KR101575912B1

KR101575912B1 - 파스테우렐라세애의 카복실산 생산 구성원

Info

Publication number: KR101575912B1
Application number: KR1020107005763A
Authority: KR
Inventors: 에드차르트 숄텐; 디르크 대겔레; 슈테판 해프너; 하르트비히 슈뢰더
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2008-08-14
Publication date: 2015-12-08
Also published as: EP2185682B1; CN102317432B; BRPI0815409B1; CA2696666C; JP2010536329A; CN103589662A; EP2505637B1; WO2009024294A8; EP2505637A1; ES2764410T3; CA2696666A1; ES2587402T3; BRPI0815409A2; JP2014158474A; JP5564426B2; WO2009024294A1; US20110008851A1; US9631211B2; EP2185682A1; CN102317432A

Abstract

본 발명은 유기산, 특히 석신산 (SA)을 생산할 수 있는 능력을 지니고 있고, 소의 반추위 (rumen)로부터 최초로 단리되었으며, 탄소원으로서 글리세롤을 활용할 수 있는, DD1로 명명된 신규한 세균성 균주; 및 이러한 능력을 보유하고 있으면서 상기 균주로부터 유래된 변이체 균주 뿐만 아니라 상기 미생물을 사용함으로써 유기산, 특히 석신산을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

Description

파스테우렐라세애의 카복실산 생산 구성원{Carboxylic acid producing member of the Pasteurellaceae}

바이오매스 (biomass)로부터 석신산 (SA)을 발효적으로 생성시키는 것은 이미 상당한 관심을 끌어왔었는데, 이는 상기 산이 합성 수지의 중요한 구성분을 나타내거나 또는 매우 유용한 추가의 저분자 화학 화합물, 특히 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈의 공급원이기 때문이다 [참고: WO-A-2006/066839].

소의 반추위로부터 단리된 SA-생산 세균은 문헌 [참고: Lee et al (2002a)]에 기재되어 있다. 이러한 세균은 비-운동성이고, 비-포자 형성성이며, 중온성이고 카프노필릭 (capnophilic)인 그램-음성 간균 (rod) 또는 구간균 (coccobacillus)이다. 16S rRNA 서열에 기초한 계통발생학적 분석 및 생리학적 분석 결과, 상기 균주는 신규 종으로서 만하이미아 (Mannheimia) 속에 속하는 것으로나타났고 만하이미아 석시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens) MBEL55E로 명명되었다. 100％ CO₂ 조건 하에서는, 6.0 내지 7.5의 pH 범위에서 잘 성장하고, 석신산, 아세트산 및 포름산을 2:1:1의 일정 비로 생산한다. 엠. 석시니시프로두센스 (M. succiniciproducens) MBEL55E을 탄소원으로서 글루코스를 이용하여 CO₂-포화 하에 혐기적으로 배양한 경우에는, 7.5시간의 항온 배양에서 19.8 g/L의 글루코스가 소모되었고 13.3 g/L의 SA가 생성되었다.

그러나, 상기 유기체의 중요한 단점은 트리아실 글리세롤 (TAG)의 구성분으로서, 예를 들어 바이오디젤 (Biodiesel) 생성의 에스테르기 전이 반응에서 부산물로서 용이하게 입수 가능해진 글리세롤을 대사시킬 수 없다는 것이다 [참고: Dharmadi et al., 2006].

글리세롤로부터의 석신산의 발효적 생성은 과학 문헌 [참고: Lee et al., 2001; Dharmadi et al., 2006]에 보고되었는데, 글리세롤을 이용한 경우에는 글루코스와 같은 통상의 당을 이용한 경우에 달성된 것 보다 더 높은 수율 [생성된 SA의 질량/소모된 원료의 질량]이 달성되었다 [참고: Lee et al, 2001]. 그러나, 글리세롤을 이용한 경우에 수득된 공간 시간 수율은 글루코스를 이용한 경우 보다 실질적으로 더 낮았고 (0.14 대 1.0 g SA/[L h]) 조 (crude) 글리세롤은 전혀 사용되지 않았다.

단지 몇 가지 경우에서는, 글리세롤이 혐기적으로 대사하여 발효 산물을 생성시키는 것으로 보고되었다. 이. 콜라이 (E. coli)는 발효 가스 수소가 축적되지 못하게 하는 산성 pH, 및 적당한 배지 조성과 같은 극히 특이적 조건 하에서 글리세롤을 발효시킬 수 있다 [참고: Dharmadi et al 2006, Yazdani and Gonzalez 2007]. 많은 미생물이 외부 전자 수용체의 존재 하에서는 글리세롤을 대사시킬 수 있지만 (호흡 대사), 발효적으로 (즉, 전자 수용체의 부재 하에서) 이렇게 대사시킬 수 있는 것은 거의 없다. 글리세롤의 발효적 대사는 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae) 과, 예를 들어 시트로박터 프레운디이 (Citrobacter freundii) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)의 몇 가지 종에서 상당히 상세히 연구되어 왔다. 이들 유기체에서 글리세롤을 이화시키는 것은 고도로 환원된 생성물 1,3-프로판디올 (1,3-PDO)을 합성할 수 있는 그들의 능력과 절대적으로 관련이 있다 [참고: Dharmadi et al 2006]. 안애로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens)를 이용하여 글리세롤을 석신산으로 전환시키는 것이 보고되었다 [참고: Lee et al. 2001]. 이러한 연구 결과는 탄소원으로서 글리세롤을 사용함으로써 부산물 아세트산은 거의 형성되지 않으면서 석신산이 생성될 수 있으므로, 석신산의 정제를 촉진시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 가장 높은 수율은 글리세롤 및 효모 추출물을 간헐적으로 공급함으로써 수득하였는데, 이는 약 19 g/L의 석신산을 생성시켜 주는 전략이다. 그러나, 효모 추출물에 존재하는 미확인 영양 성분들이 글리세롤 발효가 일어나는 데 필요한 것으로 인지되었다.

효소 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC), 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 (PEPCK) 및 피루베이트 카복실라제 (PycA)에 의해 촉매된 옥살로아세테이트의 카복시화 반응은 CO₂ 공급원으로서 HCO₃ ^-을 활용하고 있다 [참고: Peters-Wendisch, PG et al]. 따라서, 탄산수소염 공급원, 예를 들어 NaHCO₃, KHCO₃, NH₄HCO₃ 등을 발효 및 배양 배지에 적용하여, 기질을 석신산으로 대사시키는 데에 있어서 HCO₃ ^-의 이용 효율을 개선시킬 수 있다. 글루코스로부터 석신산을 생성시키는 것은 지금까지의 선행 기술 분야에서는 HCO₃ ^-의 첨가에 의존적인 것으로 밝혀지지 않았었다.

혐기성 유기체에 의한 바이오매스 생성은 발효적 경로로부터 생성된 ATP의 양에 의해 제한된다. 혐기성 유기체에서의 글리세롤의 바이오매스 수율은 당류, 예를 들어 헥소스, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 펜토스, 예를 들어 크실로스, 아라비노스 또는 이당류, 예를 들어 슈크로스 또는 말토스 보다 더 낮다 [참고: Lee et al. 2001 , Dharmadi 2007].

그러나, 당류는 이론적으로, 폴리올 글리세롤과 비교해서 당류의 환원 상태가 보다 낮기 때문에 글리세롤 보다 상당히 더 낮은 수율로 석신산으로 전환될 수 있다. 당류를 글리세롤과 조합한 것이 석신산 생산 혐기성 유기체에서 기능적인 것으로 밝혀졌지만 [참고: Lee et al. 2001], 석신산 역가는 28 g/l를 넘어서지 못하였다.

따라서, 글리세롤로부터 유기산, 특히 SA를 생성시킬 수 있는 능력을 지닌 추가의 세균성 균주가 요망된다. 특히, 이러한 균주는, 예를 들어 선행 정제없이도 바이오디젤 생성으로부터의 조 글리세롤을 사용할 수 있는 경우에, 글리세롤로부터 고 생산성으로 상기 산을 생산해야 한다.

<발명의 요약>

본 발명의 목적은 글리세롤, 특히 조 글리세롤로부터 석신산을 생성시킬 수 있는 능력을 지닌 세균성 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적은 놀랍게도, 목적하는 대사 특징을 지닌, DD1로 명명된 신규한 세균성 균주를 단리한 본 발명자들에 의해 해결되었다.

도 1은 DD1에 대한 계통발생학적 트리를 도시한 것이다.
도 2는 DD1의 16S rDNA 서열 (서열 1)을 도시한 것이다.
도 3은 DD1의 23S rDNA 서열 (서열 2)을 도시한 것인데, 이를 "엠. 석시니시프로두센스" MBEL55E의 상응하는 6개 개별적 서열과 정렬하였는데, DD1 서열 (바닥)과 MBEL55E 서열 간의 차이가 강조되어 별개의 부록 1에 제시되어 있다.
도 4는 DD1의 광 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 5는 상이한 초기 글루코스 농도에서 DD1의 NH₄OH-제어 배치식 배양을 도시한 것이다.
도 6은 상이한 온도 및 pH 값에서 DD1의 NH₄OH-제어 배치식 배양을 도시한 것이다.
도 7은 DD1의 NH₄OH-제어 배치식 배양을 도시한 것이다. 본 도면은 효모 추출물 (Y), 펩톤 (P) 및 옥수수 침출액 (C)의 초기 수준 [g/L]을 나타낸다.
도 8은 펩톤을 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우의 DD1의 NH₄OH-제어 배치식 배양에서 수득된 바와 같은 부산물을 도시한 것이다.
도 9는 C-공급원으로서 글루코스를 이용한 DD1의 호기성 배치식 배양 결과를 도시한 것이다.
도 10은 문헌 [참고: Lee et al., 2002a and 2002b]에 기재된 바와 같이 글루코스를 이용하여 CO₂-포화 조건 하에서의 DD1의 혐기성 배치식 배양 결과를 도시한 것이다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명의 제1 양태는 소의 반추위로부터 단리될 수 있고, 탄소원으로서 글리세롤 (조 글리세롤 포함)을 활용할 수 있는, DD1로 명명된 세균성 균주; 및 이러한 능력을 보유하고 있으면서 상기 균주로부터 유래된 변이체 균주에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 균주는 특히 혐기성 조건 하에 글리세롤 (조 글리세롤 포함)로부터 석신산을 생성시킬 수 있는 능력을 지니고 있다.

특히, 신규 균주는 서열 1의 16S rDNA 또는 96, 97, 98, 99 또는 99.9％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열 및/또는 서열 2의 23S rDNA 또는 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는다.

두 뉴클레오티드 서열 간의 "동일률" 또는 "상동성"은 정렬된 서열의 전체 길이에 걸친 잔기의 동일률을 의미하는데, 예를 들어 동일률은 다음과 같은 데폴트 파라미터를 이용하는 생물 정보학 소프트웨어 패키지 EMBOSS (버전 5.0.0, http://emboss.sourceforge.net/what/)로부터의 프로그램 지침 하에 계산하였다 (약간 유사한 서열에 대한 동일률):

-갭 개방 (갭 개방에 대한 페널티): 10.0

-갭 연장 (갭 연장에 대한 페널티): 0.5

-데이터 파일 (패키지에 포함된 스코어링 매트릭스 파일): EDNAFUL

균주 DD1의 23S rDNA 서열을 "엠. 석시니시프로두센스" MBEL55E의 상응하는 6개 개별적 서열과 정렬시킨 것이 부록 1에 제시되어 있다. 여기서는, DD1 서열 (바닥)과 MBEL55E 서열의 6개 23S rDNA 서열 간의 차이가 강조된다. DD1 서열 (또한 서열 2 참고)은 DD1의 PCR 증폭된 23S rDNA를 서열 분석함으로써 수득된 바와 같은 서열 정보를 나타낸다. 서열 분석 실험 결과, 명백한 서열 정보가 생성되었는데, 이는 DD1로부터 유래될 수 있는 23S rDNA 정보가 DD1 균주의 두드러진 특징으로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 DD1 서열은 각 개별적 MBEL55E 서열과 6개 이상 서열 위치에 있어서 상이하다. 가장 중요한 차이는 약 133 bp가 각각의 MBEL55E 서열 내에 삽입되어 있는 것인데 (근처 위치 1325), 이는 DD1 서열에서는 누락되어 있다. 추가의 중요하고도 특이적인 서열 차이는 위치 451, 1741, 2040, 2041, 2045 및 2492 (해당 정렬시 사용된 바와 같은 넘버링)에서 이루어진다.

