ES2559385T3

ES2559385T3 - Células bacterianas que tienen una derivación de glioxilato para la fabricación de ácido succínico

Info

Publication number: ES2559385T3
Application number: ES09178048.6T
Authority: ES
Inventors: Edzard Dr. Scholten; Stefan Dr. Haefner; Hartwig Dr. Schröder
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2016-02-11
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: EP2202294A1; US8877466B2; US20100159543A1; EP2202294B1

Abstract

Una célula bacteriana del género Pasteurella que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad isocitrato liasa y un polipéptido heterólogo que tiene actividad malato sintasa.

Description

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aparato conocido per se en varios diseños.

Por ejemplo, se puede utilizar una planta de esterificación que funciona en modo continuo que comprende una columna de rectificación con un número apropiado de estadios teóricos que se consiguen por instalación de bandejas o paquetes. La carga acuosa que comprende la sal amónica de SA se alimenta en la parte superior de la columna a partir de un envase de depósito tan pronto como se forme un estado estable del perfil de temperaturas en la columna como resultado de la alimentación de alcanol que se evapora en el bucle evaporador adherido al colector de la columna. La reacción forma un flujo de contracorriente de descenso del líquido que contiene sal de amonio y se condensa, y de ascenso de la fase de vapor que contiene alcanol. Para catalizar la reacción de catálisis, se puede añadir un agente catalítico homogéneo a la carga inicial de sal de amonio. De manera alternativa, se pueden proporcionar agentes catalíticos heterogéneos en el interior de la columna. El éster carboxílico que se forma es líquido bajo las condiciones del proceso y entra por medio del extremo inferior de la columna en el colector de la columna de destilación y se retira continuamente del colector. Los componentes gaseosos, por ejemplo las mezclas azeotrópicas que comprenden alcanol-agua y/o amoniaco, se retiran de la columna de reacción y por lo tanto del equilibrio de reacción en la parte superior de la columna.

Se pueden implementar más modificaciones de las realizaciones específicas descritas anteriormente por el experto en la técnica sin un esfuerzo inaceptable.

los intervalos de parámetros del proceso adecuados para el proceso de esterificación de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente por el experto en la técnica dependiendo de la configuración del aparato que se utilice, por ejemplo, el tipo de columna interna que se utilice, el tipo y cantidad de los reactivos, tipo y cantidad de los agentes catalíticos que se utilicen si es apropiado. Por ejemplo, sin ser restrictivos a estos, los parámetros individuales se pueden establecer con los siguientes intervalos de parámetros:

Temperatura de la columna: 0-300 ºC, en particular 40-250 ºC, o 70-200 ºC Presión: desde 0,1 a 6 bares, en particular presión de referencia Tiempo de residencia: unos pocos segundos (por ejemplo de 1 a 60) hasta días (por ejemplo de 1 a 5), en particular de unos pocos minutos (por ejemplo de 1 a 60) a unas pocas horas (por ejemplo 1 a 15), más preferentemente desde unos pocos minutos (por ejemplo desde 5 a 20) a 2 h.

b) Proceso de hidrogenación

Los ésteres de SA que se preparan de acuerdo con la invención se hidrogenan de una manera conocida per se utilizando procesos, aparatos y asistentes, tales como agentes catalíticos, familiares para el experto en la técnica.

En particular, se lleva a cabo la hidrogenación de fase gaseosa de una manera continua o discontinua en presencia de un agente catalítico heterogéneo adecuado para la hidrogenación de un éster. Los parámetros óptimos del proceso pueden establecerse por un experto en la técnica para el éster en particular sin un esfuerzo inaceptable. Por ejemplo, la temperatura de la reacción está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 ºC, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 200 a 280 ºC, y la presión es desde aproximadamente 5 a 100 bares, por ejemplo desde 10 a 50 bares. La relación molar de reactivo respecto a hidrógeno se fija en el intervalo en el intervalo de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:2000, por ejemplo de 1:800 a 1:1500.

