CN103502429B - 使用红曲霉来生产聚乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种用于生产聚乳酸（PLA）的方法，包括步骤：在发酵容器中pH低于或等于5的培养基中、以及向培养基中生产乳酸的条件下发酵红曲霉属微生物，将所生产的乳酸转化为丙交酯，和将丙交酯聚合形成PLA。

Description

使用红曲霉来生产聚乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种用于从由微生物发酵产生的乳酸生产聚乳酸的方法。

背景技术

聚乳酸（PLA）是一种通过生物发酵从可再生资源制造的热塑性、可生物降解的脂肪族聚酯，具有广泛的用途。如同大多数热塑性材料，它可以被加工成纤维或薄膜。PLA有着广泛的应用，比如纺织衬衫、可微波使用的盘子和热充应用。PLA目前应用于许多生物医学用途，比如缝合、支架、透析介质以及药物运输装置。由于其生物降解能力，其还可用于生物塑料的制造，生物塑料可用于制造疏松包装、肥料袋、食品包装以及一次性餐具。纤维和非纺织纺织品形式的PLA也有许多潜在的用途，例如用于室内装潢、一次性服装、雨篷、女性卫生用品和尿片。

目前利用细菌发酵从玉米淀粉或蔗糖生产乳酸。然而，由于水的产生能够降解所形成的聚合物，因而乳酸不能直接被聚合成有用的产品。相反，它被二聚化成为丙交酯（lactide）。高分子量的PLA是利用最普通的催化剂（例如，锡）通过开环聚合从丙交酯产生的。该机制不会产生额外的水，因此可以获得在广泛范围内的分子量。通常PLA的分子量平均数值（Mn）介于75000和100000道尔顿之间。

许多微生物都能够通过需氧或厌氧发酵作用来生产有机酸。乳酸菌物种目前被广泛用于以淀粉为基础的乳酸生产工业。这些物种中大多数都缺乏发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的能力。尽管戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）能够将戊糖发酵为乳酸，但戊糖是经磷酸酮醇酶途径代谢的，该途径的乳酸生产效率低下。事实上，在磷酸酮醇酶途径中，木酮糖5-磷酸被切割为甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸。经该途径，由于丢失两个碳原子给乙酸，使得乳酸的最大理论产率限于一乳酸每戊糖（0.6g乳酸每克木糖）。

在大多数比如大肠杆菌这样的平台宿主生物中，高滴度的乳酸生产要么 是低效率的要么是有毒性的。在中性pH时生产乳酸通常导致产生乳酸钙，不得不通过添加硫酸使其转化成乳酸，结果形成CaSO₄（石膏）作为副产物。为了直接生产乳酸，必须在低pH（优选比乳酸的pKa值3.85至少低一个单位）下完成发酵。然而乳酸对微生物是有毒性的，因为在其质子化形式下，它是破坏膜电势的解偶联剂。因此，尽管有许多微生物能够耐受低pH，却只有有限数目的微生物因其能在低pH下耐受有机酸而适于有机酸生产。

细菌发酵的一个重要缺陷是成本。由于一些微生物不能合成其生长和有效代谢糖类所需的某些氨基酸或蛋白质，因而常需向其饲以稍显复杂的营养包，这提高了进行发酵的直接开支。此外，液体培养基的复杂性提高也使得以合理纯的形式回收发酵产物更加困难，由此使得回收产物操作和资金成本提高。同样，使用玉米作为给料直接与食品和饲料业形成竞争。

由此，仍然需要一种利用耐受高水平乳酸的微生物在基本发酵液体培养基中生产PLA的改进方法。

发明概述

本发明提供利用产生乳酸的改进微生物生产PLA的方法。特别地，所提供的生产聚乳酸（PLA）的方法包括步骤：

-在发酵容器中pH低于或等于5的培养基中、以及向培养基中生产乳酸的条件下发酵红曲霉（Monascus）属的微生物，

-将所产生的乳酸转化成丙交酯，和

-将丙交酯聚合化形成PLA。

根据具体的实施方案，在将乳酸转化成丙交酯之前利用相萃取（phaseextraction）从发酵培养基中回收乳酸。由此，利用相萃取的回收可包括步骤：

（A）通过使所述培养基与萃取溶剂接触从去除了碎片的所述培养基中提取游离乳酸，从而形成：

（i）含乳酸的萃取物和

（ii）去乳酸的水性溶液；和

（B）将所述含乳酸的萃取物（i）与所述水性溶液（ii）分离，

由此获得回收的乳酸。

用于提取的萃取溶剂可包含1-丁醇、2-乙基己醇、1-辛醇、甲基异丁酮、环己酮、二异丁基酮、异丙醚、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乳酸乙酯、乳酸丁 酯、乳酸辛酯、N.N-二丁基乳酰胺和己酸的一种或多种。根据本方面的一个优选方面，萃取溶剂包含一种烷基叔胺、一种提高分配系数的氧化溶剂和一种调整溶剂混合物粘度的煤油成分。萃取溶剂优选包含一种烷基叔胺三辛酰胺（例如，Henkel's Alamine336）。萃取溶剂还可以包含辛醇或甲基异丁酮和煤油（例如IsoPar K）。根据本发明的一个方面，萃取溶剂含有60至80wt%烷基叔胺，比如Alamine336，5至20%甲基异丁酮，以及10至30%煤油（例如IsoPar K）。

相萃取后可接着进行任选地反萃取（stripping）步骤。由此，回收还可包括步骤：

（C）用反萃取溶剂形成以下不混溶相从所述分离的萃取物（i）中反萃取所萃取的乳酸：

iii）含乳酸的反萃取溶液，和

iv）去乳酸的萃取溶剂，

（D）从所述去乳酸萃取溶剂（iv）中分离含乳酸的反萃取溶液（iii），

由此获得回收的乳酸。反萃取溶剂是水性溶剂、极性有机溶剂或这些溶剂的混合物。

根据本发明的另一个实施方案实施方案，利用醇沉淀使污染物沉淀来从发酵培养基中回收乳酸。由此，在本发明的一种实施方案中，在转化为丙交酯之前，先从发酵培养基中回收乳酸，所述回收包括以下步骤：

-利用醇将培养基中的污染物沉淀，所述培养基任选地已清除碎片，和

-除去沉淀物以获得含乳酸的澄清的醇溶液。

由此获得回收乳酸。所述醇可以是C₁至C₄直链或支链醇。

本发明方法中的丙交酯通常直接或经乳酸缩聚形成乳酸寡聚物而从乳酸转化而来。根据具体的实施方案，所回收的乳酸经加热寡聚化、以及加热由此形成的乳酸寡聚物产生丙交酯蒸汽，而被转变为丙交酯。所回收的乳酸可以在疏水性溶剂中，优选Alamine336。加热乳酸寡聚物从而产生丙交酯蒸汽的步骤可以在催化剂，优选锡催化剂，优选辛酸亚锡（II）的存在下完成。根据其它具体的实施方案，乳酸在水性溶液中，并通过加热所回收乳酸的水性溶液形成蒸汽、以及将所形成的蒸汽通过维持在升高温度的反应器，来转化为丙交酯，所述反应器中任选地放置有催化剂。催化剂可以是氧化铝。根据其它具体的实施方案，乳酸在水性溶液中，并通过从水性溶液中去除水来 转变为丙交酯。

根据具体的实施方案，丙交酯在金属催化剂存在下经开环聚合成PLA。该金属催化剂可具有以下通式（I）：

（I）

其中

R¹和R²各自独立为C_1-10烷基，

R³、R⁴和R⁵各自独立为C_1-10烷基，或

R³和R⁴彼此共价结合且各自为亚甲基，和

R⁵为C_1-10烷基，

X¹选自C_1-10烷基、-OR⁶、或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶为C_1-10烷基以及R⁷为C_1-6烷基。

本发明使用在低pH下高度耐受高浓度乳酸并因此而适用于通过遗传工程生产乳酸的微生物。在另外的具体的实施方案中，本发明利用重组真菌，更特别的是红曲霉属内物种的重组真菌，所述重组真菌中特定外源和/或内源基因过表达和/或被抑制由此使其在可发酵培养基中培养时可产生更高水平的乳酸。因此，本发明的重组红曲霉菌株可用于低pH下增强的乳酸生产，由此提供增加的乳酸供应以用在PLA制造中。

因此本发明将微生物，更具体地红曲霉属的微生物用于PLA生产，，其在低pH下耐受高浓度的乳酸。在具体的实施方案中，它们可以在高于乳酸pKa值（3.85）不到1.5个单位的pH下耐受浓度提高的乳酸。更具体地，本发明的微生物可在低于5，更特别的低于4，甚至更特别的低于3，最特别的低于2.8的pH下耐受乳酸。在另外的具体的实施方案中，它们能够在含有50g/L，最特别的是100g/L乳酸的培养基中生长，以及在具体的实施方案中在含有高达150至175g/L乳酸，在低pH，更特别的是低于5，更特别的是低于4，甚至更特别的是低于3，最特别的是低于2.8的pH下，在培养基中生长。在本发明 的具体的实施方案中，红曲霉属内的种是红色红曲霉（Monascus rubber）。该高酸耐受性使其甚至在厌氧或准厌氧条件下，也尤其适用于乳酸的工业生产。

为进一步增强乳酸生产，可以通过遗传工程对这些微生物进行修饰。在具体的实施方案中，本发明的微生物能够在己糖和戊糖中生长并在乳酸中转化这些糖。在更具体的实施方案中，本发明的微生物在浓度为至少50g/L，更特别地，浓度为至少70g/L，至少100g/L，至少200g/L或更高的葡萄糖和戊糖中生长。在某些特定的实施方案中，本发明利用能够在低pH下生产更高水平乳酸，尤其是L-乳酸的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株。更特别地，L-乳酸是以高产率从己糖和/或戊糖生产的。

在具体的实施方案中，微生物含有异源或外源LDH基因。相应地，在具体的实施方案中，本发明利用含有异源或外源LDH基因的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株。在进一步的具体实施方案中，根据本发明所利用的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株含有异源或外源LDH基因，其编码与由SEQ ID NO:1编码的蛋白质至少80%同一性的功能性蛋白质。

本发明还设想，乳酸产率可通过使编码参与内源代谢途径的蛋白质的内源红曲霉基因失活来进一步提高，所述内源代谢途径产生的代谢物非乳酸和/或所述内源代谢途径消耗该有机酸。在具体的实施方案中，非目的有机酸的代谢物的生产被减少。根据更具体的实施方案，根据本发明使用的微生物含有至少一个工程化的基因缺失和/或失活，所述基因缺失和/或失活是消耗乳酸的内源途径的基因缺失和/或失活、或者编码参与产生代谢物非乳酸的内源途径的酶的基因缺失和/或失活。

在具体的实施方案中，根据本发明利用的红曲霉属菌株微生物是重组微生物，其含有一种编码乳酸脱氢酶（LDH）的重组基因和/或内源乳酸消耗途径的至少一种工程化的基因缺失和/或失活、或参与产生非乳酸代谢物的内源途径的酶的编码基因的基因缺失和/或失活。

根据本发明所利用的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株还包含至少一种工程化的基因或失活。

在更具体的实施方案中，所述至少一种工程化的基因缺失或失活是在编码选自丙酮酸脱羧酶（pdc）、延胡索酸还原酶、醇脱氢酶（adh）、乙醛脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc）、D-乳酸脱氢酶（d-ldh）、L-乳酸脱氢酶 （I-ldh）、乳酸2-单加氧酶的酶的基因中以及所述基因的任意组合。在更具体的实施方案中，至少一种工程化的基因缺失和/或失活是在编码乳酸脱氢酶的内源基因中。

在进一步的实施方案中，至少一个工程化的基因缺失和/或失活是在编码丙酮酸脱羧酶（pdc）的内源基因中。更特别的是，该基因是本文所述的内源PDC1、PDC2和/或PDC4基因。在更具体的实施方案中，失活和/或删除的一或多个内源脱羧酶编码序列是对应于SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ NO:5中一或多个的序列。

在具体的实施方案中，至少一个工程化的基因缺失或失活是在编码细胞色素依赖性乳酸脱氢酶的内源基因中，比如细胞色素B2-依赖性L-乳酸脱氢酶。更特别的是，该工程化的基因缺失或失活是含有SEQ ID NO:2的基因的失活和/或在含SEQ ID NO:6的基因中。

在具体的实施方案中，依照本发明所利用的微生物能够以至少0.5g/L的产率从己糖或戊糖或其组合生产乳酸。更特别的是，产率为至少2g/L，更特别的是至少5g/L。在具体的实施方案中，所消耗的糖向乳酸的转化产率为至少50%。

本发明的具体的实施方案利用根据本发明的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株，其能够以至少2g/L的产率从己糖和/或戊糖生产乳酸。在具体的实施方案中，形成乙醇作为副产物。在具体的实施方案中，乳酸是L-乳酸。

在特定实施方案中，本发明的生产乳酸（含乳酸的组合物）的方法得到的乳酸产率是至少2g/L。在更具体的实施方案中，乳酸滴度介于50-100g/L之间，生产力为至少1g/L/hr，更特别的是，介于2-3g/L/hr之间。

附图简述

本发明通过以下附图进行说明，这些附图仅被视作示例且不以任何方式限制本发明的范围。

图1图示根据本发明具体的实施方案，可用于转化红曲霉菌株的转化载体的实例。

图2图示根据本发明具体的实施方案，用于载体构建的盒-模型的实例。

图3图示根据本发明具体的实施方案，用于转化红曲霉菌株的pCGHT3转化载体。

图4图示密码子优化的Bt-L-LDH基因序列。

图5图示根据本发明具体的实施方案，带有经密码子优化的（Bos taurus Bt）LDH基因的转化载体pCGHTGBt LT。

图6图示根据本发明具体的实施方案，基于pUR5750质粒的带有经密码子优化的（Bos taurus Bt）LDH基因的转化载体pURGHTGBt LT。

图7图示根据本发明具体的实施方案，表达合成的LDH基因后大肠杆菌蛋白质提取物中的LDH活性。

图8a图示根据本发明具体的实施方案，对于转化体LF5-T1和LF5-T2以及未转化的红色红曲霉对照LF5，由HPLC测定的在培养基中的葡萄糖浓度。图8b图示根据本发明具体的实施方案，转化体LF5-T1和LF5-T2以及未转化的红色红曲霉对照LF5中的乳酸浓度。

