ES2560534T3 - Células bacterianas que muestran actividad de formato deshidrogenasa para la fabricación de ácido succínico - Google Patents

Abstract

Una célula bacteriana de la cepa DD1 de Pasteurella capaz de usar glicerol como fuente de carbono que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad de formato deshidrogenasa.

Description

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La producción de ácido succínico podría aumentarse más expresando una o ambas de las enzimas anteriormente mencionadas (isocitrato liasa y/o malato sintasa). Debido a la expresión de las enzimas, se estabilizará una derivación de glioxilato en las células bacterianas de Pasteurella que normalmente carecen de estas enzimas. Dicha derivación de glioxilato potenciará la producción de ácido succínico y evitará pérdidas debido al CO2 como resultado del ciclo del ácido cítrico.

Además, En otra divulgación de la célula bacteriana de la presente memoria descriptiva, dicha célula bacteriana es deficiente en alcohol deshidrogenasa.

La expresión "deficiente en alcohol deshidrogenasa" se refiere a una célula bacteriana que o bien no tiene actividad de alcohol deshidrogenasa detectable o al menos una actividad de alcohol deshidrogenasa significativamente reducida cuando se compara con una célula bacteriana que muestra niveles de actividad fisiológicos de alcohol deshidrogenasa. Si una reducción es significativa puede determinarse mediante procedimientos estadísticos bien conocidos para los expertos en la materia. Las células bacterianas que son deficientes en alcohol deshidrogenasa pueden ser de origen natural, es decir, debido a mutaciones espontáneas. Puede modificarse una célula bacteriana para que carezca o para que tenga actividad de alcohol deshidrogenasa significativamente reducida mediante diversas técnicas que se describen en detalle anteriormente para células bacterianas que sean deficientes en lactato deshidrogenasa.

Una alcohol deshidrogenasa preferida de acuerdo con la invención está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica tal como se muestra en SEC ID Nº: 15; b) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEC ID Nº: 16; c) un ácido nucleico que es al menos un 70 % idéntico al ácido nucleico de a) o b); y d) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b).

Se ha descubierto en los estudios subyacentes a esta memoria descriptiva que una célula bacteriana que expresa formato deshidrogenasa que carece de alcohol deshidrogenasa también permite la producción aumentada de ácido succínico. Además, la cantidad de etanol no deseada en dichas células se reduce de manera significativa.

Finalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar AS que comprende

i) cultivar una célula bacteriana de la presente divulgación en condiciones de cultivo adecuadas; y

ii) obtener AS a partir de las células bacterianas cultivadas.

La expresión "ácido succínico" (AS) tiene que entenderse en su sentido más amplio y también abarca sales del mismo, tales como por ejemplo sales de metales alcalinos, como sales de Na y K, o sales alcalinotérreas, como sales de Mg y Ca, o sales de amonio; o anhídridos de dichos ácidos.

Las condiciones de cultivo adecuadas y las técnicas para obtener el AS para aplicarse en el procedimiento de la presente memoria descriptiva, es decir, el proceso fermentativo para la producción de AS, son los siguientes:

la célula bacteriana de la presente divulgación, preferentemente, se incuba en un medio que contiene una fuente de carbono que puede asimilarse y cultivarse a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 a 60 o de 20 a 50 o de 30 a 45°C a un pH de 5,0 a 9,0 o de 5,5 a 8,0 o de 6,0 a 7,0 en presencia de dióxido de carbono.

Preferentemente, se produce AS en condiciones anaerobias. Las condiciones anaerobias puede establecerse mediante técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, desgasificando los constituyentes del medio de reacción y manteniendo condiciones anaerobias introduciendo dióxido de carbono o de nitrógeno o mezclas de los mismos y opcionalmente hidrógeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o de 0,2 a 0,5 vvm. Las condiciones aerobias puede establecerse mediante técnicas convencionales, tales como por ejemplo introduciendo aire u oxígeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o de 0,2 a 0,5 vvm. En caso de que sea adecuado, puede aplicarse una ligera sobrepresión de 10 a 150 kPa en el procedimiento.

