ES2870324T3 - Procedimiento de producción de un compuesto orgánico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de un compuesto orgánico, comprendiendo el procedimiento I) cultivar un microorganismo modificado genéticamente en un medio de cultivo que comprende la sacarosa como una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado genéticamente produzca el compuesto orgánico, II) recuperar el compuesto orgánico del caldo de fermentación obtenido en la etapa I del procedimiento), en el que el microorganismo modificado genéticamente comprende A) al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que al menos una modificación genética A) comprende una sobreexpresión del gen rbsK, en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae y en el que el compuesto orgánico es ácido succínico.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de producción de un compuesto orgánico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, a un microorganismo genéticamente modificado y al uso del microorganismo genéticamente modificado para la producción fermentativa de un compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico.

Los compuestos orgánicos tal como ácidos dicarboxílicos pequeños con 6 o menos carbonos son componentes químicos comercialmente significativos con muchos usos. Por ejemplo, los diácidos pequeños incluyen 1,4-diácidos, tal como ácido succínico, ácido málico y ácido tartárico, y la molécula de 5-carbono de ácido itacónico. Otros diácidos incluyen ácido oxálico de dos átomos de carbono, ácido malónico de tres átomos de carbono, ácido glutárico de cinco átomos de carbono y ácido adípico de seis átomos de carbono y también existen numerosos derivados de tales diácidos.

Como un grupo, los diácidos pequeños tienen cierta similitud química y sus usos en la producción de polímeros pueden proporcionar propiedades especializadas a la resina. Esta versatilidad les permite encajar fácilmente en los mercados de infraestructura química corriente abajo. Por ejemplo, las moléculas de 1,4-diácidos cumplen muchos de los usos del anhídrido maleico químico a gran escala dado que se convierten en una variedad de productos químicos industriales (tetrahidrofurano, butyrolactona, 1,4-butanediol, 2-pirrolidona) y los derivados succinatos de succinamida, succinonitrilo, diaminobutano y ésteres de succinato. El ácido tartárico tiene una serie de usos en la industria alimentaria, del cuero, del metal y de la impresión. El ácido itacónico forma el material de partida para la producción de 3-metilpirrolidona, metil-BDO, metil-THF y otros.

En particular, el ácido succínico o succinato - estos términos se utilizan indistintamente en la presente memoria - ha despertado un interés considerable porque se ha utilizado como precursor de muchos productos químicos industriales importantes en la industria alimentaria, química y farmacéutica. De hecho, un informe del Departamento de Energía de los EE.UU. informa que el ácido succínico es uno de los 12 principales bloques de construcción químicos fabricados a partir de biomasa. Por lo tanto, la capacidad de producción diácidos en las bacterias sería de importancia comercial significativa.

El documento WO-A-2009/024294desvela una cepa bacteriana productora de ácido succínico, siendo miembro de la familia de Pasteurellaceae, originalmente aislada de rumen, y capaz de utilizar glicerol como fuente de carbono y variantes y cepas mutantes derivadas de la retención de dicha capacidad, en particular, una cepa bacteriana designada DD1 depositada en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikrokisorganhismen GmbH, Inorganisgen und Zellenstr 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) con el número de depósito DSM 18541 (ID 06-614) y con la capacidad de producir ácido succínico. La cepa DD1 pertenece a la especie Basfia succiniproducens y a la familia de Pasteurellaceae según la clasificación de Kuhnert et. al., 2010. Las mutaciones de estas cepas, en las que el gen IdhA y/o el gen pflD o pflA ha sido alterado, se desvelan en el documento WO-A-2010/092155, estas cepas mutantes se caracterizan por un aumento significativo de la producción de ácido succínico a partir de fuentes de carbono como glicerol o mezclas de glicerol y carbohidratos como maltosa, en condiciones anaeróbicas, en comparación con DD1-WILDWILDWD-a-2009/024294.

Sin embargo, el succinato de base biológica todavía enfrenta el desafío de volverse competitivo en cuanto a costos contra alternativas basadas en petroquímicos. Para desarrollar la producción industrial de base biológica de ácido succínico, es importante cultivar las células en un medio de bajo costo, y la cepa de trabajo debe ser capaz de metabolizar una amplia gama de materias primas de azúcar de bajo costo para producir ácido succínico en buenos rendimientos para que puedan ser utilizadas las materias primas disponibles más baratas.

La sacarosa (comúnmente conocida como azúcar) es un disacárido que consiste en glucosa y fructosa, y es una fuente de carbono que es muy abundante en naturaleza y se produce a partir de todas las plantas que tienen capacidad de fotosíntesis. En particular, la caña de azúcar y la remolacha azucarera contienen grandes cantidades de sacarosa, y más del 60% de la sacarosa del mundo se está produciendo actualmente a partir de la caña de azúcar. Particularmente, la sacarosa se produce a un costo muy bajo, porque puede ser producida industrialmente a través de un simple procedimiento de evaporación/concentración de extractos obtenidos por prensado mecánico de la caña de azúcar. La sacarosa como materia prima para la producción de compuestos químicos mediante fermentación microbiana es, por lo tanto, barata y también funciona para proteger la membrana celular de un entorno externo que contiene grandes cantidades de metabolitos deseados, produciendo así altas concentraciones de metabolitos deseados, como lo demuestra Kilimann et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006).

El documento WO 2015/118051 A1 desvela un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen fruA, en el que el tipo silvestre del que se ha derivado el microorganismo modificado pertenece a la familia de Pasteurellaceae, el gen fruA codifica para una fosfotransferasa específica a la fructosa (PTS). En comparación con la célula de tipo silvestre (es decir, la cepa DD1 descrita anteriormente), la célula recombinante en la que se ha eliminado el gen fruA se caracteriza por un mayor rendimiento de ácido succínico cuando se cultiva en presencia de sacarosa como la única o predominante fuente de carbono. Sin embargo, en vista de la eficiencia económica de la producción fermentativa de ácido succínico a partir de sacarosa como fuente de carbono, todavía es deseable proporcionar más microorganismos modificados capaces de producir una gran cantidad de ácido succínico a partir de sacarosa y que - en comparación con las cepas modificadas conocidas de la técnica anterior - preferentemente produce aún más ácido succínico de la sacarosa.

Por lo tanto un objeto de la presente invención fue superar las desventajas de la técnica anterior

En particular, un objeto de la presente invención fue proporcionar un procedimiento de producción de un compuesto orgánico tal como ácido succínico por medio del alto rendimiento de carbono que se puede lograr cuando se utiliza sacarosa como la fuente de carbono.

También fue un objeto de la presente invención proporcionar un microorganismo genéticamente modificado que, en comparación con la célula original de la que se ha derivado por modificación genética, permite la producción de un compuesto orgánico como el ácido succínico de sacarosa como la fuente de carbono con mayores rendimientos de carbono.

Una contribución a la consecución de los objetivos mencionados con anterioridad se realiza mediante un procedimiento de producción de un compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, comprendiendo el procedimiento

I) cultivar un microorganismo modificado genéticamente en un medio de cultivo que comprende la sacarosa como una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado genéticamente produzca el compuesto orgánico,

II) recuperar el compuesto orgánico del caldo de fermentación obtenido en la etapa I del procedimiento),

en el que el microorganismo modificado genéticamente comprende

A) al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente,

y en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae.

Inesperadamente, se ha descubierto que los microorganismos de la familia Pasteurellaceae que comprenden al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK (codificación para una fructoquinasa dependiente de ATP; EC 2.7.1.4) se caracterizan por una mayor producción de compuestos orgánicos tal como ácido succínico de sacarosa como la única fuente o una fuente predominante de carbono, en comparación con los microorganismos originales que no han sido modificados genéticamente. Si, además de esta modificación genética, los microorganismos modificados comprenden al menos una modificación genética que conduce a una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen fruA (codificación para un sistema de fosfotransferasa específico para la fructosa; EC 2.7.1.202), la producción de compuestos orgánicos como el ácido succínico a partir de la sacarosa puede incluso aumentar.

En el procedimiento de acuerdo con la presente invención se utiliza un microorganismo modificado genéticamente que comprende A) al menos una modificación genética que conduce a una actividad aumentada de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae.