본 발명의 균주는 또한 바람직하게, 다음 부가의 대사 특징들 중 한 가지 이상을 나타낸다:

a) 특히 혐기성 조건 하에, 슈크로스로부터 석신산을 생성시키는 것;

b) 특히 혐기성 조건 하에, 말토스로부터 석신산을 생성시키는 것;

c) 특히 혐기성 조건 하에, D-프럭토스로부터 석신산을 생성시키는 것;

d) 특히 혐기성 조건 하에, D-갈락토스로부터 석신산을 생성시키는 것;

e) 특히 혐기성 조건 하에, D-만노스로부터 석신산을 생성시키는 것;

f) 특히 혐기성 조건 하에, D-글루코스로부터 석신산을 생성시키는 것;

g) 특히 혐기성 조건 하에, D-크실로스로부터 석신산을 생성시키는 것;

h) 특히 혐기성 조건 하에, L-아라비노스로부터 석신산을 생성시키는 것;

i) 크실리톨, 이노시톨 및 솔비톨을 활용하지 않는 것;

j) 호기성 조건과 혐기성 조건 둘 다에서 성장하는 것;

k) 초기 글루코스 농도 75 g/L 이상에서 성장하는 것;

l) 암모니아 내성이 있는 것.

특히 상기 균주는 상기 부가의 특징 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11가지 이상 또는 전부를 나타낸다.

DD1를 대상으로 하여, 예를 들어 당류 및 폴리올 글리세롤을 공동-대사시킬 수 있는 능력을 알아보기 위해 추가로 분석하였다. 그 결과, DD1이 말토스와 글리세롤을 공동-대사시켜 바이오매스 형성, 석신산 형성과 동시에 말토스 및 글리세롤를 활용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

용어 "산" (본원에서 지칭된 바와 같은 유기 모노 또는 디카복실산, 즉 아세트산, 락트산 및 석신산의 맥락에서)은 그의 가장 광범위한 의미로 이해되어야 하고, 이에는 또한 그의 염, 예를 들어 알칼리 금속 염 (예: Na 및 K 염), 또는 알칼리 토금속 염 (예: Mg 및 Ca 염), 또는 암모늄 염; 또는 상기 산의 무수물이 포괄된다.

용어 "조 글리세롤"은 이것이, 예를 들어 바이오디젤 또는 바이오 에탄올의 생성과 같이 글리세롤이 부산물인 공정에서 축적되기 때문에 처리되지 않은 글리세롤 함유 스트림으로서 이해되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "글리세롤"은 또한 "조 글리세롤"을 포괄한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 DSMZ에 수탁 번호 DSM 18541로 기탁된 바와 같은 세균성 균주 DD1, 및 이로부터 유래된 변이체 또는 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 상기 변이체 및 돌연변이체는 적어도, 글리세롤, 슈크로스, 말토스, D-글루코스, D-프럭토스 및/또는 D-크실로스로부터 석신산 (SA)을 생성시킬 수 있는 능력을 보유하고 있다. 특히, 이들 균주는 서열 1의 16S rDNA 또는 96, 97, 98, 99 또는 99.9％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열 및/또는 서열 2의 23S rDNA 또는 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열을 가질 수도 있다. 상기 DD1 균주의 변이체 또는 돌연변이체는 23S rDNA 서열을 MBEL55E 균주의 서열과 구별시켜 주는 상기 논의된 바와 같은 서열 차이들 중 한 가지 이상은 유지하면서도 서열 2와 상이한 23S rDNA를 가질 수 있다. 한 예로서, 이러한 변이체 또는 돌연변이체에서는 또한 132 bp 삽입물이 누락되었는데, 이는 부록 1의 정렬에 도시된 기타 특이적 서열 차이 중의 한 가지 이상과 임의로 조합된다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.5 g/g 이상 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S; 예를 들어 0.6 g/g 이상, 0.7 g/g 이상, 0.75 g/g 이상, 0.8 g/g 이상, 0.85 g/g 이상, 0.9 g/g 이상, 0.95 g/g 이상, 1.0 g/g 이상, 1.05 g/g 이상, 1.1 g/g 이상, 1.15 g/g 이상, 1.20 g/g 이상, 1.22 g/g 이상, 또는 1.24 이상의 수율 계수 YP/S로 석신산으로 전환시킨다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 28 g/L 이상의 글리세롤을, 1.0 g/g 이상, 또는 >1.0 g/g, 또는 > 1.05 g/g, 또는 >1.1 g/g, 또는 >1.15 g/g, 또는 >1.20 g/g, 또는 >1.22 g/g, 또는 >1.24 g/g 내지 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S로 28.1 g/L 이상의 석신산으로 전환시킨다. 예를 들어, 28 g/L의 글리세롤은 약 40 g/L 이하 또는 약 35 g/L 이하의 석신산으로 전환될 수 있다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.65 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.7 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.75 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산, 또는 0.77 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율로 석신산으로 전환시킨다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시킨다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원 28 g/L 이상을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시킨다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세균성 균주는 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.65 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.7 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산, 또는 0.77 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율, 및 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시킨다.

상기 정의된 바와 같은 청구된 세균성 균주의 또 다른 양태에서는, 탄소원이 글리세롤 또는 글리세롤과 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, 및 L-아라비노스 중에서 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물이다.

본원에서 기재된 바와 같은 상이한 수율 파라미터 ["수율" 또는 YP/S; "비 생산성 수율"; 또는 공간-시간-수율 (STY)]는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [참고: Song and Lee, 2006]에 기재된 바와 같이 결정한다.

"수율" 및 "YP/S" (각각은 생성된 생성물 질량/소모된 물질 질량으로 표현된다)은 본원에서 동의어로 사용된다.

비 생산성 수율은 무수 바이오매스 1 g당 발효 육즙 1 L 및 시간당 생성되는 석신산과 같은 생성물의 양을 나타낸다. DCW로서 기재된 무수 세포 중량은 생화학적 반응에서 생물학적 활성 미생물의 양을 의미한다. 그 값은 시간당 DCW 1 g당 생성물 g으로서 제공된다 (즉, g gDCW^-1h^-1).

본 발명의 추가의 양태는

a) 후술되는 청구항 중의 하나에서 정의된 바와 같은 세균성 균주를, 동화 가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 항온 배양하고, 이러한 균주를 이산화탄소의 존재 하에 5.0 내지 9.0 또는 5.5 내지 8.0 또는 6.0 내지 7.0의 pH에서 약 10 내지 60℃ 또는 20 내지 50℃ 또는 30 내지 45℃ 범위의 온도에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 배지로부터 유기산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계

를 포함하는, 유기산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 불연속적으로 또는 연속적으로 수행할 수 있고, 산 생성 과정은 통상적인 수단, 예를 들어 HPLC 또는 GC 분석에 의해 모니터링할 수 있다.

바람직하게는 혐기성 조건 하에 상기 방법에 의해, 바람직하게 석신산 (SA)이 생성된다. 혐기성 조건은 통상적인 기술에 의해, 예를 들어 반응 배지 중의 구성분을 탈기시키고, 이산화탄소 또는 질소 또는 이들의 혼합물 및 임의로 수소를, 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입함으로써 혐기성 조건을 유지시킴으로써 확립시킬 수 있다.

호기성 조건은 통상적인 기술에 의해, 예를 들어 공기 또는 산소를, 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입함으로써 확립시킬 수 있다.

적당한 경우, 0.1 내지 1.5 바의 약간 과압력을 적용할 수 있다.

상기 방법에서는, 상기 동화 가능한 탄소원이 바람직하게, 글리세롤, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 이들의 혼합물 또는 하나 이상의 상기 화합물을 함유하는 조성물 중에서 선택되거나 또는 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스의 분해 생성물 중에서 선택된다.

동화 가능한 탄소원의 초기 농도는 5 내지 100 g/l 범위의 값으로 조정하는 것이 바람직하고, 배양 동안에 이러한 범위를 유지시킬 수 있다.

반응 배지의 pH는 적합한 염기, 예를 들어 NH₄OH, NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, NaOH, Na₂CO₃, NaHCO₃, KOH, K₂CO₃, KHCO₃, Mg(OH)₂, MgCO₃, Mg(HCO₃)₂, Ca(OH)₂, CaCO₃, Ca(HCO₃)₂, CaO, CH₆N₂O₂, C₂H₇N, 또는 기타 염기 및 이들의 혼합물을 부가함으로써 제어할 수 있다. 염기의 물리적 조건은 수성 용액, 수성 현탁액, 기체 또는 고체일 수 있다.

SA를 생성시키기는 데에 특히 바람직한 조건은 다음과 같다:

탄소원: 글루코스, 크실로스 또는 말토스 및/또는 글리세롤 (조 글리세롤 포함).

온도: 30 내지 45℃.

pH: 6.0 내지 7.0, 상기 언급된 바와 같은 염기, 바람직하게 HCO₃ ^- 공급원, 예를 들어 Na₂CO₃, NaHCO₃, Mg(HCO₃)₂, Ca(HCO₃)₂, 또는 Mg(OH)₂, MgCO₃, Ca(OH)₂, CaCO₃에 의해 제어됨.

공급 기체: CO₂.

또 다른 양태에서, 본 발명은

a) 세균성 균주를, 하나 이상의 동화 가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 항온 배양하고, 이러한 균주를 목적하는 유기산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및

를 포함하고, 28 g/L 이상의 글리세롤을, 1.0 g/g 이상, 또는 >1.0 g/g, 또는 >1.05 g/g, 또는 >1.1 g/g, 또는 >1.15 g/g, 또는 >1.20 g/g, 또는 >1.22 g/g, 또는 >1.24 g/g; 내지 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S; 예를 들어, 0.6 g/g 이상, 0.7 g/g 이상, 0.75 g/g 이상, 0.8 g/g 이상, 0.85 g/g 이상, 0.9 g/g 이상, 0.95 g/g 이상, 1.0 g/g 이상, 1.05 g/g 이상, 1.1 g/g 이상, 1.15 g/g 이상, 1.20 g/g 이상, 1.22 g/g 이상, 또는 1.24 g/g 이상의 수율 계수 YP/S로 28.1 g/L 이상의 석신산으로 전환시키는 것을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 28 g/L의 글리세롤은 약 40 g/L 이하 또는 약 35 g/L 이하의 석신산으로 전환될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은

를 포함하고, 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.65 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.7 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.75 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산, 또는 0.77 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율로 석신산으로 전환시키는 것을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은

를 포함하고, 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 탄소원을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은

를 포함하고, 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 탄소원 28 g/L 이상을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은

를 포함하고, 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤 중에서 선택된 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.65 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.7 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산 또는 0.75 g gDCW^-1h^-1 이상 석신산, 또는 0.77 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율, 및 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염 또는 유도체를 발효적으로 생성시키는 방법을 제공한다.

상기 확인된 석신산의 생성 방법의 또 다른 양태에서는, 탄소원이 글리세롤 또는 글리세롤과 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, 및 L-아라비노스 중에서 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물이다.

추가의 바람직한 조건은 첨부된 실시예 및 도면으로부터 유래 가능할 것이다.

생성된 석신산 및/또는 석신산 염은 당업계에 공지된 방법에 의한 통상적인 방식, 예를 들어 결정화, 여과, 전기투석, 크로마토그래피로 단리할 수 있다. 예를 들어, 이들은 침전물을 중화 및 여과시키기 위하여 수산화칼슘, 산화칼슘, 탄산칼슘 또는 탄산수소를 사용함으로써 발효 동안 발효기에서 칼슘 석시네이트 생성물로서 침전시킴으로써 단리할 수 있다.

