF refere-se a um gene de esporulação cuja sequência nucleotídica é fornecida na SEQ ID NO: 51 para Geobacillus thermoglucosidans. A sequência de aminoácidos codificada é fornecida na SEQ ID NO: 52. As sequências de nucleotídeos flanqueando o sigF podem ser identificadas por iniciadores de PCR SEQ ID NOs 3-6.

[0047] Em outra modalidade o gene de esporulação inativado ou eliminado é sigF.

[0048] Ainda em outra modalidade a célula bacteriana termofílica geneticamente modificada de acordo com a presente invenção é uma célula bacteriana gram-positiva. Preferivelmente a célula pertence ao gênero Bacillus, mais preferivelmente Geobacillus.

[0049] Novamente em outra modalidade a célula bacteriana termofílica geneticamente modificada de acordo com a presente invenção é Geobacillus thermoglucosidans.

[0050] Um dos objetivos da presente invenção é produzir uma cepa de Geobacillus que é anaeróbica facultativa e produz ácido (R) -láctico por fermentação homoláctica.

[0051] Deste modo, num aspecto, a presente invenção divulga um método para modificação genética de espécies Geobacillus moderadamente termofílicas que são anaeróbicas facultativas e homolácticas por meio da engenharia genética.

[0052] Na presente invenção fermentação homoláctica é definida pela produção de ácido láctico a partir de fontes de hidrocarbonetos com a formação de não mais de 15% (p/p), preferivelmente não mais de 10% (p/p) e mais preferivelmente não mais de 5%, 4%, 3% ou 2% (p/p) de subprodutos como ácido fórmico, ácido acético e etanol. Esta percentagem refere-se ao peso total de subprodutos sobre o peso total de ácido láctico (incluindo ácido (R)-láctico e qualquer ácido (S)-láctico que possa estar presente). A quantidade de ácido láctico e etanol, ácido acético e ácido fórmico pode ser determinada por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por derivatização e análise por cromatografia gás- líquido (GLC) ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[0053] Em várias modalidades, a quantidade formada de pelo menos um entre ácido fórmico, etanol e ácido acético não é superior a 5% (p/p), com base no peso total de ácido fórmico, etanol ou ácido acético sobre o peso total de ácido láctico produzido, em particular não mais de 2%, 1%, 0,25% ou 0,1% (p/p). Em outras palavras, a quantidade em peso de ácido fórmico formado na fermentação homoláctica pode ser, por exemplo, não superior a 5% (p/p) e mais particularmente não superior a 2%, 1%, 0,25% ou 0,1% (p/p) em relação à quantidade total em peso de ácido láctico. De modo semelhante, a quantidade em peso de etanol pode ser não superior a 5%, 2%, 1%, 0,25% ou 0,1% (p / p) e a quantidade de ácido acético pode ser não superior a 5%, 2%, 1 %, 0,25% ou 0,1% (p/p).

[0054] A pureza quiral é um aspecto importante para a produção de polímeros de ácido poliláctico. Portanto, é essencial produzir ácido (R)- láctico enantiopuro para aplicações comerciais.

[0055] Assim, a presente invenção também fornece uma célula bacteriana termofílica modificada geneticamente que produz ácido (R)- láctico com uma pureza enantiomérica de pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, 99,8% ou 99,9%.

[0056] Num aspecto da invenção é fornecido um método para produzir ácido láctico enantiomérico puro. O método compreende as etapas de: cultivar uma célula bacteriana termofílica de acordo com a presente invenção usando matéria-prima fermentável adequada contendo carbono e isolar o ácido (R)-láctico.

[0057] Em outro aspecto a invenção prove um método para produzir ácido láctico enantiomérico puro em que a matéria-prima contendo carbono inclui xilose, glicose ou sacarose.

[0058] A cultura é preferivelmente realizada em uma temperature entre 50°C e 70°C, mais preferivelmente entre 55 e 65°C.

[0059] No contexto da invenção, inativação ou deleção de um gene pode ser a modificação de um gene que codifica um polipeptídeo desejado a ser produzido pela célula e / ou um gene que codifica um polipeptídeo envolvido na produção de um metabólito primário ou secundário pela célula. Em princípio, isto pode ser feito diminuindo os níveis celulares da proteína codificada. A diminuição dos níveis celulares pode ser efetuada, por exemplo, por inativação direcionada do gene que codifica a enzima de interesse. O gene pode ser removido na sua totalidade. No entanto, como uma alternativa, também a deleção de parte do gene pode resultar numa redução da atividade da proteína codificada. Alternativamente, ou adicionalmente, as sequências nucleotídicas responsáveis pela regulação ou expressão dos genes, como intensificadores de promotores, locais iniciadores de tradução e semelhantes, podem ser modificados ou removidos. Outra forma de influenciar a atividade da proteína de interesse pode ser a modificação de sinais de transporte, se necessário, ou a introdução de RNA antissenso.

[0060] A modificação cromossómica é preferida uma vez que a modificação cromossómica irá assegurar uma distribuição estável da funcionalidade do gene sobre as células da progênie. A deleção de uma funcionalidade desejada no cromossomo pode ser feita com recombinação não homóloga, bem como com a recombinação homóloga. A recombinação homóloga é preferida, uma vez que abre a oportunidade de introduzir, remover ou introduzir e remover simultaneamente uma funcionalidade.