Tal microorganismo modificado genéticamente se puede obtener mediante un procedimiento que comprende al menos las etapas de procedimiento:

i) proporcionar un microorganismo original de la familia Pasteurellaceae;

ii) modificar genéticamente el microorganismo de manera que aumente la actividad de la enzima codificada por el gen rbsK;

iii) opcionalmente realizar modificaciones genéticas adicionales del microorganismo que conducen a una actividad aumentada o reducida de una o más enzimas adicionales que son diferentes de la enzima codificada por el gen rbsK, en el que la etapa de procedimiento iii) puede realizarse en cualquier momento después de la etapa de procedimiento i) (particularmente antes de la etapa ii del procedimiento), después de la etapa ii del procedimiento) o antes y después de la etapa ii del procedimiento).

El término "microorganismo origina!' como se usa en la presente memoria se refiere preferentemente a la cepa denominada "tipo silvestre". El término "tipo silvestre" se refiere a un microorganismo cuyo genoma, en particular cuyo gen rbsK y cuyos elementos reguladores del gen rbsK, está presente en un estado generado naturalmente como resultado de la evolución. En consecuencia, el término "tipo silvestre" preferentemente no abarca aquellos microorganismos cuyas secuencias genéticas hayan sido modificadas por el hombre al menos en parte mediante procedimientos recombinantes. El término "microorganismo modificado genéticamente" incluye, por tanto, un microorganismo que ha sido alterado, modificado o manipulado genéticamente (por ejemplo, manipulado genéticamente) de manera tal que presenta un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificación genética afecta la codificación de las secuencias de ácidos nucleicos del microorganismo) en comparación con el microorganismo natural de tipo silvestre del que se derivó. De acuerdo con una realización particular preferente del microorganismo modificado genéticamente utilizado en el procedimiento de la presente invención, el microorganismo modificado genéticamente es un microorganismo recombinante, lo que significa que el microorganismo se ha obtenido utilizando ADN recombinante. La expresión "ADN recombinante'', tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las secuencias de ADN resultantes del uso de procedimientos de laboratorio (clonación molecular) para reunir material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otra manera no se encontrarían en organismos biológicos. Un ejemplo de tal ADN recombinante es un plásmido en el que se ha insertado una secuencia de ADN heterólogo.

El microorganismo original del cual el microorganismo modificado genéticamente ha sido derivado por la modificación genética descrita anteriormente pertenece a la familia Pasteurellaceae. Pasteurellaceae comprende una gran familia de proteobacterias Gram-negativas con miembros que oscilan desde bacterias como Haemophilus influenzae hasta comensales de la mucosa animal y humana. La mayoría de los miembros viven como comensales en las superficies mucosas de aves y mamíferos, especialmente en el tracto respiratorio superior. Pasteurellaceae típicamente tiene forma de vara, y es un grupo notable de anaerobios facultativos. Puede distinguirse de las Enterobacteriaceae relacionadas por la presencia de oxidasa, y de la mayoría de las otras bacterias similares por la ausencia de flagelos. Las bacterias de la familia Pasteurellaceae se han clasificado en varios géneros basados en propiedades metabólicas y hay secuencias de ARN 16S y ARN 23S. Muchas de las Pasteurellaceae contienen genes piruvato-formato-liasa y son capaces de fermentar anaeróbicamente las fuentes de carbono a ácidos orgánicos.

En este contexto, es particularmente preferente que el microorganismo original pertenezca al género Basfia y es particularmente preferente que pertenezca a la especie Basfia succiniproducens.

Con máxima preferencia, el microorganismo original es la cepa DD1 de Basfia succiproducens depositada en virtud del Tratado de Budapest con DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH), Alemania, con el número de depósito DSM 18541. Esta cepa se ha aislado originalmente del rumen de una vaca de origen alemán. Las bacterias pasteurella pueden aislarse del tracto gastrointestinal de los animales y, preferentemente, de los mamíferos. La cepa bacteriana DD1, en particular, puede aislarse del rumen bovino y es capaz de utilizar glicerol (incluyendo glicerol bruto) como fuente de carbono. Otras cepas del género Basfia que se pueden utilizar para preparar el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención son la cepa Basfia que se ha depositado bajo el número de depósito DSM 22022 o las cepas Basfia que se han depositado con la Colección de Cultivos de la Universidad de Goteborg (CCUG), Suecia, con los números de depósito CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 o CCUG 57766. Dichas cepas han sido aisladas originalmente del rumen de vacas de origen alemán o suizo.

En este contexto es particularmente preferente que el microorganismo original tenga un ADNr 16S de SEQ ID NÚM.:

1 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos ei_ 99,9 % con SEQ ID NÚM: 1. También se prefiere que el microorganismo original tenga un ADNr 23S de SEQ ID NÚM.: 2 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,9 % con SEQ ID NÚM: 2.

La identidad en valores porcentuales a los que se hace referencia en relación con los diversos polipéptidos o polinucleótidos que se utilizarán para el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se calcula, preferentemente, como identidad de los residuos sobre la longitud completa de las secuencias alineadas, tal como, por ejemplo, la identidad calculada (para secuencias bastante similares) con la ayuda de la aguja del programa del EMBOSS del paquete de software de bioinformática (Versión 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/) con los parámetros predeterminados que son, es decir, GAP Abierto (penalidad para abrir un GAP): 10,0, extensión de la Gap (penalización para extender un Gap): 0,5, y archivo de datos (archivo de matriz de puntuación incluido en el paquete): EDNAFUL.

Cabe señalar que el microorganismo original del que se ha derivado el microorganismo modificado genéticamente no se limita a una de las cepas mencionadas, especialmente no a la cepa DD1 de Basfia succiproducens, sino que también puede incluir variantes de estas cepas. En este contexto, la expresión "una variante de una cepa” comprende cada cepa que tiene las mismas características o esencialmente las mismas que la cepa tipo silvestre. En este contexto, es especialmente preferente que ADNr 16 S de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 %, más preferentemente al menos el 99,5 %, más preferentemente al menos el 99,6 %, más preferentemente al menos el 99,7 %, más preferentemente al menos el 99,8 % y más preferentemente al menos el 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. También es especialmente preferente que ADNr 23 S de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 %, más preferentemente al menos el 99,5 %, más preferentemente al menos el 99,6 %, más preferentemente al menos el 99,7 %, más preferentemente al menos el 99,8 % y más preferentemente al menos el 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. Una variante de una cepa en el sentido de esta definición puede, por ejemplo, obtenerse tratando la cepa tipo silvestre con un agente químico mutagenizante, rayos X o luz UV.

De acuerdo con una realización preferente del microorganismo modificado genéticamente, el gen rbsK comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a1) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 3;

b1) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 4;

c1) ácidos nucleicos que son de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a1) o b1), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a1) o b1);

d1) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5%, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, preferentemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a1) o b1), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a1) o b1);

e1) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según a1) o b1); y

f1) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a1) o b1), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a1) o b1) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El término "hibridación"tal como se usa en la presente memoria incluye "any process by which a strand of nucleic acid molecule joins with a complementary strand through base pairing" (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre las moléculas de ácido nucleico) se ve afectada por factores tal como el grado de complementariedad entre las moléculas de ácido nucleico, la severidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado, y la relación G:C dentro de las moléculas de ácido nucleico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "Tm" se utiliza en referencia a la "temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de ácido nucleico de doble cadena se disocia a la mitad en hebras únicas. La ecuación para calcular la Tm de las moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la técnica Como se indica en las referencias estándar, se puede calcular una estimación simple del valor de Tm mediante la ecuación: Tm = 81,5 0,41(% G+C), cuando una molécula de ácido nucleico se encuentra en solución acuosa a 1 M NaCl (véase por ej., Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados, que tienen en cuenta tanto las características estructurales como las de secuencia para el cálculo de la TM. Las condiciones estrictas, son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6,3.1-6.3.6.

En particular, el término "condiciones de severidad" se refiere a condiciones, en las que 100 nucleótidos contiguos o más, 150 nucleótidos contiguos o más, 200 nucleótidos contiguos o más o 250 nucleótidos contiguos o más que son un fragmento o idénticos a la molécula de ácido nucleico complementario (ADN, ARN, ADNss o ARNss) se hibridizan en condiciones equivalentes a la hibridación en 7% de sulfato de dodecilo sódico (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mm EDTA a 50°C con lavado en 2 * SSC, 0,1% SDS a 50°C o 65°C, preferentemente a 65°C, con una molécula específica de ácido nucleico (ADN; ARN, ADNss o ARNss). Preferentemente, las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mm EDTA a 50°C con lavado en 1 * SSC, 0,1% SDS a 50°C o 65°C, preferentemente 65°C, Más preferentemente, las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), 0,5 M Na-PO4, 1 mm EDTA a 50°C con lavado en 0,1 * SSC, 0,1% SDS a 50°C o 65°C, preferentemente 65°C. Preferentemente, los nucleótidos complementarios se hibridan con un fragmento o con los ácidos nucleicos fruA enteros. Alternativamente, las condiciones de hibridación preferentes abarcan hibridación a 65°C en 1 * SSC o a 42°C en 1 * SSC y formamida al 50%, seguido de lavado a 65°C en 0,3 * SSC o por hibridación a 50°C en 4 * SSC o a 40°C en 6 * s Sc y formamida al 50%, seguido de lavado a 50°C en 2 * SSC. Otras condiciones de hibridación preferentes son 0,1 % SDS, 0,1 SSD y 65°C.

Ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 3 corresponde al gen rbsKde la cepa DD1 de Basfia succiproducens.

De acuerdo con una realización particularmente preferente del microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención el microorganismo modificado genéticamente comprende además

B) al menos una modificación genética que conduce a una actividad reducida de la enzima codificada por el gen fruA, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente.

En el microorganismo original del que se ha derivado el microorganismo modificado, el gen fruA comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a2) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 5;

b2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 6;

c2) ácidos nucleicos que son de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a2) o b2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a2) o b2);

d2) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5%, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, preferentemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a2) o b2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a2) o b2);

e2) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según a2) o b2); y

f2) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a2) o b2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a2) o b2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

Ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 5 corresponde al gen fruA de la cepa D1 de Basfia succiniproducens.

Aumento de la actividad de fructoquinasa

Los microorganismos genéticamente modificados que se utilizan en el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprenden A) al menos una modificación genética que conduce a una actividad aumentada de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente. Tal modificación genética puede, por ejemplo, ser una modificación del gen rbsK propiamente dicho y/o una modificación de un elemento regulador del gen rbsK en la que la modificación del gen rbsK y/o la modificación de un elemento regulador de gen rbsK conduce a un aumento de la actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original en el que el gen rbsK y/o el elemento regulador del gen rbsK no ha sido modificado.

El aumento de la actividad enzimática (Aact¡v¡dad) es - en el caso de un microorganismo original que ya tiene una determinada actividad de fructoquinasa - preferentemente definido de la siguiente manera:

* actividad del microorganismo modificado qenéticamente

i actividad del microorganismo original

en la cual, al determinar la Aactividad, la actividad en el microorganismo original y la actividad en el microorganismo modificado se determinan exactamente en las mismas condiciones. La actividad de la fructoquinasa que está codificada por el gen rbsK puede determinarse según lo desvelado por Helanto et al.: "Characterization of genes involved in fructose utilization by Lactobacillus fermentum"; Arch. Microbiol. (2006), Vol. 186, p. 51-59.

El aumento de la actividad de la fructoquinasa puede ser un aumento de la actividad enzimática de 1 a 10000%, en comparación con la actividad de dicha enzima en el tipo silvestre del microorganismo, o un aumento de la actividad enzimática de al menos 50%, o al menos el 100 %, o al menos el 200 %, o al menos el 300 %, o al menos el 400 %, o al menos el 500 %, o al menos el 600 % o al menos el 700 %, o al menos el 800 %, o al menos el 900 %, o al menos el 1000 %, o al menos el 5000 %. Preferentemente, el aumento de la actividad de una enzima se encuentra en el intervalo de 10 a 1000 %, más preferentemente en el intervalo de 100 a 500 %.

Un aumento de la actividad de la fructoquinasa puede lograrse mediante una modificación genética del gen rbsK propiamente dicho, por ejemplo aumentando el número de copias del gen rbsK, utilizando un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente que tiene una mayor actividad o introduciendo una o más mutaciones genéticas que conducen a un aumento de la actividad de la fructoquinasa. Estas mutaciones pueden volver a generarse no dirigidas, ya sea por procedimientos clásicos, tal como adopción evolutiva, irradiación Uv o productos químicos mutágenos, o bien dirigidas por procedimientos de manipulación genética tal como deleción, inserción y/o intercambio de nucleótidos por mutagénesis dirigida al sitio. Además, se puede lograr una mayor actividad de la fructoquinasa mediante una modificación de los elementos reguladores del gen rbsK, tal como una modificación genética de la secuencia promotora de rbsK o una modificación de proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares implicados en la transcripción del gen rbsK y/o la traducción del producto genético. En este contexto es posible, por ejemplo, utilizar una secuencia promotora que, en comparación con la secuencia promotora del microorganismo original, es más fuerte. Por supuesto, también es posible combinar estas medidas para aumentar la actividad de la fructoquinasa.

De acuerdo con la invención, se producen microorganismos genéticamente modificados, por ejemplo por transformación, transducción, conjugación, o una combinación de estos procedimientos, con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o partes de éste, e incluye un gen que permite la expresión del vector. La expresión heteróloga se logra, en particular, integrando el gen o alelos en el cromosoma de la célula o en un vector de replicación extracromosómico.

En este contexto es particularmente preferente que al menos una modificación genética A) incluya una sobreexpresión del gen rbsK, preferentemente una sobreexpresión del gen rbsK en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA. El promotor del ACKA comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a3) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 7;

b3) ácidos nucleicos que son al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos el 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a3), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a3).

El grado en que un gen se expresa en una célula puede, por ejemplo, determinarse mediante PCR en tiempo real. Los detalles para determinar la expresión génica en una célula mediante PCT en tiempo real son desvelados por Wong and Medrano in "Real-time PCR for mRNA quantitation", BioTechniques, Vol. 39, No. 1, July 2005, pp. 75-85.

Reducción de la actividad de la fosfotransferasa

De acuerdo con una realización particularmente preferente del microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención el microorganismo modificado genéticamente comprende además B) al menos una modificación genética que conduce a una actividad reducida de la enzima codificada por el gen fruA, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente. Tal modificación genética puede, por ejemplo, ser una modificación del gen fruA y/o una modificación de un elemento regulador del gen fruA, en el que la modificación del gen fruA y/o la modificación de un elemento regulador del gen fruA conducen a una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen fruA, en comparación con el microorganismo original en el que el gen fruA y/o el elemento regulador del gen fruA no se ha modificado.

La reducción de la actividad enzimática (Aact¡v¡dad) se define de la siguiente manera:

* actividad del microorganismo modificado qenéticamente

i actividad del microorganismo original

en la cual, al determinar la Aactividad, la actividad en el microorganismo original y la actividad en el microorganismo modificado genéticamente se determinan exactamente en las mismas condiciones. Los procedimientos para la detección y determinación de la actividad de la enzima codificada por el gen fruA se pueden encontrar, por ejemplo, en la publicación de Helanto et al.

La reducción de la actividad de la fosfotransferasa específica a la fructosa codificada por el gen fruA (o, como se describe más adelante, "una reducción de la actividad de lactato deshidrogenasa" o "una reducción de la actividad de piruvato formato liasa") puede ser una reducción de la actividad enzimática en al menos un 50%, en comparación con la actividad de dicha enzima en la célula original, o una reducción de la actividad enzimática en al menos un 90%, o más preferentemente una reducción de la actividad enzimática en al menos un 95%, o más preferentemente una reducción de la actividad enzimática en al menos un 98%, o incluso más preferentemente una reducción de la actividad enzimática en al menos un 99% o más preferentemente una reducción de la actividad enzimática en al menos un 99,9%. El término "una actividad reducida de la fosfotransferasa específica de la fructosa" o - como se describe a continuación -"una actividad reducida de lactato deshidrogenasa" o "una actividad reducida de piruvato formato liasa", también abarca un microorganismo modificado que no tiene actividad detectable de estas enzimas.

Una reducción de la actividad de la fosfotransferasa puede lograrse mediante una modificación genética del gen fruA. En este contexto se prefiere especialmente que la modificación genética B) comprenda una inactivación del gen fruA, en el que esta inactivación se realiza preferentemente mediante la supresión del gen fruA o partes del mismo. También es posible utilizar un gen o alelo que codifique para una enzima correspondiente que tiene una actividad reducida o introduciendo una o más mutaciones genéticas que conducen a una actividad reducida de la fosfotransferasa. Estas mutaciones pueden volver a generarse no dirigidas, ya sea por procedimientos clásicos, tal como adopción evolutiva, irradiación Uv o productos químicos mutágenos, o bien dirigidas por procedimientos de manipulación genética tal como deleción, inserción y/o intercambio de nucleótidos por mutagénesis dirigida al sitio. Además, una reducción de la actividad de la fosfotransferasa puede lograrse mediante la modificación de elementos reguladores del gen fruA, como secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión del gen fruA (por ejemplo, mediante la eliminación de promotores fuertes o promotores represibles), proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares involucrados en la transcripción del gen fruA y/o la traducción del gen.