图9图示根据本发明具体的实施方案，两种转化体LF5-T1和LF5-T2和未转化红色红曲霉对照LF5的生物质中的L-LDH酶活性。

图10图示根据本发明具体的实施方案，转化体和野生型菌株LF4、LF5和LF6的葡萄糖消耗。

图11图示根据本发明具体的实施方案，转化体和野生型菌株LF4、LF5和LF6的乳酸生产。

图12转化体和野生型菌株LF4、LF5和LF6的乙醇生产。菌株在10ml YEPD培养基中预培养三天。

图13图示根据本发明具体的实施方案，在有氧和厌氧条件下，转化体和野生型菌株LF4的糖类（葡萄糖和木糖）的消耗和产物（乙醇和乳酸）的形成。

图14图示根据本发明具体的实施方案，在重度有氧和厌氧条件下，转化体和野生型菌株LF5的糖（葡萄糖和木糖）消耗和产物（乙醇和乳酸）形成。

图15图示根据本发明具体的实施方案，在重度需氧和厌氧条件下，转化体和野生型菌株LF6的糖（葡萄糖和木糖）消耗和产物（乙醇和乳酸）形成。

图16图示红色红曲霉PDC1开放阅读框的序列。

图17图示红色红曲霉PDC2开放阅读框的序列。

图18图示根据本发明具体的实施方案，可用于利用遗传霉素选择来破坏红曲霉菌株PDC1的转化载体的例子。

图19图示根据本发明具体的实施方案，可用于利用遗传霉素选择来破坏 红曲霉菌株PDC2的转化载体的例子。

图20图示根据本发明具体的实施方案，可用于利用zeocin选择来破坏红曲霉菌株PDC2的转化载体的例子。

图21提供用于破坏PDC1基因的载体pCH#PDC1的示意图。

图22提供用于同时破坏PDC1基因和插入LDH基因的载体pCL1H#PDC1的示意图。

图23提供用于在PDC1-LDH+转化体中破坏PDC2基因的载体pCN#PDC2的示意图。

图24图示红色红曲霉PDC4开放阅读框的序列（SEQ ID No:5）。

图25图示根据本发明具体的实施方案，来自酿酒酵母（Sc）和红曲霉菌株LF4、LF5、LF6、以及CBS菌株的蛋白质提取物中的Cyt-LDH活性。

图26图示红色红曲霉CYB2开放阅读框的序列（SEQ ID NO:2）；基因组序列中的推定内含子以小写字母表示。

图27图示编码细胞色素依赖性L-LDH的红色红曲霉Mona00569基因的序列（SEQ IDNo:6）。

发明详述

除非另外定义，所有用于公开本发明的术语，包括技术和科学术语，均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指引，纳入术语定义以更好地理解本发明的教导。

在描述本发明方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法或产物，因为这样的方法或产物当然是可以变化的。还应理解，本文所使用的术语无意于作出限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

本说明书通篇述及的“一个实施方案”或“一种实施方案”意指，所描述的与该实施方案相关的特定特征、结构或性质至少被包括在本发明的一种实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在一种实施方案中”在本说明书通篇不同场合的出现，未必全部指同一个实施方案，而是可以指。此外，特定特征、结构或性质可以以对本领域技术人员来说从本公开内容中显而易见的任何适宜方式在一或多个实施方案中组合。而且，如本领域人员将理解的，尽管本文所描述的一些实施方案包括一些特征却不包括其他实施方案中所包括的另一些特征，不同实施方案的特征的组合亦在本发明范围 内，并形成不同的实施方案。例如，在以下权利要求书中，所请求保护的任何实施方案均可以任何组合使用。

在描述本发明时，除非上下文中有不同指示，所使用的术语将根据以下定义进行解释。

本发明中无论何时使用术语“取代的”均意指，选择一个所述基团来替换在用“取代的”这一表达中所指示的原子上的一或多个氢原子，只要不超出该被指示原子的常价，并且该取代能够产生化学稳定的化合物，即该化合物足够稳固使其能够经受以有用的纯度从反应混合物中分离出来。

如本文所使用的，除非上下文中有不同的清楚指示，单数形式“一种/一个/该”包括单数和复数指代物两者。

本文所使用的术语“包含”与“包括”或“含有”同义，而且是包括在内的或开放式的，并不排除附加的、未记述的成分、要素或方法步骤。当以含有特定要素或步骤的方式述及实施方案时，这暗示本发明还涵盖基本上由所述元素或步骤组成的实施方案。

以端点记载的数值范围包括相应范围内包含的所有数值和分数以及所记载的端点。

本文所使用的术语“约”当用于表示如参数、量、持续时间等这样的可测值时，意味着包括（自）该确定值的+/-10%或更小、优选+/-5%或更小、更优选+/-1%或更小、以及更优选+/-0.1%或更小的变化，只要这样的变化适于在本公开发明中实施。应理解，该修饰词“约”所指的值本身也是明确地且优选地公开的。

如本文所使用的，术语“同源性”表示相同或不同分类单元的两种大分子之间，尤其是两种多肽或多核苷酸之间，的结构相似性，其中所述相似性源于共同的祖先。因此，术语“同源物”表示具有所述结构相似性的如此相关的大分子。

本说明书中所引用的所有文件通过提述由此完整并入。

如本文所使用的，两个多肽间的序列同一性可通过最优比对（两个蛋白质的最优比对是将配对得分总和减去任何引入的缺口罚分最大化的比对；并且可优选地通过计算机算法工具来完成，比如采用Wilbur和Lipman的比对算法的“Clustal”W，1983（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80:726-730）。可替代的方法包括采用Needleman和Wunsch算法的“Gap”1970（J Mol Biol48: 443-453），或采用Smith和Waterman算法的“Bestfit”1981（JMol Biol147:195—197），如可从Accelrys中例如GCG^TMv.11.1.2包获得的）多肽的氨基酸序列并通过以下进行打分，一方面，是多肽含有相同氨基酸残基的比对位置数，另一方面，是两个多肽序列差异的比对位置数。若两条多肽在给定位置含有不同氨基酸残基（氨基酸取代），或者一条多肽在该位置含有氨基酸残基而另一条多肽不含或者正好相反（氨基酸插入或缺失），则这两条多肽的序列在比对中在该位置上不同。序列同一性以多肽包含相同氨基酸残基的比对位置相对比对位置总数的比例（百分数）来计算。在具体的实施方案中，完成序列比对和确定序列同一性的算法是以最初由Altschul等人1990（J Mol Biol215:403-10）描述的Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）为基础的，更特别的是，由Tatusova和Madden1999（FEMS Microbiol Lett174:247-250）描述的“Blast2序列”算法，比如利用其缺省设置。

如本文所使用的，两多肽间的“序列相似性”可通过最优比对（参见上述）多肽氨基酸序列并通过以下进行打分，一方面是多肽含相同或相似（即保守取代）氨基酸残基的多肽的比对位置数，以及另一方面，两多肽序列不同的比对位置数。若两条多肽在给定位置含有非保守氨基酸残基，或者其中一条多肽在该位置含有氨基酸残基而另一条多肽不含或者正好相反（氨基酸插入或缺失），则这两条多肽的序列在该位置上不同。序列相似性以多肽包含相同或相似氨基酸残基的比对位置相对比对位置总数的比例（百分数）来计算。

本申请中的术语“乳酸”指游离酸或者盐形式的2-羟基丙酸。乳酸的盐形式不论中和剂，即碳酸钙或氢氧化铵，均称作“乳酸盐”。如本文所使用的，乳酸可指乳酸的立体异构体形式（L-乳酸或D-乳酸）之一。术语乳酸盐可指乳酸盐的立体异构体形式（L-乳酸盐或D-乳酸盐）之一。当述及乳酸生产，其包括生产乳酸或乳酸盐的单一异构体，或者乳酸或乳酸盐两种立体异构体的混合物。在具体的实施方案中，本发明的重组真菌专门生产单一的乳酸或乳酸盐立体异构体，所产生的乳酸或乳酸盐立体异构体被称作“手性纯的”。短语“手性纯的”是指没有可检测的乳酸或乳酸盐的一种立体异构体形式对另一种立体异构体形式的污染（指定立体异构体的手性纯度为至少大于（或大于或等于）99.9%）。

已发现依照本发明所利用的生物在低pH下高度耐受乳酸。

如本文所使用的术语“高乳酸浓度耐受性”指微生物在含有至少50g/L，或至少75g/L但潜在高达大于100g/L，或甚至高于150g/L，比如175g/L或200g/L乳酸的培养基中生长的能力。在具体的实施方案中，术语“高乳酸浓度”，可以指乳酸的饱和溶液。

如本文所使用的术语“低pH”指2.0至5.0的pH，比如低于4.0，更特别的是，低于3.0，更特别的是，pH为2.8或更低。

技术人员应理解，在述及低pH下的乳酸耐受性时，尤其相关的是在对应于或低于该乳酸pKa值的pH，更特别的是，在高于及低于该乳酸pKa值1.5个单位之间的pH，耐受乳酸的能力。若乳酸有两个pKa值（由于存在两个酸性基团），相关的pKa是最低的pKa值。

如本文所使用的“乳酸脱氢酶活性”指蛋白质催化丙酮酸盐转变为乳酸盐的反应的能力。乳酸脱氢酶活性包括（但不限于）酶学委员会编号EC1.1.1.27和EC1.1.1.28分类的酶。

如本文在提及宿主生物、微生物或细胞时所使用的术语“重组”或“经遗传修饰”涵盖其中已经导入核酸分子或者以另一种方式经过遗传修饰的这类宿主生物、微生物或细胞，以及这类宿主生物、微生物或细胞的重组后代。这既包括其中在内源基因序列在基因组中的天然位置以外的位置将其导入的生物，也包括其中已经修饰或删除内源基因序列的生物。

如本文在提到存在于宿主生物、微生物或细胞中的核苷酸序列时所使用的术语“重组”指并非天然存在于所述生物、微生物或细胞中的核苷酸序列。这包括对于所述生物、微生物或细胞而言是外来的核苷酸序列，以及被导入到基因组中非其天然位置的位置的核苷酸序列和已被修饰的内源序列。

术语“转化体”包括外源核酸比如重组核酸向宿主生物、微生物或细胞中的导入或转移。优选如此导入的核酸或所得的内源核酸删除在所述宿主生物、微生物或细胞的进一步生长和分裂中得以保持。任何一种常规的基因转移或遗传修饰方法均可用于实现转化，比如但不限于电穿孔、电渗透、化学转化法、脂转染、病毒或噬菌体介导的转染，等。

本文通常所使用的术语“基因”指包含编码序列、启动子以及任何其他在宿主细胞中表达所需的调控区域的序列。

如本文所使用的，术语“启动子”指位于转录起始位点上游50bp以内的不翻译序列，其控制结构基因转录起始。通常其位于结构基因起始密码子上 游（也即5'）约1至1000bp，优选1-500bp，尤其是1-100bp以内。类似的，术语“终止子”指位于结构基因翻译终止密码子下游（也即3'）的不翻译序列（通常在约1至1000bp，更典型地在1-500bp，以及尤其是1-100bp以内），其控制结构基因转录终止。启动子或终止子与结构基因是“可操作性连接的”，如果其在基因组中的位置相对于结构基因的位置，视情况而定，使其执行该结构基因的转录控制功能。

如本文所使用的，术语“异源的”或“外源的”指这样一个事实：所考虑的基因或编码序列不是宿主天然或内源的。

术语“天然的”或“内源的”在本文中用于指在野生型宿主菌株细胞基因组中发现（除不影响功能的个体间突变之外）的遗传材料（例如，基因、启动子或终止子）。

“编码”意指，依据所论述的生物的遗传密码，核酸序列或其部分对应于特定氨基酸序列，例如期望的多肽或蛋白质的氨基酸序列。举例而言，“编码”特定多肽或蛋白质的核酸可包括基因组、hnRNA、前体mRNA、mRNA、cDNA、重组或合成的核酸。

优选地，编码特定多肽或蛋白质的核酸可包含编码所述多肽或蛋白质的开放阅读框（ORF）。“开放阅读框”或“ORF”指一连串以本身已知的翻译起始密码子起始和以翻译终止密码子终止的编码核苷酸三联体（密码子），且不包含任何内部符合读框的翻译终止密码子，并潜在地能够编码多肽。因此，该术语可与本领域所使用的“编码序列”同义。

本发明涉及通过利用微生物的发酵工艺制备聚乳酸（PLA）的方法。尤其特别的是，该方法描述从微生物生产出的乳酸制备丙交酯，和从丙交酯制备PLA。

根据本发明的红曲霉目的微生物，在低pH下对高乳酸浓度有优良的耐受性。更特别的是，它们在pH5或更低下耐受乳酸。

根据本发明的微生物对乳酸的耐受性使得它们尤其适用于工业生产乳酸。尽管在一些工业环境下，可以在生产过程中提取目的乳酸从而不会维持极端的高浓度，但是菌株对乳酸的耐受性无论如何都是有利的。更特别的是，令人感兴趣的是能够在发酵过程中pH下降（优选可降至低于乳酸pKa3.85的值）的培养基中发酵菌株。

本发明的微生物在pH低于3对乳酸具有优越的耐受性。

此外，已发现根据本发明使用的生物可被工程化以确保乳酸生产。更特别的是，可将其工程化从而可以高产率将简单糖发酵为乳酸。在具体的实施方案中这些生物可在厌氧或准厌氧条件下培养的事实为工业生产方法提供了另外的益处。

根据本发明所使用的微生物是红曲霉属内的种。令人惊讶地，已经发现，可以鉴定出在低pH下耐受高乳酸浓度的红曲霉菌株。通常这些微生物代表选自以下种的菌株：白色红曲霉（monascus albidulus）、阿根廷红曲霉（monascus argentinensis）、橙色红曲霉（monascus aurantiacus）、巴克红曲霉（monascus barkeri）、monascus bisporus、monascus eremophilus、佛罗里达红曲霉（monascus floridanus）、烟灰色红曲菌（monascus fuliginosus）、monascus fumeus、monascus kaoliang、新月红曲霉（monascuslunisporas）、monascus mucoroides、monascus olei、monascus pallens、monascuspaxii、丛毛红曲霉（monascus pilosus）、monascus pubigerus、紫红红曲霉（monascuspurpureus）、红色红曲霉（monascus ruber）、monascus rubropunctatus、monascusrutilus、monascus sanguineus、monascus serorubescens和monascus vitreus。在本发明的具体的实施方案中，本发明的微生物是红色红曲霉种的菌株。

根据本发明所使用的示范性菌株（本文中也称作LF4、LF5和LF6）已保藏于荷兰乌得勒支（Utrecht）的微生物菌种保藏中心（CBS），登录号分别为CBS127564、CBS127565和CBS127566。

在具体的实施方案中，本发明使用如上述红曲霉目的微生物，其已被遗传工程化以提高从简单糖如己糖或戊糖或其组合的乳酸产率。这可以通过互不排斥的不同途径实现。

在具体的实施方案中，在本发明上下文中涵盖的遗传工程技术其目的在于通过表达编码参与乳酸生产的酶的（外源的）基因来提高乳酸生产。

乳酸脱氢酶（LDH）催化糖类向乳酸转化的最后一步，其将丙酮酸盐转化为乳酸盐。由此，提高的LDH基因表达和/或活性确保乳酸产率提高。因此，在具体的实施方案中，本发明提供经遗传修饰或重组的红曲霉菌株，其含有至少一种整合进其基因组中的功能性乳酸脱氢酶基因。在具体的实施方案中，该LDH基因包含异源或外源LDH编码序列。

外源LDH基因的导入使得经修饰的红曲霉菌株能够生产更大量的L-和/或D-乳酸立体异构体。根据本发明的某些具体的实施方案，所使用的经遗传 修饰或重组的红曲霉目的微生物包含（或仅含有）一或多种外源L-LDH基因（而非外源D-LDH基因），由此该生物能够产生光学或手性纯的L-乳酸。或者，通过导入外源D-LDH基因可生产手性纯D-乳酸。在本发明的特定实施方案中，本发明的红曲霉目的经遗传修饰或重组的生物包含一或多种外源L-LDH编码序列以及一或多种外源D-LDH编码序列，从而使该重组菌株生产L-和D-乳酸的外消旋混合物。

