CN106591398A - 一种利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得sa的方法 - Google Patents

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陈祥松
吴金勇
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Abstract

本发明公开了一种利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得SA的方法，其特征在于：以生物柴油副产物粗甘油、含铵根离子的氮源和餐厨废水等为发酵底物，利用大肠杆菌基因工程菌进行发酵，发酵过程中进行碳源和氮源的补加，获得N‑乙酰神经氨酸含量可达5～10g/L。本发明为生物柴油副产物粗甘油的高附加转化提供一条新的途径。

Description

一种利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得SA的 方法
技术领域
本发明涉及一种对废弃油脂制备生物柴油过程中产生的副产物粗甘油进行高附加值转化为N-乙酰神经氨酸的方法，属于生物工程技术及废弃物资源转化技术领域。
背景技术
生物柴油具有可再生、无毒、含硫量低等优越性能，作为一种极有发展前景的新能源可部分替代石化柴油，因此越来越受到人们的关注，并得到大力发展。而目前生物柴油生产过程中产生大量的副产物粗甘油，大约每生产1吨生物柴油可产生0.1吨的甘油。有研究学者对粗甘油进行加工提纯，做成纯度较高的工业用甘油(刘汉勇，化学世界，2009年第三期，174-177页)，有的利用副产物粗甘油发酵产DHA和EPA(孔秀梅，2012年天津商业大学硕士论文)，也有的利用副产物粗甘油发酵生产1,3-丙二醇(胡秋龙，中国油脂2010年第35卷第10期)等等，粗甘油的深度开发已成为人们的重点研究对象。
N-乙酰神经氨酸，也称唾液酸(SA)，是细胞膜蛋白的重要组成部分，参与细胞表面多种生理功能，具有提高婴儿智力和记忆力、抗老年痴呆、抗菌和抗病毒等功能。目前越来越多的受到人们的关注，已经在食品、保健品、化妆品和医药等领域得到应用。N-乙酰神经氨酸目前全球需求量很大，且价格较高，如SIGMA公司出售的SA，纯度98％的产品的价格为＄1010.0/g，纯度99％的产品的价格为＄2695.0/g(sigma官网)。
因此，若能以生物柴油副产物粗甘油为原料，进行高附加值转化获得SA，将具有极高的研究价值。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得SA的方法，旨在将粗甘油变废为宝，获得属于高附加值营养品和保健品的N-乙酰神经氨酸，提高SA产量、降低成本，为粗甘油的高附加值转化利用提供一条新的途径。
本发明的发明人所在课题组利用基因重组技术研究开发了一种基因工程大肠杆菌(专利号ZL 201310600843.0)，可以葡萄糖或甘油等为底物来发酵产N-乙酰神经氨酸。利用催化酯化制备的生物柴油符合国家BD100的标准，本发明对其产生的副产物粗甘油进行稍加处理，然后加入餐厨废水，通过上述基因工程菌发酵生产N-乙酰神经氨酸，其产量可达5～10g/L。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得SA的方法，包括如下步骤：
a、副产物粗甘油的预处理：
将制备得到的生物柴油粗品静止分层，上层为柴油、下层为副产物粗甘油；
首先将粗甘油与蒸馏水按体积比1:2～4混匀，以降低粗甘油的粘性；然后用酸调节pH至3～5，使粗甘油中的皂化物转变为游离脂肪酸，静置分层，使游离脂肪酸从粗甘油中分离出来；再对粗甘油进行40～80℃真空蒸发，除去易挥发性杂质；最后再加入活性炭进行吸附脱色并除杂，活性炭加入量占液体总质量的1％～4％；
b、发酵培养基的配置：
以预处理后的粗甘油作为碳源，加入含铵根离子的氮源，再加入餐厨废水，使碳源和氮源的质量比为1:1～3:1、甘油含量在10～30g/L；再加入IPTG，使IPTG的质量浓度在1～3％；最后调pH至7.0、高温灭菌，获得发酵培养基；
c、种子液制备：首先将活化大肠杆菌基因工程菌接种到LB固体培养基上，培养6～12h；然后接种到LB液体培养基上，继续培养6～12h，得到二级种子液；
LB固体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L；
LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L。
d、发酵：将二级种子液按照3％～15％的接种量接种到5L步骤b获得的发酵培养基中，溶氧保持在20％以上，搅拌，维持发酵温度为35～40℃，进行连续发酵；
e、待底料耗完后，开始补料，保持pH在6.0～7.0，继续培养60～80h，发酵结束，得产物。
所述的氮源为氨水或硫酸铵。
步骤b中所述的餐厨废水含有钠盐和钾盐，在加入IPTG之前，先调整钾盐含量在3～4g/L。
步骤c中所述的大肠杆菌基因工程菌为专利ZL 201310600843.0中构建的大肠杆菌工程菌。
步骤e中所述的补料是补入碳源和氮源，所述的碳源为预处理后的粗甘油，所述的氮源为氨水或硫酸铵；碳源的补料速度在300～500g/L.h；在补入碳源的同时补入氮源至pH在6.0～7.0。
本发明的技术效果体现在：
1、本发明以生物柴油副产物粗甘油为底物，利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产N-乙酰神经氨酸，产物的产量在5L发酵罐内达到了5～10g/L，为粗甘油的高附加值转化利用提供一条新的途径。
2、本发明在发酵培养基中加入餐厨废水，其含有多种无机盐(如钠盐、钾盐)和维生素(如VB)等，给发酵过程提供所需的无机盐和维生素，提高了发酵产量。
