ES2821418T3 - Bacteria termófila modificada genéticamente que produce ácido (R)-láctico - Google Patents

Abstract

Una célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética del género Geobacillus que es anaeróbica facultativa que comprende: a. un gen de la (S)-lactato deshidrogenasa endógeno inactivado o suprimido; b. un gen de la (R)-lactato deshidrogenasa no endógeno seleccionado del grupo del gen hdhD de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 38 y el gen IdhA de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 36; c. un gen de la piruvato formiato liasa A y/o B endógeno inactivado o suprimido.

Description

DESCRIPCIÓN

Bacteria termófila modificada genéticamente que produce ácido (R)-láctico

La presente invención se refiere a la modificación de una célula bacteriana termófila para la producción de ácido (R)-láctico homoláctico y enantiopuro, una célula modificada genéticamente y a un procedimiento para producir ácido (R)-láctico puro enantiomérico.

El ácido láctico y sus sales, conocidas como lactatos, son productos comercialmente viables útiles en diferentes campos, incluyendo la medicina, polímeros biodegradables y procesamiento de alimentos. Las bacterias termófilas, tales como las especies de Geobacillus, que son anaerobias facultativas parecen organismos ideales para la fabricación industrial de ácido láctico. Son capaces de crecer a temperaturas de entre 37-75 °C, con un óptimo de 55-65 °C (Nazina y col., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 433-446) y permiten la fermentación industrial anaeróbica a temperaturas por encima de 50 °C. Esta alta temperatura tiene ventajas cuando se fermenta a escala industrial: menor riesgo de infecciones y por tanto mayor pureza enantiomérica, reacciones más rápidas, menores costes de enfriamiento, etcétera. La naturaleza anaeróbica facultativa de los Geobacilli permite la fermentación en condiciones anaeróbicas o al menos bajo una presión parcial de oxígeno baja, lo que es deseable para la escala industrial porque permite un equipo y un procesamiento relativamente económicos. Adicionalmente, los requisitos de nutrientes de estas bacterias son menos exigentes que los de las bacterias de ácido láctico, tales como las especies de Lactobacillus que también permiten procedimientos industriales relativamente económicos.

Las especies de Geobacillus que son anaeróbicas facultativas se conocen por producir ácido láctico cuando crecen en condiciones anaeróbicas o al menos bajo una presión parcial de oxígeno baja. Son ejemplos G. caldotenax, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. kaustophilus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. tepidimans, G. thermodenitrificans, G. thermoglucosidans, G. thermoleovorans, G. toebii, G. tropicalis.

G. thermoglucosidans se conoce por producir ácido láctico a partir de xilosa, arabinosa, glucosa, fructosa, sacarosa y celobiosa (Green y col., 2003, WO03/008601). Para las aplicaciones industriales, las materias primas que contienen sacarosa, glucosa, xilosa o arabinosa o mezclas de las mismas, son las más relevantes. La capacidad de utilizar simultáneamente glucosa y xilosa (Green y col., 2003, WO03/008601) es una ventaja importante para G. thermoglucosidans cuando se utilizan azúcares fermentables derivados de materias primas lignocelulósicas.

Una desventaja de las especies de Geobacillus conocidas que son anaeróbicas facultativas es el hecho de que producen principalmente ácido (S)-láctico y muy poco ácido (R)-láctico. Dado que la aplicación exitosa de polímeros de ácido láctico biodegradables dependerá de la disponibilidad tanto del ácido (S)-láctico económico como del ácido (R)-láctico económico, se requiere una producción rentable de ambos enantiómeros. Las bacterias productoras de ácido (R)-láctico conocidas actualmente son mesofílicas (por ejemplo, Bacillus laevolacticus) o tienen requisitos de nutrientes exigentes (por ejemplo, Lactobacillus delbrueckii), que hace que la fabricación de ácido (R)-láctico sea mucho más costosa que la de ácido (S)-láctico.

Otra desventaja de las especies de Geobacillus conocidas que son anaeróbicas facultativas es el hecho de que generalmente tienen una fermentación ácida mixta, que produce ácido láctico, etanol, ácido acético y ácido fórmico como principales productos de fermentación. En esta solicitud, la expresión ácidos orgánicos quiere decir que incluye también sus sales correspondientes.

Hay una necesidad clara de utilizar cepas bacterianas (por ejemplo, cepas de Geobacillus) para la producción de ácido láctico homoláctico y enantiopuro que tienen características atractivas para la aplicación industrial, tales como las necesidades bajas de nutrientes, amplia capacidad de consumo de azúcares, la capacidad de producir enzimas carbohidrolíticas, tasa de crecimiento alta, productividad alta, resistencia al estrés osmótico y accesibilidad genética.

Uno de los objetos de la presente invención es producir una cepa bacteriana termófila que sea anaeróbica facultativa y que produzca ácido (R)-láctico mediante fermentación homoláctica. Debe entenderse que otras expresiones para el ácido (R)-láctico son ácido D-láctico o ácido D(-)-láctico. En esta solicitud, estas expresiones se utilizan indistintamente. De forma similar, las expresiones ácido (S)-láctico, ácido L-láctico y ácido L(+)-láctico se utilizan indistintamente.

Otro objeto de la presente invención es producir una cepa bacteriana termófila que sea anaeróbica facultativa y que produzca ácido (R)-láctico.

Se ha descrito a G. thermoglucosidans como una especie de Bacillus termófila (Suzuki y col., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4: 487-495; Nazina y col., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 433-446; Coorevits y col., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62: 14770-1485). Previamente, se conocía a G. thermoglucosidans como Bacillus thermoglucosidasius (Suzuki y col., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495), que fue renombrado como G. thermoglucosidasius por Nazina y col. en 2001 (Nazina y col., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446) y más tarde renombrado como G. thermoglucosidans por Coorevits y col., (Coorevits y col., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol.

62: 14770-1485). La cepa tipo se aisló del suelo (Suzuki y col., 1976, Appl. Environ. Microbiol. 31: 807-812). Aunque originalmente se informó que era aeróbica estricta, los estudios posteriores informaron del crecimiento anaeróbico facultativo y de la producción de ácido (S)-láctico (Green y col., 2003, WO 03/008601; Fong y col., 2006, Extremophiles 10: 363-372). El intervalo de temperatura está entre 42 y 69 °C, con un óptimo de 62 °C (Suzuki y col., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4: 487-495). Se ha informado de la modificación genética de cepas de G. thermoglucosidans para producir etanol (Green y col., 2001, WO 01/49865; Atkinson y col., 2008, WO08/038019). Esto incluye la descripción de las herramientas genéticas para DSM 2542T de G. thermoglucosidans y un procedimiento para alterar el gen de la L-lactato deshidrogenasa (Idh) (Atkinson y col., 2006, WO2006/117536 y 2008, WO2008/038019). Se ha informado de rutas y flujos metabólicos para células cultivadas en xilosa y glucosa para M10EXG de G. thermoglucosidans (Tang y col. 2009, Biotechnol. Lett. 102: 1377-1386).

Se ha observado que la inactivación de la lactato deshidrogenasa (IdhL) en las especies de Geobacillus optimiza la producción de etanol (Payton y col., 1985, FEMS Microbiol. Lett. 26: 333-336; Green y col., 2001; Atkinson y col., 2006, WO 2006/117536; Cripps y col., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408). Cripps y col. muestran que los derivados de IdhL- de G. thermoglucosidans NCIMB 11955 muestran una fuerte reducción, pero no una eliminación completa de la producción de ácido láctico en las fermentaciones discontinuas, si bien la producción de etanol, formiato y piruvato se ve aumentada. Una mutación combinada de IdhL y pflB, que codifica la formiato piruvato liasa, elimina la formación de formiato (Cripps y col., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408).

La expresión génica heteróloga parece ser problemática en G. thermoglucosidans. Una enzima funcional de la piruvato descarboxilasa de Zymomonas mobilis solo se produjo cuando se cultivó a 52 °C, una temperatura subóptima para G. thermoglucosidans, pero no a 54 °C, 56 °C o 58 °C (Thompson y col., 2008, Biotechnol. Lett. 30: 1359-1365). La expresión heteróloga del gen de la piruvato descarboxilasa de Gluconobacter oxydans requiere de la armonización de codones para conseguir actividad en G. thermoglucosidans a 45 °C, pero no proporciona actividad a 52 °C (van Zyl y col., 2014, Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 1247-1259).