La fuente de carbono asimilable se selecciona preferentemente entre glicerol, D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-galactosa, D-manosa y mezclas de los mismos o composiciones que contienen al menos uno de dichos compuestos, o se selecciona entre productos de descomposición de almidón, celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa.

La concentración inicial de la fuente de carbono asimilable, preferentemente, se ajusta a un valor en el intervalo de 5 a 100 g/l y puede mantenerse en dicho intervalo durante el cultivo.

El pH del medio de reacción puede controlarse mediante la adición de bases adecuadas, tales como, por ejemplo, hidróxido de amonio en forma de una solución acuosa a al menos el 5 % (p/v) o más concentrada (hasta saturación) de amoniaco o amoniaco gaseoso u otras bases.

Las condiciones particularmente preferidas para producir AS son:

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Fuente de carbono: Glucosa o glicerol (incluyendo glicerol en bruto)

Temperatura: 30 a 45 °C,

pH: 5,5 a 7,0

Gas suministrado: CO2

La expresión "glicerol en bruto" debe entenderse como una corriente que contiene glicerol no tratado tal como se obtiene en procedimientos en las que el glicerol es un subproducto, tales como, por ejemplo, la producción de biodiésel

o de bioetanol. A menos que se afirme lo contrario, el término "glicerol", tal como se usa en el presente documento también abarca "glicerol en bruto".

Las condiciones preferidas adecuadas se derivarán de los ejemplos y figuras adjuntos.

El ácido succínico y/o las sales de SA producidas, preferentemente, se obtienen mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cristalización, filtración, electrodiálisis, cromatografía. Por ejemplo, pueden aislarse precipitando como producto de succinato de calcio en el fermentador durante la fermentación usando hidróxido, óxido, carbonato o hidrogenocarbonato de calcio para la neutralización y filtración del precipitado.

El producto de AS deseado se recupera a partir del calcio o succinato precipitado mediante acidificación del succinato con ácido sulfúrico seguido de filtración para eliminar el sulfato de calcio (yeso) o que se precipita. La solución resultante puede purificarse adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico para eliminar los iones residuales no deseados.

Otra divulgación de la presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la producción de AS y/o sales de AS, en particular sales de amonio, comprendiendo dicho procedimiento la producción fermentativa de AS, tal como se define anteriormente y controlando el pH con una base adecuada, en particular una base inorgánica, como amoniaco, o una solución acuosa de la misma.

Otra divulgación de la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la producción de tetrahidrofurano (THF) y/o 1,4-butanodiol (BDO) y/o gamma-butirolactona (GBL) que comprende

a) la producción fermentativa de AS y/o sales de AS, por ejemplo, sales de amonio, tal como se definen anteriormente, y b1) bien la hidrogenación catalítica del ácido libre obtenido a THF y/o BDO y/o GBL o b2) la esterificación química de AS libre obtenido y/o sales de amonio de SA en su correspondiente éster de di-alquilo inferior y la posterior hidrogenación catalítica en THF y/o BDO y/o GBL.

Alquilo inferior representa preferentemente una cadena C1-C6-lineal o ramificada, preferentemente un resto de alquilo C1-C4, en particular metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, así como n-pentilo y n-hexilo y análogos ramificados de los mismos.

Otra divulgación de la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la producción de pirrolidonas que comprende

a) la producción fermentativa de sales de amonio de AS tal como se definen anteriormente, y b) la conversión química de sales de amonio de AS en pirrolidonas de una manera conocida en sí, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO-A-2006/066839.

En una divulgación adicional, dicho glicerol, que se usa como fuente de carbono asimilable, es glicerol en bruto.

Más detalles de la hidrogenación directa de AS:

las condiciones experimentales adicionales para llevar a cabo la hidrogenación catalítica directa se conocen bien, y por ejemplo, se describen en el documento US 4.550.185.