[0061] Quando se pretende uma recombinação homóloga, o DNA de transformação contém ainda uma sequência de DNA que é homóloga a uma sequência alvo genômica da célula específica a ser engenheirada. O especialista compreenderá que não é necessária identidade de 100% para obter recombinação homóloga. Uma percentagem de identidade de 80%, preferivelmente de 90%, 95% ou 98% também será suficiente. O mais preferido é 99%. Geralmente, a sequência de DNA de interesse a ser inserida no cromossomo por recombinação homóloga é flanqueada por sequências homólogas com um comprimento suficiente para permitir a recombinação homóloga. Tal comprimento pode ser de pelo menos cerca de 200 bp, por exemplo entre cerca de 200 e cerca de 1500 bp, preferivelmente entre cerca de 200 e cerca de 1000 bp.

[0062] Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos refere-se à percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado utilizando o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Programa para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). As configurações padrão para os parâmetros do algoritmo Blastp são limiar de significância estatística (Expect threshold) de 10, tamanho de palavra (Word size) de 3, correspondência máxima em um intervalo de consulta (Max matches in a query range) de 0, Matriz é BLOSUM62, Penalidade para existência (abertura) de lacuna (Gap Costs Existence) de 11 e de Extensão de 1, Ajustes composicionais em Ajuste da matriz de escore composicional condicional (Conditional compositional score matrix adjustment).

[0063] Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências nucleotídicas refere-se à percentagem de nucleotídeos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado utilizando o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Programa para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). As configurações padrão para os parâmetros do algoritmo Blastn são limiar de significância estatística de 10, tamanho de palavra de 28, correspondência máxima em um intervalo de consulta de 0, Escores para alinhamento correto/incorreto (Match/Mismatch Scores) de 1, -2, Penalidade para abertura de lacuna (Gap Costs) em Linear.

[0064] Como mencionado acima, nenhuma das sequências que identificam os genes acima em Geobacillus thermoglucosidans necessita de ser 100% idêntica para modificar o gene de interesse por engenharia genética. Além disso, em células bacterianas termofílicas relacionadas de outras espécies, os genes podem desviar-se destas sequências. Contudo, a utilização das sequências genéticas de Geobacillus thermoglucosidans homólogas a estes genes e que têm a mesma funcionalidade pode ser facilmente identificada pelos especialistas na arte e os iniciadores correspondentes podem ser preparados para realizar a recombinação homóloga nestas cepas. Assim, mesmo se os desvios das sequências dos genes identificados acima existirem numa determinada cepa, os genes homólogos podem ser facilmente identificados. A sua sequência de nucleotídeos pode ser determinada utilizando tecnologias conhecidas na arte e, se necessário, um novo conjunto de iniciadores idêntico ou complementar às sequências de genes flanqueantes pode ser definido.

[0065] As células de acordo com a presente invenção podem ser preparadas usando tecnologias conhecidas na técnica. Em particular métodos para introduzir DNA em bactérias termofílicas por eletroporação foram descritos por Van Kranenburg et al., 2007, WO2007/085433 e Cripps et al. 2009, Metab. Eng. 11:398-408.

[0066] A transformação destas espécies de Bacillus por eletroporação pode ser conseguida por uma descarga de alta tensão através de uma suspensão contendo uma espécie de Bacillus moderadamente termofílica que é facultativa anaeróbica e homoláctica e um DNA de transformação adequado contendo a funcionalidade e / ou sequências de DNA homólogas a sequências genômicas dos Bacilli específicos desejados.

[0067] Ácido (R) -láctico pode ser obtido por fermentação de uma célula bacteriana termofílica geneticamente modificada tal como aqui descrita na presença de uma fonte de carboidrato (por exemplo glicose e/ou xilose) por métodos conhecidos na técnica. Durante a fermentação o ácido láctico excretado pelos micro-organismos é geralmente neutralizado utilizando uma base, por exemplo, sais básicos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos tais como hidróxidos, carbonatos e / ou hidrogenocarbonatos de sódio, potássio, magnésio e / ou cálcio. Bases de magnésio, por exemplo, hidróxido de magnésio, carbonato de magnésio e/ou hidrogenocarbonato de magnésio, são geralmente preferidos. Assim, em vários aspectos, a presente invenção refere-se particularmente a um método para produzir ácido (R)-láctico enantiomérico puro, compreendendo o referido método a cultura de célula bacteriana termofílica como aqui descrito na presença de uma base de magnésio (por exemplo, selecionada entre pelo menos uma de hidróxido de magnésio, carbonato de magnésio e hidrogenocarbonato de magnésio) utilizando matéria-prima fermentável adequada contendo carbono e isolando o ácido (R)-láctico.