El documento WO 2005/086670 describe aislados de Bacillus, que pueden convertir una fuente de carbohidratos en ácido láctico. Los aislados crecen a una temperatura de 45 °-60 °C, con un óptimo a 50 °C. Estos aislados son subespecies del termófilo moderado Bacillus coagulans. Van Kranenburg y col. muestran que el moderadamente termófilo Bacillus coagulans se puede utilizar para la producción de ácido (R)-láctico a temperaturas entre 45 °C y 54 °C mediante la supresión del gen nativo de L-lactato deshidrogenasa y su reemplazo con un gen heterólogo de D-lactato deshidrogenasa obtenido a partir de Lactobacillus delbrueckii (van Kranenburg y col., 2007, WO2007/085443). Sin embargo, no se pueden encontrar ejemplos de proteínas heterólogas activas a temperaturas por encima de 52 °C en experimentos de expresión heteróloga de genes de la piruvato descarboxilasa en G. thermoglucosidans, si bien la temperatura óptima para esta especie suele estar normalmente alrededor de 60 °C. Además, no se sabe si la D-lactato deshidrogenasa de L. delbrueckii está activa a 60 °C.

Los inventores han descubierto que una célula bacteriana termófila se puede utilizar para la producción de ácido (R)-láctico mediante la alteración del gen endógeno IdhL de la lactato deshidrogenasa y la introducción de un gen que codifica la actividad de D-lactato deshidrogenasa. Los presentes inventores han introducido independientemente el gen IdhA (SEQ ID NO: 35) y el gen hdhD (SEQ ID NO: 37) de un aislado de L. delbrueckii, codificantes ambos de la actividad D-lactato deshidrogenasa. Los expertos en la materia saben que otros genes que codifican la actividad D-lactato deshidrogenasa que se expresan funcionalmente en G. thermoglucosidans se pueden utilizar en su lugar.

Las especies de Geobacillus que son anaerobias facultativas muestran fermentaciones ácidas mixtas con ácido láctico, etanol, ácido acético y ácido fórmico como productos principales. La alteración de los genes que codifican enzimas esenciales en la producción de subproductos es un enfoque común para mejorar la producción de un producto deseado. Sin embargo, los efectos de la alteración de un gen específico pueden tener diferentes efectos secundarios dependiendo del metabolismo general del hospedador. Las mutaciones únicas en pflA de Escherichia coli, que codifica una enzima activadora de piruvato-formiato liasa y adhE, que codifica el complejo bifuncional acetaldehído-CoA/alcohol deshidrogenasa, dan como resultado una producción mejorada de ácido láctico con un aumento concomitante de la formación de subproductos de piruvato, producción residual de ácido acético y etanol y rendimiento de biomasa fuertemente reducido (pflA-) o producción mejorada de ácido láctico con ácido acético como producto principal de fermentación (adhE-) (Zhu y Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7: 104-115). En varias cepas de E. coli el locus focA-pflAB se ha alterado para eliminar la producción de ácido fórmico (Zhou y col., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 2237-2244; Liu y col., 2011, Appl. Biochem. Biotechnol. 164: 162-169). La importancia de focA, que codifica una proteína del canal de formiato, en la acumulación de ácido láctico en el medio se ha demostrado recientemente (Beyer y col., 2013, J. Bacteriol. 195:1428-1435), por lo que estará contribuyendo a que los fenotipos de las cepas de E. coli tengan deleciones de focA-pflAB. En el alga verde Chlamydomonas reinhardtii las desactivaciones de los genes que codifican la piruvato formiato liasa y la alcohol deshidrogenasa mejoraron la fermentación del ácido láctico, pero también aumentaron las concentraciones extracelulares de glicerol y de acetato (Catalanotti y col., 2012, Plant Cell 24: 692-707).

En G. thermoglucosidans los genes de pflBA se orientan de forma convergente hacia el gen adhE. Por cuestiones prácticas, los presentes inventores decidieron alterar pflA, pflB y adhE mediante la supresión de pflBA y de parte de adhE en una modificación. Sorprendentemente, los presentes inventores estuvieron cerca de poder suprimir la formación de subproductos de etanol, ácido acético y ácido fórmico sin afectar a otros subproductos y sin afectar al rendimiento de la fermentación del ácido láctico. Por ejemplo, en la presente solicitud, que la formación de subproductos está casi suprimida significa que al fermentar una célula modificada por ingeniería genética como se describe en el presente documento, la cantidad en peso de subproductos (tales como etanol, ácido acético y ácido fórmico) con respecto a la cantidad total de ácido láctico producido es de no más de un 10% (p/p) y en particular, no más de un 5%, un 4 %, un 3% o un 2% (p/p). La cantidad de ácido láctico y de subproductos se puede determinar por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por derivatización y análisis por cromatografía gas-líquido (GLC; del inglés, gas-liquid chromatography) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC; del inglés, highperformance liquid chromatography).

Existen varias opciones que pueden dar como resultado impurezas quirales en la producción de ácido láctico descritas en la literatura. El ácido (R)-láctico se puede formar a partir de piruvato por la actividad de una D-lactato deshidrogenasa, se puede formar a partir de ácido (S)-láctico por la actividad de una lactato racemasa o se puede formar a través de la ruta del metilglioxal. El ácido (S)-láctico se puede formar a partir de piruvato por la actividad de una L-lactato deshidrogenasa, se puede formar a partir de ácido (R)-láctico por la actividad de una lactato racemasa o se puede formar a través de la ruta del metilglioxal.

La metilglioxal sintasa (CE 4.2.99.11) cataliza la conversión de fosfato de dihidroxiacetona en metilglioxal y ortofosfato en la primera etapa de la derivación del metilglioxal. A continuación, el metilglioxal se puede convertir a través de dos rutas diferentes en ácido (S)- o (R)-láctico. Por tanto, la derivación de metilglioxal podría ser una fuente de contaminación quiral para la producción de ácido tanto (S)- como (R)-láctico. En la bacteria mesófila Gram negativa Escherichia coli la alteración del gen mgsA que codifica la metilglioxal sintasa mejoró la pureza quiral para la producción de ácido tanto (S)- como (R)-láctico (Grabar y col., 2006, Biotechnol. Lett. 28: 1527-1535). En las Gram positivas, se sabe poco sobre la actividad de la ruta del metilglioxal. En el mesófilo Bacillus subtilis el gen mgsA está codificado en un operón junto con genes que codifican las dos primeras enzimas en la biosíntesis de bacilitiol (Gaballa y col., 2010, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 107: 6482-6486; Helmann, 2011, Antioxidants and Redox signaling 15: 123-133). Recientemente, Chandrangsu y col. han demostrado que el bacilitiol está implicado en la destoxificación del metilglioxal (Chandrangsu y col., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715). La ruta del metilglioxal dependiente de bacilitiol utiliza glioxalasa I (GlxA) y glioxalasa II (FlxB) para convertir el metilglioxal en ácido (R)-láctico (Chandrangsu y col., 2014). Además, el metilglioxal se puede convertir en ácido (R)-láctico por la actividad de YdeA, YraA e YfkM, homólogos previstos de glioxalasa III (Chandrangsu y col., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715). No hay informes sobre la producción de ácido (S)-láctico por la ruta del metilglioxal en bacterias Gram positivas.

Basándose en la información del genoma, podría esperarse que la producción de ácido (S)-láctico no la causa una lactato racemasa, para la cual no se encuentra ningún homólogo, ni por la ruta del metilglioxal, que parece incompleta y que no se conoce que produzca ácido (S)-láctico en organismos Gram positivos. Sorprendentemente, la cantidad mínima de ácido (S)-láctico producida en una cepa de Geobacillus productora de ácido (R)-láctico que se modificó mediante la alteración del gen IdhL de la L-lactato deshidrogenasa endógeno e introduciendo un gen que codifica la actividad D-lactato deshidrogenasa, se podría reducir adicionalmente mediante la alteración del gen mgsA, previsto como codificador de la metilglioxal sintasa.

La deficiencia de esporulación es una propiedad deseada para la aplicación industrial de las especies de Bacillus. De acuerdo con la Directiva 2009/41/CE del Parlamento Europeo y del Consejo del 6 de mayo de 2009 sobre el uso confinado de microorganismos modificados genéticamente, los usos confinados de microorganismos modificados genéticamente deben clasificarse respecto al riesgo que presentan para la salud humana y el medio ambiente. Tener un fenotipo deficiente en esporulación para las especies de Bacillus se observa como un medio para minimizar el riesgo de propagación en el medio ambiente. Se conocen diferentes procedimientos para obtener fenotipos deficientes en esporulación, incluida la selección de derivados espontáneos deficientes en esporulación (Green y col., 2001, WO01/49865) o la alteración dirigida de la ruta de esporulación, por ejemplo, alterando el spo0A (Gonzy-Tréboul y col., 1992, J. Mol. Biol. 244: 967-979; Atkinson y col., 2010, WO2010/052499) o el sigF (Fleming y col., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 3775-3780; Wang y col., 2005, J. Appl. Microbiol. 98: 761-767; Kovács y col., 2010, Appl. Environ. Microbiol. 76: 4085-4088).