목적하는 석신산 생성물은 석시네이트를 황산으로 산성화시킨 다음, 여과시켜 황산칼슘 (석고) 또는 침전물을 제거함으로써 상기 침전된 칼슘 또는 석시네이트로부터 회수한다. 이로써 생성되는 용액을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 바람직하지 못한 잔류성 이온을 제거할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의된 바와 같은 석신산을 발효적으로 생성시키는 단계; 및 적합한 염기, 특히 무기 염기, 예를 들어 암모니아, 또는 그의 수성 용액을 이용하여 pH를 제어하는 단계를 포함하는, 석신산 및/또는 석신산 염, 특히 암모늄 염을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는

a) 석신산 및/또는 석신산 염, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 암모늄 염을 발효적으로 생성시키는 단계, 및

b1) 수득된 유리 산을 직접적으로 촉매적 수소화하여 테트라히드로푸란 (THF) 및/또는 1,4-부탄디올 (BDO) 및/또는 감마-부티로락톤 (GBL)을 수득하는 단계 또는

b2) 수득된 유리 석신산 및/또는 석신산 암모늄 염을 화학적으로 에스테르화하여 그의 상응하는 디-저급 알킬 에스테르를 수득하고, 이러한 에스테르를 후속 촉매적 수소화하여 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL을 수득하는 단계

를 포함하는, 테트라히드로푸란 (THF) 및/또는 1,4-부탄디올 (BDO) 및/또는 감마-부티로락톤 (GBL)의 생성 방법에 관한 것이다.

저급 알킬은 바람직하게, 직쇄 또는 측쇄 C₁-C₆-, 바람직하게 C₁-C₄-알킬 잔기, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 3급-부틸 뿐만 아니라 n-펜틸 및 n-헥실 및 그의 분지된 유사체를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태는

a) 상기 정의된 바와 같은 석신산 암모늄 염을 발효적으로 생성시키는 단계; 및

b) 예를 들어, WO-A-2006/066839 (본원에 참고로 도입된다)에 기재된 바와 같은, 자체 공지된 방식으로 석신산 암모늄 염을 피롤리돈으로 화학적으로 전환시키는 단계

를 포함하는 피롤리돈의 생성 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 동화 가능한 탄소원으로서 사용되는 글리세롤은 조 글리세롤이다.

SA의 직접적인 수소화 반응에 관한 보다 상세 내역:

직접적인 촉매적 수소화 반응을 수행하는 데에 적합한 실험 조건은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참고로 도입된 US 4,550,185에 기재되어 있다.

SA는 당업자에게 친숙한 공정, 장치 및 보조제, 예를 들어 용매를 이용하여 자체 공지된 방식으로 수소화한다. 특히, 연속식 또는 배치식 액상 수소화를 산 수소화에 적합한 불균질한 촉매의 존재 하에 수행한다. 허용 가능한 노력 만으로도 당업자는 최적의 공정 파라미터를 확립할 수 있다. 예를 들어, 반응 온도는 약 100 내지 약 300℃의 범위, 바람직하게 약 130 내지 약 285℃의 범위이고, 압력은 약 20 내지 350 바, 예를 들어 100 내지 250 바이다. 수소화 반응에 유용한 촉매는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 각종 팔라듐/레늄/탄소 촉매를 사용할 수 있다. 수소화 반응에 유용한 용매는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 수성 용매 매질을 사용할 수 있다.

SA의 에스테르화 반응에 이은 수소화 반응에 관한 보다 상세 내역:

화학적 에스테르화 반응에 이은 직접적인 촉매적 수소화 반응을 수행하는 데에 적합한 실험 조건은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허원 제06007118.0호 (본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.

a) 에스테르화 공정:

반응성 증류를 포함할 수 있는 에스테르화 공정은 자체 공지된 각종 디자인의 장치를 이용하여 수행할 수 있다.

예를 들어, 트레이 또는 팩킹을 설치함으로써 달성되는 적당한 수의 이론적 단계를 수반하는 정류 칼럼을 포함하는, 연속적인 방식으로 작동되는 에스테르화 플랜트를 사용할 수 있다. 칼럼의 웅덩이 (sump)에 부착된 증발기 루프에서 증발되는 알칸올 급송에 따른 결과로서 칼럼에서 정지 상태 온도 프로파일이 형성되자 마자 SA의 암모늄 염을 포함하는 수성 충전물을 저장고 용기로부터 칼럼 상부 내로 공급한다. 이러한 반응으로 하행의 암모늄 염-함유 액체 및 축합물과 상행의 알칸올-함유 기상의 역류가 형성된다. 에스테르화 반응을 촉매하기 위하여, 균질한 촉매를 암모늄 염 초기 충전물에 가할 수 있다. 또 다른 한편으론, 불균질한 촉매를 칼럼 내부에 제공할 수 있다. 형성된 카복실산 에스테르는 본 공정 조건 하에서는 액체이고, 칼럼의 하부 말단을 통하여 증류 칼럼의 웅덩이 내로 통과하며, 이러한 웅덩이로부터 지속적으로 회수된다. 기체 성분, 예를 들어 알칸올-수 및/또는 암모니아를 포함하는 공비 혼합물을 반응 칼럼으로부터 제거함으로써 칼럼 상부의 반응 평형으로부터 제거한다.

상기 언급된 구체적 양태의 추가의 변형은 허용 가능한 노력만으로도 당업자에 의해 실행될 수 있다.

본 발명에 따르는 에스테르화 공정에 적합한 공정 파라미터 범위는 사용된 장치의 형상, 예를 들어 사용된 칼럼 내부의 유형, 반응물의 유형 및 양, 적당한 경우 사용된 촉매의 유형 및 양에 따라서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 개별적 파라미터를 다음 파라미터 범위 내에서 설정할 수 있다:

칼럼 온도: 0 내지 300℃, 특히 40 내지 250℃, 또는 70 내지 200℃;

압력: 0.1 내지 6 바, 특히 표준 압력;

체류 시간: 수 초 (예를 들어, 1초 내지 60초) 내지 수 일 이하 (예를 들어, 1일 내지 5일), 특히 수 분 (예를 들어, 1분 내지 60분) 내지 수 시간 (예를 들어, 1시간 내지 15시간), 보다 바람직하게 수 분 (예를 들어, 5 내지 20분) 내지 2시간.

b) 수소화 공정

본 발명에 따라서 제조된 SA 에스테르는 당업자에게 친숙한 공정, 장치 및 보조제, 예를 들어 촉매를 이용하여 자체 공지된 방식으로 수소화한다.

특히, 연속식 또는 배치식 기상 수소화 반응을 에스테르 수소화에 적합한 불균질한 촉매의 존재 하에 수행한다. 허용 가능한 노력 만으로도 당업자는 특별한 에스테르에 대한 최적의 공정 파라미터를 확립할 수 있다. 예를 들어, 반응 온도는 약 100 내지 약 300℃의 범위, 바람직하게 약 200 내지 약 280℃의 범위이고, 압력은 약 5 내지 100 바, 예를 들어 10 내지 50 바이다. 반응물 대 수소의 몰 비는 약 1:100 내지 약 1:2000, 예를 들어 1:800 내지 1:1500 범위 내로 설정된다.

본 발명의 수소화 반응에 유용한 촉매는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 각종 구리 촉매를 사용할 수 있다. 선행 기술 분야에는, 예를 들어 명칭 85/1 (공급처: Davy Process Technology Ltd., England)으로 수득 가능한 환원 구리 크로마이트 촉매를 사용하는 것이 보고되었다. 그러나, 본 발명에 따라서 특히 적합한 촉매는 지지된 산화구리 촉매인데, 이러한 산화구리는 알루미나 또는 실리카 지지체 물질에 적용된다. 구리 촉매를 이용하여 석신산 에스테르를 BDO (1,4-부탄디올)/GBL (감마-부티로락톤)/THF로 수소화시키는 것의 예가 또한, 다음 논문에 기재되어 있다 [참고: Schlander, Jan., Feb. 2000, University of Karlsruhe, "Gasphasenhydrierung von Maleinsaeuredimethylester zu 1,4-Butandiol, gamma-Butyrolacton und Tetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren"].

발효 단계에 관한 보다 상세 내역:

본 발명에 따라서 사용된 바와 같은 발효는 교반식 발효기, 버블 칼럼 및 루프 반응기에서 수행할 수 있다. 교반기 유형 및 기하학적 디자인을 포함한 가능한 방법 유형의 포괄적인 개요는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: "Chmiel: Biopro-zesstechnik: Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1"]. 본 공정에서, 이용 가능한 전형적인 변형은 당업자에게 공지되어 있거나 또는, 예를 들어 문헌 [참고: "Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering"]에 설명된 다음 변형, 예를 들어 바이오매스의 재순환을 수반하거나 수반하지 않는 연속식 발효, 배치식, 공급 배치식, 또는 반복형 공급 배치식이다. 생산 균주에 따라서, 우수한 수율을 달성하기 위해서는 공기, 산소, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 적당한 기체 혼합물을 이용하여 살포할 수 있고/살포해야만 한다.

본 발명에 따르는 방법에서 발효 육즙에서의 화학적 전환 이전에 발효 육즙을 예비-처리할 수 있는데, 예를 들어 상기 육즙의 바이오매스를 제거할 수 있다. 바이오매스를 제거하는 공정은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 여과, 침강 및 부유이다. 결과적으로, 바이오매스는 원심분리기, 분리기, 경사 제거기, 여과기를 이용하거나 또는 부유 장치에서 제거할 수 있다. 유용한 생성물을 최대로 회수하기 위하여, 바이오매스를, 예를 들어 투석여과의 형태로 세척하는 것이 종종 바람직하다. 방법의 선택은 발효기 육즙 내의 바이오매스 함량 및 바이오매스의 특성, 및 바이오매스와 유용한 생성물 간의 상호 작용에 따라서 결정된다. 한 양태에서는, 발효 육즙을 멸균 또는 저온 살균할 수 있다.

추가의 양태에서는, 발효 육즙을 농축시킨다. 요구 사항에 따라서, 이러한 농축을 배치식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 일차적으로는 생성물 손상이 일어나지 않아야 하고, 이차적으로는 최소한의 장치 및 에너지 사용이 필요하도록 압력 및 온도 범위를 선택해야 한다. 특히 다단계 증발을 위한 압력 및 온도 수준을 능숙하게 선택함으로써 에너지를 절감할 수 있다.

장치 항목에서는, 교반식 탱크, 유하 액막 (falling-film) 증발기, 박막 증발기, 강제-섬광 순환 증발기 및 기타 증발기 유형이 자연 또는 강제 순환 방식에 활용될 수 있다.

결과적으로, 용어 "발효 육즙"은 발효적 공정에 기초한 수성 용액을 의미하고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 확대 작업시켰거나 시키지 않았다.

<실시예>

본 발명은 다음 실시예에 의해 보다 상세히 기재될 것이다. 다음 실시예는 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: DD1의 단리

이러한 단리를 위해, 샘플링 단계, 증균 배양 단계, 순수한 배양물의 분리 단계 및 석신산 (SA) 생성을 알아보기 위한 순수 배양물의 시험 단계를 포함한 4-단계 접근 방식을 이용하였다.