EL AS se hidrogena de una manera conocida en sí usando procedimientos, aparatos y auxiliares, tales como disolventes, familiares para los expertos en la materia. En particular, se lleva a cabo una hidrogenación continua o por lotes de fase líquida en presencia de un catalizador heterogéneo adecuado para la hidrogenación ácida. Los parámetros óptimos del procedimiento pueden establecerse por el experto en la materia sin un esfuerzo inaceptable. Por ejemplo, la temperatura de reacción se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 °C, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 130 a 285 °C, y la presión es de aproximadamente 2000 a 35000 kPa, por ejemplo, de 10000 a 25000 kPa. Los catalizadores usables para la reacción de hidrogenación se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden usarse diversos catalizadores de paladio/renio/carbono. Los disolventes usables para la reacción de hidrogenación se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede usarse un medio disolvente acuoso.

Más detalles acerca de la esterificación de AS seguida de hidrogenación:

las condiciones experimentales adecuadas para llevar a cabo la esterificación química, seguida de hidrogenación catalítica directa se conocen bien, y por ejemplo, se describen en la Solicitud de Patente Europea 06007118.0.

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a) Procedimiento de esterificación:

El procedimiento de esterificación que puede comprender una destilación reactiva puede llevarse a cabo usando un aparato conocido en sí con diversos diseños.

Por ejemplo, puede usarse una planta de esterificación que se opere de modo continuo la cual comprende una columna de rectificación con un número adecuado de etapas teóricas logradas mediante la instalación de bandejas o empaquetamientos. La carga acuosa que comprende la sal de amonio de AS se alimenta en la parte superior de la columna a partir de un vaso de depósito tan pronto como se ha formado un perfil de temperatura de estado estacionado en la columna como resultado de la alimentación de etanol que se evapora en el bucle evaporador adyacente al sumidero de la columna. La reacción forma un flujo contracorriente de líquido descendente que contiene sal de amonio y condensado, y una fase de vapor ascendente que contiene alcanol. Para catalizar la reacción de esterificación, puede añadirse un catalizador homogéneo a la carga inicial de sal de amonio. Como alternativa, pueden proporcionarse los catalizadores heterogéneos en la parte interna de la columna. El éster carboxílico formado es líquido en las condiciones del procedimiento y pasa a través del extremo inferior de la columna al sumidero de la columna de destilación y se extrae de manera continua del sumidero. Los componentes gaseosos, por ejemplo, mezclas azeotrópicas que comprende alcano-agua y/o amoniaco, se extraen de la columna de reacción y por tanto forman el equilibrio de reacción en la parte superior de la columna.

Pueden incorporarse modificaciones adicionales de las divulgaciones específicas anteriormente descritas por los expertos en la materia sin un esfuerzo inaceptable.

Los intervalos adecuados para los parámetros del procedimiento para el procedimiento de esterificación pueden determinarse fácilmente por el experto en la materia dependiendo de la configuración del aparato usado, por ejemplo, el tipo de componentes internos de la columna usados, el tipo y la cantidad de los reactivos, el tipo y la cantidad del catalizador usado en caso adecuado. Por ejemplo, sin restringirse a los mismos, pueden ajustarse parámetros individuales dentro de los siguientes intervalos de parámetros:

Temperatura de la columna: 0-300 °C, en particular 40-250 °C, o 70-200 °C Presión: de 10 a 600 kPa, en particular presión estándar Tiempo de residencia: unos pocos segundos (por ejemplo de 1 a 60) hasta días (por ejemplo, de 1 a 5), en particular desde unos pocos minutos (por ejemplo, de 1 a 60) hasta unas pocas horas (por ejemplo, de 1 a 15), más preferentemente desde unos pocos minutos (por ejemplo, de 5 a 20) hasta 2 h.

b) Procedimiento de hidrogenación

Los ésteres de AS preparados de acuerdo con la divulgación se hidrogenan de un modo conocido en sí usando procedimientos, aparatos y auxiliares, tales como catalizadores, familiares para los expertos en la materia.