Por tanto, en un primer aspecto, la invención desvela una célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética según la reivindicación 1 que es anaeróbica facultativa que comprende

a) un gen de la (S)-lactato deshidrogenasa endógeno inactivado o suprimido;

b) un gen no endógeno de la (R)-lactato deshidrogenasa;

c) un gen de la piruvato formiato liasa A y/o B endógeno inactivado o suprimido.

Los genes endógenos son genes que están presentes en un microorganismo. No es necesario comentar que una bacteria como se describe en el presente documento en la que un gen está inactivado o suprimido requiere que el gen esté presente de forma inherente en la bacteria. En ausencia de una indicación de lo contrario, en la presente solicitud cualquier referencia a un gen significa un gen endógeno. Los genes que se introducen en un microorganismo, como un gen de la (R)-lactato deshidrogenasa introducido en células bacterianas como se describe en el presente documento, no son genes endógenos.

En la presente especificación la secuencia de nucleótidos del gen de la (S)-lactato deshidrogenasa (IdhL) se proporciona en la SEQ ID NO: 47 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 48: Las regiones de nucleótidos que flanquean a IdhL se pueden identificar mediante los cebadores corriente abajo de las SEQ ID NO: 11 y 12 y los cebadores corriente arriba de las secuencias SEQ ID NO: 13 y 14 para Geobacillus thermoglucosidans.

Los genes adecuados que codifican para la actividad (R)-lactato deshidrogenasa son aquellos genes que codifican una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 o 38 o genes homólogos que codifican una secuencia de aminoácidos que muestra un grado de identidad de al menos un 90%, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 o 38, preferentemente un 95 %, más preferentemente al menos un 98% y aún más preferentemente al menos un 99% de grado de identidad. La actividad (R)-lactato se puede demostrar mediante la sobreexpresión del gen en un hospedador adecuado y la cuantificación posterior de la actividad de la enzima de (R)-lactato en el extracto celular mediante la utilización de un ensayo enzimático o se puede demostrar por la capacidad de complementar un mutante de ldha de E. coli, tal como E. coli FMJ144. Tales secuencias homólogas pueden abarcar polimorfismos que pueden existir en células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a la variación natural o intracepa. Un homólogo puede derivarse adicionalmente de especies distintas de la especie en la que se origina el ADN o la secuencia de aminoácidos especificada o se puede diseñar y sintetizar artificialmente. Las proteínas identificadas por las SEQ ID NO: 36 y 38 están codificadas por los genes IdhA y hdhD de Lactobacillus delbrueckii. Ambos genes codifican una actividad D-lactato deshidrogenasa.

En una realización de acuerdo con la presente invención, la célula modificada por ingeniería genética comprende un gen de (R)-lactato deshidrogenasa que es el gen hdhD de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, preferentemente un 95 % de identidad, más preferentemente al menos un 98% y aún más preferentemente al menos un 99% de grado de identidad.

En otra realización de acuerdo con la presente invención, la célula modificada por ingeniería genética comprende un gen de (R)-lactato deshidrogenasa que es el gen IdhA de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, preferentemente un 95 % de identidad, más preferentemente al menos un 98 % y todavía más preferentemente al menos un 99 %.

En todavía otra realización, el gen hdhD en la célula de acuerdo con la invención codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.

En todavía otra realización, el gen IdhA en la célula de acuerdo con la invención codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36.

En otra realización de acuerdo con la presente invención, la célula modificada por ingeniería genética comprende el gen hdhD de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 37.

En de nuevo otra realización, la célula modificada por ingeniería genética comprende el gen IdhA de acuerdo con la secuencia de nucleótidos en la SEQ ID NO: 35.

En una realización preferida el gen de piruvato-formiato liasa endógeno se activa mediante la inactivación o la supresión del locus pflBA-adhE de la piruvato-formiato liasa/alcohol deshidrogenasa. Como alternativa, el gen A y/o B de la piruvato liasa endógeno y los genes de la alcohol deshidrogenasa endógenos adhE se pueden inactivar o suprimir en etapas separadas. Las regiones de nucleótidos que flanquean pflBA-adhE pueden identificarse mediante los cebadores de Pc R de las SEQ ID NO: 19-21.

En la presente memoria descriptiva con pflBA significa los genes A y B de la piruvato-formiato liasa, que codifican la enzima que activa la piruvato-formiato liasa y la piruvato formiato liasa, respectivamente.

plfA se refiere al gen de la piruvato formiato liasa A (que codifica la enzima activadora de la piruvato formiato liasa), cuya secuencia se proporciona en la SEQ ID NO: 39 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 40. plfB se refiere al gen de la piruvato formiato liasa B (que codifica la piruvato formiato liasa), cuya secuencia de nucleótidos se proporciona en la SEQ ID NO: 41. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 42. En la presente invención adhE se refiere al gen E de la alcohol deshidrogenasa, que codifica el complejo bifuncional acetaldehído-CoA/alcohol deshidrogenasa, cuya secuencia de nucleótidos se proporciona en la SEQ ID NO: 43 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

En una realización preferida, la inactivación mediante el gen de la piruvato-formiato liasa se inactiva mediante la inactivación o la supresión del locus pflBA-adhE de la piruvato-formiato liasa/alcohol deshidrogenasa. Como alternativa, el gen A y/o B de la piruvato liasa y los genes adhE de la alcohol deshidrogenasa se pueden inactivar o suprimir en etapas separadas.

En la presente invención, las regiones de nucleótidos que flanquean adhE pueden identificarse mediante los cebadores de PCR de las SEQ ID NO: 9 y 10 para Geobacillus thermoglucosidans.

En otra realización de acuerdo con la presente invención, en la célula modificada por ingeniería genética también el gen endógeno de la metilglioxal sintasa (mgsA) está desactivado o suprimido.

En la presente memoria descriptiva, las regiones de nucleótidos que flanquean mgsA pueden identificarse mediante los cebadores de PCR de las SEQ ID NO: 21-24 para Geobacillus thermoglucosidans.

La secuencia de nucleótidos de mgsA se proporciona en la SEQ ID NO: 45 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 46.

En otra realización de acuerdo con la presente invención, en la célula modificada por ingeniería genética también el gen de la fosfotransacetilasa (pta) está desactivado o suprimido. La secuencia de nucleótidos de pta se proporciona en la SEQ ID NO: 49 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: 50. La inactivación o eliminación de pta (que codifica la fosfotransacetilasa) minimiza adicionalmente la producción de acetato remanente asociada a la actividad de pta endógena. La cepa resultante (con pta inactivada o suprimida) es auxótrofa para el ácido acético. En consecuencia, cuando se fermentan estas células modificadas por ingeniería genética, el medio de crecimiento debe complementarse con ácido acético.

En todavía otra realización de acuerdo con la presente invención, la célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética además se vuelve deficiente en esporulación por inactivación o supresión de un gen de esporulación endógeno.

En otra realización el gen de esporulación inactivado o suprimido es sigF.

sigF se refiere a un gen de esporulación cuya secuencia de nucleótidos se proporciona en la SEQ ID NO: 51 para Geobacillus thermoglucosidans. La secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en la SEQ ID NO: :52. Las regiones de nucleótidos que flanquean sigF pueden identificarse mediante los cebadores de PCR de las SEQ ID NO: 3-6.

En todavía otra realización, la célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética de acuerdo con la presente invención es una célula bacteriana Gram positiva. Preferentemente la célula pertenece al género Bacillus, más preferentemente a Geobacillus.

En de nuevo otra realización, la célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética de acuerdo con la presente invención es Geobacillus thermoglucosidans.

Uno de los objetos de la presente invención es producir una cepa de Geobacillus que sea anaeróbica facultativa y que produzca ácido (R)-láctico por fermentación homoláctica.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención desvela un procedimiento para la modificación genética de las especies de Geobacillus moderadamente termófilas que son anaeróbicas facultativas y homolácticas mediante ingeniería genética.