[0068] Após a fermentação, o ácido (R)-láctico (ou um sal do mesmo) é separado do caldo de fermentação por qualquer uma das muitas técnicas convencionais conhecidas para separar ácido láctico e / ou lactato de soluções aquosas. Partículas de substrato ou microorganismos (a biomassa) podem ser removidas antes da separação para aumentar a eficiência de separação. A referida separação pode ser realizada por centrifugação, filtração, floculação, flotação ou filtração por membrana. Isto é, por exemplo, conhecido do documento WO 01/38283, em que é descrito um processo contínuo para a preparação de ácido láctico por meio de fermentação. Embora a discussão da fermentação neste relatório faça geralmente referência a um processo em batelada, partes do processo ou o processo completo podem ser realizados continuamente.

[0069] Após separação do ácido (R)-láctico (ou um sal do mesmo) do caldo de fermentação, o produto pode ser submetido a uma ou mais etapas de purificação, como extração, destilação, cristalização, eletrodiálise, filtração, tratamento com carvão ativado, troca iônica, etcetera. As várias correntes residuais podem ser recicladas, opcionalmente após o tratamento, para o vaso de fermentação ou para qualquer etapa de purificação realizada anteriormente.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS CEPAS E PLASMÍDEOS

[0070] Cepas e plasmídeos usados neste estudo são listados na Tabela 1.

[0071] Escherichia coli foi rotineiramente cultivada em caldo LB (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual (Clonagem molecular, um manual de laboratório). 3a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) a 37°C em condições aeróbicas. Quando apropriado, cloranfenicol e/ou ampicilina foram usados em concentrações de 20 mg/L e 100 mg/L, respectivamente.

[0072] L. lactis foi rotineiramente cultivado em caldo M17 broth ® (BD Biosciences) suplementado com 0,5% de glicose a 30°C em condições anaeróbicas. Quando apropriado, cloranfenicol foi usado em uma concentração de 5 mg/L.

[0073] G. thermoglucosidans foi rotineiramente cultivado em meio TGP a 52°C, 55°C ou 60°C em condições aeróbicas, a não ser que indicado o contrário. Meio TGP (Taylor et al., 2008, Plasmídeo 60:4552) continha 17 g/L de triptona, 3 g/L de peptona de soja, 5 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2HPO4 em pH 7,0, e adições pós-autoclave de 4 ml/L de glicerol e 4 g/L de piruvato de Na. Para placas de TGP 10 g/L ágar foram usados. Quando apropriado, o meio foi suplementado com cloranfenicol (8 μg/mL).Tabela 1. Cepas e plasmídeos usados neste estudo

TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO DE DNA

[0074] Técnicas padrão de manipulação de DNA foram realizadas como descrito por Sambrook e Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual (Clonagem molecular, um manual de laboratório), 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque).

[0075] Os derivados de construção pNW33N foram realizados em E. coli.

[0076] O isolamento em larga escala de DNA plasmídico de E. coli a partir de 100 mL de cultura foi realizado utilizando o kit Jetstar 2.0 Plasmide Maxiprep Kit® (Genomed) seguindo as instruções do fabricante. O isolamento em pequena escala de DNA plasmídico de E. coli a partir de 1 mL de cultura foi realizado utilizando o kit Nucleospin Plasmide Quick Pure® (Macherey-Nagel) seguindo as instruções do fabricante.

[0077] Células competentes de E. coli foram preparadas usando cloreto de cálcio e transformadas por choque térmico como descrito por Sambrook e Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque).

[0078] A construção de derivados de pNZ124 foi realizada em L. lactis.

[0079] Isolamento de DNA plasmídico de L. lactis a partir de 100 mL de cultura foi realizado utilizando o kit Jetstar 2.0 Plasmide Maxiprep Kit® (Genomed). O pélete de célula foi ressuspenso em 10 ml de tampão E1 modificado (Tris / HCl pH8 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, sacarose a 20%, lisozima 4 g / L (Sigma Aldrich) e incubado a 50 ° C durante 1 hora. Subsequentemente, foram seguidas as instruções do fabricante a partir da lise da célula em diante.

[0080] L. lactis foi transformada por eletroporação como descrito por Holo e Nes (Holo, H., e I. F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55: 3119-3123).

[0081] As reações de PCR para fins de clonagem foram realizadas com a polimerase Pwo de alta fidelidade (Roche) seguindo as instruções do fabricante.

[0082] Para análise de colônia-PCR foram colhidas colônias com um palito e uma quantidade pequena de material de célula foi transferida para um tubo de reação de PCR. As células foram rompidas por incubação de 1 min a 1000 W num forno de micro-ondas. Foram preparadas misturas de reação de PCR de 25 μL com DNA Polimerase DreamTaq™ (Thermo Scientific ™) conforme recomendado pelo fabricante e adicionadas aos tubos de reação com as células rompidas.

[0083] Eletroporação de G. thermoglucosidans

[0084] G. thermoglucosidans foi transformada por eletroporação, com base no protocolo descrito por Cripps et al. (Cripps et al., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408). G. thermoglucosidans foi cultivada de um dia para o outro a 55 ° C e 1 mL foi utilizado para inocular 50 ml de meio TGP pré-aquecido num frasco cônico de 250 ml com defletores. Células foram incubadas a 60 ° C (180 rpm) até o OD600 ser de ®1,0. O frasco foi resfriado em gelo durante 10 min. e as células foram peletizadas por centrifugação (4°C). Em seguida, as células foram lavadas quatro vezes com tampão de eletroporação gelado (sorbitol 0,5 M, manitol 0,5 M, glicerol a 10% (v/v)). Os volumes das etapas de lavagem foram 50 ml, 25 ml, 10 ml e 10 ml. O pélete final foi ressuspenso em 1,3 ml de tampão de eletroporação gelado e alíquotas de 60 μl de células electrocompetentes foram armazenados a -80 ° C ou diretamente utilizados para eletroporação.