3、本发明在发酵过程中，利用粗甘油、餐厨废水等废弃物转化为高附加值的N-乙酰神经氨酸，体现了变废为宝的技术效果。
附图说明
图1为制备的生物柴油粗品静止分层后的副产物粗甘油(下层棕色液体)；
图2为生物柴油副产物粗甘油发酵制备N-乙酰神经氨酸的发酵产量图(实施例1)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。但这些实施例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。
实施例1
本实施按如下步骤利用生物柴油副产物粗甘油通过大肠杆菌基因工程菌进行发酵生产N-乙酰神经氨酸：
a、副产物粗甘油的预处理：
将制备得到的生物柴油粗品静止分层，如图1所示，上层浅黄色半透明状液体为柴油、下层棕色液体为副产物粗甘油；
首先将粗甘油加入2倍体积的蒸馏水中；然后用盐酸调节pH至4，使粗甘油中的皂化物转变为游离脂肪酸，静置分层，使游离脂肪酸从粗甘油中分离出来；再对粗甘油进行60℃真空蒸发30min，除去少量甲醇等易挥发性杂质；最后再加入占液体总质量的2％活性炭进行吸附脱色并除杂；
b、发酵培养基的配置：
以预处理后的粗甘油作为碳源，加入含铵根离子的氮源，再加入餐厨废水，使碳源和氮源的质量比为1:2、甘油含量在20g/L；再加入IPTG，使IPTG的质量浓度在2％；最后调pH至7.0、高温灭菌，获得发酵培养基；
c、种子液制备：首先活化大肠杆菌基因工程菌，然后接种到LB固体培养基上，培养6h；再接种到LB液体培养基上，继续培养6h，得到二级种子液；
d、发酵：将二级种子液按照4％的接种量接种到5L步骤b获得的发酵培养基中，溶氧为20％，开启搅拌，维持发酵温度为36℃，进行连续发酵；
e、待底料耗完后，开始补料，预处理后的粗甘油的补料速度在300g/L.h，在补入碳源的同时补入氨水至pH在6.0～7.0之间。继续培养60h，发酵结束，N-乙酰神经氨酸含量达5g/L。
实施例2
本实施按如下步骤利用生物柴油副产物粗甘油通过大肠杆菌基因工程菌进行发酵生产N-乙酰神经氨酸：
a、副产物粗甘油的预处理：
将制备得到的生物柴油粗品静止分层，上层浅黄色半透明状液体为柴油、下层棕色液体为副产物粗甘油；
首先将粗甘油加入3倍体积的蒸馏水中；然后用盐酸调节pH至5，使粗甘油中的皂化物转变为游离脂肪酸，静置分层，使游离脂肪酸从粗甘油中分离出来；再对粗甘油进行60℃真空蒸发30min，除去少量甲醇等易挥发性杂质；最后再加入占液体总质量的2％活性炭进行吸附脱色并除杂；
b、发酵培养基的配置：
以预处理后的粗甘油作为碳源，加入含铵根离子的氮源，再加入餐厨废水，使碳源和氮源的质量比为1:3、甘油含量在20g/L；再加入IPTG，使IPTG的质量浓度在3％；最后调pH至7.0、高温灭菌，获得发酵培养基；
c、种子液制备：首先活化大肠杆菌基因工程菌，然后接种到LB固体培养基上，培养8h；再接种到LB液体培养基上，继续培养8h，得到二级种子液；
d、发酵：将二级种子液按照5％的接种量接种到5L步骤b获得的发酵培养基中，溶氧为30％，开启搅拌，维持发酵温度为36℃，进行连续发酵；
e、待底料耗完后，开始补料，预处理后的粗甘油的补料速度在400g/L.h，在补入碳源的同时补入氨水至pH在6.0～7.0之间。继续培养80h，发酵结束，N-乙酰神经氨酸含量达8g/L
以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用生物柴油副产物粗甘油进行高附加值转化获得SA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、副产物粗甘油的预处理：
将制备得到的生物柴油粗品静止分层，上层为柴油、下层为副产物粗甘油；
首先将粗甘油与蒸馏水按体积比1:2～4混匀，以降低粗甘油的粘性；然后用酸调节pH至3～5，使粗甘油中的皂化物转变为游离脂肪酸，静置分层，使游离脂肪酸从粗甘油中分离出来；再对粗甘油进行40～80℃真空蒸发，除去易挥发性杂质；最后再加入活性炭进行吸附脱色并除杂；
b、发酵培养基的配置：
以预处理后的粗甘油作为碳源，加入含铵根离子的氮源，再加入餐厨废水，使碳源和氮源的质量比为1:1～3:1、甘油含量在10～30g/L；再加入IPTG，使IPTG的质量浓度在1～3％；最后调pH至7.0、高温灭菌，获得发酵培养基；
c、种子液制备：首先将活化大肠杆菌基因工程菌接种到LB固体培养基上，培养6～12h；然后再接种到LB液体培养基上，继续培养6～12h，得到二级种子液；
d、发酵：将二级种子液按照3％～15％的接种量接种到5L步骤b获得的发酵培养基中，溶氧保持在20％以上，搅拌，维持发酵温度为35～40℃，进行连续发酵；
e、待底料耗完后，开始补料，保持pH在6.0～7.0，继续培养60～80h，发酵结束，得产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的氮源为氨水或硫酸铵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的餐厨废水含有钠盐和钾盐，在加入IPTG之前，先调整钾盐含量在3～4g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中所述的大肠杆菌基因工程菌为专利ZL 201310600843.0中构建的大肠杆菌工程菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤e中所述的补料是补入碳源和氮源，所述的碳源为预处理后的粗甘油，所述的氮源为氨水或硫酸铵；碳源的补料速度在300～500g/L.h；在补入碳源的同时补入氮源至pH在6.0～7.0。
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