De acuerdo con una realización preferente del microorganismo modificado genéticamente utilizado en el procedimiento de acuerdo con la presente invención, la inactivación del gen fruA se logra mediante una supresión del gen fruA o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen fruA o partes del mismo, como una secuencia promotora, o mediante la introducción de al menos una mutación en el gen fruA.

A continuación se describe una técnica adecuada para la recombinación, en particular para introducción de una mutación o para eliminación de secuencias.

A menudo, esta técnica también se denomina en la presente memoria "recombinación Campbell" (Leen-houts et al., Appl Env Microbiol.(1989), Vol. 55, pág. 394-400). "Campbell in", como se usa en la presente memoria, se refiere a un transformante de una célula huésped original en la que una molécula circular de ADN de doble hebra (por ejemplo, un plásmido) se ha integrado en un cromosoma por un solo evento homólogo de recombinación (un evento de cruce), y eso resulta efectivamente en la inserción de una versión linealizada de dicha molécula de ADN circular en una primera secuencia de ADN del cromosoma que es homóloga a una primera secuencia de ADN de dicha molécula de ADN circular. "Campbelled In" se refiere a la secuencia de ADN linealizada que se ha integrado en el cromosoma de un transformante "Campbell in". Un "Campbell in" contiene una duplicación de la primera secuencia de ADN homólogo, cada copia de la cual incluye y rodea una copia del punto de cruce de recombinación homóloga.

"Campbell Out", como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula que desciende de un transformante "Campbell In", en el que se ha producido un segundo evento de recombinación homóloga (un evento de cruce) entre una segunda secuencia de ADN que está contenida en el ADN insertado linealizado del ADN "Campbelled In", y una segunda secuencia de ADN de origen cromosómico, que es homóloga a la segunda secuencia de ADN de dicho inserto linealizado, el segundo evento de recombinación que resulta en la supresión (eliminación) de una porción de la secuencia de ADN integrada, pero, lo que es relevante, también resulta en una porción (esto puede ser tan poco como una sola base) del Campbelled integrado en el ADN que permanece en el cromosoma, de manera tal que en comparación con la célula huésped original, la célula "Campbell Out" contiene uno o más cambios intencionales en el cromosoma (por ejemplo, una sola sustitución de base, múltiples sustituciones de base, inserción de un gen heterólogo o secuencia de a Dn , inserción de una copia adicional o copias de un gen homólogo o un gen homólogo modificado, o inserción de una secuencia de ADN que comprende más de uno de estos ejemplos mencionados anteriormente). Una célula "Campbell Out" se obtiene, preferentemente, mediante una contraselección versus un gen que está contenido en una porción (la porción que se desea descartar) de la secuencia de ADN "Campbelled in", por ejemplo el gen Bacillus subtilis sacB, que es letal cuando se expresa en una célula que se cultiva en presencia de aproximadamente 5% al 10% de sacarosa. Ya sea con o sin una contraselección, una célula deseada "Campbell Out" puede obtenerse o identificarse mediante la detección de la célula deseada, utilizando cualquier fenotipo observable, tal como, pero sin limitación, morfología de colonias, color de colonias, presencia o ausencia de resistencia a antibióticos, presencia o ausencia de una secuencia de ADN dada por reacción en cadena de la polimerasa, presencia o ausencia de una auxotrofia, presencia o ausencia de una enzima, hibridación de ácido nucleico de colonias, detección de anticuerpos, etc. El término "Campbell in" y "Campbell out" también puede usarse como verbos en varios tiempos para referirse al procedimiento o proceso descrito anteriormente.

Se entiende que los eventos de recombinación homóloga que conducen a un "Campbell in" o "Campbell out" pueden ocurrir sobre una gama de bases de ADN dentro de la secuencia de ADN homóloga, y puesto que las secuencias homólogas serán idénticas entre sí para al menos parte de este rango, generalmente no es posible especificar exactamente en qué lugar ocurrió el evento de cruce. En otras palabras, no es posible especificar con precisión qué secuencia era originalmente del ADN insertado, y cuál era originalmente del ADN cromosómico. Además, la primera secuencia de ADN homólogo y la segunda secuencia de ADN homólogo suelen estar separadas por una región de no homología parcial, y es esta región de no homología la que permanece depositada en un cromosoma de la célula "Campbell Out".

Preferentemente, la primera y segunda secuencia de ADN homólogo tienen al menos 200 pares de bases de longitud, y pueden tener hasta varios miles de pares de bases de longitud. Sin embargo, el procedimiento se puede realizar para trabajar con secuencias más cortas o más largas. Por ejemplo, una longitud para la primera y segunda secuencias homólogas puede variar de aproximadamente 500 a 2000 bases, y la obtención de un "Campbell Out" de un "Campbell In" se facilita al organizar la primera y segunda secuencias homólogas para que sean de aproximadamente la misma longitud, preferentemente con una diferencia de menos de 200 pares de base y lo más preferentemente con la más corto de las dos siendo de al menos el 70% de la longitud del más largo en pares de base.

El gen fruA o sus partes que pueden ser eliminadas por la mencionada "recombinación Campbell" o en la que al menos una mutación es introducida por la mencionada "recombinación Campbell" comprende preferentemente un ácido nucleico como se define con anterioridad.

De acuerdo con una realización preferente del microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención el microorganismo puede estar caracterizado adicionalmente por

- una actividad reducida de piruvato formato liasa,

- una disminución de la actividad de lactato deshidrogenasa, y/o

- una actividad reducida de piruvato formato liasa y una actividad reducida de lactato deshidrogenasa.

Los microorganismos modificados que son deficientes en lactato deshidrogenasa y/o que son deficientes en actividad de piruvato formato liasa se desvelan en los documentos WO-A-2010/092155, US 2010/0159543 y WO-A-2005/052135,cuya divulgación con respecto a los diferentes enfoques de reducción de la actividad de lactato deshidrogenasa y/o piruvato formato liasa en un microorganismo, preferentemente en una célula bacteriana del género Pasteurella, en particular preferente en la cepa DD1 de Basfia succiproducens, se incorpora en la presente memoria. Los procedimientos para determinar la actividad de la piruvato formato liasa son, por ejemplo, desvelados por Asanum N. and Hino T. en "Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis", Appl.Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, pages 3773-3777y los procedimientos para determinar la actividad de lactato deshidrogenasa son, por ejemplo, desvelados porBergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983-1986) en "Methods of Enzymatic Analysis", 3rd Edition, Volume III, pages 126-133, Verlag Chemie, Weinheim.

En este contexto se prefiere que la reducción de la actividad de la lactato deshidrogenasa se logre mediante una inactivación del gen idhA (que codifica la lactato deshidrogenasa; LdhA; EC 1.1.1.27 o EC 1.1.1,28) y la reducción de la piruvato formato liasa se logra mediante la inactivación del gen pflA (que codifica para un activador de piruvato formato liasa; PflA; EC 1.97.1.4) o el gen pflD (que codifica la piruvato formato liasa; PflD; EC 2.3.1.54), en el que se logra la eliminación de estos genes (es decir, IdhA, pflA y pflD), preferentemente por la supresión de un elemento regulador de estos genes o al menos una parte o por la introducción de al menos una mutación en estos genes, en el que estas modificaciones se realizan preferentemente por medio de la "recombinación Campbell" como se describió anteriormente.

El gen ldhA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a1) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 8;

a2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 9;

a3) ácidos nucleicos que son de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos 99.7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a1) o a2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a1) o a2);

a4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a1) o a2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a1) o a2);

a5) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según a1) o a2); y

a6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a1) o a2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a1) o a2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El gen pflA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

p1) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 10;

p2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 11;

p3) ácidos nucleicos que son de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos 99.7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de p1) o p2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de p1) o p2);

p4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es de al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos el99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de p1) o p2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de p1) o p2)

p5) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos según p1) o p2); y

p6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de p1) o p2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de p1) o p2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El gen pflD cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

Y l) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 12;

Y2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 13;

Y3) ácidos nucleicos que son de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de y1) o y2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de y1) o y2);

Y4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es de al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, preferentemente 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de y1) o y2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de y1) o y2);

Y5) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con y1) o y2); y

Y6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de y1) o y2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de y1) o y2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

En este contexto se prefiere que la modificación del microorganismo modificado genéticamente que se utiliza en el procedimiento de acuerdo con la presente invención, además de al menos una modificación A) o además de al menos una modificación A) y la al menos una modificación B), además comprende:

C) una supresión del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o la introducción de al menos una mutación en el gen ldhA;

D) una supresión del gen pflD o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen pflD o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pflD;

E) una supresión del gen pflA o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen pflA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pflA;

F) una supresión del gen ldhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen ldhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen ldhA y una deleción del gen pflD o, al menos, una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pflD o, al menos, una mutación o una parte del gen pflD;

G) una supresión del gen ldhA o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen ldhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen ldhA y una supresión del gen pflA o al menos una parte del mismo, una supresión de un elemento regulador del gen pflA o, al menos, una parte del gen pflA.