En particular, se lleva a cabo una hidrogenación continua o por lotes de fase gaseosa en presencia de un catalizador heterogéneo adecuado para la hidrogenación estérica. Los parámetros óptimos del procedimiento pueden establecerse por el experto en la materia para el éster particular sin un esfuerzo inaceptable. Por ejemplo, la temperatura de reacción se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 °C, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 200 a 280 °C, y la presión es de aproximadamente 500 a 10000 kPa, por ejemplo, de 1000 a 5000 kPa. La relación molar de reactivo a hidrógeno se ajusta dentro del intervalo de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:2000, por ejemplo, de 1:800 a 1:1500.

Los catalizadores usables para la reacción de hidrogenación desvelada se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden usarse varios catalizadores de cobre. La técnica anterior describe, por ejemplo, el uso de catalizadores de cromito de cobre reducidos que pueden obtenerse con el nombre 85/1 de Davy Process Technology Ltd., Inglaterra. Sin embargo, los catalizadores particularmente adecuados de acuerdo con la divulgación son catalizadores de óxido de cobre soportados, aplicándose el óxido de cobre a materiales de soporte de alúmina o sílice. Los ejemplos de la hidrogenación de ésteres succínicos a BDO (1,4-butanodiol)/GBL (gamma butirlactona)/THF con catalizadores de cobre también se conocen bien en la técnica.

La fermentación, tal como se usa de acuerdo con la presente divulgación puede llevarse a cabo en fermentadores agitados, columnas de burbujeo y reactores de bucle. Los tipos de procedimiento posibles incluyendo tipos de agitador y diseños geométricos se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en libros de texto convencionales. En el procedimiento, las variantes típicas disponibles son las siguientes variables conocidas por los expertos en la materia o explicadas, por ejemplo, en un libro de texto convencional (Chmiel H, Hammes WP, Bailey JE, 1987, "Biochemical engineering. A challenge for interdisciplinary cooperation.", ISBN: 3-437-30574-3.), tales como fermentación por lotes, lotes alimentados, lotes alimentados repetidos o continua con y sin reciclado de la biomasa. Dependiendo de la cepa de producción, burbujeando con aire, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o mezclas adecuadas de gas pueden/tienen que efectuarse en orden para lograr buenos rendimientos.

Antes de la conversión química en el caldo de fermentación en el procedimiento de acuerdo con la divulgación, puede pretratarse el caldo de fermentación; por ejemplo, puede eliminarse la biomasa del caldo. Los procedimientos para eliminar la biomasa se conocen por los expertos en la técnica, por ejemplo, filtración, sedimentación y flotación. Por

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(continuación)

Cepa

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LU 13843 pJFF224 (PpckA fdh C.b, PEFTU icl ms Y.m.)

DD1 pJFF224 (PpckA fdh C.b, PEFTU icl ms Y.m.)

LU15050 delta adhE.

delta ldh delta adhE de DD1

LU15050 delta adhE. pJFF224 (PpckA fdh C.b.)

delta ldh delta adhE pJFF224 de DD1 (PpckA fdh C.b.)

LU 13843 pJFF224 (fdh W.s.)

pJFF224 de DD1 (fdh W.s.)

LU 15050 pJFF224 (fdh W.s.)

delta ldh pJFF224 de DD1 (fdh W.s.)

LU 15050 delta adhE pJFF224

delta ldh delta adhE pJFF224 de DD1 (fdh

(fdh W.s.)

W.s.)

La cepa LU 13843 de Pasteurella se transformó con ADN mediante electroporación usando el siguiente protocolo:

Cultivo previo:

Se inoculó a LU 13843 a partir de una placa de BHI-Agar recientemente cultivada en 40 ml de BHI (infusión de cerebro corazón, Difco) en un matraz agitado de 100 ml. La incubación se llevó a cabo durante toda la noche a 30 °C; 200 rpm.