Los agentes catalíticos que se pueden utilizar para la reacción de hidrogenación inventiva se conocen por el experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar varios agentes catalíticos de cobre. La técnica anterior describe, por ejemplo, el uso de agentes catalíticos de cobre cromita que se pueden obtener bajo el nombre 85/1 en Davy Process Technology Ltd., Inglaterra. Sin embargo, los agentes catalíticos adecuados de acuerdo con la invención son agentes catalíticos de óxido de cobre de soporte, el óxido de cobre se aplica a materiales de soporte de alúmina o silicio. También se conocen en la técnica ejemplos de la hidrogenación de ésteres succínicos en BDO (1,4Butanodiol)/GBL (gamma-butirolactona)/THF con agentes catalíticos de cobre.

La fermentación como se utiliza de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo en fermentadores con agitado, columnas de burbujas y reactores de bucle. Los tipos de procedimientos posibles que incluyen los tipos con agitado y los diseños geométricos se conocen bien en la técnica y se pueden encontrar en los libros de texto convencionales. En el proceso, las típicas variantes disponibles son las siguientes variantes conocidas por los expertos en la técnica o que se explican, por ejemplo, en un libro de texto de referencia (Chmiel H, Hammes WP, Bailey JE, 1987, "Biochemical engineering. A challenge for interdisciplinary cooperation.", ISBN: 3-437-30574-3.), tal como una fermentación discontinua, de alimentación discontinua, de alimentación discontinua repetida o continua con y sin reciclado de la biomasa. Dependiendo de la cepa de producción, se puede/debe efectuar el rociado con aire, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o mezclas de gases adecuadas con el fin de conseguir buenos rendimientos.

Antes de la conversión química en el caldo de fermentación en el proceso de acuerdo con la invención, se puede pre-tratar el caldo de fermentación; por ejemplo, se puede retirar la biomasa del caldo. Los procesos para retirar la biomasa son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, filtración, sedimentación y flotación. En consecuencia, se puede retirar la biomas, por ejemplo, con centrífugas, separadores, decantadores, filtros o en un aparato de flotación. Para la recuperación máxima del producto con valor, a menudo es aconsejable lavar la

biomasa, por ejemplo en forma de una diafiltración. La selección del procedimiento depende del contenido de biomasa en el caldo fermentador y las propiedades de la biomasa, y también la interacción de la biomasa con el producto con valor. En una realización, el caldo de fermentación se puede esterilizar o pasteurizar.

En una realización más, el caldo de fermentación está concentrado. Dependiendo de las necesidades, esta

5 concentración se puede hacer de manera discontinua o continua. El intervalo de presión y temperatura se debería seleccionar de manera que primariamente no se produzca un daño en el producto, y secundariamente es necesario un uso mínimo del aparato y de energía. La selección hábil de los niveles de presión y temperatura en una evaporación multiestadio en particular hace posible el ahorro energético.

La expresión “caldo de fermentación” se entiende que significa una solución acuosa que está basada en un proceso 10 fermentativo y que no se ha preparado, o se ha preparado, por ejemplo, como se describe en el presente

documento. En términos de aparatos, los depósitos con agitado, los evaporadores de película descendente, evaporadores de película fina, evaporadores de circulación ultrarrápida forzada y otros tipos de evaporación que se pueden utilizar en modo de circulación natural o forzada.

15 Figuras Figura 1: Un mapa esquemático del plásmido PSacB. Figura 2: Un mapa esquemático del plásmido PSacB (delta IdhA) (lactato deshidrogenasa). Figura 3: Un mapa esquemático pSacB (delta pflDK) (piruvato formiato liasa). Figura 4: Un mapa esquemático de un plásmido de expresión pJFF224 (icl ms Y.m.) para la expresión del

20 operón de derivación de glioxilato de Yersinia mollaretii (isocitrato liasa (icl) y malato sintasa (ms)).