1. 실험적 접근 방식

1.1. 샘플링

샘플을 소의 반추위, 도시 하수 처리 공장으로부터의 소화 슬러지 (digested sludge) 및 찌기 (와인 제조 잔류물)로부터 취하였다. 이들 채집지는 비교적 고 농도의 유기 물질 및 산소를 수반하지 않는 CO₂-풍부 대기를 특징으로 한다. 샘플, 그의 기원 및 조작에 관한 보다 상세한 정보는 다음에 제공된다:

a) 캐눌라 삽입된 홀스타인 (Holstein) 암소 (공급처: the Institut fuer Tier-ernaehrung , University of Hohenheim)로부터 반추위 내용물을 취하였다. 계내-pH 및 -온도는 각각 6.7 및 37℃였다. 재료를 멸균성 필터 천을 통하여 여과시키고, CO₂로 기체 공급하며, 동일자로 수송 및 가공 처리하기 위해 얼음 상에서 즉시 냉각시켰다.

b) 만하임-샌드호펜 (Mannheim-Sandhofen) 내의 도시 하수 처리 공장의 분해 타워로부터 소화 슬러지를 취하였다. 계내-pH 및 -온도는 각각 7.1 및 36.3℃였다. 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고 동일자로 가공 처리하였다. 슬러지 내의 기상의 주요 성분은 메탄 및 이산화탄소이다.

c) 독일의 서남부 들판에서 2005년 11월에 찌끼 샘플을 수집하였다. 빅 스태쉬 (big stash)의 중앙으로부터 적포도 (Spaetburgunder) 찌끼를 취하였다. 이러한 영역은 혐기적이어야 한다. 알코올성 발효가 이미 진행되고 있는 저장 용기로부터 백포도 (Mueller-Thurgau) 찌끼를 취하였다.

1.2. 증균 배양

단독 탄소원으로서 D-글루코스, D-크실로스 및 L-아라비노스를 함유하는 상이한 배지 상에서 증균 배양을 수행하였다. 배지 조성은 다음에 기재되어 있다:

MgCO₃ 및 물 (0.75 g 및 4O mL)를 100 mL-혈청 병에서 오토클레이빙하였다 (121℃, 20분). 효모 추출물, 펩톤, C-공급원, NH₄SO₄ 및 K₂HPO₄를 모두 별개로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물의 경우에는, 오토클레이빙시킨 1개 원액을 준비하였다. 산소가 존재하지 않는다는 것을 보장하기 위해, 다음 표준 과정을 사용하였다:

- 오토클레이빙 후, 배양 배지에 멸균성 및 산소-무함유 CO₂로 기체 공급하였다.

- 혐기성 조건 하에 수행해야만 하는 실험을 위해 혐기성 박스 (Meintrup DWS Laborgeraete GmbH, Laehden-Holte, Germany)를 사용하였다.

- 한천 판의 항온 배양은 혐기성 항아리에서 일어났다. 혐기성 조건을 보장하기 위해, 안애로컬트A (Anaerocult^®A) (공급처: Merck)를 사용하였다.

반추위 샘플 및 소화 슬러지는 접종물로서 희석되지 않은 채로 사용하였다. 50 g의 고형 찌끼를 100 mL 0.9％ NaCl 용액에 희석시키고, 여과시켜 거친 입자를 제거한 다음, 접종물로서 사용하였다.

100 mL 혈청 병 (공급처: Zscheile & Klinger, Hamburg, Germany)을 50 mL 배지 및 2 mL의 각각의 접종물로 채우고, 부틸 고무 마개 (공급처: Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Germany)로 밀봉시키며 CO₂로 기체 공급하였다. 약 0.8 바의 과압력을 조정하였다. 상기 병을 진탕 항온 배양기 (160 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃ 하에 항온 배양하였다.

글루코스, 크실로스 및 아라비노스의 소모와 석신산 및 부산물의 형성은 RI-탐지를 이용하여 배양 육즙의 희석되지 않은 세포 무함유 상등액을 HPLC 분석함으로써 정량화하였다. 부틸 고무 플러그를 통하여 멸균성 주사기를 이용하여 육즙 샘플을 취하고, 여과 (0.22 ㎛)에 의해 세포 분리를 수행하였다. 300 x 7.8 mm I. D. 칼럼 아미넥스 (Aminex) HPX-87 H (공급처: Biorad) 및 5 mm H₂SO₄를 각각 정지 상 및 이동 상으로서 사용하였다. 칼럼 온도는 30℃이고, 유속은 0.5 mL min^-1였다.

1.3. 순수 배양물의 단리

한천 판 상에서 반복적으로 스트리킹함으로써 증균 배양으로부터 순수 배양물을 단리하였다.

1.4. 석신산 생성을 알아보기 위한 순수 배양물의 시험

SA 생성을 알아보기 위해 순수 배양물을 액체 배양물에서 시험하였다. 당 소모 및 SA 및 부산물 형성은 HPLC에 의해 정량화하였다. 배양 및 HPLC 조건은 상기 섹션 '증균 배양'에서 기재된 바와 동일하였다.

2. 결과

2.1. 권장되는 증균 조건

다음 표에는 석신산 (SA) 생산자를 보강시키기 위해 권장될 수 있는 실험 조건이 요약되어 있다.

반추위 내용물로부터 SA 생산자를 보강시키는 데에 가장 우수한 C-공급원은 아라비노스이다 (3개 증균 배양물 중의 3개 모두가 SA 생성을 나타내었고; 글루코스를 이용한 경우에는 3개 중의 0개가 SA 생성을 나타내었으며, 크실로스를 이용한 경우에는 3개 중의 2개가 SA 생성을 나타내었다). 이러한 결과는 다음 표에 요약되어 있다. 이오노포릭 (ionophoric) 항생제 라살로시드 및 모넨신을 증균 배지에 부가하면 SA 생성이 실질적으로 더 많아지고 (17시간 내에 0.9 내지 1.2 g/L에서 1.9 내지 5.4 g/L으로 증가함), 락트산 및 프로피온산의 생성은 더 적어졌다. 따라서, 이들 결과는 SA 생산 미생물은 이들 화합물을 증균 배지에 부가함으로써 실제로 촉진될 수 있다는 사실을 확인시켜 준다 [참고: Lee et al., 2002a]. MgCO₃-완충된 증균 배지는 TRIS를 이용한 시도 보다 더 많은 양의 SA를 생성시키는 것으로 밝혀졌다 (17시간 내에 1.2 내지 1.4 g/L에서 1.9 내지 5.4 g/L으로 증가함). 이는 아마도, i) MgCO₃의 보다 높은 완충 능력, ii) 낮은 용해도에 기인한 보다 낮은 삼투 스트레스 및 iii) SA 생합성에 필요한, 카보네이트-이온으로부터의 CO₂의 방출에 의해 유발된다.

소화 슬러지로부터 SA 생산자를 보강시키기 위해 시험된 유일한 C-공급원은 아라비노스였다. 그 결과가 다음 표에 요약되어 있다. 이들 실험은 프로피온산 생산 균주에 의한 것으로 추정되는 SA 소모 및 기질 고갈을 방지하는 데에 24시간 이하의 단기간 항온 배양 시간이 필요하다는 것을 나타내었다:

찌끼로부터의 증균 배양시 수득된 결과는 다음 표에 요약되어 있다. 찌끼로부터의 SA 생산자의 보강은 적포도 (Spaetburgunder 유형)로부터의 찌끼가 사용된 경우에만 성공적이었다. 와인 효모에 의해 유발되는 것으로 추정되는 에탄올 생성을 저해하기 위해 앰포테리신 B를 증균 배지에 부가하는 것이 절대적으로 필요하다. 글루코스와 아라비노스 둘 다는 적합한 C-공급원이었지만, 크실로스는 그렇치 못하였다. SA 생성을 명료하게 탐지하는 데 필요한 항온 배양 시간은 반추위 및 소화 슬러지로부터의 샘플 재료를 이용한 경우 보다 실질적으로 더 길었다.

2.2. 증균 실험으로부터의 가장 우수한 결과

SA-생산자에 대한 증균 배양에서 수득한 가장 우수한 결과가 다음 표 6에 열거되어 있다.

상기 표는 세 가지 샘플 재료 각각을 이용하여 SA 생산성 증균 배양을 받을 수 있다는 것을 나타낸다. 소화 슬러지로부터 유래된 증균 배양은 반추위 및 찌끼로부터의 증균 배양 보다 더 높은 공간 시간 수율을 나타내었다 (0.4 대 0.2 및 0.1 g/[L h]). 그러나, SA-생산 단리물은 접종물로서 반추위 재료를 이용한 SA-생산 증균 배양으로부터만 수득하였다. 소화 슬러지 및 찌끼로부터 SA 생산자를 외관상 단리시키기 위해서는 보다 복잡한 전략이 필요하다.

2.3. 석신산 생산 단리물

순수 배양물 실험에서 SA 생산을 나타내는 가장 우수한 단리물 (=순수 배양물) 및 그의 특징이 다음 표에 요약되었다. 가장 높은 SA 농도 (8.8 g/L) 및 공간 시간 수율 (0.6 g/[L h])은 반추위 단리물 DD1을 이용하여 달성하였다.

3. 결론

확립된 과정은 반추위, 소화 슬러지 및 찌끼로부터 SA 생산자를 보강시키는 데 적합하다. 그러나, SA-생산 단리물은 접종물로서 반추위 재료를 이용한 SA-생산 증균 배양으로부터만 수득하였다. 가장 두드러진 단리물은 반추위 세균 DD1이다. 이는 SA 생산을 위해 글루코스와 아라비노스를 이용한다. 아직까지 최적화되지 않은 조건 하에서는 거의 9 g/L의 SA가 15 g/L의 아라비노스로부터 생성된다. 도 4는 광 현미경으로 찍은 DD1의 사진을 도시한 것이다.

실시예 2: DD1의 세포 은행 제조

1. 배지 제조

배양 배지의 조성은 표 8에 기재되어 있다.

5 g 효모 추출물, 5 g 펩톤, MgCO₃ 및 (고체 배지의 경우) 12 g 박토-한천을 900 ml 증류수에서 혼합하고 오토클레이빙하였다 (20분). 약 65℃로 냉각시킨 후, 누락된 성분을 멸균성 원액으로서 가하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 K₂HPO₄를 모두 별개로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물을 함께 오토클레이빙하였다.

2. MCB 제조

2개의 한천 판에 DD1을 신선하게 접종하고 혐기성 항아리 (Anaerocult A, Merck)에서 37℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 바이오매스를 판으로부터 떼어내고, 20 g/L 글루코스를 수반한 MgCO₃-무함유 액체 배지에 재현탁시켜 OD₆₀₀을 약 1.0으로 조정하였다. 이러한 세포 현탁액 0.5 mL과 함께 접종을 수행하였다. 20 g/L 글루코스 및 30 g/L MgCO₃ 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반한 50 ml의 액체 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (공급처: Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Germany)가 있는 100 mL-혈청 병에서 배양을 수행하였다. 이러한 혈청 병 (총 10개)을 37℃, 160 rpm의 회전 속도 및 2.5 cm의 진탕 직경 하에 항온 배양하였다.

글루코스 소모를 모니터링하기 위해, 1개 병의 배양을 중단하고 0, 3, 4, 5, 7, 8 및 8.5시간 후에 샘플링 및 HPLC 분석을 수행하였다. 8.5시간 (글루코스 농도는 3.4 g/L였다) 후, 배양을 중단하였다. 0.5 mL 세포 현탁액 및 0.5 mL 멸균성 글리세롤의 분취액을 한랭 바이알에 채우고, 혼합한 다음, -20℃ 하에 13시간 저장한 후 MCB로서 -80℃ 하에 저장하였다. MCB를 대상으로 하여, 오염 제어를 위해 마지막 냉동 바이알의 루프를 한천 판 상에 스트리킹하고, 액체 배지 (표 8에 기재된 바와 같은 배지)에서 생성물 스펙트럼을 검사하고, 현미경에 의해 오염에 관하여 검사함으로써 순도에 관하여 시험하였다. HPLC 조건은 실시예 1에서 기재된 바와 동일하였다.

3. WCB 제조

MCB의 1개 바이알을 사용하여, 50 g/L 글루코스를 수반한 50 ml의 액체 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에 접종하였다. 항온 배양을 진탕 항온 배양기 (회전 속도: 180 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃ 하에 10시간 동안 수행하였다. 배양이 끝날 무렵, 글루코스 농도는 20 g/L였고 pH는 약 6.5였다. 0.5 mL 세포 현탁액 및 0.5 mL 멸균성 글리세롤의 분취액을 한랭 바이알에 채우고, 혼합한 다음, WCB로서 -80℃ 하에 저장하였다. 순도 검사는 MCB에 대해서와 동일하였다. HPLC 조건은 실시예 1에서 기재된 바와 동일하였다.