Cultivo principal:

50 ml de BHI en matraz agitado de 100 ml

Inoculado a una DO(610) final de 0,4

Incubación: aproximadamente 1,5 h a 30 °C, 200 rpm

Las células se recogieron a una DO de aproximadamente 1,3

El precipitado se lavó una vez con glicerol frío al 10 % a 4 °C. Se resuspendió en 1,7 ml de glicerol al 10 % (4 °C) Se mezclaron 100 l de células competentes con 5-10 g de ADN (10-20 l) y se mantuvieron sobre hielo durante 2 min en una cubeta de electroporación con una profundidad de 0,2 cm. Condiciones de electroporación: 800 Ω; 25 F; 2 kV (Pulsador génico, Bio-Rad) Adición de 1 ml de BHI inmediatamente después de la electroporación; Incubación durante 2 h a 30 °C

Las células se sembraron en BHI con 5 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante 2-5 d a 30 °C hasta que estaban visibles las colonias de los transformantes. Se aislaron los clones y se volvieron a sembrar sobre BHI con 5 mg/l de cloranfenicol hasta que se obtuvo la pureza de los clones.

Ejemplo 2: Generación de construcciones de eliminación

Se construyeron plásmidos de eliminación basándose en el vector pSacB (SEC ID Nº: 9). La Figura 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB. Las regiones 5' y 3' flanqueantes del fragmento cromosómico que debían eliminarse se amplificaron mediante la PCR a partir de ADN cromosómico de LU 13843 y se introdujeron en el vector usando técnicas convencionales. Normalmente, se usó como diana al menos un 80 % del ORF para su eliminación. De este modo, se construyeron los plásmidos de eliminación para ldhA de lactato deshidrogenasa, pSacB (delta IdhA), y para el pflD de piruvato formato liasa, pSacB (delta pfID). Las Figuras 2 y 3 muestran mapas esquemáticos del plásmido pSacB (delta IdhA) y pSacB (delta pfID).

Ejemplo 3: Generación de cepas productoras de succinato mejoradas

Se transformó LU 13843 tal como se describe anteriormente con pSacB (delta Idh) y se "recombinó tipo Campbell por integración" para producir una cepa "recombinante tipo Campbell por integración". La transformación e integración en el genoma de LU 13843 se confirmó mediante PCR produciendo bandas para el suceso de integración del plásmido en el genoma de LU 13843. La cepa "recombinante tipo Campbell por integración" se "recombinó tipo Campbell por eliminación" posteriormente usando placas de agar que contenían sacarosa como medio de contraselección, seleccionando respecto de la pérdida (de función) del gen sacB. Por lo tanto, las cepas " recombinantes tipo Campbell por integración " se incubaron en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI que no contenía antibiótico) a 37 °C, 220 rpm durante toda la noche. Entonces se sembró el cultivo de toda la noche sobre placas de sacarosa que contenían BHI recientemente preparadas (10 %, sin antibióticos) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C ("primera transferencia de sacarosa"). Las colonias individuales obtenidas a partir de la primera transferencia se sembraron nuevamente sobre placas de BHI que contenían sacarosa recientemente preparadas (10 %) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C ("segunda transferencia de sacarosa"). Este procedimiento se repitió hasta una compleción mínima de cinco transferencias ("tercera, cuarta, quinta transferencia de sacarosa") en sacarosa. La expresión "primera a quinta transferencia de sacarosa" se refiere a la transferencia de una cepa después de la integración cromosómica de un vector que contiene un gen de levansacarosa de sacB en sacarosa y placas de agar que contienen medio de crecimiento con el fin de seleccionar respecto de cepas con la pérdida del gen sacB y las secuencias de plásmido circundantes. Las colonias individuales de las placas de la quinta transferencia se inocularon en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI que no contenía antibiótico) y se incubaron a 37 °C, 220 rpm durante toda la noche. El cultivo de toda la