En la presente invención la fermentación homoláctica se define mediante la producción de ácido láctico a partir de fuentes de hidrocarburos con la formación de no más de un 15% (p/p), preferentemente no más de un 10% (p/p) y más preferentemente no más de un 5%, un 4 %, un 3% o un 2% (p/p) de subproductos tales como el ácido fórmico, ácido acético y etanol. Este porcentaje se refiere al peso total de subproductos sobre el peso total de ácido láctico (incluyendo el ácido (R)-láctico y cualquier ácido (S)-láctico que pueda estar presente). La cantidad de ácido láctico y etanol, ácido acético y ácido fórmico se puede determinar por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por derivatización y análisis por cromatografía gas-líquido (GLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). En varias realizaciones, la cantidad formada de al menos uno de ácido fórmico, etanol y ácido acético no es más de un 5% (p/p), basado en el peso total de ácido fórmico, etanol o ácido acético sobre el peso total de ácido láctico producido, en particular no más de un 2%, un 1 %, un 0,25 % o un 0,1 % (p/p). En otras palabras, la cantidad en peso de ácido fórmico formado en la fermentación homoláctica puede ser, por ejemplo, de no más de un 5 % (p/p) y más en particular no más de un 2 %, un 1 %, 0,25 % o 0,1 % (p/p) relativo a la cantidad del peso total de ácido láctico. De manera similar la cantidad de peso de etanol puede ser de no más de un 5 %, un 2 %, un 1 %, un 0,25 % o un 0,1 % (p/p) y la cantidad ácido acético puede ser de no más de un 5 %, un 2 %, un 1 %, un 0,25 % o un 0,1 % (p/p).

La pureza quiral es un aspecto importante para la producción de polímeros de ácido poliláctico. Por tanto, es esencial producir ácido (R)-láctico enantiopuro para aplicaciones comerciales.

Por tanto, la presente invención proporciona también una célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética que produce ácido (R) -láctico con una pureza enantiomérica de al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99,5 %, un 99,8 % o un 99,9 %.

En un aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para producir ácido láctico puro enantiomérico. El procedimiento comprende las etapas de: cultivar una célula bacteriana termófila de acuerdo con la presente invención utilizando materia prima que contiene carbono fermentable adecuado y aislar el ácido (R)-láctico.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir ácido láctico puro enantiomérico en el que la materia prima que contiene carbono comprende xilosa, glucosa o sacarosa.

La temperatura del cultivo se realiza preferentemente a una temperatura de entre 50 °C y 70 °C, más preferentemente de entre 55 y 65 °C.

En el contexto de la invención, la inactivación o supresión de un gen puede ser la modificación de un gen que codifica un polipéptido deseado para que se produzca por la célula y/o un gen que codifica un polipéptido implicado en la producción de un metabolito primario o secundario por la célula. En principio, esto se puede hacer disminuyendo los niveles celulares de la proteína codificada. La disminución de los niveles celulares puede efectuarse, por ejemplo, mediante la inactivación dirigida del gen que codifica la enzima de interés. El gen se puede eliminar en su totalidad. Sin embargo, como alternativa, la supresión de parte del gen también podría dar como resultado una reducción de la actividad de la proteína codificada. Alternativa o adicionalmente, las secuencias de nucleótidos responsables de la regulación o expresión de los genes tales como los potenciadores de promotores, sitios iniciadores de traducción y similares se pueden modificar o eliminar. Otra forma de influir en la actividad de la proteína de interés podría ser la modificación de las señales de transporte, si fuera necesario, o la introducción de ARN antisentido.

Se prefiere la modificación cromosómica, dado que la modificación cromosómica asegurará una distribución estable de la funcionalidad del gen sobre las células de la descendencia. La eliminación de una funcionalidad deseada en el cromosoma puede realizarse con recombinación no homóloga así como con recombinación homóloga. Se prefiere la recombinación homóloga, ya que abre la oportunidad de introducir, eliminar o introducir y eliminar simultáneamente una funcionalidad.

Cuando se pretende una recombinación homóloga, el ADN transformante contiene además una secuencia de ADN que es homóloga a una secuencia diana genómica de la célula específica que se va a diseñar. El experto en la materia entenderá que no se requiere una identidad del 100% para obtener una recombinación homóloga. Un porcentaje de identidad de un 80%, preferentemente un 90 %, un 95 % o un 98 % será suficiente también. El más preferido es un 99 %. Habitualmente, la secuencia de ADN de interés para insertar en el cromosoma mediante recombinación homóloga está flanqueada por secuencias homólogas con una longitud suficiente para permitir la recombinación homóloga. Tal longitud puede ser de al menos aproximadamente 200 pb, por ejemplo entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1500 pb, preferentemente entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1000 pb.

Para el fin de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se refiere al porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias. El grado de identidad se determina utilizando el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, y col., J. Mol. Biol. 215: 403 -410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La configuración por defecto para los parámetros del algoritmo Blastp son un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 3, máximos aciertos en un intervalo de búsqueda de 0, la matriz es BLOSUM62, los costes del espacio tienen una existencia de 11 y una extensión de 1, ajustes de composición en ajuste de matriz de puntuación de composición condicional.

Para el fin de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se refiere al porcentaje de nucleótidos que son idénticos entre las dos secuencias. El grado de identidad se determina utilizando el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, y col., J. Mol. Biol. 215: 403 -410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nim.nih.gov/). La configuración por defecto para los parámetros del algoritmo Blastn son un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 28, máximos aciertos en un intervalo de búsqueda de 0, puntuaciones de acierto/desacierto de 1, -2, Costes de brecha en Lineal.

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, ninguna de las secuencias que identifican los genes anteriores en Geobacillus thermoglucosidans necesitan ser un 100% idénticas para poder modificar el gen de interés mediante ingeniería genética. Adicionalmente, en células bacterianas termófilas relacionadas de otras especies, los genes podrían desviarse de estas secuencias. Sin embargo, haciendo uso de las secuencias génicas de Geobacillus thermoglucosidans homólogas a estos genes y que tienen la misma funcionalidad, pueden identificarse fácilmente por los expertos en la materia y pueden prepararse los cebadores correspondientes para realizar la recombinación homóloga en estas cepas. Por tanto, incluso si existen desviaciones de las secuencias de los genes identificados anteriormente en una determinada cepa, se pueden identificar genes homólogos fácilmente. Su secuencia de nucleótidos se puede determinar utilizando tecnologías conocidas en la técnica y si fuera necesario, se puede definir un nuevo conjunto de cebadores idénticos o complementarios a las secuencias de genes flanqueantes.

De acuerdo con la presente invención, las células se pueden preparar utilizando tecnologías conocidas en la técnica. En particular, se han descrito procedimientos para introducir ADN en bacterias termófilas mediante electroporación por Van Kranenburg y col., 2007, WO2007/085433 y Cripps y col. 2009, Metab. Eng. 11: 398-408.

La transformación de estas especies de Bacillus mediante electroporación se puede lograr mediante una descarga de alto voltaje a través de una suspensión que contiene una especie de Bacillus moderadamente termófila que es anaeróbica facultativa y homoláctica y un ADN transformante adecuado, que comprende la funcionalidad deseada y/o secuencias de ADN homólogas a secuencias genómicas de los Bacilli específicos.

El ácido (R)-láctico se puede obtener fermentando una célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética como se describe en el presente documento en presencia de una fuente de carbohidratos (por ejemplo, glucosa y/o xilosa) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Durante la fermentación, el ácido láctico excretado por los microorganismos habitualmente se neutraliza utilizando una base, por ejemplo, sales básicas de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como hidróxidos, carbonatos y/o hidrogenocarbonatos de sodio, potasio, magnesio y/o calcio. Habitualmente se prefieren las bases de magnesio, por ejemplo, el hidróxido magnésico, el carbonato magnésico y/o el hidrogenocarbonato magnésico. En consecuencia, en varios aspectos la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido (R)-láctico puro enantiomérico, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula bacteriana termófila como se describe en el presente documento en presencia de una base de magnesio (por ejemplo, seleccionada de al menos una de hidróxido magnésico, carbonato magnésico e hidrogenocarbonato magnésico) utilizando una materia prima que contiene carbono fermentable adecuado y aislando el ácido (R)-láctico.

Después de la fermentación, el ácido (R)-láctico (o una sal del mismo) se separa del caldo de fermentación mediante cualquiera de las muchas técnicas convencionales conocidas para separar el ácido láctico y/o lactato de soluciones acuosas. Las partículas de sustrato o microorganismos (la biomasa) pueden eliminarse antes de la separación para mejorar la eficacia de la separación. Dicha separación se puede realizar mediante centrifugación, filtración, floculación, flotación o filtración por membrana. Esto se conoce, por ejemplo, a partir del documento WO 01/38283, en el que se describe un procedimiento continuo para la preparación de ácido láctico mediante fermentación. Si bien la discusión de la fermentación en esta especificación generalmente se refiere a un procedimiento discontinuo, una parte o todo el procedimiento completo se puede realizar de forma continua.

Después de la separación del ácido (R)-láctico (o una sal del mismo) del caldo de fermentación, el producto puede someterse a una o más etapas de purificación tales como extracción, destilación, cristalización, electrodiálisis, filtración, tratamiento con intercambio iónico de carbono activado, etcétera. Las diversas corrientes residuales pueden reciclarse, opcionalmente después del tratamiento, en el recipiente de fermentación o en cualquier etapa de purificación realizada previamente.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Cepas y plásmidos

Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.