本发明上下文中所使用的外源LDH基因是编码乳酸脱氢酶或其活性片段即具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。

在具体的实施方案中，外源LDH基因或编码序列是衍生于另一生物的基因或编码序列，所述生物为改进在红曲霉中的表达已经过遗传修饰（例如密码子被改变）。

在本发明上下文中，适宜的LDH基因包括那些从细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源获得的基因。特定的L-LDH基因的例子获自瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸杆菌（L.casei）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）、米根霉（Rhizopus oryzae）以及哺乳动物来源比如牛或猪。尤其是来源于牛（Bos taurus）。特定的D-LDH基因的例子获自瑞士乳杆菌（L.helveticus）、约氏乳酸杆菌（L.johnsonii）、保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）、德式乳杆菌（L.delbrueckii）、植物乳杆菌（L.plantarum）、戊糖乳杆菌（L.pentosus）和P.acidilactici。相对于这些基因中的编码序列在氨基酸水平的同一性得分至少为70%且编码功能性蛋白质的功能性编码序列是适宜的。如果需要的话，可对从这些来源中任一来源获得的天然基因进行诱变从而提供从常见真菌起始密码子（ATG）起始，或者出于其他目的，的编码序列。在具体的实施方案中，L-LDH基因获自瑞士乳杆菌或是与之具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的序列。根据其它特定的实施方案，L-LDH基因获自巨大芽孢杆菌或是与这类基因相比至少80%、85%、90%或95%的基因。根据另外的某些具体的实施方案，L-LDH基因获自牛或者是与该基因相比具有至少80%、85%、90%或95%同一性得分的基因。在具体的实施方案中，D-LDH基因获自瑞士乳杆菌或是与这类基因相比具有至少80%、85%、90%，更特别的至少95%得分的基因。

特别适宜的LDH编码序列包括那些编码酶的序列，所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO:1所确定的序列相比具有至少80%、85%或95%同一性得分。特 别适宜的LDH基因还包括那些编码功能性酶的基因，所述功能性酶具有与SEQ ID NO1所编码的蛋白质序列相比具有至少80%、85%或95%同一性得分的序列；在具体的实施方案中，适宜的LDH基因包括那些编码功能性酶并具有与SEQ ID NO1的序列相比具有至少80%、85%或95%同一性得分或与SEQ IDNO:1相同的序列的基因。本发明的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株可包含编码参与目的乳酸生产的酶的单个外源基因或多个外源基因。由此，例如，重组菌株可包含单个外源LDH基因或多个外源LDH基因，比如1至10个外源LDH基因，尤其1至5个外源LDH基因。当转化菌株含有多个外源LDH基因时，单个基因可以是相同基因的拷贝，或包括两个或更多个不同的LDH基因拷贝。外源LDH基因的多个拷贝可整合进宿主菌株基因组中的一个基因座（由此它们可以彼此相邻）或数个基因座。

编码目的酶的重组编码序列被置于一或多个启动子和一或多个终止子的转录控制之下，所述启动子和终止子在经修饰的真菌细胞中都是有功能性的。

启动子和终止子序列对于红曲霉宿主菌株可以是天然的或者对细胞是外源的。有用的启动子和终止子序列包括那些在其功能区分别与对宿主菌株天然的启动子和终止子序列的功能性部分相比高度同一（也即，具有90%或更高、尤其是95%或更高、最优选99%或更高的同一性得分）的序列，尤其是当外源基因的插入靶向该菌株基因组中的特定位点时。

在具体的实施方案中，启动子相对于真菌基因的天然启动子具有至少90%、95%或99%的同一性得分。更特别的是，启动子相对于红曲霉宿主菌株的天然基因启动子具有至少90%、95%或99%的同一性得分。在具体的实施方案中，终止子相对于真菌天然的基因启动子具有至少90%、95%或99%的同一性得分。终止子相对于红曲霉宿主菌株的天然基因终止子可具有至少90%、95%或99%的同一性得分。使用（宿主菌株）天然的启动子和终止子，及其相应上下游侧翼区，能够允许重组基因靶向整合进宿主菌株基因组的特定基因座，并用于同时整合重组基因及删除另一天然基因。有可能将比如LDH编码序列这样的不同的外源编码序列置于不同类型的启动子和/或终止子的控制之下。

重组基因可被随机整合进宿主菌株基因组中或者插入到一或多个靶向位置。靶向位置的例子包括欲删除或破坏的基因座。

本发明人还涵盖在根据本发明的红曲霉目的微生物中提高乳酸生产，其通过限制宿主内源代谢物的生产和/或降低内源目的乳酸的消耗。事实上，这不仅阻止宿主浪费原料和能量，还推动宿主完全依赖于由重组基因导入创建的目的酶生产途径。

在比如红曲霉这样的真菌中，在氧气存在下乳酸被消耗。这是由细胞色素依赖性乳酸脱氢酶保障的。由此，另外/备选地，根据本发明的特定实施方案，微生物经修饰以降低内源乳酸消耗。更特别的是，这是通过降低内源LDH基因的表达来保障的。这提高了有氧条件下的乳酸产率。

因此，根据本发明的一个特定实施方案，本发明中使用的微生物具有一或多个失活的内源细胞色素-依赖性LDH基因。本发明人还鉴定并表征了来自红色红曲霉的内源LDH基因。在具体的实施方案中，内源LDH含有SEQ ID NO：2的编码序列或SEQ ID NO：6的编码序列。如下文详述的，源自红色红曲霉内源LDH基因的编码、非编码和/或调控序列可被用于阻止或降低红曲霉中的LDH表达。

在更具体的实施方案中，在本发明上下文中所使用的遗传工程化技术旨在降低非目的乳酸的代谢物的内源生产。更特别的是，提供了重组微生物，其特征在于参与比如乙醇这样的非乳酸代谢物的生产的酶活性已被失活或者抑制。

在本文中，“失活”意指基因的全部或部分编码区被消除（缺失），或者基因或其启动子和/或终止子区经修饰（比如缺失、插入或突变）从而该基因不再产生有活性的酶，或产生活性严重降低的酶。失活还包括通过比如反义、三螺旋和核糖酶这样的方法沉默，所有都是技术人员已知的。

根据特定实施方案，根据本发明使用的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株含有至少一个工程化的基因缺失和/或失活，更特别的是，在编码参与乙醇生产途径的酶的内源基因中。在这些实施方案中，所述至少一个工程化的基因缺失或失活可以是例如在内源基因内，所述内源基因编码在宿主菌株中参与乙醇生产途径或其他非乳酸代谢物的生产的酶，比如编码选自由丙酮酸脱羧酶（pdc）、延胡索酸还原酶、醇脱氢酶（adh）、乙醛脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc）、D-乳酸脱氢酶（d-ldh）、L-乳酸脱氢酶（I-ldh）、乳酸2-单加氧酶组成的组的酶的基因以及所述基因的组合。在更具体的实施方案中，至少一个工程化的基因缺失和/或失活可以在编码丙酮酸脱羧酶（pdc）的内 源基因中。丙酮酸脱羧酶催化乙醇途径中的第一步。由此特别涵盖了具有实质上降低的丙酮酸脱羧酶（PDC）活性的微生物。术语“降低的丙酮酸脱羧酶活性”意指，或者细胞中的酶浓度减少（至少一种影响表达的遗传修饰的结果）和/或降低或没有酶的特异性催化活性（至少一种影响活性的遗传修饰的结果）。

在具体的实施方案中，本发明利用红曲霉目的微生物，其中丙酮酸脱羧酶活性接近零或者与野生型菌株中的正常丙酮酸脱羧酶活性相比活性降低。由此，在具体的实施方案中，本发明菌株的丙酮酸脱羧酶活性为例如比野生型菌株中可检测到的丙酮酸脱羧酶活性低至少60%，优选低至少80%以及甚至更优选低至少90%。

在具体的实施方案中，本发明提供含有一或多个失活的内源丙酮酸脱羧酶基因的微生物。本发明人已经鉴定并表征了来自红色红曲霉的内源丙酮酸脱羧酶基因。在具体的实施方案中，内源pdc基因含有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO:5的编码序列。在具体的实施方案中，本发明提供红色红曲霉菌株，其中全部三个pdc基因都被失活或者删除。如下文详述的，源自红色红曲霉的一个或多个内源pdc基因的编码、非编码和/或调控序列的核苷酸序列可用于阻止或降低红曲霉中pdc的表达。

根据本发明的具体的实施方案，提供了菌株，其特征在于所述菌株的乙醇生产接近零或者至少与野生型菌株中的本底乙醇生产相比被降低。由此，在具体的实施方案中，本发明菌株中的乙醇生产为例如比相应的野生型菌株中的乙醇生产低至少60%，优选低至少80%以及甚至更优选低至少90%。

根据本发明具体的实施方案，提供红曲霉菌株，其经过修饰从而提高比如木糖这样的C5糖类的消耗。这可以通过本领域已知方法来实现，更特别的是，通过导入编码能够将葡萄糖转化为木糖和/或将木糖还原为木酮糖的酶的基因来实现。在具体的实施方案中，使用一或多个编码木糖异构酶和/或木糖还原酶的内源或外源基因。在更具体的实施方案中，使用外源木糖异构酶和/或木糖还原酶基因。适宜的木糖异构酶基因的例子是本领域已知的，包括但不限于来自Piromyces菌种的木糖异构酶和来自毕赤酵母（P.stipitis）的还原酶基因。因此，在具体的实施方案中，本发明还提供已经用一或多个参与C5糖类代谢的基因（更具体为木糖异构酶和/或木糖还原酶）转化的红曲霉菌株。宿主菌株的遗传修饰经设计和构建适宜载体以及用此载体转化宿主细胞的 一个或多个步骤来完成。可以使用本领域已知的电穿孔法和/或化学（比如基于氯化钙或醋酸锂）转化方法或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法。载体可以经特定的限制酶切割，也可以以环形DNA使用。用于遗传修饰宿主菌株的载体可以是任何载体，只要它能够整合进宿主菌株的基因组中。本发明的载体作为克隆载体或表达载体可以在所选择的宿主菌株中操作。许多载体都是本领域技术人员已知的，适宜载体的选择只是一个选择问题。载体可以是，例如pUR5750转化载体、pCGHT3转化载体，等等。

通常，制备含有目的编码序列及相关启动子和终止子序列的载体。该载体可含有各种类型的用于线性化或片段化的限制性位点。载体还可包含骨架部分（比如用于在大肠杆菌中增殖），其中许多都可方便地商购自酵母或细菌载体。载体优选包含一或多个选择标记基因盒。“选择标记基因”是编码转化细胞在选择性培养基中生存和/或生长所需的蛋白质的基因。典型的选择标记基因编码以下蛋白质：（a）赋予抗生素或其他毒素抗性的蛋白质，例如zeocin（来自印度斯坦链异壁菌（Streptoalloteichus hindustanus）的sh ble基因）、遗传霉素、蜜二糖酶（MEL5）、潮霉素（来自大肠杆菌的氨基糖苷类抗生素抗性基因）、氨苄青霉素、四环素或卡那霉素（Tn903的卡那霉素抗性基因），（b）补充细胞营养缺陷。两种突出的营养缺陷例子是氨基酸亮氨酸缺陷（例如，LEU2基因）或尿嘧啶缺陷（例如，URA3基因）。乳清苷-5'-磷酸脱羧酶阴性（ura3-）细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。这样，功能性UBA3基因可用作带有尿嘧啶缺陷的细胞的标记，并且可以在缺少尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。只有转化有功能性URA3基因的细胞能够在这样的培养基上合成尿嘧啶和生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷（例如，如在I.orientalis的情况下），为了利用URA3作为菌株的选择标记，必须制造带有该缺陷的营养突变体。其实现方法是本领域熟知的。

优选的选择标记包括zeocin抗性基因、G418抗性基因、潮霉素抗性基因。选择标记盒通常还包括启动子和终止子序列，其与选择标记基因可操作性连接，其在宿主红曲霉菌株中也是可操作的。

通过利用标记基因贡献的特性，或者由所插入的基因贡献的其他特征（比如生产乳酸的能力，乙醇生产能力的缺失，或者在特定底物上生长的能力），可用已知方法选择出成功的转化体。筛选可通过PCR或Southern分析来完成以验证已经发生了目的插入和缺失，验证拷贝数，以及鉴定基因在宿主 菌株基因组中的整合点。由所插入基因编码的酶的活性和/或由所删除基因所编码的酶的活性缺乏可用已知检测方法来证实。

本文所涵盖的缺失或失活可通过遗传工程方法，迫使进化(forced evolution)或诱变和/或选择或筛选来实现。事实上，本领域现有技术提供了广泛的可用于基因失活、缺失或置换的技术。这样的分子技术包括但不限于：

（i）基于天然基因沉默方法的基因失活技术，包括反义RNA、核糖酶和三螺旋DNA形成，

（ii）单基因突变技术，比如利用非复制质粒单交（single crossing over）的基因失活，以及利用能够进行双交染色体整合的非复制质粒或线性DNA片段的基因失活（Finchham，1989，Microbiological Reviews，53：148-170；Archer等人,2006，BasicBiotechnology：95-126），和

（iii）在同一菌株中的多个未标记突变技术，例如但不限于：

（a）通过整合质粒的同源重组利用双交整合进行抗生素抗性基因对靶基因的删除与置换，得到分离地高度稳定的突变体；

（b）利用来自酿酒酵母的Flp重组酶系统除去抗生素抗性基因，所述系统允许在同一菌株中重复使用多个未标记突变的构建方法；和

（c）产生删除编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶upp基因的菌株，由此可以利用5-氟尿嘧啶作为反向选择标记和对双交整合体的阳性选择。

在具体的实施方案中，根据Oliveira等人(2008)（Appl MicrobiolBiotechnol80，917-924）描述的方法来进行内源基因的缺失或破坏。

在本发明的一个特别的非限制性实施方案中，内源基因的缺失或破坏，可包括导入一或多个功能性结构基因，特别是编码参与乳酸生产的酶的基因，比如上述LDH基因，插入至宿主菌株内源基因的5'和3'侧翼区之间。功能性基因优选包括与结构基因可操作性相连的功能性启动子和终止子序列。该方法允许同时删除内源基因和插入功能性外源或异源基因。载体可包含选择标记基因代替或附加结构基因。选择标记基因也位于载体上被靶向的内源基因的5’和3’侧翼区之间，最终插入功能性内源基因座。利用选择标记基因的好处是引入了用于选择成功转化体的方法。然而，也可以基于所得的功能性特征来选择成功的转化体。例如，依据所删除和导入的基因，有可能依据降低或去除的在特定构建块上生长的能力、生产高浓度乳酸的能力或降低的生产比如乙醇这样的特定代谢物的能力，进行筛选。