[0085] Uma alíquota de 60 μl de células eletrocompetentes (descongeladas) foi misturada com 1-2 μg de DNA plasmídico e subsequentemente transferida para uma cubeta de eletroporação resfriada (abertura de 0,1 cm). As condições de eletroporação utilizando um eletroporador Gene Pulser Bio-Rad foram 2,5 kV, 10 μF e 600 Q. Após a eletroporação, as células foram transferidas para 1 ml de TGP pré-aquecido (52°C) num tubo plástico de 50 ml e recuperadas a 52°C, 180 rpm durante duas horas. A suspensão de células recuperada foi peletizada e todo o sobrenadante com exceção de 150 μl foi descartado. O pélete foi ressuspenso no sobrenadante remanescente.

[0086] Volumes de 1/10 e 9/10 foram colocados em placas de TGP contendo 8 μg / L de cloranfenicol. As placas foram incubadas a 52 ° C durante 24-48 horas. As colônias que apareceram nas placas foram transferidas para uma placa de TGP fresca contendo 8 μg / L de cloranfenicol e incubadas a 55 °C de um dia para o outro. As que cresceram foram testadas quanto a presença do plasmídeo por PCR de colônia utilizando os iniciadores 1 e 2 (Tabela 2).

INTEGRAÇÃO

[0087] O vetor ponte de Geobacillus-E.coli pNW33n foi usado como vetor de integração em G. thermoglucosidans como anteriormente descrito (Cripps et al., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408). 20 mL de TGP contendo 8 μg / mL de cloranfenicol foram inoculados com cepas transformadas a partir de uma solução estoque de glicerol. Após crescimento de um dia para o outro a 55 ° C, 180 rpm, diluições apropriadas foram colocadas em placas de TGP contendo 8 μg / mL de cloranfenicol. Estas placas foram então incubadas a 68° C por 24h. Colônias individuais foram estriadas (streaked) numa placa fresca (incubada a 52 ° C) e realizou-se uma PCR de colônia nestas colônias para identificar uma colônia com um cruzamento (crossover) único. As combinações de iniciadores apropriadas foram utilizadas para identificar cruzamentos únicos através do fragmento a montante ou a jusante (Tabela 2; combinações de iniciadores 655-170 e 656-571 para integração de pRM3, combinações de iniciadores 744-170 e 808-571 para integração de pRM12, combinações de iniciadores 629-170 e 630571 para integração de pFS3, combinações de iniciadores 754-170 e 991-571 para integração de pJS43, respectivamente). Em seguida, isolou-se DNA cromossômico de colônias positivas utilizando o Kit Masterpure Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies) e para confirmar os resultados da PCR de colônia, repetiu-se a PCR descrita acima no DNA cromossômico isolado. Um cruzamento único através da região flanqueante a montante e um cruzamento único através da região flanqueante a jusante foram selecionados para a segunda etapa de recombinação.

[0088] Para obter um cruzamento duplo, os integrantes primaries foram subcultivados várias vezes em TGP sem cloranfenicol. Diluições apropriadas (10-4, 10-5, 10-6) foram plaqueadas em placas de TGP. As colônias isoladas foram transferidas para uma placa de TGP com e sem 8 μg / mL de cloranfenicol. Mutantes de cruzamento duplo (double crossover mutants) são sensíveis ao cloranfenicol. A análise por PCR utilizando as combinações de iniciadores apropriadas (Tabela 2, combinações de iniciadores 655-656 para ΔsigF, 744-808 para ΔpflBA- adhE e 754-991 para ΔmgsA) foi utilizada para discriminar mutantes de deleção de tipo selvagem e para verificar a ausência de O plasmídeo. Todas as modificações foram confirmadas por sequenciamento dos produtos de PCR.

[0089] O vector de clonagem de Lactococcus pNZ124 foi utilizado como vetor de integração em G. thermoglucosidans para ldhA. Células competentes de G. thermoglucosidans recentemente preparadas com uma eficiência de transformação relativamente elevada (pelo menos 103 CFU/μg de pNW33n) foram transformadas com 2 μg de DNA plasmídico pJS65. As placas de transformação foram incubadas por 16 horas a 60°C, por 8 horas a 68°C e por 20 horas a 55°C. Colônias individuais foram estriadas numa placa fresca (incubada a 52°C) e realizou-se uma PCR de colônia nestas colônias para identificar uma colônia com um único cruzamento. As combinações de iniciadores apropriadas foram utilizadas para identificar cruzamentos únicos através do fragmento a montante ou a jusante (Tabela 2, combinações de iniciadores 1539-205 e 204-630).Tabela 2. Iniciadores (Primers) usados neste estudoTabela 2. Iniciadores (Primers) usados neste estudo