Escherichia coli se cultivó de forma rutinaria en caldo LB (Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) a 37 °C en condiciones aeróbicas. Cuando fue apropiado, se utilizó cloranfenicol y/o ampicilina en concentraciones de 20 mg/l y 100 mg/l, respectivamente.

L. lactis se cultivó de forma rutinaria en caldo M17 ® (BD Biosciences) complementado con glucosa al 0,5% a 30 °C en condiciones anaeróbicas. Cuando fue apropiado, se utilizó cloranfenicol a una concentración de 5 mg/l.

G. thermoglucosidans se cultivó de forma rutinaria en medio TGP a 52 °C, 55 °C o 60 °C en condiciones aeróbicas, a menos que se indique de otro modo. El medio TGP (Taylor y col., 2008, Plasmid 60:45-52) contenía 17 g/l de triptón, 3 g/l de peptona de soja, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de K2HPO4 a pH 7,0 y adiciones postautoclave de 4 ml/l de glicerol y 4 g/l de piruvato sódico. Para las placas de TGP se utilizó 10 g/l de agar. Cuando fue apropiado, el medio se complementó con cloranfenicol (8 pg/ml).

Tabla 1. Cepas y plásmidos utilizados en este estudio

Cepa o plásmido Características relevantes Fuente o referencia

Cepas

E. coli TG90 Cepa libre de plásmidos Gonzy-Treboul, G., Karmzyn-Campelli, C., Stragier, P. 1992. J. Mol. Biol. 224: 967-979 E.coli DH5a Cepa libre de plásmidos ZymoResearch

L. lactis MG1363 Cepa libre de plásmidos Gasson, M.J. 1983. J. Bacteriol.

154: 1-9

G. thermoglucosidans Cepa tipo de G. thermoglucosidans DSMZ, Braunschweig DSM2542

G. thermoglucosidans G. thermoglucosidans deficiente en Este trabajo

DSM2542 A sigF esporulación

G. thermoglucosidans G. thermoglucosidans que produce ácido (R)- Este trabajo

DSM2542 A sigF, A láctico deficiente en esporulación

ldhL::hdhD

(continuación)

Cepa o plásmido Características relevantes Fuente o referencia

Cepas

G. thermoglucosidans DSM G. thermoglucosidans que produce ácido (R)- Este trabajo

2542 A sigF, AldhL::hdhD, A láctico deficiente en esporulación, quiral puro y

pflBA-A adhE homoláctico

G. thermoglucosidans DSM G. thermoglucosidans que produce ácido (R)- Este trabajo

2542 AsigF, AldhL::hdhD, A láctico deficiente en esporulación, quiral puro y

pflBA-A adhE, A mgsA homoláctico

G. thermoglucosidans DSM G. thermoglucosidans que produce ácido (R)- Este trabajo

2542 AsigF, AJdhL::ldhA, A láctico deficiente en esporulación y homoláctico

pflBA-A adhE

G. thermoglucosidans DSM G. thermoglucosidans que produce ácido (R)- Este trabajo

2542 AsigF, AdhL::ldhA, láctico deficiente en esporulación, quiral puro y

A pflBA-A adhE, A mgsA homoláctico

Plásmidos

pNW33N 4,2 kb, CmR, vector lanzadera de E. Bacillus Genetic Stock Centre coli/Geobacillus

pNZ124 2,8 kb, CmR, vector lanzadera de E. coli/Gram Platteeuw, C., G. Simons y W.

positivos M. de Vos. 1994. Appl. Environ.

Microbiol. 60: 587-593 pRM3 6,2 kb, CmR, derivado de pNW33n con las Este trabajo

regiones corriente arriba y corriente abajo de

sigF de G. thermoglucosidans

pRM12 6,4 kb, CmR, derivado de pNW33n con las Este trabajo

regiones corriente arriba y corriente abajo del

locus pflBA-adhE de G. thermoglucosidans

pJS65 6,3 kb, CmR, derivado de pNZ124 con ldhA de Este trabajo

L. delbruecki flanqueado por las regiones

corriente arriba y corriente abajo de IdhL de G.

thermoglucosidans

pFS3 7,9 kb, CmR, derivado de pNW33n con hdhD de Este trabajo

L. delbruecki flanqueado por las regiones

corriente arriba y corriente abajo de IdhL de G.

thermoglucosidans

pJS43 6,4 kb, CmR, derivado de pNW33n con las Este trabajo

regiones corriente arriba y corriente abajo de

mgsA de G. thermoglucosidans

Técnicas de manipulación de ADN

Las técnicas de manipulación de ADN estándar se realizaron como describen Sambrook y Russell (Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).

La construcción de derivados de pNW33N se realizó en E. coli.

El aislamiento del ADN plasmídico de E. coli a gran escala a partir de 100 ml de cultivo se realizó utilizando el kit Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit® (Genomed) siguiendo las instrucciones del fabricante. El aislamiento del ADN plasmídico de E. coli a pequeña escala a partir de 1 ml de cultivo se realizó utilizando el kit Nucleospin Plasmid Quick Pure® (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se prepararon células competentes de E. coli utilizando cloruro cálcico y se transformaron mediante choque térmico como describen Sambrook y Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).

La construcción de derivados de pNZ124 se realizó en L. lactis.

El aislamiento del ADN plasmídico de L. lactis a partir de 100 ml de cultivo se realizó utilizando el kit Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit® (Genomed). El sedimento celular se resuspendió en 10 ml de tampón E1 modificado (Tris/HCL 10 mM pH8; NaCl 50 mM; EDTA 10 mM; sacarosa al 20%; lisozima 4 g/l (Sigma Aldrich)) y se incubó a 50 °C durante 1 hora. Posteriormente, se siguieron las instrucciones del fabricante desde la lisis celular en adelante.

L. lactis se transformó mediante electroporación como describen Holo y Nes (Holo, H. y I. F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55: 3119-3123).

Las reacciones de PCR con fines de clonación se realizaron con la polimerasa Pwo de alta fidelidad (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para el análisis de colonias por PCR, las colonias se recogieron con un palillo de dientes y se transfirió un poco de material celular a un tubo de reacción de PCR. Las células se rompieron mediante 1 min de incubación a 1000 W en un horno microondas. Se prepararon mezclas de reacción de PCR de 25 pl con ADN polimerasa de DreamTaq™ (Thermo Scientific™) según lo recomendado por el fabricante y se agregaron a los tubos de reacción con las células rotas.

Electroporación de G. thermoglucosidans

G. thermoglucosidans se transformó mediante electroporación, basándose en el protocolo descrito por Cripps y col. (Cripps, y col., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408). G. thermoglucosidans se cultivó durante la noche a 55 °C y se utilizó 1 ml para inocular 50 ml de medio TGP precalentado en un matraz cónico de 250 ml con tabiques deflectores. Las células se incubaron a 60 °C (180 rpm) hasta que la OD600 fue “ 1,0. El matraz se enfrió en hielo durante 10 min y las células sedimentaron mediante centrifugación (4 °C). A continuación, las células se lavaron cuatro veces con tampón de electroporación helado (sorbitol 0,5 M, manitol 0,5 M, glicerol al 10% (v/v)). Los volúmenes de las etapas de lavado fueron 50 ml, 25 ml, 10 ml y 10 ml. El sedimento final se resuspendió en 1,3 ml de tampón de electroporación helado y se almacenaron alícuotas de 60 pl de células electrocompetentes a -80 °C o se utilizaron directamente para la electroporación.

Una alícuota de 60 pl de células electrocompetentes (descongeladas) se mezcló con 1-2 pg de ADN plasmídico y posteriormente se transfirió a una cubeta de electroporación enfriada (anchura de rendija de 0,1 cm). Las condiciones de electroporación usando un electroporador generador de pulsos de genes Bio-Rad fueron 2,5 kV, 10 pF y 6000. Tras la electroporación las células se transfirieron a 1 ml de TGP precalentado (52 °C) en un tubo de plástico de 50 ml y se recuperaron a 52 °C, 180 rpm durante dos horas. La suspensión celular recuperada se sedimentó y se descartó toda excepto 150 pl del sobrenadante. El sedimento se resuspendió en el sobrenadante restante. Se sembraron volúmenes de 1/10 y 9/10 en placas de TGP que contenían 8 pg/l de cloranfenicol. Las placas se incubaron a 52 °C durante 24-48 horas. Las colonias que aparecieron en las placas se transfirieron a una placa de TGP nueva que contenía 8 pg/l de cloranfenicol y se incubaron a 55 °C durante la noche. Las que crecieron se analizaron para determinar la presencia del plásmido mediante PCR de colonias utilizando los cebadores 1 y 2 (Tabla 2).