由此，本发明的又一方面提供了获得生产高产乳酸的微生物的方法，该方法包括：

a)从红曲霉属获得能够在低pH下高度耐受乳酸的微生物；

b)用一或多个重组核酸序列转化微生物从而确保乳酸生产增强和/或内源代谢物生产降低；和

c)选择能够高产率生产乳酸的微生物。

鉴定在低pH下对乳酸具有高度耐受性的微生物这一步骤可通过在含有高浓度乳酸的培养基上选择微生物来完成。更特别的是，通过在pH比其pKa值高一个单位的含乳酸的培养基上选择来完成选择。在另外的具体的实施方案中，pH低于其pKa值。在具体的实施方案中，pH低于3.8，更特别的的是，低于3。

在具体的实施方案中，在含有50g/L，更特别的是100g/L乳酸的培养基上选择微生物，和在具体的实施方案中，在含有高达150至175g/L乳酸的培养基上选择微生物。

本发明人惊奇地发现，可以鉴定出在低pH，更具体地在低于乳酸pKa的pH，耐受高乳酸浓度的红曲霉目微生物。更特别的是，可以鉴定出在低于3.0的pH耐受提高的乳酸浓度的红曲霉目微生物。

转化微生物的步骤详细描述于前文。如上文详述的，涵盖了提高乳酸生产产率的不同遗传修饰。

选择能够高产量生产乳酸的微生物的步骤是技术人员已知的，包括但不限利用本文实施例中描述的用于LDH的方法测定参与目的乳酸生产的酶活性。另外/或者，在根据本发明的方法中，选择步骤可基于降低的乙醇生产、降低的乳酸消耗等。

在另一方面，本发明提供生产乳酸的方法，更特别的是，以高产率生产乳酸的方法。事实上，乳酸的高产率生产对于其许多工业应用都是令人感兴趣的。本发明的方法对于生产用于聚乳酸生产的乳酸是令人感兴趣的。

在具体的实施方案中，本发明的方法包括从红曲霉目获得在低pH下耐受高浓度乳酸的微生物，对其进行遗传修饰以提高乳酸产率，以及在特定底物或化学构建块的存在且pH低于5，更特别的是，低于4，更特别的是，在高出有机酸pKa值不到1.5个单位的pH培养由此获得的微生物的步骤。

在具体的实施方案中，本发明的方法包括步骤：

（i）从红曲霉目获得菌株，其能够在低pH，更特别的是，在高出乳酸pKa不到1.5个单位的pH耐受乳酸；（ii）修饰所述菌株使其能够从己糖或戊糖或己糖与戊糖的组合高产生产有机酸；以及（ii）在适宜底物存在下培养所述菌株，更特别的是，在高出有机酸pKa值不到1.5个单位的pH，最特别的是pH低于5，最特别的是低于4。最特别的是，所生产的乳酸是L-乳酸。从红曲霉目获得耐受乳酸的微生物的方法以及修饰所述生物以提高乳酸产率的方法如前文所述，并在实施例部分示例阐述。

在本发明方法的具体的实施方案中，红曲霉目的微生物或菌株可以培养于含有可被所转化菌株发酵的糖的培养基中。该糖可以是己糖比如葡萄糖，多糖或其他葡萄糖多聚物，葡萄糖寡聚物，比如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖，潘糖，果糖和果糖寡聚物。在具体的实施方案中，微生物被修饰从而具备发酵戊糖的能力，并且培养基中包含戊糖比如木糖、木聚糖或其他木糖寡聚物。在具体的实施方案中，在己糖和戊糖的组合上培养微生物。

糖类可以是含半纤维素或纤维素的生物质的水解产物。在具体的实施方案中，微生物经修饰从而确保生物质降解为单体（例如，纤维素酶基因的表达）。由此，在具体的实施方案中，底物包含糖寡聚物或多聚物，比如纤维素、半纤维素或果胶。

另外/或者，可以向培养基中加入酶以确保底物降解为可发酵单体。

在本发明的具体的实施方案中，培养基包含至少（当量的）5g/L，至少10g/L，至少20g/L，至少30g/L，更特别的是，至少40g/L，以及甚至更特别的是，至少50g/L葡萄糖。在更具体的实施方案中，培养基包含至少100g/L，更特别的是，至少200g/L。发酵过程中可以向培养基中添加葡萄糖。

培养基任选地还可以包含特定红曲霉菌株所需的营养物，包括比如氨或铵盐等这样的无机氮源、矿物等。然而，在更具体的实施方案中，培养基是含有戊糖或己糖作为唯一碳源的完全矿物质培养基。本发明的菌株在该简单培养基上生长的能力大大降低了培养成本并简化所生产乳酸的纯化。

一种优选的培养基是S.C.培养基，其含有(NH₄)₂SO₄（例如4-6g/l，优选5g/l）、KH₂PO₄（例如2-4g/l，优选3g/l）、MgSO₄.7H₂O（例如0.3-0.7g/l，优选0.5g/l）、ZnSO₄.7H₂O（例如3.5-5.5mg/l，优选4.5mg/l）、MnCl₂.2H₂O（例如0.6-1mg/l，优选0.84mg/l）、CoCl₂.6H₂O（例如0.2-0.4mg/l，优选0.3mg/l）、CuSO₄.5H₂O（例如0.2-0.4mg/l，优选0.3mg/l）、Na₂MoO₄.2H₂O（例如0.2-0.4 mg/l，优选0.4mg/l）、CaCl₂.2H₂O（例如10-14mg/l，优选12.25mg/l）、FeSO₄.7H₂O（例如2-4mg/l，优选3mg/l）、H₃BO₃（例如0.5-1.5mg/l，优选1mg/l）、KI（例如0.05-0.15mg/l，优选0.1mg/l）、葡萄糖.H₂O（例如40-70g/l，优选55g/l）。可以使用防沫剂，例如Sigma204防沫剂。

对其他生长条件，比如总发酵时间、温度、细胞密度等进行一般性选择以提供一种经济的方法。各生长阶段和生产阶段期间温度的范围可以从培养基的结冰温度之上至约50℃。优选温度，尤其是在生产阶段，为约30-45℃。发酵时间可以等于或大于10、20、40、60、80、100、120、140、160小时，或者上述任意两个值之间的范围内的值，优选介于100和140小时之间。任选地在发酵过程中调节pH以维持有利于最佳生产的稳定pH。在具体的实施方案中，pH维持在低于4，更特别的是，低于3.8，甚至更特别的是，低于3，最优选为2.8。

本发明方法的培养步骤可以在有氧、微氧或厌氧条件下进行。也可以采用准厌氧条件或限制氧条件，在此条件下除了生产过程起始时存在于培养基中的溶解氧之外在过程中不添加氧气。

在具体的实施方案中，本发明的方法包括在厌氧或氧限制条件下培养表现出将糖类转化为乳酸的能力的红曲霉目微生物（菌株）。

根据本发明此方面的方法的培养步骤可以以连续、分批、或其一些组合的方式来进行。

利用根据本发明的工具和方法获得的乳酸产率依赖于所使用的培养条件。

在特定实施方案中，根据本发明的生产乳酸的方法得到的有机酸产率为至少0.5g/L，特别的是，至少2g/L，更特别的是，至少3g/L。涵盖了产率高达50g/L，以及更特别的50至100g/L。在更具体的实施方案中，产率约为2-3g/L/小时。

在具体的实施方案中，本发明的微生物能够转化至少50%、更特别的是，至少60%、甚至更特别的是，75%、更特别的是至少95%、以及高达100%的所消耗的葡萄糖。实践中，在本发明方法的具体的实施方案中获得的产率为至少0.5g/g糖，更特别的是，至少0.6g/g糖，但可以高达0.95g/g糖。

典型地，提供含约4至100g/l总乳酸原料的培养基用于进一步加工。通过例如离心、或通过过滤器、或絮凝、离心、或者这些不同技术的组合，澄清 培养基以除去粗糙杂质和其他不溶物。该过滤器可以是使用微滤或超滤膜的封闭端（dead-end）过滤或错流过滤。某些情况下，还可以用活性炭预处理以纯化混合物。澄清过的培养基的pH可以是5或更低，优选3.85或更低，更优选3或更低，更优选介于2和3之间。任选地可以用酸来降低pH，比如硫酸。微生物在发酵过程中分泌的化合物，尤其是乳酸，会降低培养基的pH，因此调节pH并不是必需的。

将培养基中存在的乳酸转化为丙交酯，其中丙交酯是聚合为PLA的底物。考虑到微生物可以在仅含糖类作为碳源的矿物培养基上生长这一事实，向丙交酯的转化可以被大大简化。

在随后转化为丙交酯之前，可以首先从培养基中回收乳酸。或者，可以在培养基中将乳酸转化为丙交酯，任选地结合在转化前从培养基中除去杂质的步骤。

依据与乳酸并存的溶剂，向丙交酯的转化可通过乳酸缩聚为寡聚乳酸而继续，该寡聚物解聚为丙交酯。通常，存在于非水性溶剂中的乳酸利于这样的解聚或者“腐蚀（back-biting）”反应。寡聚乳酸的平均分子量可为600至800。

当乳酸存在于实质上的水性溶剂中时，作为备选，转化可以避免形成寡聚乳酸，也即，乳酸会直接转化为丙交酯，这直接促进了使用来自乳酸发酵罐的水性原料的转化。

在转化为丙交酯之前，可先从前述培养基中回收乳酸。

通常，乳酸被萃取进与澄清培养基形成相的萃取溶剂中，乳酸被分配到该萃取溶剂中。移出含乳酸的分配区。

萃取前，任选地，经澄清的液体培养基可用醇类处理以沉淀杂质。可用本领域已知的任何技术进行污染物的沉淀，例如，如US2009/0093034所述。沉淀优选使用醇类（例如，C₁至C₄直链或支链醇类），也即，甲醇、乙醇、丙醇或丁醇或其中一或多种的混合物。尽管乳酸在甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中有良好的溶解性，乳酸发酵液中所含的培养基成分以及用于中和或酸化的试剂可能在这些溶剂中具有差溶解性。丙醇可以是1-丙醇（n-丙醇）和2-丙醇（异丙醇）中的任一。丁醇可以是1-丁醇（n-丁醇）、2-甲基-1-丙醇（异丁醇）、2-丁醇（仲丁醇）和2-甲基-2-丙醇（叔丁醇）中任一。

此处，所有培养基成分均可溶于水，但培养基成分中仅极少数成分可溶 于低级醇。

通过向含培养基成分的乳酸发酵液中添加作为弱溶剂的醇类，比如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇，优选伴有搅拌，比如培养基成分等这样的污染物在其中会变得不溶并沉淀，并且可以通过随后的萃取从液体上清液中收集乳酸成分。沉淀物可以通过离心除去。

从发酵培养基（任选地除去杂质）中萃取乳酸可通过本领域已知技术来实施，例如，如记载于US98/15517、WO99/19290、US5,831,122、WO97/35489、US2002/0102672的，其通过提述并入本文。最优选用两相萃取法完成萃取。

根据本发明的一个方面，通过包括以下步骤的方法从澄清培养基中回收乳酸：

（A）通过将所述培养基与萃取溶剂接触从澄清培养基中萃取乳酸，形成：

（i）含乳酸的萃取物和

（ii）去乳酸的水性溶液；和

（B）从所述水性溶液（ii）分离所述含乳酸的萃取物（i），

由此得到回收的乳酸。

萃取物（i）和水性溶液（ii）在不同的相中。萃取溶剂至少部分，优选全部，与水不混溶。萃取溶剂的选择对于分离工艺的整体效率以及经济是重要的。萃取效率的一种度量是分配系数，它是用有机相（萃取剂）中的乳酸浓度（按重量）除以水相（自其发生萃取的相）中的乳酸浓度计算得到的。理想的是分配系数大于0.1，甚至更理想的是分配系数大于1.0，以及甚至更好的是分配系数大于3.0。后者可以通过从以下溶剂中选择适当的溶剂或溶剂混合物来实现。当然在商业规模实践中，萃取效率是实现高产率、低萃取剂体积以及浓缩产物的综合能力。这可以通过本文所述技术来实现。

产生有利分配的萃取溶剂包括：氧化溶剂、磷酸酯、膦氧化物、胺、及这些溶剂的混合物。适宜的氧化溶剂包括醇、酮、醚、酯、酸或具有多个这些官能团的溶剂。优选包含至少60%wt.，更优选至少80%w/w和最优选至少90%w/w（典型地95%或更高）、与水一般不混溶的成分（25℃在水中的溶解度不超过约50克每升）的溶剂。

除非另外指明，本文的所有百分数均按重量（w/w）。

具体的有用溶剂是1-丁醇，2-乙基己醇，1-辛醇，甲基异丁酮，环己酮，二异丁基酮、异丙醚、乙酸乙酯、乙酸异丁酯，乳酸乙酯、乳酸丁酯、乳酸辛酯、N.N-二丁基乳酰胺和己酸。适宜的磷酸盐化合物包括磷酸三丁酯（TBP）、磷酸三苯酯、二乙基己基磷酸和三辛基氧化膦（trioctylphosphine oxide）。适宜的胺任选自具有总数至少18个碳原子的伯胺、仲胺和叔胺。最优选的是叔胺。适宜的胺包括三乙胺、二辛胺、三辛胺、十三胺、二十二烷基甲基胺和比如Amberlite LA-1（在各烷基链上有12个碳原子的二烷基胺混合物）、Alamine304（三月桂胺）、Alamine308（各链上共8碳的三烷基支链混合物）和Alamine336（可商业获得的三辛基胺、十三烷基胺、二辛基癸胺和二癸基辛胺的混合物）这样的工业制品。萃取溶剂还可优选包含一种烃成分，比如煤油，典型地（如果完全使用）为1至40%w/w。这样的烃成分有利地改变粘度、相聚结和系统的其他物理特性。

根据本发明的一个优选方面，萃取溶剂包含一种烷基叔胺、一种提高分配系数的氧化溶剂以及一种调节溶剂混合物粘度的煤油成分。

萃取溶剂优选包含一种烷基叔胺三辛酰胺（例如，Henkel's Alamine336）。萃取溶剂还可包含辛醇或甲基异丁酮和煤油（例如IsoPar K）。根据本发明的一个方面，萃取溶剂含有60至80wt%的烷基叔胺，比如Alamine336，5至20%甲基异丁酮，以及10至30%煤油（例如IsoPar K）。

根据本发明的另一方面，萃取溶剂包含45-55%三辛酰胺（Henkel's Alamine336）、25至25%辛醇以及余量的煤油。优选地，萃取溶剂包含48%三辛酰胺（Henkel'sAlamine336）、30%辛醇和22%煤油。一种可用的且常为优选的萃取剂包含按重量计0至15%的乙醇、65至85%的Alamine336和15至35%的煤油。

根据本发明的另一方面，萃取溶剂包含：

-作为一级萃取溶剂的至少一种烷基仲胺或烷基叔胺，其中碳原子的聚集数为至少20，和

-一种空间位阻的、极性的有机化合物，其带有至少5个碳原子，碱性弱于所述一级萃取溶剂，并且具有对温度敏感、调节萃取的性质。

该空间位阻的、极性的有机化合物任选自烷醇、羧酸、叔胺或三烃基磷酸盐，其在携带所述极性基团的碳或者所述碳的α、β或γ位碳上附接有空间位阻取代基。

依赖于所需工艺以及酸或盐和一级萃取溶剂的性质，所述空间位阻的极性有机化合物可以是一种萃取抑制剂，其功能是，例如，在低温下作为弱抑制剂，以及更高的温度下作为更强的抑制剂；或者是在低温下比在更高温下具有更强的萃取增强活性的萃取增强剂。