Figura 5: Un mapa esquemático del plásmido pJFF224 (icl ms S.t.) para la expresión del operón de derivación de Salmonella typhimurium. Figura 6: Un mapa esquemático del plásmido pJFF224 (icl ms Y.m.). Figura 7: Un mapa esquemático del plásmido pJFF224 (PpckA fdh C.b.).

25 Figura 8: Un mapa esquemático del pSacB (delta adhE).

Figura 9: Un mapa esquemático de un plásmido de expresión pJFF224 (fdh W.s.) para la expresión de la formiato deshidrogenasa en W. succinogenes (fdh W.s.). Figura 10: Un mapa esquemático de un plásmido de expresión pJFF224 (fdh C.b.) para la expresión de formiato

deshidrogenasa en Candida boidinii (fdh C.b.). 30 Figura 11: Las secuencias de la SEC ID Nº 1 a 21. La invención se describirá ahora por los siguientes ejemplos que no se conciben, en absoluto, como una limitación de su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1: Transformación de DD1

35 Tabla 1: Nomenclatura de las DD1 de tipo silvestre y mutantes a las que se hace referencia en los Ejemplos

Cepa: Descripción

LU13843: DD1 tipo silvestre (depositado como DSM18541)

LU15050: DD1 delta ldh

LU15224: DD1 delta ldh pflD

LU15224 pJFF224 (icl ms Y.m.): DD1 delta ldh pflD pJFF224 (icl ms Y.m.)

LU15224 pJFF224: DD1 delta ldh pflD pJFF224

LU13843 pJFF224: pJFF224

(continuación)

Cepa: Descripción

LU 13843 pJFF224 (icl ms S.t.): DD1 pJFF224 (icl ms S.t.)

LU15050 pJFF224: DD1 delta ldh pJFF224

LU15050 pJFF224 (icl ms S.t.): DD1 delta ldh pJFF224 (icl ms S.t.)

LU 15050 pJFF224 (icl ms Y.m.) LU 15050 pJFF224 (icl ms Y.m.): DD1 delta ldh pJFF224 (icl ms Y.m.)

LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b.): DD1 pJFF224 (PpckA fdh C.b.)

LU 15050 pJFF224 (PpckA fdh C.b.): DD1 delta ldh pJFF224 (PpckA fdh C.b.)

LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.): DD1 pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.)

LU15050 delta adhE.: DD1 delta ldh delta adhE

LU15050 delta adhE. pJFF224 (PpckA fdh C.b.): DD1 delta ldh delta adhE pJFF224 (PpckA fdh C.b.)

LU 13843 pJFF224 (fdh W.s.): DD1 pJFF224 (fdh W.s.)

LU 15050 pJFF224 (fdh W.s.): DD1 delta ldh pJFF224 (fdh W.s.)

LU 15050 delta adhE pJFF224 (fdh. W.s.): DD1 delta ldh delta adhE pJFF224 (fdh W.s.).

Se transformó la cepa LU13843 de Pasteurella con ADN por electroporación utilizando el siguiente protocolo:

Pre-cultivo:

5 Se inoculó la LU 13843 a partir de un cultivo reciente en placa BHI-Agar en 40 ml de BHI (infusión cerebro corazón, Difco) en matraces de agitado de 100 ml. Se llevó a cabo la incubación una noche a 30 ºC; 200 rpm.

Cultivo principal:

50 ml de BHI en matraz de agitado de 100 ml Inoculado hasta una DO final (610) de 0,4 10 Incubación: aproximadamente 1,5 h a 30 ºC, 200 rpm Las células se recolectaron a una DO de aproximadamente 1,3

El aglomerado se lavó una vez con glicerol al 10% frío a 4 ºC Se resuspendió en 1,7 ml de glicerol al 10% (4 ºC)

Se mezclaron 100 l de células competentes con 5-10 g de ADN (10-20 l) y se mantuvieron en hielo durante 2 min 15 en una cubeta de electroporación con una anchura de 0,2 cm.