Integración

El vector lanzadera pNW33n de Geobacillus-E.coli se utilizó como vector de integración en G. thermoglucosidans como se describió anteriormente (Cripps y col., 2009, Metab. Eng. 11: 398-408). Se inocularon 20 ml de TGP que contenían 8 pg/ml de cloranfenicol con cepas transformadas de una solución madre de glicerol. Después de un crecimiento durante la noche a 55 °C, 180 rpm, se sembraron diluciones apropiadas en placas de TGP que contenían 8 pg/ml de cloranfenicol. A continuación, estas placas se incubaron a 68 °C durante 24 h. Las colonias individuales se sembraron en una placa nueva (incubadas a 52 °C) y se llevó a cabo una PCR de colonias en estas colonias para identificar una colonia con un solo cruzado. Se utilizaron las combinaciones de cebadores apropiadas para identificar cruzados únicos a través del fragmento corriente arriba o corriente abajo (Tabla 2; combinaciones de cebadores 655-170 y 656-571 para la integración de pRM3, combinaciones de cebadores 744-170 y 808-571 para la integración de pRM12, combinaciones de cebadores 629-170 y 630-571 para la integración de pFS3, combinaciones de cebadores 754-170 y 991-571 para la integración de pJS43, respectivamente). A continuación, se aisló el ADN cromosómico de las colonias positivas utilizando el kit de purificación de ADN Gram positivo Masterpure (Epicenter Biotechnologies) y para confirmar los resultados de la ^pC^r de colonias, se repitió la PCR descrita anteriormente sobre el ADN cromosómico aislado. Se seleccionaron un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente arriba y un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente abajo para la segunda etapa de recombinación.

Para obtener un cruzado doble, los integrantes primarios se subcultivaron varias veces en TGP sin cloranfenicol. Las diluciones apropiadas (10‘4, 10'5, 10'6) se sembraron en placas de TGP. Las colonias aisladas se transfirieron a una placa de TGP con y una sin 8 pg/ml de cloranfenicol. Los mutantes de cruzado doble son sensibles al cloranfenicol. Se usó un análisis de PCR que utiliza las combinaciones de cebadores apropiadas (Tabla 2; combinaciones de cebadores 655-656 para AsigF, 744-808 para ApflBA-adhE y 754-991 para AmgsA) para discriminar el tipo silvestre de los mutantes de supresión y para verificar la ausencia del plásmido. Todas las modificaciones se confirmaron mediante la secuenciación de los productos de PCR.

El vector de clonación pNZ124 de Lactococcus se utilizó como vector de integración en G. thermoglucosidans para IdhA. Las células competentes de G. thermoglucosidans recién preparadas con eficiencia de transformación relativamente alta (al menos 103 UFC/pg de pNW33n) se transformaron con 2 pg de ADN plasmídico de pJS65. Las placas de transformación se incubaron 16 horas a 60 °C, 8 horas a 68 °C y 20 horas a 55 °C. Las colonias individuales se sembraron en una placa fresca (incubadas a 52 °C) y se llevó a cabo una PCR de colonias en estas colonias para identificar una colonia con un solo cruzado. Se utilizaron las combinaciones de cebadores apropiadas para identificar cruzados únicos a través del fragmento corriente arriba o corriente abajo (Tabla 2; combinaciones de cebadores 1539-205 y 204-630).

Tabla 2. Cebadores utilizados en este estudio

SEQ ID NO ID del Secuencia (5'-3')1

cebador

1 1 TCGCCTT CTT CT GTGTCATC

2 2 CTGGAGGAGAGCAATGAAAC

3 651 GCGCGGGT ACCCAGCAAACCGAGCGGAAT CAG

4 652 GCGCGGTCGACGGATGGGTAGGCATCCATTC

5 653 GCGCGGTCGACGTCTCCCTTAGTTACATAACGC

6 654 GCGCGAAGCTT GCTTCGCAGTCCAATCGTCGC

7 739 GCGCGGGATCCCCCAAATGGCATTACCGGTGTG

8 805 T GTT ATTGCT GGCAGTTTCCCTCCCATGCATCTG

9 806 GGAGGGAAACTGCCAGCAATAACACCAACAGGCTC

10 807 GCGCGCTGCAGCGAAAGCGAACGAAATT GCCAAC

11 624 GCGCGGTCGACCTGACTTT GAAT ACAACAAGGTGAAC

12 631 GCGCGGCAT GCCGGCAAACAGAGCTTT AAAACCAGGC

13 1200 CCCGCATGCTTAGCCAACCTTAACTGGAGTTTCAG

14 676 TTTAGT CATCGCT GT CTGTCATCCTTTCC

15 675 GATGACAGACAGCGATGACTAAAATTTTTGCTTACGCAATTCG

16 564 GCGCGGTCGACTT AGCCAACCTTAACTGGAGTTTCAG

17 1057 GCGCGGGATCCCTCGTTGTATTTGGGCATACGTCG

18 1203 CT GACATT AT ACAT GGCAATTTT AGT CATCGCT GT CTGTCATCCTTTCC

19 1202 GGAAAGGATGACAGACAGC GATGACTAAAATT GCCAT GTATAAT GT CAG

20 1189 CGGCTCGAGTT ACAGGTT AACGA TGCTTCTTGGC

21 750 GCGCGGGATCCGCTTTCCGTTTGCCATTTGCCG

22 999 T AT GCGACGGGCGCGT GGAGGAATATT GTCCGC

23 1000 ATTCCTCCACGCGCCCGTCGCATACAGTT CAT GTT G

24 753 GCGCGCTGCAGGGCAAGACT GACAGAAGAGCTTGG

25 170 GCCCTCGAGAGGGCTCGCCTTTGGGAAG

26 571 GCTCGTT AT AGTCGA TCGGTTC

27 655 GCTAAGATCGGCCATACGTTAAGC

28 656 GGAGACGAGCTTGGCGTCCTG

29 744 GCCAAGATGGATATGGGCGTT AGC

30 808 CCGGAGATGGACGGAATTGAAG

31 629 GACTGGGCGCAAGCGGT GAT G

32 630 CCTGTTGCTGATACAAGGTCTAGC

33 754 CAGCAGTAACGGCATCCGATTG

34 991 GCGGATAT GATT GAATTT GTGACTGCC

53 204 CT GCAAGCTTT GGCAGACAACGGCATCAC

54 205 TTGCGTAACCGAAGACCTTGCCTGAGTCC

55 957 CCTCGAGCGGCAAACAGAGCTTT AAAACCAGGC

56 1537 GGGTCTAGAGCCGCTTCGTTTTCCAACTGATGC

57 1539 T CTTTCGCTTCCAGGGCT GTT C

58 1589 GCGCGGAGCTCGTCGACCTGACTTT GAATACAACAAGGTGAAC

Los sitios de restricción están subrayados *5

Fermentación

El medio TMM se modificó de Fong y col. (Fong y col., 2006) y contenía por L: 60 g/l de glucosa; 30 g/l de xilosa; 8,37 g de MOPS, 0,23 g de K2HPO4; 0,51 g de NH⁴Cl; 0,50 g de NaCl; 1,47 g de Na²SO⁴; 0,08 g de NaHCOa; 0,25 g de KCI; 1,87 g de MgCl2.6H2O; 0,41 g de CaCl².2H²O; 16,0 mg de MnCl².4H²O; 1,0 mg de ZnSO⁴.7H²O; 2,0 mg de H3BO3; 0,1 mg de C11SO4.5H2O; 0,1 de mg Na²MoO⁴.2H²O; 1,0 mg de C0CI2.6H2O; 7,0 mg de FeSÜ⁴.7H²O; 0,1 mg de tiamina; 0,1 mg de riboflavina; 0,5 mg de ácido nicotínico; 0,1 mg de ácido pantoténico; 0,5 mg de piridoxamina, HCl; 0,5 mg de piridoxal, HCl; 0,1 mg de D-biotina; 0,1 mg de ácido fólico; 0,1 mg de ácido p-aminobenzoico; 0,1 mg de cobalamina. El pH se ajustó a pH 7,2. Se esterilizaron por filtración glucosa, xilosa, metales y vitaminas. El medio se esterilizó en autoclave. TMM1, TMM2.5 y TMM5 se suplementaron con 1 g/l, 2,5 g/l y 5 g/l de extracto de levadura (Oxoid), respectivamente.

STMM, difirió de TMM en las concentraciones de K2HPO4 (1,00 g/l), NH⁴Cl (2,50 g/l), NaCl (5,00 g/l) y CaCb.2H²O (50 mg/l) y se suplementó con D,L-metionina (68,5 mg/l) y betaína (0,14 g/l). Se utilizó sacarosa (90 g/l) en lugar de glucosa y xilosa. STMM5 se suplementó con extracto de levadura 5 g/l (Biospringer).