极性的且尤其是质子的有机化合物充当用胺进行酸萃取的增强剂，因其具有使在这样的萃取中形成的胺酸离子对溶剂化的能力。适用于本发明作为增强剂的有机化合物具有至少一个这样的极性或质子基团，其溶剂化特性受到该分子的结构阻碍。极性基团优选为羟基、酯、醛、羧基、酮或胺，或者所述极性基团可包含卤素、硫、氮、或磷原子。这种阻碍可通过用脂肪族基团取代烃基链中的氢原子来实现，也即，在携带所述极性基团的碳原子或者所述碳原子的α、β或γ位碳原子上形成分支。

增强剂应当是一种比用作萃取剂组合物中的一级萃取剂更弱的碱。用0.1M的HCl水性溶液以增强剂比HCl的摩尔比率为2的比例进行平衡时，水相的pH将保持在低于2。在类似的平衡下，利用自身作为非增强萃取剂的胺，水相的pH升至约2.5或更高。

萃取溶剂可含有至少一种烷基仲胺或烷基叔胺作为一级萃取溶剂，其碳原子聚集数为至少20。尤其适宜的胺是可商业获得的三辛基、三辛酰基、十三烷基和三月桂基胺。

除了一级萃取溶剂和空间位阻的极性有机增强化合物，萃取溶剂中还可包含水不混溶的极性或非极性溶剂，例如脂肪烃或芳香烃、含氮或卤素取代基的烃、和醇类。

在本发明的优选实施方案中，所述空间位阻的极性萃取增强化合物选自下组：仲烷醇或叔烷醇、三-(2-乙基己基)胺和三乙基己基磷酸酯。

如所示，本改进方法尤其适用于回收羟基羧酸，比如柠檬酸和乳酸，以及可用于改变或替代制备柠檬酸的商用方法，例如，如本发明所教导的，通过用空间位阻的极性有机化合物替代萃取溶剂组合物中的1-辛醇，所述空间位阻的极性有机化合物带有至少5个碳原子并且碱性弱于所述一级萃取溶剂的碱性。

反萃取步骤（步骤（C）-参见下文）可在比进行所述萃取的温度至少高20℃的温度进行。所述空间位阻的极性有机化合物既改变所述一级萃取剂组合物的萃取能力，也有利于所述对温度敏感的反萃取操作。

根据本发明的一个方面，萃取溶剂包含至少一种C₃-C₈烷醇。特别地，该萃取溶剂包含高达50%的带有至少18个碳原子的脂肪胺。优选地，该C₃-C₈烷醇是n-丙醇、2-丁醇。根据一个方面，萃取溶剂包含2-丁醇和tridocylamine。根据一个方面，萃取溶剂包含n-丙醇和tridocylamine。

根据本发明的一个方面，萃取溶剂包含一种水不溶性胺。为了获得有利的乳酸分配及选择性，优选使用胺溶剂。优选地，该胺是与水不混溶的，其包含至少18个碳原子。最优选，用叔胺进行萃取。参见例如美国专利号4,771,001、5,132,456和5,510,526；和Shimizu等人，J.of Fermentation and Bioengineering（1996），第81卷第240-246页；Yabannavar和Wang，Biotech Bioeng.，（1991）第37卷，第1095-1100页；和，Chen和Lee，Appl.BiocheM.Biotech，（1997），第63-65卷，第435-447页。

适宜的胺包括脂肪族、芳脂族或芳香族胺或混合的脂肪族-芳脂族或脂肪族-芳香族胺，或这些胺的混合物。胺的例子包括三乙胺、二辛胺，三辛胺，十三烷基胺，甲基双月桂基胺以及工业制品比如Amberlite LA-1（各烷基链上带十二个碳原子的二烷基胺混合物，可获自Rohm和Haas，宾夕法尼亚州，费城）、Alamine304（三月桂胺，可获自Cognis，Tuscon，Ariz.，formerly Henkel Corp.）、Alamine308（各链带有共8个碳原子的支链三烷基混合物，可获自Cognis，Tucson，Ariz.）和Alamine336（三辛胺、十三烷基胺、双辛基癸胺^-和双癸基辛胺的混合物，可获自Cognis，Tucson，Ariz.）。

萃取溶剂还可优选包含烃成分，以改变粘度、相聚结和系统的其他物理特性。适宜烃的一个例子是煤油。例如，Exxon的IsoPar产品家族就是适宜的煤油产品。尤其优选的是IsoPar K。烃在萃取溶剂中（若完全使用）通常为约1wt%至约70wt%。优选的溶剂系统包含，按重量计，30wt%至70wt%Alamine304，0wt%至20wt%极性有机增强剂，比如辛醇或磷酸三丁酯，以及30wt%至70wt%煤油。在含低浓度增强剂的溶剂组合物中，可以在乳酸萃取中形成第二有机相。一般，第二有机相包含高浓度乳酸。然而，第二有机相的存在可导致某些操作上的困难。

萃取溶剂还可包括增强剂以提高乳酸的分配系数。水相中的游离乳酸浓度低时，也即低于15wt%时，增强剂尤其有用。一般，在增强剂存在下乳酸更倾向于分配进有机相，而在无增强剂存在下更倾向于分配进水相。增强剂通常根据其增强强度、挥发性、反应性或任何其他为萃取效率或操作便利 性所需的特性来选择。典型的增强剂是极性有机化合物，包括醇、酮、酯、酰胺以及其他极性有机液体。优选挥发性增强剂，因为可以在水性反向萃取之前将其从负载溶剂中蒸馏出来。

已经发现，硫酸也可作为增强剂并趋于在低乳酸浓度时提高乳酸向有机溶剂的分配，尤其是基于胺的溶剂，更特别的是，基于叔胺的溶剂。这样加载硫酸的基于胺的溶剂也称作含硫酸或硫酸盐溶剂或者硫酸或硫酸盐增强的溶剂。

用萃取溶剂进行萃取的温度可以依据各种参数而变化，包括萃取效率和粘度。通常，萃取在约0℃至95℃，优选20℃至约70℃，更优选约30℃至60℃的温度进行。

水性乳酸溶液与萃取溶剂可以在，例如，机械搅拌柱、填充柱、孔板塔、脉冲塔、雨桶型接触器（raining bucket contactor）、离心接触器或混合/静置装置中以逆流方式接触。装置的选择取决于形成乳液的趋势，以及其他操作参数，比如温度和压力。从萃取过程放出的流体是去乳酸水性溶液和含乳酸萃取物。

萃取溶剂与含乳酸萃取物的比率可为5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、优选3:1。

含乳酸萃取物（i）可在随后步骤中转化为丙交酯。萃取溶剂通常是非水性的，从而允许进行经由乳酸寡聚体向丙交酯转化。经由乳酸寡聚体向丙交酯转化的技术描述于下文。

或者，在转化成丙交酯之前，含乳酸萃取物（i）可接受反萃取步骤，也即，将乳酸以更高的纯度反向萃取到反萃取溶剂中。

反萃取步骤的采用可部分由萃取溶剂决定，例如，若萃取溶剂是疏水性萃取溶剂，则反萃取步骤可能是非必需的。适宜疏水性萃取溶剂的例子有，带有高比例长链烷基胺且任选地含有至少1至35%重量比煤油的萃取溶剂。具体例子包括Alamine-334、甲苯、二甲苯、mesylene、乙苯和矿物油精。

在转化成丙交酯之前，任选地，含乳酸萃取物（i）可进行如本文别处所述的反萃取步骤。反萃取可根据本领域已知的技术完成，例如，如US98/15517和WO99/19290中所述的技术。

因此，在上述步骤（A）和（B）后，该方法还可包括步骤：

（C）用反萃取溶剂从所述萃取物（i）中反萃取所萃取的乳酸，从而形 成：

iii）反萃取溶液中的乳酸溶液，和

iv）去乳酸萃取溶剂。

在随后的步骤（D）中，将所述去乳酸萃取溶剂（iv）与含乳酸的反萃取溶液（iii）分离，由此得到回收的乳酸。

乳酸溶液（iii）和（iv）去乳酸萃取溶剂形成于不同的相中。反萃取（步骤C）可通过将萃取物（i）中的乳酸反向萃取进部分或完全与萃取溶剂不混溶的反萃取溶剂中来完成。用于形成不混溶相的反萃取溶剂可以是水性溶剂（例如，水）、极性有机溶剂或这些溶剂的混合物。已经发现，一些极性有机溶剂与上述优选的萃取溶剂是不相溶的。随着三烃基胺和煤油的重量比提高，极性有机化合物与萃取溶剂的不相溶的可能性也提高。目的极性有机溶剂包括：甲醇、乙醇、丙交酯、乳酸寡聚体、二甲基亚砜（DMSO）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、1,4-二氧六环（dioxane）、1,3-二氧六环、四亚甲基砜（TMSF）和环丁砜。一般而言，目的极性有机溶剂是在水中的溶解度大于1g每10g水的那些极性有机溶剂。若用水作为反萃取溶剂，它还可包括碱性化合物以提高乳酸在水相中的分布，比如氢氧化钠、氢氧化铵或氢氧化钙。

反向萃取优选在高于最初将乳酸萃取入萃取溶剂的温度进行（典型的是30℃至160℃或更高，通常为90℃至160℃）。可以有例外，并且当使用含大比例醇类比如己醇或辛醇的萃取溶剂时，在低于初始萃取的温度实施反向萃取可能是有利的。由于在使用水性溶剂时温度会上升至100℃以上，因而通常在施以氮气压力下进行反向萃取。正向萃取乳酸和反向萃取之间的萃取溶剂的组成可以被改变。

反萃取溶剂还可包含碱性化合物以提高乳酸向第二不相溶相的反向分配。已经发现，室温下的三乙胺-乳酸-三辛胺三级系统具有两相。这多少是有些令人吃惊的，因为三乙胺与三辛胺是可混溶的。三辛胺相几乎不含乳酸，如果所添加的三乙胺量稍高于化学当量（stoichiometric）。三乙胺富集相的乳酸与三乙胺比摩尔比接近1:1，其乳酸重量百分比为47%。因此，该系统能够在反向萃取过程中浓缩乳酸。三乙胺实质上比乳酸更易挥发，并且可以被蒸馏从而获得粗制乳酸产物。预期三甲胺、氨以及其他分子量低于200的胺将与三乙胺有相似表现。Bailey等人美国专利4,771,001（通过提述并入本文 中）中公开了在反向萃取入水相（具有相对强的碱如氨）时将三烷基叔胺用于有机溶剂中。

由于可以仔细控制溶剂与三乙胺的比率，因此反向萃取到具有相对低挥发性的极性溶剂内的三乙胺混合物中是一种有效的方法。溶剂的存在使得能够在从乳酸中蒸馏胺的过程中维持低粘度，并且能够为乳酸变成乳酸产物的进一步反应提供介质。

反向萃取乳酸的这一最后提到的选项已经一般性描述为使用带碱性萃取剂的非极性溶剂，比如长链（18个碳原子或更多）烷基胺，以及使用极性有机溶剂作为反萃取相。当然，反之也是正确的。初始萃取溶剂可以是相对极性的，但仍然是与水不相混溶的，并且反向萃取溶液可以是带碱性萃取溶剂的非极性溶剂。基本概念是，用萃取溶剂从水性溶液中萃取乳酸以及从将乳酸反向萃取进第二液体中的能力。在某些情况下，液体可以是水，但它也可以是适于有效分离乳酸或制备和分离乳酸产物的有机液体。

当将乳酸反萃取进第二极性液相时，富集乳酸的反萃取相中仍然会存在残余量的萃取溶剂成分。如果期望的话，可以通过将反萃取相与比如IsoPar K这样的非极性溶剂接触来减少残余的萃取溶剂。

反萃取过程中可以在机械搅拌柱、填充柱、孔板塔、脉冲塔、雨桶型接触器、离心接触器或混合/静置装置中以逆流方式使反萃取溶剂和含乳酸的萃取物接触。从萃取工艺排放出的流体是去乳酸萃取溶剂和含乳酸反萃取溶剂。

反萃取溶剂与萃取溶剂的比率可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1，优选3:1。

随后将所回收的乳酸转化为丙交酯。可以在适宜的情况下通过蒸发从乳酸溶液中除去反萃取溶剂，并将剩余物质重悬于疏水溶剂中以经乳酸寡聚体直接转化为丙交酯。当反萃取溶剂为水性时，可利用本文别处所述方法将含乳酸溶液直接转化为丙交酯。

如上述，可以主要从澄清的发酵培养基制备丙交酯。所述澄清的发酵培养基任选地可以经处理以除去杂质。适宜的处理的例子包括，用本领域已知技术沉淀污染物，例如通过提述并入本文的US2009/0093034。沉淀使用醇类（例如，C₁至C₄直链或支链醇类），也即，甲醇、乙醇、丙醇或丁醇或其中一或多种的混合物。尽管乳酸在甲醇、乙醇、丙醇和丁醇有良好的溶解性，但乳酸发酵液中所含的培养基成分和用于中和或酸化的试剂可能在这些溶 剂中溶解性不佳。丙醇可以是1-丙醇（n-丙醇）和2-丙醇（异丙醇）中任一。丁醇可以是1-丁醇（n-丁醇）、2-甲基-1-丙醇（异丁醇）、2-丁醇（仲丁醇）和2-甲基-2-丙醇（叔丁醇）中任一。

本文中，所有的培养基成分均可溶于水，但培养基成分中仅少数可溶于低级醇中。

通过向含培养基成分的乳酸发酵液中添加作为弱溶剂的醇类例如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇，优选搅拌，比如培养基成分等污染物会在其中变得不溶并被沉淀，乳酸成分可以液体上清液的形式被收集，由此得到回收的乳酸。沉淀可离心除去。

当事先通过脱水作用来减少发酵液中水的含量比率时，醇类作为弱溶剂的效果得以提高。由此增加量的污染物得以沉淀，并由此从发酵液中除去更多的非乳酸溶质从而产生含更少量杂质的乳酸。

所得上清液可如此经进一步处理形成丙交酯。或者，可蒸馏上清液以获得浓缩形式的LA，并将其重悬于水性或有机溶剂中。会理解的是，在萃取之后用带有5个或更多个碳原子的醇进行蒸馏分离等会带来困难，因该醇沸点高。例如，甲醇的沸点为65℃，乙醇沸点为78℃，n-丙醇沸点为97℃，异丙醇沸点为82℃，异丁醇沸点为沸点为108℃，叔丁醇沸点为82.5℃，2-丁醇沸点为100℃，以及1-丁醇沸点为118℃，戊醇异构体的沸点为112至137℃，除了2-甲基-2-丁醇的沸点为102℃以外。此外，这些醇的成本高于低分子量的醇。萃取温度可以是范围从室温至各溶剂沸点的温度。例如，就使用乙醇的情况，可在室温至78℃的范围内的温度进行萃取。此外，就使用组合溶剂的情况，期望根据组合溶剂与水的共沸点来设定温度。由此，当含乳酸上清液被加热至至少溶剂与水的共沸点时，水可以从反应系统中蒸发掉从而使上清液脱水。优选搅拌加热。上述上清液脱水还可通过在负压下加热完成。