Las realizaciones preferentes particulares de los microorganismos genéticamente modificados utilizados en el procedimiento de acuerdo con la presente invención son:

- células bacterianas modificadas del género Basfia, preferentemente de la especie Basfia succiproducens, más preferentemente de la cepa DD1 de la especie Basfia succiniproducens, en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), más preferentemente en las que el gen fruA está inactivado (preferentemente por una supresión del gen fruA o al menos una de sus partes) y en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA);

- células bacterianas modificadas del género Basfia, preferentemente de la especie Basfia succiproducens, más preferentemente de la cepa DD1 de la especie Basfia succiniproducens, en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), más preferentemente en las que el gen fruA está inactivado (preferentemente por una supresión de un gen fruA o al menos una de sus partes) y en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), y en las que además de estas modificaciones genéticas la actividad de la lactato deshidrogenasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen IdhA, en particular por una supresión del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 8 y codificación para LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 9;

- células bacterianas modificadas del género Basfia, preferentemente de la especie Basfia succiproducens, más preferentemente de la cepa DD1 de la especie Basfia succiniproducens, en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), más preferentemente en las que el gen fruA está inactivado (preferentemente por una supresión del gen fruA o al menos una parte del mismo) y en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), y en las que además de estas modificaciones genéticas la actividad del piruvato formato lisasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen pflA o el gen pflD, en particular por una modificación del gen pflA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 10 y que codifica para PflA con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 11 o mediante una modificación del gen pflD con la secuencia de ácido nucleico de acuerdô con SEQ ID NÚM.: 12 y que codifica para PflD con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 13;

- células bacterianas modificadas del género Basfia, preferentemente de la especie Basfia succiproducens, más preferentemente de la cepa DD1 de la especie Basfia succiniproducens, en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), más preferentemente en las que el gen fruA está inactivado (preferentemente por una supresión del gen fruA o al menos una parte del mismo) y en las que el gen rbsK está sobreexpresado (preferentemente en un plásmido episómico bajo control del promotor ackA), y en las que además de estas modificaciones genéticas la actividad del lactato deshidrogenasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen IdhA y el gen pflA, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 8 y que codifica para ldhA con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 9 o mediante una modificación del gen pflA con la secuencia de ácido nucleico de acuerdô con SEQ ID NÚM.: 10 y que codifica para PflA con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 11, o una modificación del gen ldhA y del gen pflD, en particular por una modificación del gen ldhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 8 y que codifica para ldhA con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 9 o mediante una modificación del gen pflD con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 12 y que codifica para PflD con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÚM.: 13.

En la etapa I) del procedimiento el microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con la presente invención es cultivado en un medio de cultivo que comprende sacarosa como la fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca el compuesto orgánico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende el compuesto orgánico. Los compuestos orgánicos preferentes que pueden ser producidos por el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende ácidos carboxílicos tal como ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido 2-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido acrílico, ácido pirúvico o sales de estos ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos tal como ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glutárico, ácido itacónico, ácido adípico o sus sales, ácidos tricarboxílicos tal como ácido cítrico o sus sales, alcoholes tal como metanol o etanol, aminoácidos tal como L-asparagina, ácido L-aspártico, L-arginina, L-isoleucina, L-glicina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-cisteína, L-serina, L-tirosina, L-triptófano, L-treonina, L-valina, L-histidina, L-prolina, L-metionina, L-lisina, L-leucina, etc.

De acuerdo con una realización preferente del procedimiento de acuerdo con la presente invención el compuesto orgánico es ácido succínico. El término "ácido succínico", como se utiliza en el contexto de la presente invención, tiene que ser entendido en su sentido más amplio y también abarca sus sales (es decir, succinato), tal como, por ejemplo sales de metal de álcali, tal como sales Na+y K+, o sales térreoalcalinas, tal como sales Mg2+y CA2+, o sales de amonio o anhídridos de ácido succínico.

El microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con la presente invención es, preferentemente, incubado en el medio de cultivo a una temperatura comprendida entre 10 y 60 °C o entre 20 y 50 °C o entre 30 y 45 °C a un pH de 5,0 a 9,0 o de 5,5 a 8,0 o de 6,0 a 7,0.

Preferentemente, el compuesto orgánico, especialmente el ácido succínico, se produce en condiciones anaeróbicas. Las condiciones anaerobias pueden establecerse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, desgasificando los componentes del medio de reacción y manteniendo las condiciones anaeróbicas introduciendo dióxido de carbono o nitrógeno o mezclas de éstos y, opcionalmente, hidrógeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. Las condiciones aerobias pueden establecerse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, introduciendo aire u oxígeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. De ser adecuado, puede aplicarse una ligera sobrepresión de 100 kPa a 1500 kPa en el procedimiento.

La fuente de carbono asimilable es preferentemente sacarosa. En este contexto se prefiere que al menos 50 % en peso, preferentemente al menos 75 % en peso, más preferentemente al menos 90 % en peso, más preferentemente al menos 95 % en peso y más preferentemente al menos 99 % en peso de la fuente de carbono asimilable, sobre la base del peso total de la fuente de carbono asimilable, con excepción del dióxido de carbono, es la sacarosa.

La concentración inicial de la fuente de carbono asimilable, preferentemente la concentración inicial de sacarosa, se ajusta preferentemente a un valor en un intervalo de 5 a 100 g/l, preferentemente 5 a 75 g/l y más preferentemente 5 a 50 g/l y puede mantenerse en dicho intervalo durante el cultivo. El pH del medio de reacción puede controlarse mediante la adición de bases adecuadas como, por ejemplo, amoníaco gaseoso, NH4HCO3, (NH^COa, NaOH, Na2COa, NaHCOa, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCOa, Mg(HCOa)2, Ca(OH)2, CaCOa, Ca(HCOa)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N y/o sus mezclas. Estos agentes de neutralización alcalina son especialmente necesarios si los compuestos orgánicos que se forman en el curso del procedimiento de fermentación son ácidos carboxílicos o dicarboxílicos. En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, Mg(OH)2 es una base particularmente preferente.

La etapa I) de fermentación de acuerdo con la presente invención puede, por ejemplo, realizarse en fermentadores agitados, columnas de burbuja y reactores de bucle. Se puede encontrar una visión general completa de los posibles tipos de procedimientos, incluyendo los tipos de agitador y los diseños geométricos en Chmiel: "Bio-prozesstechnik: Einführung in die BioverfahrenstechniK", Volume 1. En el procedimiento de acuerdo con la presente invención, las variantes típicas disponibles son las siguientes variantes conocidas por los expertos en la técnica o explicadas, por ejemplo, en Chmiel, Hammes and Bailey:"Biochemical Engineering", tal como partida, alimentación por partida, alimentación por partida repetida o fermentación continua con y sin reciclaje de la biomasa. Dependiendo de la cepa de producción, puede llevarse a cabo aspersión con aire, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o mezclas de gases adecuadas, para lograr un buen rendimiento (YP/S).

Las condiciones particularmente preferentes de producción del ácido orgánico, especialmente ácido succínico, en la etapa I) del procedimiento son:

Fuente de carbono asimilable: sacarosa

Temperatura: 30 a 45 °C.

pH: 5,5 a 7,0

Gas suministrado: CO2

Es preferente, además, en la etapa I) del procedimiento que la fuente de carbono asimilable, preferentemente sacarosa, se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento de carbono YP/S de al menos 0,5 g/g hasta aproximadamente 1,18 g/g; por ejemplo, un rendimiento de carbono de al menos 0,6 g/g, de al menos 0,7 g/g, de al menos 0,75 g/g, de al menos 0,8 g/g, de al menos 0,85 g/g, de al menos 0,9 g/g, de al menos 0,95 g/g, de al menos 1,0 g/g, de al menos 1,05 g/g o de al menos 1,1 g/g (compuesto orgánico/carbono, preferentemente ácido succínico/carbono).

