JP5363119B2 - ホモ乳酸的好熱性バチルスの遺伝子改変 - Google Patents
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Description
pSH71レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたDNAを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること、ここで該相同体は、配列ID NO:1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、熱感受性複製の機能を有するポリペプチド(RepAタンパク質)をコードするDNA配列を含む;
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと;
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと;
の段階を含む。
A. プロトプラスト形質転換又はプロトプラスト融合、
B. エレクトロポレーション、
C. バイオリスティック(biolistic)形質転換、
D. 接合、又は、
E. 自然のコンピテント細胞の形質転換
により、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中に導入される。
プラスミドpNW33N(Zeigler, D.R. 2001:The genus Geobacillus; introduction and strain catalog, 7th ed., vol. 3. Bacillus Genetic Stock Center. www.bgsc.org)が、Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、オハイオ州、アメリカ合衆国、から入手され、そして、エシェリヒア コリ DH5α(Invitrogen Life Technologies)中において増殖された。pNW33Nのヌクレオチド配列は、GenBankアクセス番号AY237122下で入手可能である。
IncPプラスミドのRK2の転移のオリジン(oriT)を有するプラスミドpATΔS28(Namy, O., M.Mock, A.Fouet, 1999:Co-existence of clpB and clpC in the Baciliceae. FEMS Microbiol. Lett. 173:297-302)が、Institute Pasteurから得られた。
B.coagulans DSM1が、DSMZ、Brauschweig、ドイツ連邦共和国、から入手された。
Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363は、Gassonにより記載された(M.J.Gasson. 1983:Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J.Bacteriol. 154:1-9)。
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus LMG 6901は、BCCM/LMG bacteria collection、ヘント、ベルギーから得られた。
pRK24を宿すE.coli HB101は、Trieu-Cuotらにより記載された(Trieu-Cuot, P., C. Carlier, P.Martin, and P.Courvalin, 1987:Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294)。
及び
とのpNW33N複製遺伝子repBの同一性の為に設計された。コロニーは、つまようじにより取られ、そして、少しの細胞物質が、0.5mLのPCR反応チューブに移された。細胞は、電子レンジ中で1000Wで1分間のインキュベーションにより破壊された。rTaqポリメラーゼ(Amersham Biosciences)を有する50μL及び夫々のプライマー0.5μgのPCR反応混合物が、製造者により推奨されたとおりに調製され、そして、破壊された細胞を有する反応チューブに添加された。
3つの独立した実験において、以下の手順が用いられた。バチルス コアギュランス DSM1が、好気的条件下で5mlBC−培地中で45℃で一晩培養された。この培養物が、予め温められたC−培地中の25mlに植菌する為に用いられて、600nmで0.15の濁度を結果した。600nmでの0.9〜1.2の濁度が達せられるまで、新しい培養物が45℃で好気的にインキュベートされた(表1)。
コンピテント細胞の0.5mL部分がペレット化され、そして、該ペレットが、T−培地の0.1mL中に再懸濁されそしてpNW33NプラスミドDNAの5μgと混合された。900rpmでのThermomixer(Eppendorf)中での45℃での1.5時間のインキュベーション後、予め温められたBC培地の0.3mLが添加され、そしてインキュベーションが2時間継続され、その後、細胞は7mg/Lのクロラムフェニコールを補われたBCプレート上に蒔かれた。プレートは、45℃で好気的にインキュベートされた。インキュベーションの3日後、コロニーが現れた(表1)。