Condiciones de electroporación: 800 ; 25 F; 2 kV (Gene Pulser, Bio-Rad)

Adición de 1 ml de BHI inmediatamente después de la electroporación Incubación durante 2 h a 30 ºC

Las células se colocaron en placas con BHI con 5 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante 2-5 d a 30 ºC hasta 20 que las colonias de las transformadas eran visibles. Se aislaron los clones y se re-sembraron en estrías en BHI con 5 mg/l de cloranfenicol hasta que se obtenía la pureza de los clones.

Ejemplo 2: Generación de construcciones de eliminación

Los plásmidos de eliminación se construyeron basándose en el vector pSacB (SEC ID Nº 9). La Figura 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB. Las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del fragmento cromosómico que se 25 debería eliminar se amplificaron por PCR a partir del ADN cromosómico de LU 13843 y se introdujeron en el vector utilizando utilizando técnicas de referencia. Normalmente, al menos un 80% de la ORF se seleccionó para eliminación. De tal manera, se construyeron los plásmidos de eliminación para la lactato deshidrogenasa IdhA, pSacB (delta IdhA), y para la piruvato formiato deshidrogenasa pflD, pSacB (delta pflD). Las Figuras 2 y 3 muestran

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2. Preparación de MCB

Se inocularon de nuevo dos placas de agar con la cepa deseada y se incubó a 37 ºC en una jarra anaeróbica (Anaerocult A, Merck) durante una noche. La biomasa se sacó de las placas y se resuspendieron en el medio líquido libre de MgCO3 con 20 g/l de glucosa y se ajustó a una DO 1,0. La inoculación se llevó a cabo con 0,5 ml de esta suspensión celular. Los cultivos se llevaron a cabo en botellas de suero de 100 ml con tapones de goma de butilo ajustados con gas (Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Alemania) que contenían 50 ml del medio líquido con 20 g/l de glucosa y 30 g/l de MgCO3 y una atmósfera de CO2 con una sobre presión de 0,8 bares. Las botellas de suero (en total 10) se incubaron a 37 ºC, con una velocidad de rotación de 160 rpm y un diámetro de agitado de 2,5 cm.

Para controlar el consumo de glucosa, el cultivo de una botella se paró y se muestreó y se llevaron a cabo análisis HPLC tras 0, 3, 4, 5, 7, 8 y 8,5 h. Tras 8,5 h (la concentración de glucosa era de 3,4 g/l) se paró el cultivo. Se llenaron crioviales con alícuotas de 0,5 ml de la suspensión celular y 0,5 ml de glicerol estéril, se mezclaron y se almacenaron durante 13 horas a -20 y después a -80 ºC como MCB. La MCB se ensayó en cuanto a su pureza sembrando radialmente un asa del último criovial en placas de agar para el control de la contaminación y la comprobación en cultivo líquido (el medio que se describe en la tabla 8) del espectro del producto y la contaminación (por microscopía).

El consumo de glucosa y la formación de SA y productos secundarios se cuantificaron por medio de análisis HPLC de los sobrenadantes libres de células sin diluir del caldo de cultivo utilizando una detección RI. Las muestras de caldo se tomaron con jeringa estéril a través del tapón de goma de butilo, la separación celular se llevó a cabo por filtración (0,22 m). Se utilizaron una Columna I.D de 300 x 7,8 Aminex HPX-87 H (Biorad) y 5 mm de H2SO4 como fase fija y móvil respectivamente. La temperatura de la columna era 30 ºC, la velocidad de flujo era de 0,5 ml min-1 .