실시예 3: DD1의 분류학적 성상 확인

균주 DD1의 분류학적 성상 확인을 다음에 기재된 바와 같이 수행한 16S- 및 23S rDNA 분석을 통하여 수행하였다:

게놈 DNA의 추출, 16S rDNA의 PCR-매개된 증폭 및 PCR 생성물의 정제를 문헌 [참고: Rainey et al., 1996]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 23S rDNA를 함유하는 DNA 단편은 정배향 프라이머

및 역배향 프라이머

을 사용하여 동일한 방법에 의해 증폭시켰다. 제조업자의 프로토콜에서 지시된 바와 같은 CEQ™DTCS-퀵 스타트 (Quick Start) 키트 (공급처: Beckman Coulter)를 이용하여 정제된 PCR 생성물을 서열 분석하였다. CEQ™8000 유전자 분석 시스템을 서열 반응 생성물의 전기영동에 사용하였다. ae2 에디터 [참고: Maidak et al., 1999]를 사용하여 EMBL 및 RDP 데이터베이스로부터 입수 가능한 프로테오박테리아 (Proteobacteria)의 γ-아부류의 대표적 구성원에 대항한 균주 DD1의 16S rDNA 서열을 정렬하였다. 계통발생학적 트리 구축을 위해, PHYLIP (Phylogeny Inference Package, version 3.5c., 판매처: J. Felsenstein, Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, USA) 과정을 사용하였다: 문헌 [참고: Jukes and Cantor (1969)]의 방법을 이용하여 쌍을 이룬 진화 거리를 계산하고, 이웃-결합법을 이용하여 이들 거리로부터 계통발생학적 트리를 구축하였다 [참고: Saitou & Nei, 1987].

16S rDNA에 의거한 계통발생학적 트리가 도 1에 도시되어 있다. 16S rDNA 분석에 기초하면, 균주 DD1의 가장 가까운 동족은 "만하이미아 석시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens)" MBEL55E로 99.8％ 유사율을 나타낸다. 이 균주는 한국 과학 기술원 (KAIST)의 과학자들이 소의 반추위로부터 단리하였다 [참고: Lee et al., 2002a; Lee et al., 2002b]. DD1로부터 증폭된 23S rDNA 단편을 "만하이미아 석시니시프로두센스" MBEL55E (완전 게놈 서열 승인 번호 AE016827)로부터의 23S rDNA 서열과 정렬시켜 두 균주 간의 차이가 표시하였다.

도 2는 균주 DD1의 16S rDNA 서열을 도시한 것이다. 도 3은 균주 DD1의 23S rDNA 서열을 도시한 것이고, "만하이미아 석시니시프로두센스" MBEL55E (완전 게놈 서열 승인 번호 AE016827)의 23S rDNA과의 정렬이 부록 1에 도시되어 있다.

실시예 4: DD1의 세포 형태학 및 집락 형태학

WCB (실시예 2)의 1개 바이알을 사용하여, 50 g/L 글루코스를 수반한 50 ml의 액체 배지 (조성과 제조는 실시예 2에 기재된 바와 같다)를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에 접종하였다. 항온 배양을 170 rpm (진탕 직경: 2.5 cm) 및 37℃ 하에 15시간 동안 수행하였다. 배양이 끝날 무렵, 글루코스 농도는 약 17 g/L로 감소하였다 (실시예 1에 기재된 바와 같은 HPLC 조건을 통하여 측정하였다). DD1의 세포 형태를 조사하기 위하여, 광 현미경을 이용하여 단일 세포를 관찰하였다. DD1의 집락 형태를 성상 확인하기 위해, 세포 현탁액 루프를 뇌 심장 주입 판 [Bacto Brain Heart Infusion, 제품 번호: 237500 (12 g/L 박토 한천으로 고형화시킴), 제품 번호: 214010; 공급처: Becton, Dickinson and Company] 상에 스트리킹하고, 37℃ 하에 호기적 및 혐기적으로 (Anaerocult A, Merck) 항온 배양하였다.

DD1의 세포는 단일, 쌍을 이룬 또는 짧은 쇄로 존재하는 간균으로서 여겨진다 (도 4 참고). 24시간 항온 배양 후, 집락은 환상의 백색-황색이고 반투명하며, 직경이 0.5 내지 1 ㎛ (호기성 성장) 및 1 내지 2 ㎛ (혐기성 성장)였다.

실시예 5: 상이한 C-공급원의 활용

DD1에 의한 상이한 C-공급원의 활용을 문헌 [참고: Lee et al., 2002a]에 기재된 조건 하에 시험하였다.

1. 배지 제조

배양 배지의 조성은 표 9에 기재되어 있다.

효모 추출물, 폴리펩톤 및 MgCO₃를 함께 오토클레이빙하였다. 냉각시킨 후, 누락된 성분을 멸균성 원액으로서 가하였다. 글루코스 및 기타 C-공급원, 황산암모늄 및 K₂HPO₄를 모두 별개로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물을 함께 오토클레이빙하였다. Na₂S*9H₂O를 1 mg/L의 최종 농도에 가하여 혐기적 조건을 보장하였다.

2. 배양 및 분석

시드 배양물을 성장시키기 위해, WCB의 1개 바이알을 사용하여, 20 g/L 글루코스 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반하지만 표 9에 기재된 50 ml의 액체 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에 접종하였다. 항온 배양을 37℃ 및 160 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 13시간 동안 수행하였다. 세포 현탁액을 5000 g으로 5분 동안 원심분리시키고 (Biofuge primo R, Heraeus), 세포 펠릿을 세척한 다음, 탄소원을 수반하지 않고 MgCO₃을 수반하지 않는 50 mL 배지에 재현탁시켜 글루코스-무함유 접종물을 생성시켰다 (모든 단계는 실온 하에 혐기성 챔버에서 수행하였다).

주 배양물을 10 g/L의 각각의 C-공급원 (D-만니톨, D-프럭토스, D-크실로스, 슈크로스, 말토스, 락토스, 크실리톨, 이노시톨, D-솔비톨, 글리세롤, L-아라비노스, D-갈락토스 또는 D-만노스) 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반한 50 ml의 액체 배지를 함유하는 100 mL-혈청 병에서 성장시켰다. 글리세롤 활용에 관한 시험을 위해, 고급 '글리세롤 99％, 퓨리스' (Riedel-de Haen, 제품 번호: 15523-1L-R, 공급처: Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Germany)를 사용하였다. 1.5 mL의 글루코스-무함유 접종물을 이용하여 접종을 수행하였다. 상기 병을 37℃ 및 160 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 항온 배양하였다. DD1에 의한 각각의 C-공급원의 활용은 C-공급원 3 g/L 이상이 24시간 이내에 소모된 경우에 양성으로서 간주되었다. 주 배양물에서 수득된 결과를 검증하기 위하여, 1 mL의 각각의 주 배양물을 사용하여, 10 g/L의 각각의 C-공급원을 수반한 50 mL의 신선한 배양 배지에 접종하였다. 따라서, 2가지 후속 주 배양에서 그 결과를 확인하였다. C-공급원의 소모는 실시예 1에 기재된 바와 같은 HPLC를 통하여 정량화하였다. 글리세롤이 측정된 경우에는, 칼럼 온도를 50℃로 조정하여, 체류 시간이 유사한 SA, 락트산 및 글리세롤을 충분히 분리시켰다.

3. 결과

그 결과가 다음 표 10에 요약되어 있다.

상기 표는 두 균주의 C-공급원 활용 패턴이 글리세롤과 관련하여 상이하다는 것을 보여준다. DD1은 글리세롤을 대사할 수 있지만, 이는 MBEL55E에 의해서는 사용되지 않는다.

슈크로스, D-글루코스 및 D-프럭토스 이외에도, DD1은 D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스 및 D-만노스를 활용한다. 따라서, 리그노셀룰로스에서의 모든 유형의 단당류 [참고: Kamm et al., 2006; Lee, 1997]가 DD1에 의해 활용된다. MBEL55E에 의한 L-아라비노스, D-갈락토스 및 D-만노스의 활용은 문헌 [참고: Lee et al., 2002a]에 의해 시험되지 않았다.

실시예 6: 글리세롤 및 상이한 헥소스 및 펜토스로부터의 SA 및 부산물 형성

글리세롤, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스 및 D-만노스 상에서의 DD1의 석신산 (SA) 생산성은 10 g/L의 각각의 C-공급원 (기준으로서 10 g/L 글루코스)을 수반한 혈청 병 시도에서 평가하였다.

1. 배지 제조

배양 배지의 조성 및 제조는 실시예 2 (시드 배양물) 및 실시예 5 (주 배양물)에서와 동일하였다.

2. 배양 및 분석

50 g/L 글루코스 및 30 g/L MgCO₃을 수반한 액체 배지에서의 시드 배양물의 성장은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 글루코스-무함유 접종물의 제조는 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다.

10 g/L 글리세롤, 슈크로스, D-크실로스, D-프럭토스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 또는 D-글루코스 및 10 g/L MgCO₃을 수반한 주 배양물의 성장은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 C-공급원의 소모 및 SA 및 부산물의 생성은 실시예 5에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 정량화하였다.

3. 결과

다음 표 11에 그 결과가 요약되어 있다.

표 11은 모든 경우에 상당량의 SA가 형성된다는 것을 보여준다. DD1에 의해 슈크로스 (suc), D-글루코스 (gluc), D-프럭토스 (fruc), D-크실로스 (xyl), L-아라비노스 (ara), D-갈락토스 (gal) 또는 D-만노스 (man) 대신 글리세롤 (glyc)로부터의 SA 생산은 2가지 명백한 이점을 지니고 있다: i) 실질적으로 보다 높은 수율, ii) 실질적으로 보다 낮은 포름산 및 아세트산 형성. 한편, 글리세롤을 이용한 경우의 SA 생산성 (공간 시간 수율)은 기타 당을 이용한 경우 보다 약간 더 낮다. 그러나, 글리세롤을 이용한 경우의 DD1의 SA 생산성은 문헌 [참고: Lee et al., 2001]에 의해 안애로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens)를 이용하여 수득한 값 보다 실질적으로 더 높다 (0.14 g SA/[L h]).

특히, 글리세롤을 이용하여 실질적으로 더 높은 수율을 달성한다는 것은 매우 흥미로운 결과인데; 이는 특히, 바이오디젤 공장으로부터의 저렴한 조 글리세롤을 적용할 수 있는 경우에는, 발효적 석신산, 석신산 염 및 이로부터 만든 BDO/GBL/THF 또는 피롤리돈에 대한 생산 비용을 명백히 감소시키는 데 기여할 수 있다.

실시예 7: 상이한 조 글리세롤로부터의 SA 및 부산물 형성

상이한 조 글리세롤 (C1 내지 C3) 상에서의 DD1의 SA 생산성은 10 g/L의 각각의 글리세롤 [기준으로서 10 g/L 순수 글리세롤 (P1)]을 수반한 혈청 병 시도에서 평가하였다.

1. 배지 제조

배지 조성이 다음 표 12에 기재되어 있다.

MgCO₃ 및 물 (1.5 g 및 40 mL)을 100 mL-혈청 병에서 멸균시켰다 (121℃, 20분). 냉각시킨 후, 기타 화합물의 별개의 멸균성 용액을 가하였다. 각각의 원액을 여과시킴으로써 효모 추출물, 펩톤, 황산암모늄 및 K₂HPO₄를 모두 별개로 멸균시켰다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물에 대해서는, 여과에 의해 멸균시킨 1개의 원액을 준비하였다. 글루코스 및 상이한 글리세롤을 모두 별개로 멸균시켰다 (121℃, 20분). 순수 글리세롤 (P1)을 이용한 기준 시도를 위해, 고급 '글리세롤 99％, 퓨리스' (Riedel-de Haen, 제품 번호: 15523-1L-R, 공급처: Honeywell Specialty Chemicals Seelze GmbH, Seelze, Germany)를 사용하였다.