コロニーは、45℃での一晩インキュベーションのために、7mg/Lクロラムフェニコールを補われた新しいBCプレート上にストライプされた。コロニーPCRが、プラスミドpNW33NからのrepB遺伝子の存在を検出する為に用いられた。全てのPCR反応は、期待されたサイズの産物を産出した。夫々の実験からの1のコロニーが、O/Nインキュベーション及びminiprepプラスミド単離の為にBC培地に移された。プラスミドDNAはアガロースゲル電気泳動により視認され得なかったが、このminiprepDNAによるE.coli DH5αの形質転換は、pNW33Nが回収されることができた形質転換体を結果した。プラスミドDNAは、pNW33Nの完全性を確認する為に、EcoRI−StuIにより消化された。制限パターンは、期待されたとおりであり(表1)、プラスミドpNW33NがB.coagulans DSM1に形質転換されたことを実証した。
IncPプラスミドRK2の転移のオリジン(oriT)が、pNW33Nへクローン化された。これは、E.coli供与体中に共在する任意の自己移転可能なIncPプラスミドによる有効な共可動化を許す(Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to Gram-positive bacteria. Trieu-Cuot,P., Carlier, c., Martin, P., and Couvalin, P. 1987. FEMS Microbiol. Lett. 48:289-294)。RK2 oriT領域は、pATΔS28から由来する平滑末端化された0.5−kb AccI−AvaII断片として、SmaIにより消化されたpNW33N中にクローン化された。得られたプラスミドpJS28(図2)は、pRK24を宿すE.coli HB101へ形質転換された。この株は、B.coagulans DSM1とのプレート接合において供与体として用いられた。
アンピシリンとクロラムフェニコールとを含有するLB中で37℃で好気的に成長された、pJS28とpRK24とを宿すE.coliの一晩培養物は、抗生物質を有する新しいLB培地へ1/50で移され、そして、600nmでの0.56の濁度へ培養された。BC培地中で45℃で好気的に成長されたB.coagulans DSM1の一晩培養物が、新しいBC培地へ1/50で移され、そして、600nmで0.52の濁度へ培養された。E.coliとB.coagulansの等しい量(2mL)が,0.45μmフィルター上で回収された。細胞を有するフィルターは、抗生物質を有さないBCプレート上へ移され、そして、45℃で一晩インキュベートされた。細胞がフィルターから除去され、そして、希釈系列がBCプレート上に蒔かれそして55℃で好気的にインキュベートされた。1〜2日後にコロニーが現れた。pJS28の存在はプラスミドDNA単離により確認され、そして、その完全性がNcoIによる消化により確認されて、期待される消化パターン(1444−bp及び3299−bpの断片)を産出した。接合の効率は、受容体当たり約9.3・10−7であった。
プロモーター活性を有するB.coagulans ATCC23498ヌクレオチド配列断片(米国特許第5171673号明細書において開示されている)が、合成DNA断片(図3)として製造され、そしてBglII−BamHI断片として、同じ酵素により消化されたpMH3中へクローン化された。得られたクローニングベクターpJS25(図4)は、開始コドンとオーバーラップするNcoI部位の使用により、このプロモーターへの翻訳的な結合を許す。このNcoI部位の使用を可能とする為に、第1のプラスミドpMH3が、プラスミドpNZ124から、メガプライマーを使用してcat遺伝子からNcoI部位を除去することにより構築された。配列
及び
を有するプライマーが、メガプライマーを産生する為に用いられ、これは第2のPCR反応において、配列
を有するプライマーと組み合わせて使用された。得られたPCR産物は、完全なcat遺伝子を含み、そして、pNZ124 cat遺伝子を置換するために、BglII−SalIにより消化されて、プラスミドpMH3を産生した。プラスミドpJS25(図4)は、バチルス ズブチリス、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス プランタラム、ラクトコッカス ラクティス及びロイコノストック ラクティスを含む種々の中等温度好性のグラム陽性生物並びにグラム陰性生物エシェリヒア コリ(Use of the Escherichia coli β-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. C. Platteeuw, G. Simons, and W.M. de Vos. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60:587-593)において用いられうる。
R−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードし、そしてBernerdらにより発行された(Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli. 1991. Bernard, N., T. Ferrain, D. Garmyn, P. Hols, and J. Delcour. FEBS Lett. 290:61-64)、L.bulgaricus LMG6901 ldhA遺伝子が、配列
及び