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Xhol y Xbal. El fragmento se purifica y difiere con Xhol y Xbal, así como el vector que se desfosforila adicionalmente. El vector ligado que porta el fragmento del genoma de DD1 con las regiones cadena arriba y cadena abajo de adhE se propaga en E. coli y se usa para la transformación de DD1. La cepa LU15050 DD1 delta ldh se transforma tal como se describe anteriormente con pSacB (delta adhE) y se "recombinó tipo Campbell por integración" para dar una cepa "recombinante tipo Campbell por integración". La figura 8 muestra un mapa esquemático de pSacB (delta adhE). La transformación e integración en el genoma de LU 15050 se confirmó mediante PCR produciendo bandas para el suceso de integración del plásmido en el genoma de LU15050. La cepa "recombinante tipo Campbell por integración" se "recombinó tipo Campbell por eliminación" posteriormente usando placas de agar que contenían sacarosa como medio de contraselección, seleccionando respecto de la pérdida (de función) del gen sacB. Por lo tanto, las cepas " recombinantes tipo Campbell por integración " se incubaron en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI que no contenía antibiótico) a 37 °C, 220 rpm durante toda la noche. Entonces se sembró el cultivo de toda la noche sobre placas de sacarosa que contenían BHI recientemente preparadas (10 %, sin antibióticos) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C ("primera transferencia de sacarosa"). Las colonias individuales obtenidas a partir de la primera transferencia se sembraron nuevamente sobre placas de BHI que contenían sacarosa recientemente preparadas (10 %) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C ("segunda transferencia de sacarosa"). Este procedimiento se repitió hasta una compleción mínima de cinco transferencias ("tercera, cuarta, quinta transferencia de sacarosa") en sacarosa. La expresión "primera a quinta transferencia de sacarosa" se refiere a la transferencia de una cepa después de la integración cromosómica de un vector que contiene un gen de levansacarosa de sacB en sacarosa y placas de agar que contienen medio de crecimiento con el fin de seleccionar respecto de cepas con la pérdida del gen sacB y las secuencias de plásmido circundantes. Las colonias individuales de las placas de la quinta transferencia se inocularon en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI que no contenía antibiótico) y se incubaron a 37 °C, 220 rpm durante toda la noche. El cultivo de toda la noche se diluyó en serie y se sembró sobre placas de BHI para obtener colonias individuales aisladas. Las cepas "recombinadas tipo Campbell por eliminación" que contenían la eliminación del gen adhE se confirmaron mediante sensibilidad al cloranfenicol. Se identificaron los mutantes de eliminación entre estas cepas y se confirmaron mediante análisis PCR. Esto dio lugar al mutante de eliminación de adhE LU15050 delta adhE. Se transforma LU 15050 delta adhE con pJFF224 (PpckA fdh C.b.) que expresa la formato deshidrogenasa de Candida boidinii y pJFF224 como vector de control. Los transformantes resultantes se usaron para experimentos posteriores. Después del cultivo en botes de suero tal como se describen anteriormente se halló que las células contienen cantidades significativamente aumentadas de ácido succínico si se comparan con el plásmido de control que no contiene un gen fdh. Asimismo, la cantidad de subproductos, tales como etanol, se reduce significativamente en la cepa delta adhE de DD1 que sobreexpresa una formato deshidrogenasa.

Ejemplo 12: Clonación y expresión de fdh de Wolinella succinogenes en DD1 y cepas mutantes de DD1

En otra realización de codificación del operón de formato deshidrogenasa, los genes fdhA, fdhB, fdhC y fdhD de Wolinella succinogenes (W. succinogenes) DSMZ 1714 se amplificaron mediante PCR clonados a partir de ADN cromosómico de W. succinogenes DSMZ 1714 usando la ADN polimerasa PfuTurbo™ (Roche) y se insertaron en el vector pJFF224. La expresión de los genes en esta construcción está dirigida por un fragmento de promotor amplificado a partir de la región 5' del gen de fosfoenoilpiruvato carboxicinasa (pck) de DD1 y por un promotor de T4 localizado en el vector. La figura 9 muestra un mapa esquemático del plásmido resultante denominado pJFF224 ( fdh W.s.).

El plásmido resultante se transformó en las cepas LU 13843 y LU 135050 y DD1 delta (Idh adhE). Las cepas resultantes seleccionadas respecto del contenido de plásmido mediante adición de 4 g/ml de cloranfenicol se analizaron respecto de la producción de ácido succínico en experimentos de bote de suero tal como se describió anteriormente. Se descubrió que la expresión de los genes que codifican el operón de formato deshidrogenasa fdhA, fdhB fdhC y fdhD de Wolinella succinogenes DSMZ 1714 aumenta el rendimiento de ácido succínico así como disminuye la cantidad del subproducto formato.

Lista de referencias

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