Se utilizó un precultivo de 100 ml en TMM5 o STMM5 para inocular (10% v/v) 400 ml de TMM1, TMM2.5 o STMM5 en un fermentador Multifors de 0,75 L (Infors) equipado con un condensador (enfriado con agua corriente de aproximadamente 15 °C). El pH se controló a pH 7,2 mediante la adición de KOH 2,5 M estéril o 75 g/l de Ca(OH)2 estéril. La temperatura fue de 60 °C. La velocidad del agitador fue de 300 rpm.

Se retiraron muestras de la fermentación para la medición del ácido (R)- y (S)-láctico y los posibles subproductos. Las muestras se centrifugaron y los residuos restantes se eliminaron mediante filtración usando un filtro Millex GP de 0,22 |jm (Millex GP 0.22 |jm filter®, Millipore). El filtrado se almacenó a -21 °C hasta su análisis adicional.

Los azúcares se midieron mediante HPLC usando una columna CarboPac SA-10 de Thermo (Dionex). El ácido fórmico se midió mediante HPLC usando una columna Aminex HPX-87C de Bio-Rad (Bio-Rad). Otros ácidos orgánicos (ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido pirúvico) y etanol se midieron utilizando una derivatización y cromatografía gas-líquido (GLC). Se metilaron los lactatos (R)- y (S)- a metil-lactato y se midieron mediante análisis de espacio de cabeza en una columna quiral.

Ejemplo 1

Producción de ácido láctico homoláctico con G. thermoglucosidans

El plásmido de integración pRM3 se construyó para suprimir el gen sigF en G. thermoglucosidans. Las regiones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del gen sigF se generaron mediante PCR, utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y las combinaciones de cebadores 653 y 654 (Tabla 2) para obtener el fragmento corriente arriba y los cebadores 651 y 652 (Tabla 2) para obtener el fragmento corriente abajo. En primer lugar, el fragmento corriente abajo se clonó como fragmento Kpnl-Sall en pNW33n, digerido con las mismas enzimas. A continuación, el fragmento corriente arriba se clonó como un fragmento Sall-HindlII en este constructo, digerido con las mismas enzimas dando como resultado el plásmido pRM3. La construcción de pRM3 se realizó en E. coli TG90. La integridad de la secuencia pRM3 se confirmó mediante secuenciación de ADN.

El plásmido pRM3 se electroporó hacia G. thermoglucosidans DSM 2542. Se seleccionó una sola colonia transformante y se utilizó para obtener mutantes cruzados únicos como se describe en Materiales y procedimientos. Se seleccionaron dos colonias para seguir trabajando, una con un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente arriba y otra con un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente abajo.

Se obtuvo un mutante de cruzado doble siguiendo el procedimiento descrito en Materiales y procedimientos. Sesenta colonias, obtenidas tras el subcultivo de los integrantes cruzados únicos en TGP sin cloranfenicol, se transfirieron a placas de TGP con y sin cloranfenicol. Quince colonias resultaron sensibles al cloranfenicol. Doce colonias tenían la modificación deseada y tres habían revertido al tipo silvestre. Se seleccionó una colonia y se designó G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF. La supresión se confirmó mediante secuenciación.

Tabla 3. Fermentaciones con G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF una mezcla de glucosa/xilosa en TMM2.5.

Tiempo Glucosa Xilosa Ácido láctico Ácido (S)-láctico de Ácido Ácido

acético fórmico Etanol (h) (g/l) (g/l) total(g/kg) pureza quiral (%)

(g/kg) (g/kg) (g/kg) 24 18,5 11,4 29 89,5 <0,1 1,2 2,2 48 15,2 7,0 33 89,4 <0,1 1,2 2,2 G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF se evaluó en una fermentación con pH controlado (KOH) utilizando TMM2.5. Las fermentaciones se transfirieron 4 veces y se analizaron las fermentaciones finales. Los resultados se resumen en la Tabla 3. G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF consumió xilosa y glucosa simultáneamente.

Ejemplo 2

Construcción de un derivado de G. thermoglucosidans que produce de ácido (R)-láctico utilizando hdhD. El plásmido pFS3 se construyó para facilitar el reemplazo génico del gen ldhL nativo con el gen hdhD originario de L. delbrueckii y codificante de la actividad D-lactato deshidrogenasa. La construcción fue tal que los codones de inicio y parada de hdhD reemplazan las posiciones de los codones originales de inicio y parada de IdhL y dan como resultado una fusión de traducción de hdhD al promotor de IdhL. La región flanqueante corriente abajo del gen IdhL se generó mediante PCR, utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y la combinación de cebadores 624 y 631. El producto se digirió con Sall y Sphl y se ligó en pNW33n digerido con Sall y Sphl. El plásmido resultante se designó pFS2. La construcción de pFS2 se realizó en E. coli DH5a.

La región flanqueante corriente arriba del gen IdhL se generó mediante PCR utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y la combinación de cebadores 1057 y 1203. El gen hdhD (SEQ ID NO: 37) se generó mediante PCR utilizando ADN genómico de L. delbrueckii como molde y la combinación de cebadores 1202 y 1189. El gen se puede sintetizar también basándose en la SEQ ID NO: 37. Los dos productos de PCR resultantes se utilizan posteriormente como molde en una PCR de solapamiento utilizando la combinación de cebadores 1057 y 1189 para fusionarlos. El producto se digirió con BamHI y Xhol y se ligó en pFS2 digerido con BamHI y Sall. El plásmido resultante se designó pFS3. La construcción de pFS3 se realizó en E. coIi TG90. La integridad de la secuencia de nucleótidos de pFS3 se confirmó mediante secuenciación.

El plásmido pFS3 se electroporó hacia G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF. Se seleccionó una sola colonia transformante y se utilizó para obtener mutantes cruzados únicos como se describe en Materiales y procedimientos. En el número de colonias ensayadas, solo se obtuvieron mutantes cruzados únicos a través de la región flanqueante corriente abajo. Se seleccionó una de ellas para seguir trabajando.

Se obtuvo un mutante de cruzado doble siguiendo el procedimiento descrito en Materiales y procedimientos. Las colonias, obtenidas tras el subcultivo del integrante cruzado único en TGP sin cloranfenicol, se transfirieron a placas de TGP con y sin cloranfenicol. Diecisiete colonias sensibles al cloranfenicol se comprobaron mediante PCR. Una colonia tuvo la modificación deseada y 16 habían revertido al tipo silvestre. La colonia que tiene ldhL intercambiado por hdhD se seleccionó y se designó G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD.

Para optimizar adicionalmente G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD se deseaba eliminar la formación de subproductos de ácido fórmico, ácido acético y etanol. Aunque se sabe que las mutaciones de pflA y/o pflB y adhE tienen un impacto sobre la producción de ácido fórmico y etanol en muchas bacterias, los efectos secundarios de la alteración de esos genes son impredecibles.

Para evaluar el efecto de la alteración de estos genes, se construyó un plásmido (pRM12) para suprimir los genes pflB, pflA y adhE (parcialmente) en G. thermoglucosidans. La región flanqueante corriente arriba de pflBA y la región flanqueante corriente arriba de adhE orientado de forma convergente se generaron mediante PCR, utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y las combinaciones de cebadores 739 y 805 para obtener el fragmento de pflBA corriente arriba y los cebadores 806 y 807 para adquirir el fragmento de adhE corriente arriba. Los dos productos de PCR resultantes se utilizaron posteriormente como molde en una PCR de solapamiento utilizando la combinación de cebadores 739 y 807 para fusionarlos. El producto se clonó como fragmento de BamHI-PstI en el plásmido pNW33n digerido con BamHI y PstI, dando como resultado el plásmido pRM12. La construcción de pRM12 se realizó en E. coli TG90. La integridad de la secuencia de nucleótidos de pRM12 se confirmó mediante secuenciación.

El plásmido pRM12 se electroporó hacia G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD. Se seleccionó una sola colonia transformante y se utilizó para obtener mutantes cruzados únicos como se describe en Materiales y procedimientos. Se seleccionaron dos colonias para seguir trabajando, una con un solo cruzado a través de la región flanqueante de pflBA corriente arriba y otra con un solo cruzado a través de la región flanqueante de adhE corriente abajo.

Se obtuvo un mutante de cruzado doble siguiendo el procedimiento descrito en Materiales y procedimientos. 120 colonias, obtenidas tras el subcultivo de los integrantes cruzados únicos en TGP sin cloranfenicol, se transfirieron a placas de TGP con y sin cloranfenicol. Cinco colonias sensibles al cloranfenicol se comprobaron mediante PCR. Dos colonias tenían la modificación deseada y tres habían revertido al tipo silvestre. Una colonia con la modificación deseada se seleccionó y se designó G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD, ApflBA-AadhE.