乳酸可悬浮于适宜溶剂中，例如Alamine336、DMSO、甲苯、三甲基苯、乙苯，以及优选在疏水溶剂中的矿物油精。在接下来的步骤中将所回收的乳酸也转化为丙交酯。

使用本领域已知方法将经萃取（步骤（A）和（B））获得的、经反萃取（步骤（C）和（D））获得的或存在于澄清发酵培养基中的乳酸转化为丙交酯。

一般而言，已知方法包括经乳酸缩聚形成乳酸寡聚体随后形成丙交酯的 转化；寡聚化尤其是当乳酸存在于非水性或极性溶剂中时发生。这样的方法描述于，例如，WO99/19290、US5,332,839、WO92/05167、WO95/09142，其通过提述并入本文。

或者，已知方法包括乳酸直接转化为丙交酯而不形成中间的乳酸寡聚物。当乳酸存在于实质水性溶剂中时，尤其促进直接转化。这样的方法描述于，例如WO92/05167、US5,274,127、WO95/09142、US5,319,107、US5,332,839和US5,420,304，其通过提述并入本文。

其他技术描述于DE1234703、DE267826、US5,053,522、WO95/09879、US1,995,870和US4,797,468，其亦通过提述并入本文。

当经某个步骤回收的乳酸存在于有机溶剂（例如，DMSO、Alamine336、甲苯、三甲基苯、乙苯和矿物油精）尤其是疏水溶剂中时，，将混合物加热至驱动乳酸缩聚为乳酸寡聚物的温度。取决于溶剂，在Alamine336的情况下，该加热步骤可在160℃、50mm Hg进行，或者在DMSO的情况下，该加热步骤可在180℃、大气压进行。该加热除驱动缩聚至乳酸寡聚物外，还可以进一步蒸发水分。任选地，在该加热步骤之前可以先经过初始除水步骤，例如通过经加热蒸发。寡聚物的平均分子量典型为约600至800。随后冷却反应混合物。冷却通常在60℃至120℃的范围内。若溶剂为Alamine336，则将混合物冷却至60℃，若溶剂为DMSO，则冷却至117℃。使用特定溶剂（例如，Alamine336），混合物可分成两相，其中一相几乎是纯萃取溶剂，而另一相含有乳酸寡聚物。物理分开这些相。加热含乳酸寡聚物的溶液，由此在可被浓缩的蒸发相中获得丙交酯。加热在140至180℃的范围内，压力为5至10mm Hg。若溶剂为Alamine336，5mmHg时可加热至180℃；若溶剂为DMSO，10mmHg时可加热至145℃。可向乳酸寡聚物溶液中加入催化剂。适宜催化剂的例子包括锡催化剂，例如辛酸亚锡和FASCAT9102（丁基锡三（2-乙基己酸盐/酯））。可添加约0.1至0.5wt%催化剂。收集缩聚的丙交酯。该过程可应用于含乳酸萃取物（i），尤其是在使用Alamine336作为萃取溶剂时。其还适合直接用在未经反萃取步骤的含乳酸萃取物（i）上。

或者，当从前面步骤回收的乳酸存在于水相中，例如来自纯化的发酵培养基或在反萃取（步骤（C））之后，可通过蒸发将所回收的乳酸转变成丙交酯。这样的技术是本领域公知的，如描述于US5,332,839，其通过提述并入本文。蒸汽通过维持在高温下的反应器，反应器中任选地放置有氧化铝催化 剂。从反应器中撤出的是产物丙交酯、水和未反应的水性乳酸给料，对其进行分离以回收丙交酯产物。所分离的未反应乳酸给料符合重新进入该工艺以制备更多丙交酯的条件。该循环工艺包括将补充水性乳酸给料与来自该工艺中另一步骤的未反应的水性乳酸滤液一同通过汽化带从而形成水性乳酸给料蒸汽的步骤。然后将由此产生的蒸汽通过处于高温的蒸汽相反应带以在其中形成丙交酯。从未反应的水性乳酸滤液中分离固体丙交酯；以及将滤液再循环到该工艺初始步骤中的汽化带。水性乳酸溶液可以主要富集单体乳酸（L1A）、二聚乳酸（L2A）以及一些三聚乳酸（L3A），且不含更高的寡聚物（LnA）。水性乳酸溶液也可以用作给料。

水性乳酸溶液按如下转化为丙交酯：（a）将水性乳酸转化为其蒸汽相；（b）将蒸汽通过维持在高温的蒸汽相反应带；和（c）从所述反应带撤出丙交酯、水和未反应的水性乳酸给料。所述高温优选在约150℃至225℃的范围内。蒸汽优选借助载气通过所述蒸汽相反应带。载气优选包含氮气。蒸汽相反应带优选包含氧化铝催化剂。该方法还可包括步骤（d）：将所述撤出的丙交酯、水、和未反应水性乳酸给料通过冷涡旋分离。为了将水性乳酸（给料）溶液中任何寡聚乳酸转化为其蒸汽相，可用水将其转变成L1A、L2A或L3A中的一或多种。水性乳酸（给料）溶液可以是单体乳酸（L1A）。

水性乳酸溶液按如下转化为丙交酯：（a）将补充水性乳酸（例如，来自给料的）与来自该工艺中另一步骤的未反应水性乳酸滤液通过汽化带，并在其中形成水性乳酸给料蒸汽；（b）将所述蒸汽通过维持在高温的蒸汽相反应带以在其中形成丙交酯；（c）从未反应水性乳酸滤液分离固体丙交酯；和（d）将所述滤液通过工艺步骤（a）中所述的汽化带。所述高温优选范围从约150℃至225℃。给料蒸汽优选借助载气通过所述蒸汽相反应带。载气优选包含氮气。蒸汽相反应带优选包含氧化铝催化剂。为了将水性乳酸（给料）溶液中任何寡聚乳酸转化为其蒸汽相，可用水将其转变成L1A、L2A或L3A中的一或多种。水性乳酸（给料）溶液可以是单体乳酸（L1A）。可以通过冷离心过滤将固体丙交酯从未反应水性乳酸滤液中分离出来。滤液在通入所述汽化器带之前可经蒸馏从而浓缩其乳酸含量。滤液可通过蒸馏脱水至实质上不超过约2的聚合化（DP）程度。

若前述工艺得到的乳酸存在于水性溶液中，丙交酯可通过从水性乳酸溶液中除去水来形成。如此形成的丙交酯可从粗产品中分离。这样的技术是本 领域熟知的，例如WO92/05167中的，其通过提述并入本文通过提述并入本文。可用任何技术除水，例如，加热、渗透或者加入吸水剂，所述吸水剂优先与水反应形成对形成丙交酯无害的化合物。若采用加热方式，可通过在高温（例如，150℃至225℃）蒸馏来除去水，其导致乳酸寡聚化；蒸馏持续进行直到聚合化程度实质上不大于2。优选在真空条件下蒸馏。若使用吸水剂，它可包括比如酐（例如，乙酸酐）、缩醛（例如，乙醛的二乙基缩醛）、碳二亚胺和缩酮（例如，丙酮的二甲基缩酮）这样的化合物。可通过冷水洗涤、级分蒸馏、溶剂萃取或溶剂重结晶来完成分离。可使用共馏溶剂，比如烃基苯。烷基苯可选自十二烷基苯、十三烷基苯及其混合物。

另一适宜通过除水从水性乳酸溶液形成丙交酯的技术可以是如同US5,319,107所描述的。可通过各种方法除水，包括但不限于：反应成分稀释于共沸溶剂中，水作为共沸物被除去；在无或有非共沸有机溶剂存在以及适宜压力下，在低于乳酸汽化温度的高温加热；加入优先与水反应的吸水剂；使用分子筛或分隔（例如渗透）膜；使用与水形成含水晶体的无水盐；将进料流与水和吸收性材料比如多聚糖（例如，Ficoll）或硅石接触。

共沸剂的例子包括与水不混溶的芳香族溶剂，与水不混溶的脂肪族或环烃溶剂以及均一(homogeneous)溶剂。特别的例子讨论如下。非共沸溶剂的例子包括芳香族化合物，比如卤代芳香族，比如氯代芳香族和氟代芳香族，萘和苯胺。吸水剂的例子包括酐，比如乙酸酐，缩酮，比如丙酮的二甲基缩酮，缩醛，乙醛的二乙基缩醛，和碳二亚胺。分子筛的例子包括沸石。无水盐的例子包括无水硫酸钠和无水硫酸镁。

优选的除水方法包括除去与有机溶剂形成共沸物的水，以及在负压下加热进料流。

一种更优选的方法是从乳酸进料流除去作为共沸物的水分，讨论如下。为形成环酯而对含乳酸进料流进行的处理可受到许多参数的影响，包括温度、压力、反应时间、有无催化剂、以及有无阻断剂。进料流处理的温度不仅控制去除游离水的速率也控制酯化速率。对于其他处理参数既定的情况，为环化作用和除去水分而对进料流处理的温度是，足够高以至于有效形成环酯却又不会高至将乳酸组分转化为醛、一氧化碳或其他降解产物的温度。优选地，生产丙交酯的温度范围从约55℃至约250℃。更优选该温度为约60℃至约225℃。在使用溶剂时，溶剂的选择影响反应温度，尤其是在溶剂沸点 进行反应时。

处理进料流的压强也会影响丙交酯的形成。例如，在高压下，对于给定溶剂可以使用较高的反应温度，这将使得反应速度加快，尤其是在蒸汽相中处理时。然而，压强可以是大气压，或是高于或低于大气压。本发明的优选压力是大气压。

进料流处理可以进行不同的时间，且通常进行至根据适当的分析技术测定的环酯形成已经基本上达到最大化。反应时间当然可以根据其他参数比如温度、有无催化剂而变化。例如，通过从室温开始加热除去与甲苯形成共沸物的水而从稀释于甲苯中的乳酸形成丙交酯，可以在约2至约5小时内基本上最大化。可以使用催化剂来提高环化速率。优选更短的时间以最小化丙交酯降解和外消旋。

尽管催化剂并不是必需的，优选使用不会在反应中降解的稳定催化剂。就液相生产方法而言，有很多催化剂，其中包括环闭合酯化催化剂，其可以使用包括但不限于离子交换酸性催化剂，比如Nafion和Dowex50；可溶性酸性催化剂，比如硫酸、甲磺酸、三氟甲磺酸和甲苯磺酸；基于硅土的催化剂，例如硅酸铝；其他固体异质酸性催化剂，例如氧化铝、ε、θ、δ和γ氧化铝、硅土、硫酸铝、氧化铅、三氧化锑、三氟化硼、氧化铍、氧化钇；金属酯催化剂，例如辛酸锡和四（异丙醇氧化）钛；酶，比如水解酶；沸石；所谓的模板催化剂，例如二-n-丁基锡氧化物；胶囊催化剂，包括极性催化剂，比如琥珀酸盐，比如由Pfizer销售的名称为Aerosol OT的二(2-乙基己基)琥珀酸钠，非极性催化剂，比如聚氧乙烯壬基苯酚和磷酸盐。优选的催化剂包括沸石和酸性催化剂，例如Dowex50、γ氧化铝和甲苯磺酸。

催化剂的用量将根据比如温度和压强这样的处理参数、催化剂的反应性以及目的反应速率提升而变化。因此，依据反应动力学和进料流的处理，可能存在生产环酯的催化剂最佳量。在更高或更低的催化剂量下，转化速率可能会降低。

可以控制特定催化剂及其他反应参数来实现期望的间环（meso-cyclic）酯产物。例如，丙交酯有两个不对称碳原子，因此它可以以三种立体异构体形式获得：L-丙交酯，其中两个不对称碳原子都具有L（或S）构象；D-丙交酯，其中两个不对称碳原子都具有D（或R）构象；以及间丙交酯，其中一个不对称碳原子具有L-构象，而另一个碳原子具有D-构象。L-丙交酯和D- 丙交酯是对映异构体，而间丙交酯是L-丙交酯和D-丙交酯的非对映异构体，其中二氧六环二酮(dioxanedione)环中的甲基彼此为反式。L-乳酸中手性的维持将专有地形成L-丙交酯，其可用于生产可降解多聚物。然而，L-乳酸中最初的手性消旋将导致产生间丙交酯，其与L-丙交酯作为共单体在可降解多聚物的生产中也有重要用途。通过在本发明所述各实施方案中使用的条件和催化剂的变化，从L-乳酸给料或进料流获得的丙交酯，可以几乎全为L-丙交酯或者它除L-丙交酯以外也可以包含控制量的间丙交酯。例如，已发现在丙交酯生产中使用酸性催化剂将导致间丙交酯产率提高。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用阻断剂或端基剂（end group agent）来阻断比二聚乳酸大的羟基羧酸寡聚物的形成。阻断剂，例如酐、酮和醛，是有用的。尤其是，据信这样的阻断剂阻断羟基酸上的醇基团，由此防止酯形成。优选地利用阻断剂，可以为从乳酸形成乳酸二聚物而不显著形成乳酸三聚物或更高的寡聚物富集进料流。之后，可以除去阻断剂从而允许从乳酸二聚物形成丙交酯。

如果来自前述步骤的乳酸是在水性溶液中，可以通过在负压下蒸馏乳酸来形成丙交酯，例如，任选地，在如DE1234703、DE267826、US5,053,522、WO95/09879、US1,995,870和US4,797,468所公开的催化剂存在下，这些文献通过提述并入本文。丙交酯存在于蒸馏物中。蒸馏可以在130℃至230℃范围内的温度进行。压强可为13至25托。催化剂可以是锡粉、卤化锡或衍生自带有多至20个碳原子的羧酸的有机锡化合物。

所得丙交酯可通过本身已知的方法聚合成PLA，例如通过在金属催化剂中开环聚合，金属催化剂例如是锡或无锡催化剂。技术的例子描述于，例如美国专利号2,758,987、BE1008099、WO2004014889、US7488788和US6166169，其通过提述并入本文通过提述并入本文。

聚合方法通常产生高数均分子量（Mn）为75000至100000道尔顿之间的PLA。PLA的多分散性可为1.4至1.9。本领域已知的术语“多分散性”是，重量平均分子量（Mw）与数均分子量（Mn）的比值。丙交酯聚合成PLA可以在160℃至195℃的温度进行。丙交酯优选与金属催化剂接触。适宜的催化剂可以是通式M(Y¹,Y²，...Y^m)_n的催化剂，其中M选自下组，该组包含元素周期表第3至12栏的元素以及元素Al、Ga、In、Tl、Ge、Sn、Pb、Sb、Ca、Mg和Bi；而Y¹、Y²、...Y^m各自为选自下组的取代基，该组包含具有1至20 个碳原子的烷基、具有6至30个碳原子的芳基、具有1至20个碳原子的烷氧基、具有6至30个碳原子的芳氧基、以及其他氧化物、羧酸盐和卤代基团以及周期表中第15和/或16族的元素；m和n是1和6之间的整数。作为适宜的催化剂的例子，我们特别提到Sn、Ti、Zr、Zn和Bi的化合物；优选醇盐（alkoxide）或羧酸盐，以及更优选Sn(Oct)₂、Ti(OiPr)₄、Ti(2-乙基己酸)₄、Ti(2-乙基己基氧化)₄、Zr(OiPr)₄、Bi(新癸酸)₃或Zn(乳酸)₂。其他适宜的催化剂可以是通式(I)的催化剂：