2. 배양 및 분석

시드 배양물을, 50 g/L 글루코스 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반하는 표 12에 기재된 50 ml의 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에서 성장시켰다. 1 ml의 WCB (실시예 2)를 이용하여 접종을 수행하였다. 항온 배양을 37℃ 및 170 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 15시간 동안 수행하였다. 배양이 끝날 무렵 글루코스 농도는 약 17 g/L로 감소하였다.

세포 현탁액을 5000 g으로 5분 동안 원심분리시키고 (Biofuge primo R, Heraeus), 세포 펠릿을 세척한 다음, 글루코스를 수반하지 않고 MgCO₃을 수반하지 않는 50 mL 배지에 재현탁시켜 글루코스-무함유 접종물을 생성시켰다.

주 배양물을 10 g/L의 각각의 글리세롤 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반한 50 ml의 배지를 함유하는 100 mL-혈청 병에서 성장시켰다. 2.0 mL의 글루코스-무함유 접종물을 이용하여 접종을 수행하였다. 상기 병을 37℃ 및 170 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 9시간 동안 항온 배양하였다.

각각의 C-공급원 (시드 배양물에서는 글루코스이고, 주 배양물에서는 글리세롤이다)의 소모 및 SA 및 부산물의 생성은 실시예 5에 기재된 바와 같은 HPLC에 의해 측정하였다.

3. 결과

다음 표 13에 그 결과가 요약되어 있다.

표 13은 9시간 후, 조 글리세롤 C1 내지 C3을 이용한 경우에 수득된 SA 농도 및 이에 따른 STY (7.4 내지 8.4 g SA/L 및 0.8 내지 0.9 g SA[L h])는 모든 경우에 있어서, 순수 글리세롤 P1을 이용한 경우에 수득된 각각의 값 (6.2 g SA/L 및 0.7 g SA/[L h]) 보다 높았다. 따라서, 조 글리세롤은 보다 낮은 가격 이외에도, 보다 우수한 생산성 이점을 지니고 있다. 조 글리세롤 C1 내지 C3을 이용한 경우에 수득된 수율 (1.1 내지 1.2 g SA/g 글리세롤)은 순수 글리세롤 P1을 이용한 경우에 수득된 각각의 값과 유사하였다 (1.1 g SA/g 글리세롤).

실시예 8: DD1의 암모니아 및 글루코스 내성

글루코스로부터 석신산 및/또는 석신산 암모늄 염을 발효적으로 생성시키기 위한 통상적인 접근 방식은 특정의 초기 글루코스 수준을 이용한 NH₃-제어 공급 배치식 배양일 것이다. 이러한 설정을 위해서는 해당 균주가 NH₃/NH₄OH 내성이면서 글루코스 내성이어야 한다. DD1을 대상으로 하여 이들 특성에 관하여 시험하기 위해, pH-제어제로서 NH₄OH를 이용하고 다양한 글루코스 수준을 이용하는 배치식 배양을 수행하였다.

1. 배지 제조

배양 배지의 조성은 표 14에 기재되어 있다.

효모 추출물, 펩톤 및 MgCO₃를 발효기 및 혈청 병에서 함께 오토클레이빙하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 K₂HPO₄를 모두 별개로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물을 함께 오토클레이빙하였다. 발효기 및 혈청 병을 냉각시킨 후, 누락된 성분을 멸균성 원액으로서 가하였다. 예비배양을 위해, 동일한 배지 조성을 사용하였는데, 단 MgCO₃는 30 g/L으로 조정하였다.

2. 배양 및 분석

예비배양물을 진탕 항온 배양기 (회전 속도: 160 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃ 하에 50 mL 예비배양 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (공급처: Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Germany)가 있는 100 mL-혈청 병에서 혐기적으로 성장시켰다. 이러한 예비배양물의 접종은 혐기적 챔버 (MAKS MG 500, meintrup-dws)에서 1 mL의 DD1-작동성 세포 은행을 이용하여 수행하였다. 접종 직후, 기체 대기 (80％ N₂, 15％ CO₂ 및 5％ H₂)를 약 0.8 바 과압력의 순수 CO₂로 대체시켰다. 항온 배양한지 16시간 내지 18시간 후, 2개의 병을 혐기성 박스에 모으고, 각 경우에 15 mL를 사용하여, 산소-무함유 조건을 보장하기 위해 CO₂로 밤새 기체 공급한 300 mL 배양 배지를 함유하는 발효기 (공급처: Sixfors, Infors, Switzerland)에 접종하였다. 배양 온도는 37℃였고, 25％ NH₄OH를 이용하여 pH 6.5를 유지하였다. CO₂-기체 스트림 및 교반기 속도를 각각 0.1 L/min 및 500 rpm으로 조정하였다. 글루코스의 소모 및 SA의 생성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 정량화하였다.

3. 결과

그 결과가 도 5에 도시되어 있다.

글루코스를 수반한 NH₄OH-제어 배치식 배양에서는 40 g/L 이하의 SA가 48시간 내에 형성되었다. 따라서, DD1은 THF/BDO/GBL 및 피롤리돈으로 화학적으로 전환시키는 데에 적합한 석신산 및/또는 석신산 암모늄 염에 대한 강력한 합성 잠재력을 지니고 있다 [참고: WO-A-2006/066839].

75 g/L의 글루코스를 이용한 시도에서의 초기 SA 생산 속도는 50 및 25 g/L을 이용한 시도에서 보다 약간 더 낮았다. 그러나, 6시간과 12시간 사이에는 이러한 차이가 더 이상 없었는데, 이는 기질 억제가 75 g/L 이하의 글루코스 수준에서는 문제가 되지 않는다는 지표이다.

실시예 9: DD1에 의한 SA 형성에 대한 배양 온도 및 배양 pH의 효과

본 실험에서는 배양 온도 및 배양 pH를, 75 g/L 글루코스를 이용한 NH₄OH-제어 배치식 배양에서 다양하게 하였다.

1. 배지 제조

일정한 글루코스 농도와는 별도로, 배지 조성 및 제조는 실시예 8 'DD1의 암모니아 및 글루코스 내성'에서와 동일하였다.

2. 배양 및 분석

시험된 상이한 배양 온도 및 배양 pH 값과는 별도로, 실험적 배양 조건 및 HPLC 분석은 실시예 8 'DD1의 암모니아 및 글루코스 내성'에서와 동일하였다.

3. 결과

그 결과가 도 6에 도시되어 있다. 도 6은 37℃ 및 pH 6.5에서의 2가지 시도가 글루코스 소모 및 SA 생성 둘 다와 관련하여 극히 유사하다는 것을 나타내는데, 이는 변동성이 낮다는 지표이다. 이러한 변동성에 기초하여, pH 6.5에서 수행된 시도는 34.5℃ 내지 39.5℃의 배양 온도가 공정 성능에 강한 영향력을 미치지 않는다는 사실을 나타낸다. 그러나, 37℃에서의 시도에 의해서는, pH가 0.5 단위 정도 명백히 감소되고, pH가 0.5 단위 정도 증가하게 되면 SA 생산성이 약간 떨어지는 것으로 나타났다. 이들 결과를 근거로 하여, pH 제어가 가능하다면 DD1의 추가 배양을 pH 6.5에서 수행하였다.

실시예 10: DD1 배양에 대한 복합 배지 성분의 효과

DD1의 증균 및 단리는 5 g/L 효모 추출물 및 5 g/L 펩톤을 함유하는 배양 배지에서 수행하였다. 따라서, DD1을 이용한 첫 번째 실험은 이들 화합물을 수반한 배지에서 수행하였다. 이는 원료에 대한 비용이 많이 들게하고 부가의 불순물을 도입시키는 데 기여하기 때문에, 효모 추출물 및 펩톤을 감소시키고 보다 저렴한 옥수수 침출액 (공급처: Solulys L48L, Roquette)로 대체시킨 상이한 배지 조성을 각각 시험하였다. 본 시도의 초기 배지 조성은 숫자 (농도를 나타냄, 즉 2, 5, 15 또는 25 g/L) 및 글자 (각각의 복합 화합물을 나타냄, 즉 효모 추출물, 펩톤 또는 옥수수 침출액)로써 나타낸다.

1. 배지 제조

효모 추출물 및 펩톤 농도 각각의 변형 및 부가의 옥수수 침출액과는 별도로, 배지 조성 및 제조는 실시예 8 'DD1의 암모니아 및 글루코스 내성'에서와 동일하였다. 글루코스의 배치 농도는 모든 시도에서 50 g/L였다.

2. 배양 및 분석

실험 조건은 실시예 8 'DD1의 암모니아 및 글루코스 내성'에서와 동일하였다. 모든 배양은 37℃에서 수행하였고, 발효기에서의 배양은 25％ NH₄OH를 이용하여 pH 6.5로 유지시켰다. HPLC 분석은 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다.

3. 결과

그 결과가 도 7에 도시되어 있다. 시도 '5Y5P'와 '5Y'를 비교한 결과, SA 생성에 대한 어떠한 부정적인 효과도 유발시키지 않으면서 펩톤을 누락시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 효모 추출물을 CSL로 부분적으로 치환시키는 것이 어느 시도에서도 (시도 '5Y' 대 시도 '2Y15C') 석신산 생성을 저하시키지 못하였다. 그러나, 효모 추출물을 CSL로 완전히 치환시키면 중간 수준의 생산성 손실이 나타났다.

시도 '5Y5P' 및 '5Y'의 부산물 스펙트럼이 도 8에 도시되어 있다. 도 8은 배양 배지에 펩톤을 누락시키면 포름산 및 아세트산의 농도가 실질적으로 감소되는 반면, 락트산의 농도는 양 시도에서 거의 동등한 수준이라는 사실을 도시하고 있다. 이러한 실험은 i) 원료 비용이 절감되고, ii) 배지 화합물에 의해 도입된 불순물이 감소되며, iii) 배양 동안 부산물 형성이 감소됨으로써 배지를 개선시킬 수 있는 가능성을 나타낸다.

실시예 11: DD1과 산소와의 관계

발효적 SA 생성은 혐기성 조건에 의존하는 공정이기 때문에, SA 생성을 위해 DD1을 배양하는 것은 산소의 부재 하에 수행해야만 한다. 그러나, DD1이 산소의 존재에 대해서도 마찬가지로 견딜 수 있는지를 아는 것은 매우 중요하다. 만약 그렇다면, 상기 균주를 실험실 작업을 보다 용이하고도 신속하게 해주는 호기성 조건 하에 조작할 수 있다. 따라서, 균주 DD1을 글루코스를 이용한 진탕 플라스크 실험에서 시험하였다.

1. 배지 제조

배지 조성 및 제조는 표 8에 기재된 바와 동일하였다.

2. 배양 및 분석

37℃ 및 160 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 16시간 동안, 50 g/L 글루코스 및 30 g/L MgCO₃ 및 0.8 바 과압력의 CO₂-대기를 수반한 50 ml 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에서 혐기성 시드 배양물을 성장시켰다. 1 mL의 WCB (실시예 2)를 이용하여 접종을 수행하였다. 이들 예비배양물 7.5 mL를 사용하여 호기성 주 배양물에 접종하였다.

호기성 주 배양물 (60 g/L 글루코스 및 80 g/L MgCO₃를 수반한 150 mL 배지)을 2개의 조절판과 면 플로그가 있는 500 mL 에를렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크에서 37℃ 및 200 rpm (진탕 직경: 2.5 cm)에서 성장시켰다. 기질 소모 및 생성물 형성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 HPLC에 의해 측정하였다.

3. 결과

그 결과가 도 9에 도시되어 있다. 결과는 균주 DD1에 의한 호기성 글루코스 소모를 명백히 나타낸다. 주 생성물은 "만하이미아 석시니시프로두센스" MBEL55E의 호기적으로 성장된 세포의 가장 우세한 생성물인 아세트산 및 락트산이다 [참고: Lee et al., 2002a]. 초기 SA 수준은 혐기성 예비배양에 의해 도입하고, 배양한지 15시간 후에 광범위하게 소모되었다. 데이터는 DD1이 산소 관용성이란 사실을 나타낸다.