を有するプライマーを用いてPCRにより生産された。PCR産物は、平滑−XbaI断片として、XbaI−SmaIにより消化されたpUC18中へクローン化され、そして、その完全性がヌクレオチド配列分析により確認された。次に、ldhA遺伝子が、RcaI−XbaI断片として、NcoI−XbaIにより消化されたpJS25中へクローン化された。得られた発現ベクターpJS26(図5)は、B.coagulansプロモーターへと翻訳的に結合されたL.bulgaricusのldhA遺伝子を有する。次に、B.coagulansプロモーターとL.delbrueckii ldhA遺伝子とを含む完全な断片が、(BglIIを用いた部分消化による)PstI−BglII断片として、PstI−BamHIにより消化された好熱性クローニングベクターpNW33Nへと移されて、プラスミドpJS27(図6)を産生した。
プラスミドpJS27が、エレクトロポレーションにより、B.coagulans DSM1へと形質転換された。特異的なR−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性が、50℃でのmgタンパク質当たりの分当たりの340nmでの吸収の減少として測定された。pNW33Nを宿すB.coagulans DSM1の該特異的な活性は0.45ΔA・分−1・mgタンパク質−1であり、そしてpJS27を宿すB.coagulans DSM1のそれは2.15ΔA・分−1・mgタンパク質−1であり、L.delbrueckii LMG6901 ldhA遺伝子を含有する改変された株中のR−ラクテートデヒドロゲナーゼの過剰生産が、4.8倍増加した活性を結果したことを実証する。
R−ラクテートを生産する改変されたB.coagulans株が、主要なS−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性をコードするB.coagulans ldhL遺伝子を、R−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするL.bulgaricus ldhA遺伝子により置換することによって構築された。置換は、条件的クローニングベクター、例えば45℃で機能的だが55℃で機能的でない熱感受性レプリコンを用いて、二段階の過程における相同組み換えにより達せられる。我々は、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種中でのそのような熱感受性の性質を有することが発見された、pNZ124又はpMH3に存在するpSH71レプリコンを用いる。組み込みベクターpRK1(図7)は、pNZ124レプリコン、B.coagulans DSM1染色体中のldhLに隣接し且つ今はL.bulgaricus ldhA遺伝子に結合されたB.coagulans ATCC23498 amy プロモーターに隣接する2つの1−kb領域、及びクロラムフェニコール耐性をコードするcat遺伝子を含有する。組み込みベクターは、以下のカセットのライゲーションにより構築される:(i)1.8−kb SalI−XbaI断片、SalI部位は平滑末端にされ、pNZ124レプリコンを含有する;(ii)1.1kbのXbaI−BamHI断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてB.coagulans DSM1を用いて産生されたPCR断片から切り出されたldhL遺伝子の上流領域を含有する;(iii)1.0kbのBamHI−PstI断片、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてpMH3(実施例4)を用いて産生されたPCR断片から切り出されたcat遺伝子を含有する;(iv)1.3kbのPstI−KpnI断片、pJS27(実施例5)から切り出されたL.coagulans ATCC23498 amyプロモーターに翻訳的に結合されたB.bulgaricus LMG 6901 ldhA遺伝子を含有する;(v)1.1−kb KpnI−BglII断片、平滑末端にされたBglII部位を有し、プライマー
及び
並びにテンプレートとしてB.coagulans DSM1を用いて産生されたPCR断片から切り出されたldhL遺伝子の下流領域を含有する。
プラスミドpRK1が、エレクトロポレーションによりB.coagulans DSM1へと形質転換される。形質転換体は、7mg/Lクロラムフェニコールを補われたBCプレート上で45℃で成長されて得られた。プラスミド単離による形質転換の確認の後、単独のコロニーが、対数増殖中期へとBC培地中で45℃で培養され、その後温度は55℃にシフトされそしてインキュベーションは1時間続けられる。希釈系列が、BCプレート上に蒔かれ、そして55℃で一晩インキュベートされる。コロニーはプールされ、そして第2の希釈系列においてBCプレート上に蒔かれる。55℃での一晩インキュベーション後、コロニーは、一重交差現象を確認するPCR分析により、組み込みについて試験される。1のコロニーが、抗生物質を有するBC培地中での55℃での、1/1000希釈の逐次の移行(約10世代)による継代培養の為に選ばれる。約100世代の後、希釈系列は、抗生物質を有するBCプレート上に蒔かれた。55℃での一晩インキュベーション後、コロニーシリーズは、コロニーPCRによりldhL遺伝子の欠如について試験される:代わりに、コロニーPCRによるldhL遺伝子の欠如について試験することにより、第1の現象の一重交差変異体のうちの二重交差変異体が選抜されうる。これらPCR反応においてネガティブであるコロニーからの染色体DNAが単離さらそしてさらにldhAの存在について評価され、そして正確な組み込みがサザンブロット分析により確認される。