（I）

其中

R¹和R²各自独立为C_1-10烷基，

R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-10烷基，或

R³和R⁴彼此共价连接且各为一个亚甲基，以及

R⁵为C_1-10烷基，

X¹选自C_1-10烷基、-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶是C_1-10烷基，以及R⁷是C_1-6烷基。

术语“C_1-10烷基”，作为一个基团或基团的一部分，指具有通式C_nH_2n+1的烃基，其中数字n为从1至10的数字。一般，烷基包含1至10个碳原子，优选3至10个碳原子，更优选3、4、5、6、7、8、9、或10个碳原子。烷基基团可以是线性的、支链的或环形的，且可以如本文所述被取代。若本文中在碳原子后使用了脚标，该脚标指所指示的基团可包含的碳原子数。因此，例如，C_1-10烷基包括带有1至10个碳原子的所有线性的、或支链的或环形的烷基基团，并因此包括例如甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、丁基及其异构体（例如，n-丁基、i-丁基和t-丁基）；戊基及其异构体、己基及其异构体、庚基及其异构体、辛基及其异构体、壬基及其异构体、癸基及其异构体等。例如，C_1-6烷基包括带有1至6个碳原子的所有线性、或支链或环形烷基 基团，并由此包括例如甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、丁基及其异构体（例如，n-丁基、i-丁基和t-丁基）；戊基及其异构体、己基及其异构体。

术语“C_6-30芳基”，作为基团或基团的一部分，指带有一个环（也即，苯基）或多个融合在一起（例如，萘）或共价连接的芳香环的多不饱和、芳香烃基，通常含6至30个碳原子；其中至少一个环是芳香环。C_6-30芳基的非限制性例子包括苯基、联苯基、亚联苯基（biphenylenyl）、或1-或2-萘烷基（naphthanelyl）。

R¹和R²各自独立为C_1-10烷基；优选地，R¹和R²各自独立为C_1-6烷基；优选地，R¹和R²各自独立为C_1-4烷基；例如，，R¹和R²可各自独立选自甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基；优选地，R¹和R²可各自独立选自由甲基、乙基、i-丙基和t-丁基组成的组；例如R¹和R²可各自独立选自i-丙基或t-丁基；优选地，R¹和R²为t-丁基，

R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-10烷基，优选地，R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-6烷基，优选地R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-4烷基，例如，R³，R⁴和R⁵可各自独立选自下组：甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基；例如，R³，R⁴和R⁵可各自独立选自下组：甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；例如，R³，R⁴和R⁵各自独立选自甲基或乙基；优选地，R³，R⁴和R⁵各自独立为甲基，或R³和R⁴彼此共价连接且各自为一个亚甲基和R⁵是C_1-10烷基；优选R⁵是C_1-6烷基；优选地，R⁵是C_1-4烷基；例如R⁵可选自下组：甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基；例如R⁵可选自下组：甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；例如R⁵可选自甲基或乙基；例如R⁵可以是甲基；

X¹选自C_1-10烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃）₂，R⁶是C_1-10烷基，和R⁷是C_1-6烷基；优选地，X¹选自C_1-6烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃）₂，R⁶是C_1-6烷基，和R⁷是C_1-6烷基；优选地，X¹选自C_1-4烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃）₂，R⁶是C_1-4烷基，和R⁷是C_1-4烷基；例如X¹可选自下组：甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基、或-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃）₂，R⁶可选自甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基、和R⁷可选自甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、2-甲基-乙基、n-丁基、i-丁基和t-丁基；优选地，X¹可选自甲基、乙基、i-丙基和n-丁基、或-OR⁶，R⁶可选自甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；优选地，X¹可选自-OR⁶，R⁶可选自甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；优 选地，X¹可以是-OR⁶，和R⁶是乙基。

在一个实施方案中，R¹和R²各自独立为C_1-6烷基。优选地，R¹和R²可各自独立选自甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；例如R¹和R²可各自独立选自i-丙基或t-丁基；优选地，R¹和R²为t-丁基。

在一个实施方案中，R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-6烷基。例如，R³，R⁴和R⁵可各自独立选自甲基、乙基、i-丙基和t-丁基；优选地，R³，R⁴和R⁵可各自独立选自甲基或乙基；更优选地，R³，R⁴和R⁵可以是甲基。

例如，可以用通式（I）的催化剂完成该过程，其中，R¹和R²各自独立为C_1-6烷基；R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-6烷基；和X¹选自C_1-6烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶是C_1-6烷基，和R⁷是C_1-6烷基。

例如，可以用通式（I）的催化剂完成该过程，其中，R¹和R²各自独立为C_1-6烷基；R³和R⁴彼此共价连接且各自为一个亚甲基和R⁵是C_1-6烷基；和X¹选自C_1-6烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶是C_1-6烷基，和R⁷是C_1-6烷基。

例如，可以用通式（I）的催化剂完成丙交酯聚合成PLA，其中，R¹和R²各自独立为C_1-4烷基；R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-4烷基，X¹选自C_1-4烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶是C_1-4烷基，和R⁷是C_1-4烷基。

例如，可以用通式（I）的催化剂完成丙交酯聚合成PLA，其中，R¹和R²各自独立为C_1-4烷基；R³和R⁴彼此共价连接且各自为一个亚甲基和R⁵是C_1-14烷基；和X¹选自C_1-4烷基，-OR⁶或-N（SiR⁷ ₃)₂，R⁶是C_1-4烷基，和R⁷是C_1-4烷基。

在一个优选实施方案中，R¹和R²各自独立为C_1-4烷基，优选地t-丁基或异丙基；R³，R⁴和R⁵各自独立为C_1-2烷基，X¹is-OR⁶，和R⁶是C_1-2烷基。

在一个优选实施方案中，R¹和R²各自独立为C_1-4烷基，优选地t-丁基或异丙基；R³和R⁴彼此共价连接且各自为一个亚甲基和R⁵是C_1-2烷基；X¹is-OR⁶，R⁶是C_1-2烷基。

在一个实施方案中，催化剂是通式（Ia）、（Ib）、（Ic）或（Id），

其中R¹，R²，R³，R⁴，R⁵和X¹具有与上文限定的相同的含义。

在一个实施方案中，所述通式（I）的催化剂是(2,4-二-叔-丁基-6-(((2-(二甲基氨)乙基)(甲基)氨基)甲基)苯氧基)(乙氧基)锌，也称作“DDTBP-Zn(OEt)”并以通式（III）表示。

（III）

可如Williams等人所述制备(2,4-二-叔-丁基-6-(((2-(二甲基氨)乙基)(甲基)氨基)甲基)苯氧基)(乙氧基)锌（J.AM.CheM.Soc.，2003，125，11350-59），其通过提述并入本文。

通常，丙交酯的聚合化在该类型的催化剂存在下完成，其用量是使丙交酯/催化剂的摩尔比为介于1000/1和10000/1，优选地介于2000/1和8000/1和更优选介于4000/1和6000/1。

本发明的聚合L-或D-构象丙交酯的聚合方法是大批完成的，其通过在存在氩气或氮气的惰性气体氛围中在反应器中使丙交酯与催化剂接触，，所述反应器优选为高粘度或者为在单、双或多螺杆挤出机（或水平反应器）中挤出而配备有搅拌器。然而，也可以在大气环境下进行。

聚合过程通常可在介于160℃和195℃.，优选地介于165℃和190℃的温度完成。

丙交酯聚合成PLA还可在本领域技术人员熟知的稳定剂和/或抗氧化剂存在下完成。常用稳定剂包括（2,4-二叔丁基苯基）季戊四醇亚磷酸盐（(2,4-diterbutylphenyl)pentaerythritol diphosphite），其也称为Ultranox626。聚合可以连续或间歇进行。

优选地，本发明方法中所用的丙交酯是L-丙交酯构象（LL丙交酯）或丙交酯构象D（DD丙交酯），更优选丙交酯构象L。

在本发明的一种具体的实施方案中，该方法还包括使用引发剂。该引发剂可以是丙交酯中所含的残余水、醇或胺。优选地，丙交酯聚合的引发剂是醇或胺。

醇或胺可以是通式R-(A)_p的脂肪族或芳香族，其中p是1或2，A是OH或NH₂，以及R是含有1至20个碳原子的烷基基团或含有6至30个碳原子的芳基（C_6-30芳基）。优选地，R是具有3至12个碳原子的烷基基团或具有6至10个碳原子的芳基。芳基或烷基可以是取代的或未取代的。烷基可以是线性的、环形的、饱和的或不饱和的。胺包括异丙胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、1,4环己二胺。醇包括异丙醇、1-辛醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,7-庚二醇、苯二甲醇（xylene glycol）。

当引发剂为醇或胺时，丙交酯与引发剂的摩尔比可为50/1至1500/1，优选地为100/1和750/1，更优选为300/1和600/1。

如上述，使用无锡催化剂可允许丙交酯在160℃至195℃的温度在聚丙交酯中大量聚合，并且在聚合后直接获得无色聚丙交酯的同时具有高丙交酯转化率、以及高数均分子量和低多分散性，这一现象避免了催化剂在聚合过程中降解。这一结果是非常预料不到的，因为这是成功用于丙交酯溶液聚合的其他种类的基于锌的催化剂所无法获得的已非常成功应用于。

现将通过以下非限制性实施例进一步阐述本发明。

实施例

实施例1：分离三个红色红曲霉菌株LF4、LF5和LF6作为高乳酸耐受菌株

通过在低pH培养基中温育、提高乳酸浓度以及改变葡萄糖浓度和木糖浓度，从土壤和玉米-小麦青贮饲料中分离菌株。

通过40℃在含有50g/l葡萄糖、50g/l木糖和100g/l乳酸的pH2.8DSMZ402培养基中温育，分离出一种菌株（LF4）。

除pH为2.4外，如LF4所述地分离出另一种菌株（LF5）。

通过32℃在含有25g/l木糖和150g/l乳酸的pH2.8DSMZ402培养基中温育，分离出第三种菌株（LF4）。

发现红曲霉目，更具体地红色红曲霉的这3种菌株能够在高乳酸浓度（高达150g/L）的存在下在低pH（2-3）生长。

乳酸耐受菌株LF4、LF5和LF6于2010年7月21日根据布达佩斯条约由荷兰Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek，Bornseweilanden9，6708WG Wageningen的食品和生物研究部（Food&Biobased Research department）保藏在微生物菌种保藏中心(CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures)，保藏号分别为CBS127564，CBS127565和CBS127566。

实施例2：用可选择标志基因稳定转化

I材料和方法

a）转化

大多数用于遗传修饰红色红曲霉的方案都涉及利用电穿孔法或者通过组合氯化钙及聚乙二醇来转化原生质体。然而这些方法常具有低转化效率和低有丝分裂稳定性。报道了在红色红曲霉（Yang2008）中利用根癌土壤杆菌介导的DNA整合的高效转化方法。

我们已将该根癌土壤杆菌介导的转化系统应用于我们的红色红曲霉菌株LF4、LF5和LF6以及所选择的两种CBS菌株CBS135.60和CBS503.70。

de Groot等人，1998所述的含有二元载体pUR5750的土壤杆菌菌株获自PlantResearch International，WUR。它们于30℃生长于用卡那霉素（100μg/ml）补充的基本培养基中48小时。细胞（OD₆₀₀～1.0）用不含乙酰丁香酮（AS） 的诱导培养基洗涤，并于28℃在有和无AS条件下生长6小时。AS用于诱导毒性和T-DNA转移。培养十天后，从PDA平板收集红色红曲霉的分生孢子（10⁷个孢子/ml）。转化分生孢子时，将等体积的分生孢子与等体积根癌土壤杆菌混合，涂布于置于含或不含AS的诱导培养基上的尼龙滤器上。平板于25℃温育4天。之后将滤器转移到含200μg/ml头孢噻肟以杀死土壤杆菌细胞以及含100μg/ml潮霉素以选择转化体的YM-培养基上。

10-14天后，将快速生长的真菌菌落转移到新鲜YM平板+潮霉素和头孢噻肟上。生长五天后，再次将菌落边缘转移到新鲜YM平板+潮霉素和头孢噻肟上。

应用该程序从所选择的各红曲霉菌株得到潮霉素抗性转化体（参见表1）。

表1各红色红曲霉菌株的转化体数

红色红曲霉菌株	转化体数
		LF4	14
LF5	3
		LF6	2
CBS503.70	4

b）转化体的稳定性

我们处理的转化体的第一个特性是遗传稳定性。就此，遗传修饰菌株的以下两个特征是重要的：

（i）靶基因必须整合进基因组中，以及

（ii）即使在无抗生素选择压力下该基因仍必须保持在位并有活性。

首选通过PCR显示载体DNA存在于转化体中。

从7种转化体（5种LF4转化体和2种CBS503.70转化体）和三种野生型菌株（LF4，CBS503.70和CBS135.60）中分离得到DNA，并用能够显示潮霉素基因的引物对其进行PCR。

转化体DNA清楚地产生与来自对照载体DNA相同大小的PCR片段，而野生型菌株并不显示该PCR片段。这显示转化体中存在潮霉素基因。

为了确定载体DNA整合进红色红曲霉转化体基因组DNA，进行了Southern印迹分析。在用限制酶消化之前和之后，对基因组DNA进行印迹。 将该印迹与显示潮霉素基因存在的探针杂交。

在基因组DNA的道中，印迹上的信号与基因组DNA的位置一致，这意味着潮霉素基因整合进基因组中。在消化过的DNA道中，可以在不同位置（=不同DNA片段）看见信号，这意味着潮霉素基因的随机整合。

总之，我们已经确定载体DNA在红色红曲霉菌株中的随机基因组整合。

为了测试无抗生素选择压力下的转化体稳定性，使菌株在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）平板上生长。生长约14天后，将培养物的一部分外侧边缘再次转移到不含潮霉素的新鲜PDA平板上。该过程重复三次。最后将培养物的一部分外侧边缘转移到含潮霉素的新鲜PDA平板上，以观察该菌株在该抗生素存在下是否仍然能够生长。

记下在该步骤后在选择性平板上仍然能够生长的转化体数（表2）。

表2筛选潮霉素抗性稳定性的红色红曲霉转化体.