Además, es preferente en la etapa I) del procedimiento que la fuente de carbono asimilable, preferentemente sacarosa, se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento de productividad específico de al menos 0,6 g g DCW'1h'1 de compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, o de al menos 0,65 g g DCW-1h'1, de al menos 0,7 g g DCW'1h'1, de al menos 0,75 g g DCW'1h'1 o de al menos 0,77 g g DCW'1h'1 de ácido orgánico, preferentemente ácido succínico.

Además, es preferente en la etapa I) del procedimiento que la sacarosa se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento de tiempo de espacio para el compuesto orgánico, preferentemente para el ácido succínico, de al menos 2,2 g/(L*h) o de al menos 2,5 g/(L*h), al menos 2,75 g/(L*h), al menos 3 g/(L*h), al menos 3,25 g/(L*h), al menos 3,5 g/(L*h), al menos 3,7 g/(L*h), al menos 4,0 g/ 4,5(L*h 5,0) o L*h) preferentemente ácido succínico. De acuerdo con otra realización preferente del procedimiento de acuerdo con la presente invención en la etapa I) del procedimiento el microorganismo modificado genéticamente está convirtiendo en al menos 20 g/L, más preferentemente al menos 25 g/L e incluso más preferentemente al menos 30 g/L sacarosa a al menos 20 g/L, más preferentemente a al menos 25 g/L e incluso más preferentemente al menos 30 g/L del compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico.

Los diferentes parámetros de rendimiento descritos en la presente memoria ("rendimiento de carbono" o "YP/S"; "rendimiento de productividad específico"; o "rendimiento de espacio-tiempo (STY)") son bien conocidos en la técnica y se determinan como se describe por ejemplo por Song and Lee, 2006. "Rendimiento de carbono" y "YP/S"(cada uno expresado en masa de compuestos orgánicos producidos/masa de fuente de carbono asimilable consumida) se utilizan en la presente memoria como sinónimos. El rendimiento de productividad específico describe la cantidad de un producto, tal como ácido succínico, que se produce por h y L de caldo de fermentación por g de biomasa seca. La cantidad de peso celular seco indicada como "DCW" describe la cantidad de microorganismo biológicamente activo en una reacción bioquímica.

El valor se indica en g de producto por g de DCW por h (es decir, g g DCW-1h-1). El rendimiento de espacio-tiempo (STY) se define como la relación entre la cantidad total de compuesto orgánico formado en el procedimiento de fermentación y el volumen del cultivo, considerado durante todo el tiempo de cultivo. El rendimiento de espacio-tiempo también se conoce como la "productividad volumétrica".

En la etapa II) del procedimiento el compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, se recupera del caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento.

Normalmente, el procedimiento de recuperación comprende la etapa de separación de los microrganismos genéticamente modificados del caldo de fermentación como la denominada "biomasa". Los procedimientos para la eliminación de la biomasa son conocidos por los expertos en la técnica, y comprenden filtración, sedimentación, flotación o sus combinaciones. Por lo tanto, la biomasa se puede eliminar, por ejemplo, con centrifugadoras, separadores, decantadores, filtros o en un aparato de flotación. Para la máxima recuperación del producto de valor, el lavado de la biomasa es a menudo aconsejable, por ejemplo en forma de diafiltración. La selección del procedimiento depende del contenido de biomasa en el caldo de fermentación y de las propiedades de la biomasa, así como de la interacción de la biomasa con el compuesto orgánico (por ejemplo, el producto de valor). En una realización, el caldo de fermentación se puede esterilizar o pasteurizar. En una nueva realización, el caldo de fermentación se concentra. Dependiendo del requisito, esta concentración se puede realizar por partida o de forma continua.

El intervalo de presión y temperatura debe seleccionarse de manera que, en primer lugar, no se produzcan daños en el producto y, en segundo lugar, sea necesario un uso mínimo del aparato y de la energía. La selección cuidadosa de los niveles de presión y temperatura para una evaporación de múltiples etapas permite en particular el ahorro de energía.

El procedimiento de recuperación puede comprender además etapas de purificación adicionales en las que el compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, se purifica de forma adicional. Si, sin embargo, el compuesto orgánico se convierte en un producto orgánico secundario por reacciones químicas como se describe a continuación, una purificación adicional del compuesto orgánico es, dependiendo del tipo de reacción y las condiciones de reacción, no necesariamente necesaria. Para la purificación del compuesto orgánico obtenido en la etapa II) del procedimiento, preferentemente para la purificación del ácido succínico, se pueden utilizar procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, cristalización, filtración, electrodiálisis y cromatografía. En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, por ejemplo, el ácido succínico puede aislarse por precipitación como producto de succinato de calcio mediante el uso de hidróxido de calcio, óxido, carbonato o carbonato de hidrógeno para la neutralización y filtración del precipitado. El ácido succínico se recupera del succinato de calcio precipitado por acidificación con ácido sulfúrico seguido de filtración para eliminar el sulfato de calcio (yeso) que precipita. La solución resultante puede purificarse aún más mediante cromatografía de intercambio iónico para eliminar iones residuales no deseados. Alternativamente, si el hidróxido de magnesio, el carbonato de magnesio o sus mezclas se han utilizado para neutralizar el caldo de fermentación, el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento puede acidificarse para transformar el succinato de magnesio contenido en el medio en la forma ácida (es decir, ácido succínico), que posteriormente puede cristalizarse enfriando el medio acidificado. Los ejemplos de otros procedimientos de purificación adecuados se desvelan en los documentos EP-A-1 005562, WO-A-2008/010373, WO-A-2011/082378, WO-A-2011/043443, WO-A-2005/030973, WO-A-2011/123268yWO-A-2011/064151 y EP-A-2 360 137.

De acuerdo con una realización preferente del procedimiento de acuerdo con la presente invención el procedimiento comprende además la etapa del procedimiento:

I) conversión del compuesto orgánico contenido en el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento o conversión del compuesto orgánico recuperado obtenido en la etapa II) del procedimiento en un producto orgánico secundario siendo diferente del compuesto orgánico por al menos una reacción química.

En caso de ácido succínico como compuesto orgánico, los productos orgánicos secundarios preferentes se seleccionan del grupo compuesto por ésteres de ácido succínico y sus polímeros, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanediol (BDO), gamma-butirolactona (GBL) y pirrolidonas.

De acuerdo con una realización preferente para la producción de THF, BDO y/o GBL este procedimiento comprende:

b1) ya sea la hidrogenación catalítica directa del ácido succínico obtenido en las etapas I) o II) a THF y/o BDO y/o GBL, o

b2) la esterificación química de ácido succínico y/o sales de ácido succínico obtenidas en las etapas del procedimiento I) o II) en su correspondiente éster de alquilo diinferior y la posterior hidrogenación catalítica de dicho éster a Th F y/o BDO y/o GBL.

De acuerdo con una realización preferente para la producción de pirrolidonas este procedimiento comprende: b) la conversión química de sales de amonio ácido succínico obtenidas en las etapas I) o II) a pirrolidonas de una manera conocida per se.

Por detalles sobre la preparación de estos compuestos, se hace referencia a los documentos US-A-2010/0159543yWO-A-2010/092155.

Una contribución a la solución de los problemas mencionados al principio es además proporcionada por un microorganismo modificado genéticamente que comprende

A) al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae.

Las realizaciones preferentes de los microorganismos genéticamente modificados de acuerdo con la presente invención son aquellas realizaciones que han sido descritas con anterioridad como los microorganismos genéticamente modificados preferentes para ser utilizados en el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

Una contribución a la solución de los problemas mencionados al principio es además proporcionada por el uso del microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con la presente invención para la producción fermentativa de compuestos orgánicos, preferentemente ácido succínico, a partir de sacarosa como una fuente de carbono asimilable. Los compuestos orgánicos preferentes y las condiciones preferentes para la producción fermentativa de compuestos orgánicos son aquellos compuestos y condiciones que ya han sido descritos en conexión con la etapa I) del procedimiento del procedimiento de acuerdo con la presente invención.

A continuación, la invención se explica con mayor detalle con la ayuda de ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generación de constructos de eliminación

La construcción de vectores y cepas se llevó a cabo mediante técnicas estándar descritas anteriormente (Becker et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 110 (2013), p. 3013-3023). Todos los mutantes construidos se enumeran en la Tabla 1:

Tabla 1: Nomenclatura de DD1-tipo silvestre y mutantes referidos en los ejemplos

Las secuencias cebadoras específicas utilizadas para la construcción y validación de cepas se dan en la Tabla 2:

Tabla 2: Secuencia cebadora utilizada en los ejemplos

Para la eliminación sin marcador de fruA, codificando PTS de fructosa, se utilizó el vector integrador pClikcm(Becker et al., Metabolic Engineering, Vol. 13 (2011), p. 59-168) y los cebadores PR^fruA1 - PR^fruA4 (Tabla 2). El fragmento de eliminación fruA se ligó en el vector pClik int sacB (Kind et al., Metabolic Engineering, Vol. 12 (2010), p. 341-351) a través de los sitios de restricción Xbal y Xhol. La eliminación deseada de fruA en el genoma fue verificada por PCR. La preparación de cepas de Basfia AfruA mediante plásmidos pSacB_delta_fruA también se desvela enel documento WO 2015/118051 A1.