FERMENTAÇÃO

[0090] Meio TMM foi modificado a partir de Fong et al (Fong et al., 2006) e continha por L: 60 g/L de glicose; 30 g/l de xilose; 8,37 g de MOPS, 0,23 g de K2HPO4; 0,51 g de NH4Cl; 0,50 g de NaCl; 1,47 g de Na2SO4; 0,08 g de NaHCO3; 0,25 g de KCl; 1,87 g de MgCl2.6H2O; 0,41 g de CaCl2.2H2O; 16,0 mg de MnCl2.4H2O; 1,0 mg de ZnSO4.7H2O; 2,0 mg de H3BO3; 0,1 mg de CuSO4.5H2O; 0,1 mg de Na2MoO4.2H2O; 1,0 mg de CoCl2.6H2O; 7,0 mg de FeSO4.7H2O; 0,1 mg de tiamina; 0,1 mg de riboflavina; 0,5 mg de ácido nicotínico; 0,1 mg de ácido pantotênico; 0,5 mg de piridoxamina, HCl; 0,5 mg de piridoxal, HCl; 0,1 mg de D- biotina; 0,1 mg de ácido fólico; 0,1 mg de ácido p-aminobenzoico; 0,1 mg de cobalamina. pH foi ajustado para pH 7,2. Glicose, xilose, metais e vitaminas foram esterilizados por filtração. Meio foi autoclavado. TMM1, TMM2,5, e TMM5 foram suplementados com 1 g/L, 2,5 g/L, e 5 g/L de extrato de levedura (Oxoid), respectivamente.

[0091] STMM, diferiu de TMM em concentrações de K2HPO4 (1,00 g/L), NH4Cl (2,50 g/L), NaCl (5,00 g/L), e CaCl2.2H2O (50 mg/L) e foi suplementado com D,L-metionina (68,5 mg/L) e betaína (0,14 g/L). Sacarose (90 g/L) foi usada em vez de glicose e xilose. STMM5 foi suplementado com 5 g/L de extrato de levedura (Biospringer).

[0092] Uma pré-cultura de 100mL em TMM5 ou STMM5 foi usada para inoculação (10% v/v) 400 mL TMM1, TMM2,5, ou STMM5 em um fermentador Multifors de 0,75 L (Infors) equipado com um condensador (resfriado com água da torneira corrente de aproximadamente 15°C). O pH foi controlado em pH 7,2 por adição de KOH 2,5 M estéril ou Ca(OH)2 a 75 g/L estéril. Temperatura foi de 60°C. Velocidade do agitador foi de 300 rpm.

[0093] Amostras foram retiradas da fermentação para medição de ácido (R)- e (S)-láctico, e possíveis subprodutos. Amostras foram centrifugadas e os detritos restantes foram removidos por filtração usando um filtro Millex GP® 0,22 μm (Millipore). O filtrado foi armazenado a -21 °C até outra análise.

[0094] Os açúcares foram medidos por HPLC utilizando uma coluna Thermo CarboPac SA-10 (Dionex). Ácido fórmico foi medido por HPLC utilizando uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87C (Bio-Rad). Outros ácidos orgânicos (ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido pirúvico) e etanol foram medidos utilizando uma derivatização e cromatografia gás-líquido (GLC). (R)- e (S)-lactatos foram metilados a metil-lactato e medidos por análise do espaço de topo numa coluna quiral.

EXEMPLO 1 Produção homoláctica de ácido láctico com G. thermoglucosidans

[0095] Plasmídeo de integração pRM3 foi construído (constructed) para eliminar o gene sigF em G. thermoglucosidans. As regiões flanqueantes a montante e a jusante do gene sigF foram geradas por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde (template) e combinações de iniciadores 653 e 654 (Tabela 2) para obter o fragmento a montante e os iniciadores 651 e 652 (Tabela 2) para obter o fragmento a jusante. Em primeiro lugar, o fragmento a jusante foi clonado como fragmento KpnI-SalI em pNW33n, digerido com as mesmas enzimas. Em seguida, o fragmento a montante foi clonado como fragmento SalI- HindIII nesta construção, digerido com as mesmas enzimas resultando em plasmídeo pRM3. A construção de pRM3 foi feita em E. coli TG90. A integridade da sequência de pRM3 foi confirmada por sequenciamento de DNA.

[0096] Plasmídeo pRM3 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542. Uma única colônia transformante foi selecionada e utilizada para obter mutantes de cruzamento único como descrito em Materiais e Métodos. Duas colônias foram selecionadas para trabalhos posteriores, uma com um cruzamento único através da região flanqueante a montante e uma com um cruzamento único através da região flanqueante a jusante.

[0097] Obteve-se um mutante de cruzamento duplo seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. Sessenta colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento único em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas TGP com e sem cloranfenicol. Quinze colônias foram sensíveis ao cloranfenicol. Doze colônias tiveram a modificação desejada e três reverteram para o tipo selvagem. Uma colônia foi selecionada e designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. A deleção foi confirmada por sequenciamento.Tabela 3. Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF uma mistura de glicose/xilose emTMM2,5.

[0098] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF foi avaliado em fermentação em pH controlado (KOH) usando TMM2,5. Fermentações foram transferidas 4 vezes e as fermentações finais foram analisadas. Os resultados são resumidos na Tabela 3. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF consumiu xilose e glicose simultaneamente.