3. Preparación de WCB

Se utilizó un vial de MCB para inocular una botella de suero de 100 ml con tapón de goma de butilo ajustado con gas (véase anteriormente) que contenía 50 ml de medio líquido con 50 g/l de glucosa. Se llevó a cabo la incubación durante 10 h a 37 ºC en una incubadora rotatoria (velocidad de rotación: 180 rpm, diámetro de agitado: 2,5 cm). Al final del cultivo la concentración de glucosa era de 20 g/l y el pH alrededor de 6,5. Se llenaron crioviales con alícuotas de 0,5 ml de suspensión celular y 0,5 ml de glicerol estéril, se mezcló y se almacenó a -80 ºC como WCB. Las comprobaciones de pureza serán las mismas que para la MCB. Las condiciones de la HPLC eran las mismas que las descritas anteriormente.

Ejemplo 5: Fermentación de las cepas mutantes LU15224 pJFF224 (icl ms Y.m.) y LU15224 pJFF224

La cepa mutante de DD1 LU15224 pJFF224 (icl ms Y.m.), que es un doble anulación de ldh y pflD y que sobreexpresa el plásmido pJFF224 (icl ms Y.m.), que contenía los genes del operón de derivación de glioxilato, se analizó por experimentos de fermentación anaeróbica en comparación con la cepa del plásmido de control LU15224 pJFF224, que contenía el mismo fondo genético que LU15224 pJFF224 (icl ms Y.m.) pero solo un plásmido de expresión pJFF224 vacío. Las cepas mutantes se generaron como se describe en los ejemplos 1 a 3.

1. Preparación del medio

La composición del medio de cultivo se describe en la siguiente tabla 4.

Tabla 4: Composición del medio para cultivos discontinuos de mutantes DD1 con sobre-expresión de plásmidos

Compuesto Concentración [g/l] Concentration de solución de reserva [g/l]

Monohidrato de Glucosa: 50 722

Bacto extracto de levadura (Becton Dickinson): 5 100

(NH4)2 SO4: 1 500

CaCl2*2H2O: 0,2 20

MgCl2*6H2O: 0,2 20

NaCl: 1 100

K2HPO4: 3 500

Cloranfenicol: 0,005 5

MgCO3 a: 50 -

a El MgCO3 se utilizó como agente tamponante solo en los experimentos con botellas de suero.

El MgCO3 se suplementó con ddH2O y se esterilizó en el autoclave en botellas de suero. El extracto de levadura, glucosa, sulfato amónico y fosfato potásico se esterilizaron en el autoclave por separado. Los cloruros de Ca, Mg y Na se esterilizaron juntos en el autoclave. Tras el enfriamiento los fermentadores ddH2O esterilizados en autoclave y

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las botellas de suero se añadieron los componentes perdidos como soluciones de reserva estériles. Para sembrar los cultivos se utilizó el mismo medio.

2. Cultivos y analíticas

El cultivo sembrado se cultivó anaeróbicamente en botellas de suero de 100 ml con tampón de goma de butilo ajustado con gas que contenían 50 ml de medio a 37 ºC en una incubadora con agitado (velocidad de rotación: 170 rpm, diámetro de agitado: 2,5 cm). Se llevó a cabo la inoculación del cultivo sembrado con 1 ml de WBC (como se ha descrito en el ejemplo 4) bajo condiciones estériles. Inmediatamente tras la inoculación se sustituyó el gas de la atmósfera aeróbica por CO2 puro con una sobrepresión de aproximadamente 0,8 bares. Tras 11 h y 17 h de incubación para LU15224 pJFF224 (icl ms Y.m.) y LU15224 pJFF224, respectivamente, el fermentador se inoculó con 20 ml para iniciar el cultivo en el fermentador de 500 ml (Sixfors, Infors Suiza) que contenía 380 ml de medio de cultivo que se había gaseado durante una noche con CO2 para asegurar las condiciones libres de oxígeno. La temperatura de cultivo se mantuvo a 37 ºC y el pH a 6,5 con un 25% de NH4OH. La corriente de CO2 gaseoso se ajustó a 0,4 * min-1. La velocidad de agitado se ajustó a 500 rpm.