Para la sobreexpresión de la fructoquinasa (rbsK), se utilizó el plásmido episómico pJFF224 (Frey, Res.Microbiol. Vol.

143 (3) (1992), p. 263-9.1992). El gen fue expresado bajo control del promotor de ackA, codificando la acetato quinasa. Para la fusión sin costuras de promotor y gen, se aplicó PCR de extensión de superposición. Para ello, el promotor ackA y el gen rbsK en primer lugar se amplificaron con la combinación de cebador PR^rbsK1/PR^rbsK2 y PR^rbsK3/PR^rbsK4, respectivamente. Los fragmentos de PCR resultantes se fusionaron en el constructo del gen promotor del tamaño de 1520 bp con PR^rbsK1/PR^rbsK4. La subclonación del constructo PackArbsK en el vector digerido pJFF224 de Xbal y Xhol se realizó utilizando el kit de infusión (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA) y produjo el plásmido pJFF224_P^ackArbsK. La transformación de B. succiniproducens con pJFF224 y pJFF224_PackArbsK se realizó por electroporación (Becker et al., 2011). Los mutantes resultantes (Tabla 1) fueron analizados por PCR y estudios de actividad enzimática. La PCR se realizó de forma rutinaria con polimerasas de lectura de pruebas (Phusion High-Fidelity PCR Kit, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany).

Ejemplo 2 : Cultivo de DD1, DD1 PackArbsK and DD1 AfruAPackArbsK sobre sacarosa

La productividad de la cepa DD1 se comparó con la productividad de las cepas mutantes DD1 PackArbsK y DD1 AfruAPackArbsK en presencia de sacarosa como fuente de carbono. La productividad se analizó utilizando los medios y las condiciones de incubación descritas a continuación.

1. Preparación de medios

Para estudios fisiológicos y para la producción de succinato, serealizó el primer precultivo de B. succiniciproducens en medio complejo, que contenía por litro: 50 g de sacarosa, 5 g de extracto de levadura (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US), 5 g de bacto peptona 144 (Becton Dickinson), 1 g de NaCl, 0,2 g de MgCh-6 H2O, 0,2 g de CaCh-2 H2O, 3 g de K2HPO4, 1 g (NH4)2SO4 y 50 g de MgCO3. Para el segundo precultivo y cultivo principal, se utilizó un medio mínimo, que contenía por litro: 50 g de sacarosa, 1 g de NaCl, 0,2 g de MgCh-6 H2O, 0,2 g de CaCh-2 H2o, 3 g de K2HPO4, 5 g (NH4)2SO4, 3 mg de tiaminaHCl, 0,6 mg de riboflavina, 3 mg de ácido nicotínico, 10 mg de CA-pantotenato, 1 mg de piridoxalHCl, 0,5 mg de biotina, 0,05 mg de cianocobalamina, y 50 g de MgCO3. Se aplicó dióxido de carbono a las botellas de cultivo (matraces de suero) a una sobrepresión de 80 kPa. Para el cultivo de cepas que contenían plásmidos, se añadió cloranfenicol a una concentración final de 50 |jg mMal medio.

Para los ensayos enzimáticos, las células se cultivaron en un medio mínimo que contenía por litro: 50 g de sacarosa, 1 g de NaCl, 0,2 g de MgCh-6 H2O, 0,2 g de CaCh-2 H2O, 3 g de K2HPO4, 5 g (NH4)2SO4, 3 mg de tiaminaHCl, 0,6 mg de riboflavina, 3 mg de ácido nicotínico, 10 mg de CA-pantotenato, 1 mg de piridox-alHCl, 0,5 mg de biotina y 0,05 mg de cianocobalamina con adición automatizada de 1 M Na2CO3 para control de pH.

2. Cultivos

Para el cultivo anaerobio en matraces séricos se realizaron cultivos en botellas de suero de 30 ml, equipadas con sellos de caucho de butilo para el muestreo, y llenadas con 10 ml de medio bajo una atmósfera de CO2 a 80 kPa de sobrepresión. Después de la inoculación de stock sometido a criogenización, el primer precultivo se incubó durante 8 h a 37 °C y a 130 rpm en un agitador orbital. Durante el crecimiento exponencial, las células fueron recolectadas por centrifugación (3 min, 16.000 * g, 16°C), lavadas con 1 ml de medio y utilizadas para inocular el segundo precultivo a una densidad óptica inicial (OD600) de 0,3. Después de 10 h de incubación, se recolectaron y lavaron las células en crecimiento exponencial como se describe anteriormente, y luego se utilizaron para inocular el cultivo principal a un OD600 inicial de 0,08.

3. Análisis

El ácido succínico fue analizado por HPLC. La actividad enzimática se determinó en extractos brutos sin células. Para la preparación de extractos brutos sin células, las células se recolectaron por centrifugación (5 min, 5.000 * g, 4°C), se lavaron con TrisHCl 100 mm (0,75 mm de ditiotreitol, pH 7,8), se resuspendieron en el mismo tampón a una concentración de 0,33 (g de peso húmedo celular) ml-1 y luego se interrumpieron con un homogeneizador de banco (Precellys 24, Peqlab, VWR International GmbH, Darmstadt, Germany)). Las actividades enzimáticas se cuantificaron espectrofotométricamente (Spectronic Helios, Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, 255 USA) a 37°C. La fructoquinasa fue ensayada según lo descrito por Helanto et al 2006) en Tris HCl 100 mm (pH 7,8, MgCh 10 mm), 1 U ml-1de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, 2 U ml-1 de fosfoglucoisomerasa, 1 mm NADP+ y diferentes concentraciones de ATP (0 - 5 mm) y fructosa (0 - 25 mm) para la determinación de parámetros cinéticos.

4. Resultados

Los resultados del ensayo de enzima para la determinación de la actividad de la fructoquinasa en las cepas DD1, DD1 PaCkArbsK y DD1 AfruAPackArbsK se muestran en la Tabla 3:

Tabla 3: Actividad específica de fructoquinasa

La Tabla 4 muestra la formación de ácido succínico a partir de la sacarosa como única fuente de carbono cuando las células se cultivan en un procedimiento por partida:

Secuencias

SEQ ID NÚM.: 1 (secuencia de nucleótidos de ADNr 16 S de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 2 (secuencia de nucleótidos de ADNr 23 S de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 3 (secuencia de nucleótidos de gen rbsK de cepa DD1) atgcatatgacaaacaaaatttgggtattaggcgatgccgtggtggatttaattcctgacggagacaaccattatttgcgttgcgcaggc ggcgcaccggctaatgtggcggtcggcgttgcccgtttaggtgtgcctagcgcatttatcggccgtgtaggtaaagatccgttagggga atttatgcgcgatacgctgaatcaggaaaatgtaaacaccgattatatgttgttagatcctaaacaacgtacttcgacggtggtggttgg attaaccgacggcgaacgtagttttacctttatggtgaatccaagtgcggatcaatttttacaaatttccgatctgccgcaatttcaagccg gagactggttgcactgctgctctatcgccttaatcaatgaaccgacccgcagcgctactttcacggcaatgaaaaatatccgtgcggcc ggcggtaaagtatctttcgatccgaatttacgcgaaagcttatggaaatcccaggatgaaatgatcgatgtggtgatggaagcggtaa gccttgccgacgtattgaaattttcagaagaagaattaacgctgttaacccataccgacagcctggaaaaatcttttgaaaaaatcacc gcactttatcccgataaattgattattgtcactttagggaaagatggcgcgctctatcatctgcacggtaaaaaagaggtggttgcaggg aaagcgctgaaaccggtagataccaccggtgccggcgacgcttttgtcagcgggttattagccggattatcacaaacggaaaactgg cagcaacctgaacaactcgttactattattcgccaggccaacgccagcggcgcgcttgccacaacggcaaaaggcgctatgtcggc attaccgaatcggcaacaattagcggaatttttagcaaactaa

SEQ ID NÚM.: 4 (secuencia de aminoácidos de gen RbsK de cepa DD1)