실시예 12: KAIST에 의해 보고된 조건 하에서의 DD1 시험

DD1의 가장 근접한 동족은 KAIST가 단리한 균주인 "만하이미아 석시니시프로두센스" MBEL55E이다 (상기 참고). DD1과 상기 균주를 비교하기 위해, KAIST에 의해 보고된 배양 실험 [참고: Fig. 2b in Lee et al., 2002a and Fig. 3 in Lee et al., 2002b]을 DD1을 이용하여 수행하였다.

1. 배지 제조

배양 배지의 조성은 문헌 [참고: Lee et al., 2002b]의 각각의 실험과 동일하였고, 다음 표 15에 기재되어 있다.

효모 추출물, 펩톤 및 MgCO₃를 발효기 및 혈청 병에서 함께 오토클레이빙하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 인산칼륨을 모두 별개로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물을 함께 오토클레이빙하였다. 발효기 및 혈청 병을 냉각시킨 후, 누락된 성분을 멸균성 원액으로서 가하였다. 시드 배양을 위해, 동일한 배지를 사용하였다.

2. 배양 및 분석

시드 배양물을 진탕 항온 배양기 (회전 속도: 160 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 39℃ 하에 50 mL 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개가 있는 100 mL-혈청 병에서 혐기적으로 성장시켰다. 이러한 시드 배양물의 접종은 혐기적 챔버 (MAKS MG 500, meintrup-dws)에서 1 mL의 WCB (실시예 2)을 이용하여 수행하였다. 접종 직후, 기체 대기 (80％ N₂, 15％ CO₂ 및 5％ H₂)를 약 0.8 바 과압력의 순수 CO₂로 대체시켰다. 항온 배양한지 9시간 후, 발효기에 30 mL을 접종하여, 산소-무함유 조건을 보장하기 위해 CO₂로 밤새 기체 공급한 300 mL 배양 배지를 함유하는 발효기 (공급처: Sixfors, Infors, Switzerland)에서 배양을 시작하였다. 배양 온도는 39℃로 유지시키고, 5 M NaOH를 이용하여 pH 6.5를 유지하였다. CO₂-기체 스트림을 0.25 vvm으로 조정하였다. 교반기 속도는 500 rpm으로 조정하였다. 글루코스 소모 및 SA 및 부산물 형성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 측정하였다.

3. 결과

그 결과가 도 10에 요약되어 있다. 항온 배양한지 5시간 내에, DD1에 의해 18.9 g/L의 글루코스가 소모되었고, 12.3 g/L의 석신산, 4.5 g/L의 아세트산 및 3.3 g/L의 포름산이 생성되었는데, 이는 MBEL55E 중의 하나와 유사한 생성물 스펙트럼을 나타낸다. 그러나, 석신산에 대한 DD1을 이용하여 수득된 공간 시간 수율은 2.5 g/(L h)인데, 이는 균주 MBEL55E 중의 하나 보다 명백히 더 높은 값이다 [1.8 g/[L h], 참고: Lee et al., 2002b]. 수율은 0.7 g 석신산/g 글루코스인데, 이는 균주 MBEL55E 중의 하나와 유사하다.

실시예 13: 합성 배지에서의 DD1의 성장

비용면에서 효율적인 발효를 위해 최저 수준의 합성 배지를 설계하고 하류 프로세싱을 개선시키기 위해서는, DD1의 발효를 위해 복합 성분을 수반하지 않는 합성 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, DD1에 대한 합성 배지를 설계하였다. 한편, 근접한 동족 만하이미아 석시니시프로두센스에 대한 합성 배지가 또한 공개되었다 [참고: Song et al, 2008]. DD1의 성장을 위한 필수 및 자극성 화합물이 결정되었다. 이러한 결과를 만하이미아 석시니시프로두센스와 비교한 결과, 명백한 차이가 관찰되었는데, 이는 균주 DD1에 적합한 보다 경제적인 성장 배지에 대한 암시이다.

1. 배지 제조

DD1에 대한 합성 성장 배지는 반추위 세균에 대한 기타 합성 성장 배지 [참고: Nili and Brooker, 1995, McKinlay et al, 2005], 기타 세균을 이용하는 기존의 사내 실험 및 단일 누락 실험을 수행하는 것과 관련하여 개발하였다.

최종적으로, 배지는 50 g/L 글루코스, 1 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.2 g/L CaCl₂*2H₂O, 0.2 g/L MgCl₂*6H₂O, 1 g/L NaCl, 3 g/L K₂HPO₄, 1 mg/L 니코틴산, 1.5 mg/L 판토텐산, 5 mg/L 피리독신, 5 mg/L 리보플라빈, 5 mg/L 바이오틴, 1.5 mg/L 티아민 HCl, 0.26 g/L 리신, 0.15 g/L 트레오닌, 0.05 g/L 메티오닌, 0.71 g/L 글루탐산, 0.06 g/L 히스티딘, 0.07 g/L 트립토판, 0.13 g/L 페닐알라닌, 0.06 g/L 티로신, 0.5 g/L 세린, 0.5 g/L 글리신, 0.5 g/L 시스테인, 0.1 g/L β-알라닌, 0.27 g/L 알라닌, 0.19 g/L 발린, 0.23 g/L 루이신, 0.16 g/L 이소루이신, 0.33 g/L 아스파르트산, 0.1 g/L 아스파라긴, 0.13 g/L 프롤린, 0.15 g/L 아르기닌 및 0.1 g/L 글루타민을 함유하였다.

50 mL의 복합 또는 합성 배지를 함유하는 혈청 병을 완충 시스템으로서 30 g/L MgCO₃ 및 물과 함께 오토클레이빙하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 인산칼륨을 별개로 멸균시켰다. Ca-, Mg- 및 Na-염화물을 함께 멸균시켰다. 비타민 및 아미노산을 각종 원액에 어셈블리하고 필터 멸균시켰다. 혈청 병을 냉각시킨 후, 성분을 멸균성 원액으로서 가하였다.

폴리펩톤을 사용하지 않고 50 g/L 글루코스 및 30 g/L MgCO₃으로 출발하여 실시예 12에 기재된 바와 같이 표준 복합 배지를 제조하였다. 시드 배양 및 몇몇 주 배양 대조군 실험을 위해, 복합 배지를 사용하였다.

2. 배양 및 분석

시드 배양물을 진탕 항온 배양기 (회전 속도: 170 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃ 하에 50 mL 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개가 있는 100 mL-혈청 병을 이용하여 복합 배지에서 혐기적으로 성장시켰다. 제1 시드 배양물의 접종은 멸균성 조건 하에 1 mL의 WCB (실시예 2)을 이용하여 호기적으로 수행하였다. 접종 직후, 호기성 기체 대기를 약 0.8 바 과압력의 순수 CO₂로 대체시켰다. 항온 배양한지 8시간 후, 제1 시드 배양물 2 ml를 원심분리시키고, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.4 g/L CaCl₂*2H₂O, 0.4 g/L MgCl₂*6H₂O, 2 g/L NaCl 및 6 g/L K₂HPO₄를 함유하는 멸균성 세척 용액을 이용하여 3회 세척한 후, 제2 시드 배양물 100 mL-혈청 병 내로 접종하였다.

제2 시드 배양물의 항온 배양은 제1 시드 배양물에 대해 기재된 바와 같이 20시간 동안 일어났으며, 그 후에 20시간 더 항온 배양시킨 주 배양물을 접종하기 위해 제2 배양물 2 mL을 다시 사용하였다. 필수 또는 자극성 화합물을 결정하기 위해, 관심있는 비타민 또는 아미노산을 제2 시드 배양물 및 주 배양물에 누락시켰다. 글루코스 소모 및 석신산 형성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 측정하였다.

3. 결과

그 결과가 표 16에 요약되어 있다. 바이오틴 및 티아민 HCl이 누락된 배지는 성장과 석신산 생성을 지속하지 못한 것으로 관찰되었다. 따라서, 바이오틴 및 티아민 HCl은 DD1의 성장에 필수 성분인 것으로 밝혀졌다. 0.6 mg/L 미만의 바이오틴 농도가 DD1의 성장에 충분하였다. 아미노산 시스테인은 DD1의 성장에 필수적이지 않은 것으로 밝혀졌는데, 이는 시스테인이 누락되어도 시스테인이 함유된 대조군에서와 유사한 석신상 생성이 초래되었기 때문이다.

이들 결과와는 달리, 바이오틴은 만하이미아 석시니시프로두센스의 성장에 필수적이진 않지만 자극적이고, 시스테인이 이의 성장에 필수적인 것으로 보고되었다 [참고: Song et al, 2008]. 티아민 HCl이 양 유기체에 대해 필수적이다. 시스테인에 대해 기본 유기 영양성인 균주는 석신산 생성을 위한 보다 최저 수준의 저렴한 생산 배지를 갖게 될 것으로 예상된다.

실시예 14: 균주 DD1 에 의한 글리세롤의 대사

탄소원으로서 글리세롤의 존재 하에 균주 DD1의 생산성은 다음 최적화 배지 및 항온 배양 조건을 활용하여 추가로 분석하였다:

1. 배지 제조 및 배양

DD1을 다음 방식으로 성장시켰다. 동결된 원액으로부터의 세포를 BHI-한천 판 (공급처: Becton Dickinson) 상에 스트리킹하였다. 세포를 긁어내고 신선한 BHI 배지에 현탁시킨 다음, 37℃ 하 혐기성 혈청 병에서 5.5시간 동안 항온 배양하였다. 세포를 100 mL 혈청 병을 이용하여 표 17에 기재된 화합물을 함유하는 배지에 접종하였다. 600 nm에서의 출발 OD는 0.1이었다 (1 mL 경로에서 측정됨). 배지 성분 1 내지 7을 함께 오토클레이빙하였고, 화합물 8은 혈청 병에서 오토클레이빙하였으며, 화합물 9 및 10은 별개로 오토클레이빙하고 최종 배지에 가하였다. 부틸-고무 마개를 통하여 혈청 병에 CO₂를 3회 이상 살포하고 0.8 바의 CO₂ 과압력 하에 놓아두었다. 혈청 병을 200 rpm 및 37℃에서 항온 배양하였다. 24시간 후, 혈청 병을 개방하고, 대사물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 결정하였다.

2. 결과

다음 결과가 표 18에 기재된 바와 같이 수득되었다. DD1은 28.4 g/L 글리세롤로부터 24시간 내에 35.3 g/L 석신산을 생산하여, 1.47 g/L 석신산/h의 공간 시간 수율을 가져다 주었는데, 이는 기타 문헌에 보고된 글리세롤 대사 예 보다 탁월한 것이다 [참고: Lee et al. 2001]. 1 M 글리세롤 및 1 M CO₂가 1 M 석신산으로 교체되는 경우에는, 1.24 g/g의 수율이 보고된 1.29 g 석신산/g 글리세롤의 이론적 수율에 근접하였다 [참고: Song and Lee, 2006].

실시예 15: 글리세롤 및 말토스로부터의 석시네이트의 생성

두 탄소원의 존재 하에서의 DD1의 생산성을 결정하였다. DD1을 이당류 말토스 및 글리세롤의 동시 존재 하에 성장시켰다.

1. 배지 제조 및 배양

동결된 원액으로부터의 세포를 BHI-한천 판 (공급처: Becton Dickinson) 상에 스트리킹하였다. 세포를 긁어내고 신선한 BHI 배지에 현탁시킨 다음, 37℃ 하 혐기성 혈청 병에서 5.5시간 동안 항온 배양하였다. 배지는 표 19에 기재되어 있다. 200 mL 혈청 병을 사용하였다. 세포를 0.1의 출발 OD (600 nm에서 파마시아 광도계를 이용하여 1 mL 경로에서 측정됨)로 접종하였다. 부틸-고무 마개를 통하여 혈청 병에 CO₂를 3회 이상 살포하고 0.8 바의 CO₂ 과압력 하에 놓아두었다. 혈청 병을 200 rpm 및 37℃에서 항온 배양하였다.