El consumo de glucosa y la formación de SA y productos secundarios se cuantificaron por medio de HPLC como se describe en el ejemplo 4.

3. Resultados

Los resultados se resumen en la tabla 5 que muestra los valores tras el agotamiento de glucosa.

La sobre-expresión heteróloga de los genes de derivación de glioxilato dan lugar a un aumento significativo del rendimiento de succinato en comparación con la cepa control LU15224 pJFF224. También se detectaba que el acetato se producía con un título más bajo en pJFF224 (icl ms Y.m.), en comparación con el control, dando a entender que se introducía un flujo mejorado de piruvato por medio de la acetil-CoA, isocitrato, malato, fumarato a succinato por el operón de derivación de glioxilato heterólogo.

Tabla 5: Producción de succinato por la pJFF224 (icl ms Y.m.) mutante y con plásmido de control LU15224 pJFF224, tras el agotamiento de glucosa en un caldo de fermentación SixFors

Parámetro LU15224 pJFF224 (icl ms Y. m.) LU15224 pJFF224

Volumen final del caldo de fermentación [ml]: 432 435

glucosa consumida [g]: 22,98 23,17

succinato producido [g]: 20 19,16

rendimiento de succinato [g/g]: 0,87 0,83

lactato producido [g]: 0 0

piruvato producido [g]: 0 0

acetato producido [g]: 3,12 3,26

formiato producido [g]: 0 0

Ejemplo 6: Clonación y expresión del operón de derivación de glioxilato de Salmonella typhimurium LT2

En otra realización el operón de derivación de glioxilato de Salmonella typhimurium (S. typhimurium) LT2 ATCC 15227 se amplificó por PCR clonado del ADN cromosómico de S. typhimurium LT2 ATCC 15277 utilizando la ADN polimerasa PfuTurbo™ (Roche) y se insertó en el vector pJFF224. La expresión de los genes de esta construcción se dirigió por el promotor nativo del operón así como por un promotor T4 localizado en el vector pJFF224. La Figura 5 muestra un mapa esquemático del plásmido resultante denominado pJFF224 (icl ms S.t.). La cepa DD1 (denominada LU13843) se transformó con el plásmido pJFF224 (icl ms S.t.) como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo un experimento con botella de suero y se analizó como se ha descrito anteriormente. Se puede encontrar que con la sobre-expresión del operón de derivación de glioxilato de S. typhimurium la producción de ácido succínico estaba aumentada sobre el control. El rendimiento de glucosa convertida en succínico aumentó de 0,42 g de SA/g de glucosa a 0,51 g de SA/g de glucosa.

Tabla 6: Resultados tras la expresión del operón de derivación de glioxilato de S. typhimurium LT2 en LU13843

Cepa: ácido succínico ácido láctico ácido fórmico ácido acético rendimiento de ácido succínico g de SA/g de sustrato

LU13843 pJFF224: 15,1 10,1 6,8 7,5 0,42

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LU13843 pJFF224 (icl ms S.t.): 18,1 6,5 6 8,1 0,51

Ejemplo 7: Expresión de la cepa del operón de derivación de glioxilato de S. typhimurium LT2 en la cepa DD1 delta LDH (LU15050)

Se transformó la cepa DD1 delta ldh (LU15050) con el plásmido pJFF224 (icl ms S.t.) como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo un experimento en botellas de suero y se analizó como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron una noche con placas de agar BHI con cloranfenicol, añadido a 4 g/ml. Las células se rascaron de la placa de agar y se inocularon con una DO de 600 nm de 0,1. Se puede encontrar que con la sobreexpresión del operón de derivación de glioxilato de S. typhimurium en LU15050 la producción de ácido succínico aumentó sobre el control. El rendimiento de glucosa convertida en succínico aumentó de 0,62 g de SA/g de glucosa a 0,72 g de SA/g de glucosa.