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ttgaaggataagccgatgaatatttttcttacgcaatcaccaaatttaggtcgtgcaaaagcgtttttattgcaccaggttttggctgccgca gtaaaacaacaaaatcatcaactggtagaaaatgccgaacaagcggatttagcgattgttttcggtaaaactttgcogaatttgaccgc acttttaggtaaaaaagtgtatttggcggatgaagaacaagcgttgaatgcgcctgaaaataccgtcgcgcaggcattaaccgaggct gtggattatgttcaaccggcgcaacaggacgtgcaacccgcaactgcttccggtatgaaaaatatcgtggcggttaccgcttgtccga ccggggtggcgcacacctttatgtctgccgaggcgattacaacctactgccaacagcaaggttggaatgtaaaagtggaaaccaga

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SEQ ID NÚM.: 6 (secuencia de aminoácidos de gen FruA de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 7 (secuencia de nucleótidos de promotor acKA de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 8 (secuencia de nucleótidos de gen IdhA de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 9 (secuencia de aminoácidos de LdhA de cepa DD1)

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SEQ ID NÚM.: 10 (secuencia de nucleótidos de gen pflA de cepa DD1)

atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaa tgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtg acctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactgg ttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgat gacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaaogggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcg aattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgc acatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaa gtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctac gggcttaatgtgacatattag

SEQ ID NÚM.: 11 (secuencia de aminoácidos de gen PflA de cepa DD1)

M SVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTW DLHGGKEISVEELMKEVVTY RHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDW FRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLV LLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTW IRHVW PGYTDSDEDLHM LGNFIKD MKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY

SEQ ID NÚM.: 12 (secuencia de nucleótidos de gen pflD de cepa DD1)

atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgacttt atccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtga tggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttdcacaagcctgg

ttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaat gatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaagg cgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatc ggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaa gcgggcgaagacattcaggcaaclatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatgg cggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacalattttgcttatclggcagcggtt aaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatca ctgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattatt ctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgt attacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgt gcgaaagtatctattgatactlcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcat gctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaac ggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcg aacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatg aagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatc cgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggogacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctogaatgttgctatcga cttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaa aaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaa accggtaatactocggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggt gcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattag gtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaa cacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcag gttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa

SEQ ID NÚM.: 13 (secuencia de aminoácidos de PflD de cepa DD1)

MAELTEAQKKAW EGFVPGEW QNGVNLRDFIQKNYTPYEGDESFLADATPATSELW NSVMEGI KIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGR KLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYL MKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQ WTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRT PEYDQLFSGDPMW ATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILW SEQLPEAF KRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAI NGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDW LATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAAL MAFHDRDVFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGEYPQ FGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAP FGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDG YFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRT FTQSM

SEQ ID NÚM.: 14 (secuencia de nucleótidos de cebador PRfruAl)

tgctctagatgcggaagagagcctttccgg

SEQ ID NÚM.: 15 (secuencia de nucleótidos de cebador PRfruA2) caccaggttggctgcgcagtaaaacaatttcctaatcaagcataaagccttttttttttctc

SEQ ID NÚM.: 16 (secuencia de nucleótidos de cebador PRfruA3) gagataacaaaggctttatgcttgattaggaaattgttttttttttgcggcagccaaaacctggtg

SEQ ID NÚM.: 17 (secuencia de nucleótidos de cebador PRfruA4) ccgctgagtaggagtaactcaaggtcaccgtgtttg

SEQ ID NÚM.: 18 (secuencia de nucleótidos de cebador PRrbsKl)

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SEQ ID NÚM.: 19 (secuencia de nucleótidos de cebador PRrbsK2) gtttgtcatatgcattgaacgaatagacgtttgggaatgtta

SEQ ID NÚM.: 20 (secuencia de nucleótidos de cebador PRrbsK3) acgtctattgttcaatgcatatgacaaaatttgtattag

SEQ ID NÚM.: 21 (secuencia de nucleótidos de cebador PRrbsK4) gggccccccctcgagcctagcttaaagatagccggtaaa

SEQ ID NÚM.: 22 (secuencia de nucleótidos de plásmido pJFF224_PaCKA/'£)s/<4) ccccggagtggttcgacggcctcaagcgcgccgccgagggccgccgcctgatggtgctggacacgctgcgccggttccacatcga ggaagaaaacgccagcggccecatggcccaggtcatcggtcgcatggaggccatcgccgccgataccgggtgctctatcgtgttcc tgcaccatgccagcaagggcgcggccatgatgggcgcaggcgaccagcagcaggccagccggggcagctcggtactggtcgat aacatccgctggcagtcctacctgtcgagcatgaccagcgccgaggccgaggaatggggtgtggacgacgaccagcgccggttctt cgtccgcttcggtgtgagcaaggccaactatggcgcaccgttcgctgatcggtggttcaggcggcatgacggcggggtgctcaagcc cgccgtgctggagaggcagcgcaagagcaagggggtgccccgtggtgaagcctaagaacaagcacagcctcagccacgtccg gcacgacccggcgcactgtctggcccccggcctgttccgtgccctcaagcggggcgagcgcaagcgcagcaagctggacgtgac gtatgactacggcgacggcaagcggatcgagttcagcggcccggagccgctgggcgctgatgatctgcgcatcctgcaagggctg gtggccatggctgggcctaatggoctagtgcttggcccggaacccaagaccgaaggcggacggcagctcoggctgttcctggaacc caagtgggaggccgtcaccgctgatgccatggtggtcaaaggtagctatcgggcgctggcaaaggaaatcggggcagaggtcgat 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cggggcgctggtgtcgcccggtggtgccggtaaatccatgctggccctgcaactggccgcacagattgcaggcgggccggatctgct ggaggtgggcgaactgcccaccggcccggtgatctacctgcccgccgaagacccgcccaccgccattcatcaccgcctgcacgcc

eltggggGgcaGctcagegccgaggaacggeaagccgtggctgacggcctgctgatGcagccgctgatcggcagcctgcccaaca tcatgg

SEQ ID NÚM.: 23 (secuencia de nucleótidos de plásmido pClikCMAfru^)

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de producción de un compuesto orgánico, comprendiendo el procedimiento

I) cultivar un microorganismo modificado genéticamente en un medio de cultivo que comprende la sacarosa como una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado genéticamente produzca el compuesto orgánico,

II) recuperar el compuesto orgánico del caldo de fermentación obtenido en la etapa I del procedimiento), en el que el microorganismo modificado genéticamente comprende

A) al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que al menos una modificación genética A) comprende una sobreexpresión del gen rbsK,

en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae y en el que el compuesto orgánico es ácido succínico.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo original pertenece al género Basfia.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el microorganismo original pertenece a la especie Basfia succiniproducens.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el microorganismo original es la cepa DD1 de Basfia succiniproducens depositada bajo DSM 18541 con DSMZ, Alemania.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gen rbsK comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a1) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 3;

b1) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 4;

c1) ácidos nucleicos que son al menos un 70% idénticos al ácido nucleico de a1) o b1), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a1) o b1);

d1) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a1) o b1), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a1) o b1); e1) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a1) o b1); y

f1) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a1) o b1), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a1) o b1) anteriores debido a la degeneración del código genético.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo modificado genéticamente además comprende

B) al menos una modificación genética que conduce a una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen fruA, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el gen fruA comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a2) ácidos nucleicos con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 5;

b2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 6;

c2) ácidos nucleicos que son al menos un 70% idénticos al ácido nucleico de a2) o b2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a2) o b2);

d2) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a2) o b2), con la identidad siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a2) o b2); e2) ácidos nucleicos capaces de hibridación en condiciones estrictas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a2) o b2); y

f2) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a2) o b2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a2) o b2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que al menos una modificación genética B) comprende una modificación del gen fruA, una modificación de un elemento regulador del gen fruA o una de sus combinaciones.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que al menos una modificación B) comprende una inactivación del gen fruA.

10. Un microorganismo modificado genéticamente que comprende

A) al menos una modificación genética que conduce a una mayor actividad de la enzima codificada por el gen rbsK, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que al menos una modificación genética A) comprende una sobreexpresión del gen rbsK y

B) al menos una modificación genética que conduce a una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen fruA, en comparación con el microorganismo original que no ha sido modificado genéticamente, en el que al menos una modificación B) comprende una inactivación del gen fruA,

en el que el microorganismo original pertenece a la familia Pasteurellaceae.

11. Uso de un microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 10 para la producción fermentativa de un compuesto orgánico a partir de sacarosa como una fuente de carbono asimilable.