G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD, ApflBA-AadhE se evaluó en fermentaciones de pH controlado (Ca(OH)2) utilizando medio STMM5, que contiene 5 g/l de extracto de levadura y 90 g/l de sacarosa. Las fermentaciones se transfirieron y la segunda fermentación se analizó para la producción de ácido (R)-láctico homoláctico. G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD, ApflBA-AadhE fue capaz de producir ácido (R)-láctico homoláctico con una cantidad limitada de subproductos de etanol, ácido fórmico y ácidos acético. Por tanto, la introducción de D-lactato deshidrogenasa HdhD junto con la alteración de los genes del complejo piruvato-formiato liasa y alcohol deshidrogenasa da como resultado una fermentación de ácido (R)-láctico homoláctica a 60 °C con una cantidad limitada de subproductos de etanol, ácido fórmico y ácidos acético.

Ejemplo 3

Construcción de un derivado de G. thermoglucosidans que produce de ácido (R)-láctico utilizando IdhA. La clonación de genes IdhA que se originan a partir de las especies de Lactobacillus en E. coli se sabe que es problemática (Bernard y col., 1991. FEBS Lett. 290: 61-64). Para evitar posibles problemas de clonación, los presentes inventores decidieron utilizar L. lactis como hospedador intermedio y pNZ124 como vector de clonación. El plásmido pJS65 se construyó para facilitar el reemplazo de genes del gen IdhL nativo con el IdhA procedente de L. delbrueckii y codificante de la actividad D-lactato deshidrogenasa. La construcción fue tal que los codones de inicio y parada de IdhA reemplazan las posiciones de los codones originales de inicio y parada de IdhL y dan como resultado una fusión de traducción de IdhA al promotor de IdhL.

La región flanqueante corriente abajo del gen IdhL se generó mediante PCR, utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y la combinación de cebadores 1589 y 957. El producto se digirió con Sall y XhoI y se ligó en pNZ124 digerido con Sall y XhoI. El plásmido resultante se designó pJS64. La construcción de pJS64 se realizó en L. Iactis MG1363.

La región flanqueante corriente abajo del gen IdhL se genera mediante PCR, utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y la combinación de cebadores 1537 y 676. El gen IdhA (SEQ ID NO: 35) se generó mediante PCR utilizando ADN genómico de L. deIbrueckii como molde y la combinación de cebadores 675 y 564. El gen se puede sintetizar también basándose en la SEQ ID NO: 35, teniendo en cuenta que el gen sintético debe, preferentemente, clonarse en pNZ124 y en L. Iactis. Los dos productos de PCR resultantes se utilizan posteriormente como molde en una PCR de solapamiento utilizando la combinación de cebadores 1537 y 564 para fusionarlos. El producto se digirió con Xbal y Sall y se ligó en pJS64 digerido con Xbal y parcialmente digerido con Sall. El plásmido resultante se designó pJS65. La construcción de pJS65 se realizó en L. Iactis MG1363.

El plásmido pJS65 se electroporó hacia G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD, ApflBA-AadhE para la integración directa. Se obtuvo una sola colonia transformante con un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente arriba de IdhL. Conseguir la integración directa en el genoma de G. thermoglucosidans requerida utilizando las células competentes recién preparadas con una eficacia de transformación relativamente alta de al menos 103 UFC/pg de pNW33n.

Se obtuvo un mutante de cruzado doble siguiendo el procedimiento descrito en Materiales y procedimientos. 240 colonias, obtenidas tras el subcultivo de los integrantes cruzados únicos en TGP sin cloranfenicol, se transfirieron a placas de TGP con y sin cloranfenicol. Trece colonias sensibles al cloranfenicol se comprobaron mediante PCR. Diez colonias tenían la modificación deseada y tres habían revertido al tipo silvestre. Una colonia que tiene IdhL intercambiado por hdhD se seleccionó y se designó G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::ldhA, ApflBA-AadhE.

Tabla 4. Fermentación con G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::ldhA, ApflBA-AadhE en STMM5

Sacarosa Ácido láctico Ácido (R)-láctico de Ácido acético Ácido fórmico Tiempo (h) (g/kg) total (g/kg) pureza quiral (%) (g/kg) (g/kg) Etanol (g/kg)

0 72,1 3,3 98,9 0,2 <0,05 <0,2

24 22,0 36 98,9 0,4 <0,05 <0,2

48 1,6 48 98,9 0,5 <0,05 <0,2

G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::ldhA, ApflBA-AadhE se evaluó en fermentaciones de pH controlado (Ca(OH)2) utilizando medio STMM5, que contiene 5 g/l de extracto de levadura y 90 g/l de sacarosa. Las fermentaciones se transfirieron y se analizó la segunda fermentación. Los resultados se resumen en la Tabla 4. Estos datos demuestran claramente que la introducción de D-lactato deshidrogenasa LdhA junto con la alteración de los genes del complejo piruvato-formiato liasa y alcohol deshidrogenasa da como resultado una fermentación de ácido (R)-láctico homoláctica a una cantidad limitada de subproductos de etanol, ácido fórmico y ácido acético.

Ejemplo 4

Producción de ácido homoláctico enantiopuro con G. thermoglucosidans

El plásmido pJS43 se construyó para eliminar 267 pb del gen mgsA (423 pb) en G. thermoglucosidans. Las regiones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del mgsAse generaron mediante PCR utilizando ADN genómico de DSM 2542 como molde y las combinaciones de cebadores 750 y 999 para obtener el fragmento mgsA corriente abajo y los cebadores 1000 y 753 para adquirir el fragmento mgsA corriente arriba. Los dos productos de PCR resultantes se utilizaron posteriormente como molde en una PCR de solapamiento utilizando la combinación de cebadores 750 y 753 para fusionarlos. El producto se clonó como fragmento de BamHI-PstI en el plásmido pNW33n digerido con BamHI y PstI, dando como resultado el plásmido pJS43. La construcción de pJS43 se realizó en E. coli TG90. La integridad de la secuencia de nucleótidos de pJS43 se confirmó mediante secuenciación.

El plásmido pJS43 se electroporó hacia G. thermoglucosidans DSM 2542 AsigF, AldhL::hdhD, ApflBA-AadhE. Se seleccionaron colonias transformantes únicas y se utilizaron para obtener mutantes cruzados únicos como se describe en Materiales y procedimientos. Se seleccionaron dos colonias para seguir trabajando, una con un solo cruzado a través de la región flanqueante corriente arriba y otra con un solo cruzado a través de la región

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una célula bacteriana termófila modificada por ingeniería genética del género Geobacillus que es anaeróbica facultativa que comprende:

   a. un gen de la (S)-lactato deshidrogenasa endógeno inactivado o suprimido;

   b. un gen de la (R)-lactato deshidrogenasa no endógeno seleccionado del grupo del gen hdhD de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 38 y el gen IdhA de Lactobacillus delbrueckii que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 36;

   c. un gen de la piruvato formiato liasa A y/o B endógeno inactivado o suprimido.

   2. La célula según la reivindicación 1 en la que además el gen de la metilglioxal sintasa mgsA endógeno está inactivado o suprimido.

   3. La célula según la reivindicación 1 en la que el gen hdhD codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.

   4. La célula según la reivindicación 1 en la que el gen IdhA codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36.

   5. La célula según las reivindicaciones 1-4 en la que además el gen de la fosfotransacetilasa (pta) endógeno está inactivado o suprimido.

   6. La célula según las reivindicaciones 1-5 la cual es un derivado deficiente en esporulación debido a la inactivación o supresión de un gen de esporulación endógeno.

   7. La célula según la reivindicación 6 en la que el gen de esporulación es sigF.

   8. La célula según las reivindicaciones 1-7 en la que el gen de la piruvato formiato liasa A y/o B está inactivado mediante inactivación o supresión del locus pflBA-adhE de la piruvato formiato liasa/alcohol deshidrogenasa endógeno.

   9. La célula según las reivindicaciones 1-8 en la que la célula de Geobacillus es Geobacillus thermoglucosidans. 10. Un procedimiento para producir ácido (R)-láctico puro enantiomérico, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula bacteriana termófila según las reivindicaciones 1-8 utilizando materia prima que contiene carbono fermentable adecuado y aislar el ácido (R)-láctico.

   11. El procedimiento según la reivindicación 10 en el que la materia prima que contiene carbono comprende xilosa, glucosa o sacarosa.

   12. El procedimiento según las reivindicaciones 10 u 11 en el que el cultivo se realiza a una temperatura de entre 50 °C y 70 °C.