実施例6において記載された方法により、工業的B.coagulans株からのldhLプロモーターに結合された、工業的L.delbrueckii株からのldhA遺伝子及びpMH3からのcat遺伝子を有するカセットにより置換されたldhL遺伝子を有するB.coagulans DSM1派生体が構築された。得られた株は、RDSM1と呼ばれた。
RDSM1株が、工業的な条件を模倣するバッチ培養において成長された。発酵後、有機酸の濃度と乳酸の光学純度とが測定された(表3)。B.coagulans RDSM1により生産されたラクテートは、99.5%についてR体であった。副産物の形成における違いは、B.coagulans DSM1(実施例5)と比較して検出されなかった。2−ヒドロキシ酪酸、酢酸、酪酸、ギ酸、ピルビン酸の濃度は、検出限界(ピルビン酸については<0.02%;他については<0.01%)より低かった。コハク酸の濃度は、0.1%(v/v)より低かった。これらの結果は、野生型B.coagulans遺伝子の染色体欠失、並びに(非相同)遺伝子の染色体への挿入及び機能的な発現が可能であり、そしてB.coagulansによるエナンチオピュアなR−ラクテートの生産に適用されうることを実証する。
Claims (13)
- 通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種を遺伝子操作により改変する方法であって:
pSH71レプリコンまたはその相同体を含有する熱感受性プラスミド系中にクローン化されたDNAを、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性バチルス種の細胞中へ導入すること、ここで該相同体は、配列ID NO:1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、熱感受性複製の機能を有するポリペプチド(RepAタンパク質)をコードするDNA配列を含む;
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能な温度で該細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能な温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと;
選択培地上で、プラスミド複製にとって許容可能でない温度で該形質転換された細胞を培養して、該選択培地上で該許容可能でない温度で成長することができる形質転換された細胞を選ぶこと
を含む前記方法。 - 該バチルス種が、バチルス スミシー及び/又はバチルス コアギュランスである、請求項1に記載の方法。
- 該バチルス種が、胞子形成欠損性である、請求項1又は2に記載の方法。
- 該バチルス種が、通性嫌気性且つホモ乳酸的である中等度好熱性親バチルス種の中等度好熱性且つ通性嫌気性派生体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該DNAが所望の機能を提供する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- プラスミド複製にとって許容可能でない温度での該培養が、該DNAが該バチルス染色体中へ導入されることを許す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 望ましくない機能が、相同組み換えにより該バチルス染色体から除去される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 相同組み換えにより、所望の機能が該バチルス染色体中に導入され且つ同時に望ましくない機能が該バチルス染色体から除去される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 配列ID NO:2に従うアミノ酸配列又は、R−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するそれと実質的に相同なアミノ酸配列をコードする、該バチルス種中で機能的であるプロモーターに結合されたDNA配列を含むDNA構築物により、S−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を置換することによって該バチルス種が改変される、請求項8に記載の方法。
- 該プロモーターが、除去される内因性S−ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである、請求項9に記載の方法。
- 通性嫌気性且つホモ乳酸的である遺伝子操作された中等度好熱性バチルス株であって、S−ラクテートヒドロゲナーゼをコードするldhL遺伝子が、R−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するNADH−依存性2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子により置換されている、前記中等度好熱性バチルス株。
- 請求項9又は10に記載の方法により得られうる、請求項11に記載の遺伝子操作された中等度好熱性バチルス株。
- R−乳酸及び/またはR−ラクテートの調製方法であって、請求項11又は12の遺伝子操作された通性嫌気性である中等度好熱性バチルス種が用いられる前記方法。
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