EXEMPLO 2 Construção de derivado de G. thermoglucosidans produtora de ácido (R)-láctico usando hdhD.

[0099] Plasmídeo pFS3 foi construído para facilitar a substituição genética do gene ldhL nativo pelo gene hdhD originário de L. delbrueckii e codificando a atividade da D-lactato desidrogenase. A construção foi tal que os códons de início e de parada hdhD substituem as posições dos códons de início e de parada ldhL originais e resultam numa fusão translacional de hdhD com o promotor ldhL. A região flanqueante a jusante do gene ldhL foi gerada por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinação de iniciadores 624 e 631. O produto foi digerido com SalI e SphI e ligado a pNW33n digerido com SalI e SphI. O plasmídeo resultante foi designado por pFS2. A construção de pFS2 foi realizada em E. coli DH5a.

[00100] A região flanqueante a montante do gene ldhL foi gerada por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinação de iniciadores 1057 e 1203. O gene hdhD (SEQ ID NO: 37) foi gerado por PCR utilizando DNA genômico de L. delbrueckii como molde e combinação de iniciadores 1202 e 1189. O gene também pode ser sintetizado com base na SEQ ID NO: 37. Os dois produtos de PCR resultantes são subsequentemente utilizados como molde numa PCR de sobreposição utilizando a combinação de iniciadores 1057 e 1189 para fundir os mesmos em conjunto. O produto foi digerido com BamHI e XhoI e ligado em pFS2 digerido com BamHI e SalI. O plasmídeo resultante foi designado pFS3. Construção de pFS3 foi feita em E. coli TG90. Integridade da sequência de nucleotídeos de pFS3 foi confirmada por sequenciamento.

[00101] Plasmídeo pFS3 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. Uma única colônia transformante foi selecionada e utilizada para obter mutantes de cruzamento único como descrito em Materiais e Métodos. No número de colônias testadas apenas foram obtidos mutantes cruzados únicos através da região flanqueante a jusante. Um deles foi selecionado para trabalhos futuros.

[00102] Obteve-se um mutante de cruzamento duplo seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. Colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento único em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas TGP com e sem cloranfenicol. Foram verificadas por PCR dezessete colônias sensíveis ao cloranfenicol. Uma colônia teve a modificação desejada e 16 reverteram para o tipo selvagem. A colônia que teve ldhL trocado por hdhD foi selecionada e designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL::hdhD.

[00103] Para otimizar mais ainda G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL::hdhD houve um desejo de se eliminar a formação de subprodutos ácido fórmico, ácido acético, e etanol. Embora mutações de pflA e/ou pflB e adhE sejam conhecidas por impactar a produção de ácido fórmico e etanol em muitas bactérias, os efeitos colaterais de romper esses genes são imprevisíveis.

[00104] Para avaliar o efeito do rompimento destes genes, construiu- se um plasmídeo (pRM12) para eliminar os genes pflB, pflA e adhE (parcialmente) em G. thermoglucosidans. A região flanqueante a montante de pflBA e a região flanqueante a montante do adhE orientado de forma convergente foram geradas por PCR utilizando o DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinações de iniciadores 739 e 805 para obter o fragmento pflBA a montante e os iniciadores 806 e 807 para obter o fragmento adhE. Os dois produtos de PCR resultantes foram subsequentemente utilizados como molde numa PCR de sobreposição utilizando a combinação de iniciadores 739 e 807 para os fundir em conjunto. O produto foi clonado como fragmento BamHI-PstI em plasmídeo pNW33n digerido com BamHI e PstI, resultando em plasmídeo pRM12. A construção de pRM12 foi feita em E. coli TG90. A integridade da sequência de nucleotídeos pRM12 foi confirmada por sequenciamento.

[00105] Plasmídeo pRM12 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD. Uma única colônia transformante foi selecionada e utilizada para obter mutantes de cruzamento único como descrito em Materiais e Métodos. Duas colônias foram selecionadas para trabalhos posteriores, uma com um único cruzamento através da região flanqueante de pflBA a montante e uma com um único cruzamento através da região flanqueante de adhE a montante.

[00106] Obteve-se um mutante de cruzamento duplo seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. 120 colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento único em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas de TGP com e sem cloranfenicol. Cinco colônias sensíveis a cloranfenicol foram verificadas por PCR. Duas colônias tinham a modificação desejada e três tinham revertido ao tipo selvagem. Selecionou-se uma colônia com a modificação desejada e designou-se G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE.

[00107] G thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE foi avaliado em fermentações com pH controlado (Ca(OH)2) utilizando meio STMM5 contendo 5 g / L de extrato de levedura e 90 g / L de sacarose. As fermentações foram transferidas e a segunda fermentação foi analisada quanto à produção homoláctica de ácido (R)-láctico. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE foi capaz de produzir ácido (R)-láctico homoláctico com uma quantidade limitada de subprodutos etanol, ácido fórmico, e ácido acético. Assim, a introdução de HdhD D-lactato desidrogenase em combinação com rompimento dos genes do complexo piruvato-formiato liase e álcool desidrogenase resulta numa fermentação homoláctica de ácido (R) -láctico a 60 ° C com uma quantidade limitada de subprodutos etanol, ácido fórmico, e ácido acético.