시드 배양물에 진탕 항온 배양기 (회전 속도: 160 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃ 하에 50 mL 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개가 있는 200 mL-혈청 병에서 혐기적으로 성장시킨 2ml 동결 배양물을 접종하였다. 이러한 병에 약 0.8 바 과압력의 순수 CO₂를 살포하였다. 항온 배양한지 8시간 후, 발효기에 50 mL을 접종하여, 산소-무함유 조건을 보장하기 위해 CO₂로 기체 공급한 1 L 배양 배지를 함유하는 발효기에서 배양을 시작하였다. 배양 온도는 37℃로 유지시키고, 배지에 완충제 MgCO₃를 제외한 염기를 부가하지 않고서도 pH 6.5를 유지하였다. CO₂-기체 스트림을 0.2 vvm으로 조정하였다. 교반기 속도는 300 rpm으로 조정하였다. 말토스 및 글리세롤 소모 및 SA 및 부산물 형성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 측정하였다. 세포를 37℃ 하에 성장시키고 바이오매스를 결정하였는데, 샘플을 취하고 1 M HCl을 부가함으로써 잔류성 MgCO₃를 용해시켰다. MgCO₃를 용해시킨 후, 세포를 물로 세척하고, 동결건조에 의해 건조시켰다. 무수 바이오매스를 칭량함으로써 결정하였다.

결과:

그 결과가 표 20에 요약되어 있다. 항온 배양한지 16시간 내에, DD1에 의해 36.5 g/L의 글리세롤 및 11.2 g/L 말토스가 소모되었고, 57.54 g/L의 석신산, 3.41 g/L의 아세트산 및 3.7 g/L의 포름산이 형성되었다. 석신산에 대한 DD1을 이용하여 수득된 공간 시간 수율은 3.4 g/(L h)인데, 이는 균주 MBEL55E 및 안애로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스에 대해 기존에 보고된 것 보다 명백히 더 높은 값이고, 문헌 [참고: Lee et al, 2002b, Lee et al, 2001, Song and Lee, 2006]에 보고된 기타 균주 보다 탁월하다.

석신산 수율은 글리세롤과 말토스를 합한 탄소원 1 g당 1.2 g 석신산으로서 결정되었다. 이러한 수율은 문헌 [참고: Lee et al, 2002b, Lee et al, 2001, Song and Lee, 2006]에 보고된 균주 보다 탁월하다.

석신산에 대한 공간 시간 수율 3.7 g/(L h)은 문헌 [참고: Song et al, 2006]에 기재된 균주 보다 탁월하다.

또한, 0.77 [g gDCW^-1h^-1]^h의 석신산에 대한 비 생산성도 문헌 [참고: Song et al, 2006]에 기재된 균주 보다 탁월한 것으로 밝혀졌다.

실험 요약

1. 본 발명의 균주 DD1은 극히 두드러진 특징을 지니고 있다:

- 글리세롤에 대한 눈에 띄는 생산성 파라미터 [SA 역가: 57 g/L 이하, 석신산에 대한 공간 시간 수율: 3.4 g/(L h), 석신산에 대한 비 생산성: 0.77 g/(g DCW h) 및 탄소 수율: 소모된 탄소 1 g당 1.24 g 이하.

- 각각 75 g/L 및 70 g/L 이상의 글루코스 및 글리세롤 수준이 관용된다.

- D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스가 SA로 효율적으로 전환되는데, 이는 생물정제소 (biorefinery) 접근 방식을 이용한 SA 생성이 적합하다는 지표이다.

- 글리세롤, 특히 바이오디젤 공장으로부터의 정제되지 않은 물질이 또한, SA 생성을 위해 효율적으로 사용되는데; 수율, 공간 시간 수율, 비 생산성 및 생성물/부산물 비는 D-글루코스 및 기타 당을 이용한 경우 보다 실질적으로 더 높고 우수하다.

- pH 제어를 위한 NH₃/NH₄OH가 관용되므로, 석신산 및/또는 석신산 암모늄 염 생성이 가능하다.

- D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스가 SA로 효율적으로 전환되는데, 이는 생물정제소 접근 방식을 이용한 SA 생성이 적합하다는 지표이다.

- 글리세롤, 특히 바이오디젤 공장으로부터의 정제되지 않은 물질이 또한, SA 생성을 위해 효율적으로 사용되는데; 수율 및 생성물/부산물 비는 D-글루코스 및 기타 당을 이용한 경우 보다 실질적으로 더 높다.

- 별개의 탄소원 조합물이 석신산으로 효율적으로 전환된다.

- 호기성 세포 성장이 가능한데, 이는 특히 추가의 균주 개발을 위해 해당 균주를 실험실에서 일반적으로 조작하는 데 명백히 유리하다.

- 배양 배지가 생산성 손실 없이도 실질적으로 개선되었다.

결론:

1. 본 균주는 석신산 및/또는 석신산 염, 예를 들어 암모늄 염 (이는 THF/BDO/GBL 및 피롤리돈으로 전환될 수 있다)을 생산할 수 있는 탁월한 잠재력을 지니고 있다.

2. 단량체 적용을 위한 석신산의 생성은 또 다른 매력적인 선택 사항이다.

참고 문헌:

본 발명의 맥락에서, 세균성 균주 DD1은 2006년 8월 11일자로 DSMZ에 수탁 번호 DSM 18541로 기탁되었다.

<부록 1>

DSMZ

DSM18541

20060811

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Carboxylic acid producing member of the Pasteurellaceae <130> M/47282 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1517 <212> DNA <213> Pasteurella sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1517) <223> 16S rDNA <400> 1 tttgatcctg gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgaacggta 60 gcgggaggaa agcttgcttt ctttgccgac gagtggcgga cgggtgagta atgcttgggg 120 atctggctta tggaggggga taacgacggg aaactgtcgc taataccgcg taatatcttc 180 ggattaaagg gtgggacttt cgggccaccc gccataagat gagcccaagt gggattaggt 240 agttggtggg gtaaaggcct accaagccga cgatctctag ctggtctgag aggatgacca 300 gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360 cacaatgggg ggaaccctga tgcagccatg ccgcgtgaat gaagaaggcc ttcgggttgt 420 aaagttcttt cggtgacgag gaaggtgttt gttttaatag gacaagcaat tgacgttaat 480 cacagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcgagc 540 gttaatcgga ataactgggc gtaaagggca tgcaggcgga cttttaagtg agatgtgaaa 600 gccccgggct taacctggga attgcatttc 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tgaagtcgta acaaggtaac 1500 cgtaggggaa cctgcgg 1517 <210> 2 <211> 3008 <212> DNA <213> Pasteurella sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3008) <223> 23S rDNA <400> 2 agtaataacg aacgacacag gtataagaat acttgaggtt gtatggttaa gtgactaagc 60 gtacaaggtg gatgccttgg caatcagagg cgaagaagga cgtgctaatc tgcgaaaagc 120 ttgggtgagt tgataagaag cgtctaaccc aagatatccg aatggggcaa cccagtagat 180 gaagaatcta ctatcaataa ccgaatccat aggttattga ggcaaaccgg gagaactgaa 240 acatctaagt accccgagga aaagaaatca accgagatta cgtcagtagc ggcgagcgaa 300 agcgtaagag ccggcaagtg atagcatgag gattagagga atcggctggg aagccgggcg 360 gcacagggtg atagccccgt acttgaaaat cattgtgtgg tactgagctt gcgagaagta 420 gggcgggaca cgagaaatcc tgtttgaaga aggggggacc atcctccaag gctaaatact 480 cctgattgac cgatagtgaa ccagtactgt gaaggaaagg cgaaaagaac cccggtgagg 540 ggagtgaaat agaacctgaa accttgtacg tacaagcagt gggagcccgc gagggtgact 600 gcgtaccttt tgtataatgg gtcagcgact tatattatgt agcgaggtta accgaatagg 660 ggagccgaag ggaaaccgag tcttaactgg gcgtcgagtt gcatgatata 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Claims

서열 1의 16S rDNA; 또는 서열 1에 99.9％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열을 가지며, 석신산을 생산할 수 있는 능력을 지닌, DSMZ에 수탁 번호 DSM 18541로 기탁된 세균성 균주 DD1; 및 석신산을 생산할 수 있는 능력을 보유하고 있으면서 상기 균주로부터 유래된 변이체 또는 돌연변이체 균주.
a) 제1항의 세균성 균주를, 동화 가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 항온 배양하고, 이러한 균주를 유기산 또는 그의 염의 형성을 위한 조건 하에 배양하는 단계; 및
b) 상기 배지로부터 유기산 또는 그의 염을 수득하는 단계
를 포함하는, 유기산 또는 그의 염을 발효적으로 생성하는 방법.
제2항에 있어서, 발효가 이산화탄소의 존재 하에 5.0 내지 9.0의 pH에서 10 내지 60℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 유기산이 석신산인 방법.
제2항에 있어서, 동화 가능한 탄소원이 글리세롤, 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스; 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그노셀룰로스의 분해 생성물; 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 탄소원이 글리세롤 또는 글리세롤과 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, 및 L-아라비노스 중에서 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물인 방법.
제2항에 있어서, 동화 가능한 탄소원의 농도가 5 내지 80 g/l 범위의 값으로 조정되는 방법.
a) 제1항의 세균성 균주를, 하나 이상의 동화 가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 항온 배양하고, 이러한 균주를 유기산 또는 그 염의 형성을 위한 조건 하에 배양하는 단계; 및
b) 상기 배지로부터 유기산 또는 그의 염을 수득하는 단계
를 포함하고,
i) 28 g/L 이상의 글리세롤을 1.0 g/g 이상의 수율 계수 YP/S로 28.1 g/L 이상의 석신산으로 전환시키는 것;
ii) 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율로 석신산으로 전환시키는 것;
iii) 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 2.2 g/(L h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것;
iv) 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원 28 g/L 이상을, 2.2 g/(L h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것;
v) 슈크로스, 말토스, D-프럭토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및 글리세롤 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW^-1h^-1 이상의 석신산의 비 생산성 수율 및 2.2 g/(L h) 이상의 석신산에 대한 공간 시간 수율로 석신산으로 전환시키는 것
의 상기 특징들 중 한 가지 이상을 부가적으로 특징으로 하는, 석신산 또는 그의 염을 발효적으로 생성하는 방법.
제2항에 있어서, 불연속적으로 또는 연속적으로 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 석신산 또는 그의 염을 수득하는 단계; 및 암모니아 또는 그의 수성 용액, 또는 NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, NaOH, Na₂CO₃, NaHCO₃, KOH, K₂CO₃, KHCO₃, Mg(OH)₂, MgCO₃, Mg(HCO₃)₂, Ca(OH)₂, CaCO₃, Ca(HCO₃)₂, CaO, CH₆N₂O₂, C₂H₇N, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 pH를 제어하는 단계를 포함하는 방법.
제10항에 있어서,
a) 수득된 석신산, 석신산 염 또는 이들의 혼합물을 직접적으로 촉매적 수소화하여 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 또는 이들의 혼합물을 수득하는 단계, 또는
b) 수득된 유리 석신산, 석신산 염 또는 이들의 혼합물을 화학적으로 에스테르화하여 그의 상응하는 디-저급 알킬 에스테르를 수득하고, 이러한 에스테르를 후속 촉매적 수소화하여 THF, BDO, GBL 또는 이들의 혼합물을 수득하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 석신산 암모늄 염을 피롤리돈으로 화학적으로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 동화 가능한 탄소원으로서 사용되는 글리세롤이 트리아실글리세라이드의 에스테르 절단에 의해 수득되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 글리세롤이 바이오디젤 제조시 수득된 폐기물인 방법.
제2항에 있어서, 동화 가능한 탄소원이 글리세롤, 슈크로스, 글루코스, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, pH를 제어하는 단계가 Mg(OH)₂를 이용하는 것을 포함하는, 방법.
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