Tabla 7: Resultados tras la expresión del operón de derivación de glioxilato de S. typhimurium LT2 en LU15050

ácido succínico: ácido láctico ácido fórmico ácido acético rendimiento de ácido succínico, g de SA/g de sustrato

LU15050: 31,10 6,40 7,11 0,98 0,62

LU15050 pJFF224 (icl ms S.t.): 35,90 5,60 7,50 1,15 0,72

Ejemplo 8: Clonación y expresión del operón de derivación de glioxilato de Yersinia mollaretii ATCC 43969

En otra realización el operón de derivación de glioxilato de Yersinia mollaretii (Y. molaretii) ATCC 43969 se amplifica por PCR clonado del ADN cromosómico de Y. molaretii ATCC 43969 utilizando la ADN polimerasa PfuTurbo™ (Roche) y se insertó en el vector pJFF224. La expresión de los genes en esta construcción está dirigida por el promotor nativo del operón así como por un promotor T4 localizado en el vector pJFF224. La Figura 6 muestra un mapa esquemático del plásmido resultante llamado pJFF224 (icl ms Y.m.). Se transformó la cepa DD1 delta ldh (LU15050) con el plásmido pJFF224 (icl ms Y.m.) como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo un experimento con botellas de suero utilizando 48 g/l de glucosa y se analizó como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron durante una noche en placas agar BHI con cloranfenicol, añadido a 4 g/ml. Las células se rascaron de la placa de agar y se inocularon con una DO 600 nm de 0,1. Se puede encontrar que con la sobreexpresión del operón de glioxilato de Y. molaretii en LU15050 la producción de ácido succínico estaba aumentada significativamente sobre el control. El rendimiento de glucosa que se convertía en succínico estaba aumentada de 0,60 g de SA/ g de glucosa para LU15050 a 0,69 g de SA/ g de glucosa para LU15050 pJFF224 (icl ms Y.m.).

Tabla 8: Resultadlos de la expresión del operón de glioxilato de Y. molaretii ATCC 43969 en LU15050

ácido succínico: ácido fórmico ácido acético rendimiento de ácido succínico, g de SA/g de sustrato

LU 15050: 28,7 5,2 7,3 0,60

LU 15050 pJFF224 (icl ms Y.m.): 33,0 5,5 6,7 0,69

Ejemplo 9: Clonación y expresión del gen formiato deshidrogenasa de Candida boidinii

El gen de la formiato deshidrogenasa (fdh) de Candida boidinii (C. boidinii) ATCC 18810 se amplificó por PCR a partir del ADN cromosómico de C. boidinii ATCC 18810 utilizando la ADN polimerasa PfuTurbo™ (Roche). El gen se fusionó con el promotor PpckA de la cepa DD1 y se insertó en el vector pJFF224. La expresión de los genes de esta construcción se dirigía por el promotor PpckA así como por un promotor T4 localizado en el vector pJFF224. La Figura 7 muestra un mapa esquemático del plásmido resultante llamado pJFF224 (PpckA fdh C.b.). Se transformaron las cepas DD1 (LU13843) y DD1 delta Idh (LU 15050) con el plásmido pJFF224 (PpckA fdh C.b.) como se ha descrito anteriormente. Las cepas resultantes se seleccionaron en agar que contenía 4 g/ml de

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cloranfenicol.

La productividad de ácido succínico se analizó como se ha descrito anteriormente. Se encontró que con la sobreexpresión de fdh la cantidad de ácido succínico estaba aumentada de 27,5 a 30,3 g/l, mientras que la cantidad de formiato como producto secundario estaba reducida a menos de 0,1 g/l o 0,16 g/l en LU15050. El rendimiento de ácido succínico aumentaba de 0,57 a 0,63 en LU 13843 o de 0,67 a 0,68 para LU 15050.