EXEMPLO 3 Construção de derivado de G. thermoglucosidans produtor de ácido (R) -láctico usando ldhA.

[00108] A clonagem de genes de ldhA originários de espécies de Lactobacillus em E. coli é conhecida por ser problemática (Bernard et ai., 1991. FEBS Lett., 290: 61-64). Para contornar possíveis problemas de clonagem, decidimos usar L. lactis como hospedeiro intermediário e pNZ124 como vetor de clonagem. O plasmídeo pJS65 foi construído para facilitar a substituição genética do gene ldhL nativo pelo ldhA originário de L. delbrueckii e codificando a atividade da D-lactato desidrogenase. A construção foi tal que os códons de início e de parada ldhA substituem as posições dos códons de início e de parada ldhL originais e resultam numa fusão translacional de ldhA para o promotor ldhL.

[00109] A região flanqueante a jusante do gene ldhL é gerada por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinação de iniciadores 1589 e 957. O produto é digerido com SacI e XhoI e ligado a pNZ124 digerido com SacI e XhoI. O plasmídeo resultante é designado por pJS64. A construção de pJS64 é feita em L. lactis MG1363.

[00110] A região flanqueante a montante do gene de ldhL é gerada por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinação de iniciadores 1537 e 676. O gene de ldhA (SEQ ID NO: 35) é gerado por PCR utilizando DNA genômico de L. delbrueckii como modelo e combinação de iniciadores 675 e 564. O gene também pode ser sintetizado com base na SEQ ID NO: 35 levando em conta que o gene sintético deve, preferivelmente, ser clonado em pNZ124 e em L. lactis. Os dois produtos de PCR resultantes são subsequentemente utilizados como molde numa PCR de sobreposição utilizando a combinação de iniciadores 1537 e 564 para os fundir em conjunto. O produto é digerido com XbaI e SalI e ligado em pJS64 digerido com XbaI e parcialmente digerido com SalI. O plasmídeo resultante é designado por pJS65. A construção de pJS65 é feita em L. lactis MG1363.

[00111] Plasmídeo pJS65 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE para integração direta. Obteve-se uma única colônia transformante com um único cruzamento através da região flanqueante ldhL a montante. A obtenção da integração direta no genoma de G. thermoglucosidans exigiu a utilização de células competentes recém-preparadas com uma eficiência de transformação relativamente alta de pelo menos 103 CFU / μg de pNW33n.

[00112] Obteve-se um mutante de cruzamento duplo seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. 240 colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento simples em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas de TGP com e sem cloranfenicol. Treze colônias sensíveis ao cloranfenicol foram verificadas por PCR. Dez colônias tinham a modificação desejada e três tinham revertido para o tipo selvagem. Uma colônia tendo ldhL trocada por ldhA foi selecionada e designada por G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: ldhA, ΔpflBA-ΔadhE.Tabela 4. Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL::ldhA, ΔpflBA-ΔadhE em STMM5

[00113] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: ldhA, ΔpflBA-ΔadhE foi avaliado em fermentações com pH controlado (Ca (OH)2) utilizando meio STMM5 contendo 5 g / L de extrato de levedura e 90 g / L de sacarose. As fermentações foram transferidas e a segunda fermentação foi analisada. Os resultados estão resumidos na Tabela 4. Estes dados demonstram claramente que a introdução da LdhA D- lactato desidrogenase em combinação com a ruptura dos genes do complexo piruvato-formiato liase e álcool desidrogenase resulta numa fermentação homoláctica de ácido (R)-láctico com um montante limitado de subprodutos etanol, ácido fórmico e ácido acético.

EXEMPLO 4 Produção de ácido homoláctico enantiopuro com G. thermoglucosidans

[00114] Plasmídeo pJS43 foi construído para eliminar 267 pb do gene mgsA (423 pb) em G. thermoglucosidans. As regiões flanqueantes a montante e a jusante do gene mgsA foram geradas por PCR utilizando DNA genômico de DSM 2542 como molde e combinações de iniciadores 750 e 999 para obter o fragmento mgsA a jusante e os iniciadores 1000 e 753 para obter o fragmento mgsA a montante. Os dois produtos de PCR resultantes foram subsequentemente utilizados como molde numa PCR de sobreposição utilizando a combinação de iniciadores 750 e 753 para os fundir em conjunto. O produto foi clonado como fragmento BamHI-PstI em plasmídeo pNW33n digerido com BamHI e PstI, resultando em plasmídeo pJS43. A construção de pJS43 foi feita em E. coli TG90. A integridade da sequência de nucleotídeos pJS43 foi confirmada por sequenciamento.

[00115] Plasmídeo pJS43 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE. Foram selecionadas colônias transformantes individuais e utilizadas para obter mutantes de cruzamento único como descrito em Materiais e Métodos. Duas colônias foram selecionadas para trabalhos posteriores, uma com um cruzamento único através da região flanqueante a montante e uma com um cruzamento único através da região flanqueante a jusante.

[00116] Mutantes de cruzamento duplo foram obtidos seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. 400 colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento único em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas TGP com e sem cloranfenicol. Destas, 213 colônias eram sensíveis ao cloranfenicol. 39 das colônias sensíveis ao cloranfenicol foram verificadas por PCR para cruzamentos duplos. Oito colônias tiveram a modificação desejada e 31 tinham revertido para o tipo selvagem. Selecionou-se uma única colônia com a modificação desejada e designou-se G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL: hdhD, ΔpflBA-ΔadhE, ΔmgsA. A deleção foi confirmada por sequenciamento.

[00117] Plasmídeo pJS43 foi eletroporado a G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, AldhL :: ldhA, ΔpflBA-ΔadhE. Foram selecionadas colônias transformantes individuais e utilizadas para obter mutantes de cruzamento único como descrito em Materiais e Métodos. Duas colônias foram selecionadas para trabalhos posteriores, ambas com um único cruzamento através da região flanqueante a montante. Não foram obtidos cruzamentos simples através da região flanqueante a jusante.

[00118] Mutantes de cruzamento duplo foram obtidos seguindo o procedimento descrito em Materiais e Métodos. 240 colônias, obtidas após subcultivo dos integrantes de cruzamento simples em TGP sem cloranfenicol, foram transferidas para placas de TGP com e sem cloranfenicol. 239 colônias foram sensíveis ao cloranfenicol, das quais 134 colônias foram verificadas por PCR para cruzamentos duplos. Um tinha a modificação desejada e 133 reverteram para o tipo selvagem. A única colônia com a modificação desejada foi selecionada e designada G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, AldhL :: ldhA, ΔpflBA-ΔadhE, ΔmgsA. A deleção foi confirmada por sequenciamento.Tabela 5. Fermentação com G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL::ldhA, ΔpflBA-ΔadhE, ΔmgsA em STMM5

[00119] G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔldhL :: ldhA, ΔpflBA-ΔadhE, ΔmgsA foi avaliado em fermentações com pH controlado (Ca(OH)2) utilizando meio STMM5 contendo 5 g / L de extrato de levedura e 90 g/L de sacarose. As fermentações foram transferidas e a segunda fermentação foi analisada. Os resultados estão resumidos na Tabela 5. A pureza quiral do ácido (R) -láctico produzido foi> 99,0% para baixas concentrações de ácido láctico (<5 g / kg) e> 99,7 para maiores concentrações de ácido láctico (> 20g /Kg), que é mais puro do que ácido láctico de cepas sem ruptura de mgsA (Tabela 5). Estes dados mostram claramente que, apesar da aparente incompletude da via metilglioxal em G. thermoglucosidans, a ruptura de mgsA resulta na capacidade de produzir ácido (R) -láctico puro quiral resultando numa fermentação homoláctica e quiral pura de ácido (R) -láctico.

Claims (12)

1. Célula bacteriana termofílica modificada por engenharia genética que pertence à espécie Geobacillus thermoglucosidans e que é anaeróbica facultativa, caracterizada pelo fato de que a célula de Geobacillus thermoglucosidans compreende: (a) um gene endógeno de (S)-lactato desidrogenase (ldhL) inativado ou deletado; (b) um gene exógeno de (R)-lactato desidrogenase introduzido, em que o gene é selecionado do grupo que consiste no gene hdhD de Lactobacillus delbrueckii que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:38 e no gene ldhA de Lactobacillus delbrueckii que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (c) um gene endógeno de piruvato formiato liase A (pflA) e/ou piruvato formiato liase B (pflB) inativado ou deletado.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que adicionalmente o gene endógeno metilglioxal sintase mgsA é inativado ou deletado.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato que adicionalmente o gene endógeno fosfotransacetilase (pta) é inativado ou deletado.

4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é um derivado deficiente em esporulação devido à inativação ou deleção de um gene endógeno de esporulação.

5. Célula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato que o gene de esporulação é sigF.

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato que o gene piruvato formiato liase A e/ou B é inativado por inativação ou deleção do locus endógeno de piruvato formiato liase/álcool desidrogenase pflBA-adhE.

7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que produz ácido (R)-láctico com uma pureza enantiomérica de pelo menos 98%, mais preferivelmente de pelo menos 99%, 99,5%, 99,8% ou 99,9%.

8. Célula bacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato que os genes são modificados por recombinação homóloga.

9. Método para produzir ácido (R)-láctico enantiomérico puro, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula termofílica de Geobacillus thermoglucosidans, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a uma temperatura entre 52°C e 60°C, usando matéria-prima adequada contendo carbono fermentável e o isolamento do ácido (R)-láctico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato que a matéria-prima contendo carbono compreende xilose, glicose ou sacarose.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato que são formados não mais de 15% (p/p) de subprodutos, com base no peso total de subprodutos em relação ao peso total de ácido láctico produzido, em particular, não mais de 10% (p/p), ou não mais de 5%, 4%, 3% ou 2% (p/p).

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato que o montante formado de pelo menos um dentre ácido fórmico, etanol e ácido acético não é superior a 5% (p/p), com base no peso total de ácido fórmico, etanol ou ácido acético em relação ao peso total de ácido láctico produzido, em particular não mais de 2%, 1%, 0,25% ou 0,1% (p/p).