Tabla 9: Resultados tras la expresión de fdh de C. boidinii en LU 13843 y LU 15050

Cepa: ácido succínico ácido láctico ácido fórmico ácido acético rendimiento de ácido succínico, g de SA/g de sustrato

LU 13843 pJFF224: 27,5 7,80 4,74 7,32 0,57

LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b.): 30,3 5,82 - 6,39 0,63

LU 15050 pJFF224: 32,40 0,26 4,51 7,19 0,67

LU 15050 pJFF224 (PpckA fdh C.b.): 32,61 0,25 0,16 6,59 0,68

Ejemplo 10: Sobre-expresión simultánea del gen de la formiato deshidrogenasa de C. boidinii y el operón de derivación de glioxilato de Y. molaretii

El gen de la formiato deshidrogenasa de C. boidinii ATCC 18810 bajo el control del promotor PpckA y el operón de derivación de glioxilato de Y. molaretii bajo el control del promotor EFTU de DD1 se insertaron en el vector pJFF224 para dar lugar al pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.). La expresión de los genes en esta construcción se dirige por un promotor PpckA, el promotor PEFTU así como por el promotor T4 localizado en el vector pJFF224. La Figura 7 muestra un mapa esquemático del plásmido resultante llamado pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.). Las cepas LU13843 y LU 15050 se transformaron con el plásmido pJFF224 y pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.) como se ha descrito anteriormente. Las cepas resultantes se seleccionaron en agar que contenía 4 g/ml de cloranfenicol. La productividad de ácido succínico se analizó como se ha descrito anteriormente excepto que se añadió xilosa como fuente de carbono en vez de glucosa. Se encontró que con la sobre-expresión de fdh la cantidad de ácido succínico estaba aumentada de 37,6 g/l a 36,4 g/l, mientras que la cantidad de ácido láctico como producto secundario estaba reducida de 2,1 g/l a 1,7 g/l en LU 13843. El rendimiento de ácido succínico aumentó de 0,75 en LU 13843 a 0,76 en LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.).

Tabla 10: Resultados tras la expresión de fdh de C. boidinii y el operón de derivación de glioxilato de Y. molaretii in LU 13843 tras crecer en xilosa.

LU 13843 pJFF224: 35,6 2,1 3,4 10,2 0,75

LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b., PEFTU icl ms Y.m.): 36,4 1,7 3,9 10,4 0,76

Ejemplo 11: Eliminación del gen adhE de cepas DD1 y DD1 mutantes

El gen adhE se identificó en el cromosoma del genoma de DD1 por análisis de secuencia utilizando el gen adhE conocido de E. coli y analizando homólogos en DD1. Se obtuvo un fragmento de eliminación para el gen adhE por medio de amplificación PCR de 1500 pb que cubría la región corriente arriba y la respectiva región corriente abajo del gen adhE de DD1 con cebadores directos e inversos que portaban las secuencias de restricción para XhoI y XbaI. El fragmento se purificó y se digirió con XhoI y XbaI, así como el vector que adicionalmente se desfosforiló. El vector ligado que porta el fragmento del genoma de DD1 con las regiones corriente arriba y abajo de adhE se propagó en E. coli y se utilizó para la transformación de DD1. La cepa LU15050 DD1 delta Idh se transforma como se ha descrito anteriormente con el pSacB (delta adhE) y se “Campbella dentro” para dar lugar a una cepa “Campbell dentro”. La Figura 8 muestra un mapa esquemático del pSacB (delta adhE). La transformación e integración en el genoma de LU 15050 se confirma por las bandas que da lugar la PCR para el evento de integración del plásmido en el genoma de LU 15050. La cepa “Campbell dentro” entonces se “Campbella fuera” utilizando placas de agar que contienen sacarosa como medio de contra selección, que se seleccionan por la pérdida (de función) del gen sacB. Por lo tanto, las cepas “Campbell dentro” se incuban en 25-35 ml de medio no

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Claims

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