第二种方法是，在无抗生素选择的三次转移后从平板收集孢子，并比较将其散布于含和不含潮霉素的PDA平板（选择性平板）上后出现的菌落数。孢子经过了玻璃绒过滤以将菌丝体片段污染降至最低。若潮霉素基因丢失或者失活，则选择性平板上的菌落数将减少。

用所有菌株进行的测试均未显示选择性或非选择性平板上的菌落数的减少。

总之，无证据表明红色红曲霉转化体中所导入的基因不稳定或者失活。

作为最终测试，将连续转移到非选择性平板以及随后在无选择压力的培养基上生长后，用27种转基因菌株重复了前述Southern印迹实验。

该Southern印迹证实了在生长于非选择性培养基中后，潮霉素基因存在于红色红曲霉转化体基因组中。

c）转化载体的构建

为了能够对红色红曲霉菌株进行连续转化，例如为了导入多个基因和/ 或将基因导入与基因敲除事件相结合，我们开始构建带有其他可选择标志的转化载体。

描述于前述段落中的已用于转化的载体是pUR5750质粒。附图1显示该质粒的图谱（“RB”=右边界；“LB”=左边界；“Hpt”=潮霉素磷酸转移酶基因）。

转化过程中，RB（右边界）和LB（左边界）间的DNA部分被转移进真菌基因组中。Hpt基因位于该部分。该基因在gpd-启动子和trpC-终止子调控下的活性导致转化体中产生潮霉素抗性。为了便于克隆和该载体中启动子、基因和终止子的交换，我们设计了一个盒模型。如附图2所示，该克隆策略使我们不仅能够交换该载体中的启动子、终止子和基因，还能连续组合两个基因盒。

我们已经使用的赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因是Hpt。Ble是赋予腐草霉素或zeocin抗性的博来霉素基因。NptII是赋予新霉素（G418）抗性的新霉素磷酸转移酶基因。

由于pUR5750转化载体是一个大载体，而且在插入其他基因后会变得更大（参见附图2），我们决定还利用该载体的一个较短版本来转化红色红曲霉。通常认为，较小的载体在构建和转化实验中更易于操作。

该较小的载体是pUR5750的衍生物，其代号为pCB301（Xiang等人，1999）。从该质粒除去植物转化所需的典型DNA元件，pUR5750基本序列的原始功能，余下3574bp载体。附图3显示包含Hpt盒的pCB301，称作pCGHT3（“RB”=右边界；“LB”=左边界；“Hpt”=潮霉素磷酸转移酶基因）。该载体是初始Hpt载体的一半大小。

为了能够利用可选择标志，例如Ble或NptII基因，我们首先验证了红色红曲霉不能在含有最常用于真菌转化系统的zeocin或G418浓度的培养基中生长。来自红色红曲霉菌株LF4和LF6的分生孢子和孢子不能在含有600μg/ml zeocin或200μg/ml G418的PDA平板上生长。

利用两种基本载体和三种可选择标志，制备了六种载体（表3）。

表3构建的载体构建体

基本载体	标志基因	构建体	基本载体	标记基因	构建体
						pUR5750	Hpt	pURGHT2	pCB301	Hpt	pCGHT3
	Ble	pURGBT1		Ble	pCGBT2

NptII

pURNT3

NptII

pCGNT13

d）用六种新构建的载体转化

用上述六种载体转化来自红色红曲霉菌株LF5的分生孢子和子囊孢子混合物。在共培养步骤后，将带有长出的分生孢子和子囊孢子的滤器转移到选择性平板上。

选择性平板包含带有200μM头孢噻肟以杀死土壤杆菌细胞和100μg/ml潮霉素或200μg/ml zeocin或200μg/ml遗传霉素以选择转化体的YM-培养基。

约12天后，在选择性平板上可见首先生长的菌落。

表4显示转化体计数。

表4获自LF5分生孢子的转化体

载体	标志基因	转化体数
			pURGHT2	Hpt	7
pURGBT1	Ble	0*
			pURGNT3	NptII	1
pCGHT3	Hpt	18
			pCGBT2	Ble	0*
pCGNT3	NptII	9

*总体分散生长，未见特定菌落。

将菌落转移到含适宜抗生素的PDA平板上，充分生长后用作在含有抗生素的液体培养基（YPD）中生长的接种体。四天后收集菌丝体，分离DNA。

为了确定选择标志基因整合进红色红曲霉LF5转化体中，对多种转化体进行了两次PCR分析。第一次分析将显示可选择标志存在于分离的DNA中，是用特异于标志基因的引物进行的PCR。第二次PCR分析是用特异于根癌土壤杆菌GPD（甘油醛磷酸脱氢酶）基因的引物来完成的，其排除了可能来源于存活的根癌土壤杆菌细菌的污染载体DNA的存在。

总之，已显示已根据盒策略构建的Hpt和NptII载体对于转化红色红曲霉是有效的。利用基于pCB301的较小载体看来比以pUR5750为基础的载体产生更多的转化体。PCR分析显示，可选择标志基因整合进红色红曲霉基因组中，并显示根癌土壤杆菌细菌已被头孢噻肟有效地杀死。

II用LDH基因转化

a）载体构建

为了向红色红曲霉菌株基因组中导入至少一个拷贝的牛（Bos taurus）LDH基因，最直接的方法是在上述盒中引入密码子优化的牛LDH基因。驱动LDH基因表达的启动子和终止子序列与驱动选择标志基因的那些相同。

为进行密码子优化，我们首先分析了红曲霉的密码子使用。由于仅能获得两种来自红色红曲霉的基因，我们比较了丛毛红曲霉和紫红红曲霉的密码子使用与红色红曲霉基因的密码子使用。这三个物种关系紧密，并且发现了这3个红曲霉物种的密码子偏好之间的大量相似性。

基于密码子使用，我们能够设计出优化的牛LDH基因用于在所选择的红色红曲霉中表达（SEQ ID NO:1和附图4），并且通过Genscript公司合成了这样的基因。在获得该基因后，将其克隆进所构建的两种类型的Hpt载体中并进行测试。根据附图2所示的盒策略完成克隆，该策略的优点是除了启动子-LDH-终止子盒的插入之外初始载体未被改变。由此得到基于pCB301质粒的载体pCGHTGBtLT（附图5）和基于pUR5750质粒的载体pURGHTGBtLT（附图6）。

b）Bt-LDH基因在大肠杆菌中的克隆和表达

为了验证用于转化红色红曲霉的合成LDH基因的正确翻译及活性，将该基因克隆进大肠杆菌表达载体。所使用的表达载体是InVitrogen pBAD102载体，其在阿拉伯糖诱导后表达该蛋白质。

LDH在大肠杆菌中高水平表达，但被发现是部分可溶的。

可溶的大肠杆菌蛋白质用于分析LDH酶活性。

由该btLDH催化的反应为：

(L)-乳酸盐+NAD(+)<=>丙酮酸盐+NADH

在该活性检测中，添加了过量的丙酮酸盐和NADH，从而可以根据NADH向NAD的转化反应出活性，NAD可在340nM处分光光度法测定。

使用获自Sigma-Aldrich的LDH酶作为阳性对照。

通过由于NADH氧化导致的340nM处的吸光度降低来确定反应速度。在规定的条件下，一个单位引起25℃及pH7.3下每分钟一微摩尔NADH的氧化。

制备0.2M Tris·HCl缓冲液。LDH酶在使用前在Tris缓冲液中稀释并冷藏保存以获得0.02-0.04ΔA/min的速率。

制备2.8mL Tris·HCl，0.2M pH7.3和0.1mL6.6mM NADH的反应混合物。

测定添加和未添加底物的LDH活性，以监控本底NADH转化。

合成LDH在大肠杆菌中的表达和活性分析显示，该合成基因编码具有正确Mw且有活性的蛋白质。这些大肠杆菌菌株随时间的葡萄糖和乳糖生产示于附图7（“大肠杆菌-LDH1、2和3”对应于含有所表达的合成LDH蛋白质的三份独立大肠杆菌提取物；“大肠杆菌-对照”是表达不同蛋白质的大肠杆菌提取物）。

c）用LDH载体转化红色红曲霉。

用LDH载体pCGHTGBtLT和pURGHTGBtLT转化来自红色红曲霉菌株LF4、LF5或LF6的分生孢子和子囊孢子混合物。因此总计完成了六次转化。在如前述实施转化程序并在含潮霉素的平板上进行选择之后，仅获得三种LF5转化体。

一种转化体获自使用pCGHTGBtLT载体（LF5-t1），两种获自pURGHTGBtLT载体（LF5-t2，LF5-t5）。

d）对红色红曲霉LF5-T1和LF5-T2-LDH转化体的分析

在第一个实验中，分析了两种转化体LF5-T1和LF5-T2。

用pCGHTGBtLT转化LF5-T1，和用pURGHTGBtLT转化LF5-T2。

为了分析LDH酶活性以及可能的L-乳酸盐生产，将两种转化体和wt-LF5菌株在S.c.培养基+50g/L葡萄糖pH6.0上生长。

培养24、48和72小时后，从各培养物取培养基和生物质样品。

（i）葡萄糖消耗和乳酸盐生产

附图8a和8b清楚地显示在所有培养中的葡萄糖消耗，同时在来自LF5-T2的培养基中检测到乳酸浓度随时间提高（数字24、48和72表示生长24、48和72小时后来自两种分别的培养物的样品；“M”表示培养基）。LF5-T2消耗约8g/L葡萄糖并产生约1.5至2g/L乳酸，这表示达到了0.18至0.25g/g的产率。最大理论产率为1.00g/g。

（ii）酶分析

由于HPLC分析不能区分L-和D-乳酸，因此用酶法分析了多份样品。L-乳酸分析试剂盒（Megazyme）证实LF5-T2样品中存在L-乳酸（附图9）。

所收获的生物质样品在液氮中冷冻，并用研钵和杵研磨。冷冻粉末在缓 冲液（0.2M Tris·HCl，pH7.3）中解冻，涡旋提取蛋白质。上清液离心后并如前面段落所述进行蛋白质分析和LDH-酶活性分析。

该分析清楚地显示LF5-T2转化体中存在L-LDH活性，而在对照中未发现活性（附图9）。

(iii)Southern印迹分析

用LDH基因完成杂交。Southern印迹分析证实在非选择性培养基上生长后红色红曲霉转化体t2基因组中有一个LDH基因整合。

发现转化体t1不含LDH基因。用潮霉素基因进行的第二次Southern分析显示，两种转化体中均有潮霉素基因的整合。这表明，在转化体t1中，两个边界间的基因盒、LDH和潮霉素不是完整整合的。

（iv）结论

用所构建的转化载体结合可选择标志和合成的LDH基因，获得了27种红色红曲霉转化体。一种转化体，LF5-T2，在葡萄糖培养基上生长时显示乳酸生产。

乳酸生产、L-LDH活性和Southern印迹支持这一结论：我们已经将一个L-LDH编码异源基因以其可被表达和具有代谢活性的方式插入到该红色红曲霉LF5-T2转化体的基因组中。

e）对红色红曲霉LF4-、LF5-和LF6-LDH转化体的分析

在下一个实验中，总共分析了35种转化体，也即，4种LF4，16种LF5和15种LF6。菌株在10ml YEPD培养基中预培养三天。生物质在pH2.8的含10g/L葡萄糖的Sc培养基中洗涤，并在15ml相同组成的Sc培养基中培养。菌株的葡萄糖消耗示于附图10。这些转化体中有十九种（54%），也即，两种来自LF4、十二种来自LF5和五种来自LF6，从葡萄糖生产乳酸（附图10）。在阳性实验中，发现了不同量的乳酸，范围为0.5至3.3g/L，对应于5-33%的最大理论产率（附图11）。形成乙醇作为副产物，其浓度与乳酸浓度负相关（附图12）。

从各菌株选择两种转化体（4t3、4t4、5t2、5t21、6t4、6t5），一种具有最高的乳酸生产，另一种的乙醇生产最低。随后在摇瓶（在葡萄糖或木糖（均为10g/L）上）中培养菌株，在两种不同的通风条件下：有氧的，和严格限制氧的。

在有氧条件下，菌株在100ml摇瓶中10ml YEPD上预培养三天。然后用25ml pH2.8的Sc培养基洗涤培养物两次。用三角形的磁力搅拌棒将生物质在10ml相同培养基中均质化。750微升用于接种15ml Sc培养基，pH2.8，其中含有10g/L葡萄糖和木糖（附图13-15）。

或者，在严格限制氧条件下，在瓶子里进行培养，瓶口用安有铝帽的丁基橡胶塞封闭，瓶塞上装有自行车管阀，从而形成严格的氧气限制，几乎是无氧条件。在100ml摇瓶中10ml YEPD上预培养三天。然后用25ml S.c培养基pH2.8洗涤培养物两次。用三角形磁力搅拌棒将生物质在10ml相同培养基均质化。750微升用于接种15ml Sc培养基，pH2.8，其中含有10g/L葡萄糖和木糖。

在有氧培养中（附图13-15左栏），从葡萄糖生产了一些乳酸（约0.5-1g/L）。葡萄糖完全被消耗后乳酸被消耗。没有乙醇形成。在严格氧气限制条件下（附图13-15右栏），乳酸浓度为2.0至3.3g/L，乙醇产生浓度为0.5至1.0g/L。

实施例3：通过消除乙醇生产来进一步提高乳酸产率

a）利用序列同源性鉴定丙酮酸脱羧酶基因

为了进一步提高乳酸产率，涵盖了基因敲除系统以一方面减少非乳酸产物的生产另一方面减少红曲霉对乳酸的代谢。更特别的是，为了避免产生乙醇，涵盖了基因敲除系统，其基于编码丙酮酸脱羧酶（EC4.1.1.1）的酿酒酵母PDC1基因的红色红曲霉同源物的编码基因。

红色红曲霉在氧气限制条件下产生乙醇。由于乙醇和乳酸都从丙酮酸盐产生，因此应当阻止乙醇的产生，因为它会降低乳酸产率。

以酿酒酵母PDC1基因作为查询进行BLAST，我们在黑曲霉基因组中发现了可能代表PDC编码基因的数种同源物。使用黑曲霉是因为它与红曲霉的关系近。基于这些序列我们设计了简并PCR引物以能够克隆部分红色红曲霉PDC。

对来自红色红曲霉菌株LF6的RNA进行的RT-PCR结果产生两个1.3kB的DNA片段，将其克隆进质粒。对这些克隆的PCR片段的测序证实了存在两种与黑曲霉PDC同源物具有高度同源性、与酿酒酵母PDC1基因间存在足够同源性的开放阅读框，从而得出结论认为，我们已经克隆了两种红色红曲霉 PDC1类似物。

红色红曲霉PDC基因PDC1和PDC2的开放阅读框示于SEQ ID NO:3和4（以及附图16和17）。

b）基因敲除载体的构建

i）PDC基因的敲除

利用PCR，分离得到PDC1和PDC2基因的5’和3’半部，并在末端添加了限制性位点。然后将5’半部克隆至载体pCGNT1和PCGBT2的启动子-标志-终止子-盒的5’端（以及右边界序列的3’端）。除了使用NPTII和BLE基因而非HPT基因作为选择标志之外，这些载体与之前描述的载体pCGHT3相同。同样，相应的3’半部被克隆至启动子-标志-终止子-盒的3’（以及右边界序列的5’）。以这种方式，产生了三种载体：

1.pPDC1::NPT用于利用遗传霉素选择来破坏PDC1（附图18）

2.pPDC2::NPT用于利用遗传霉素选择来破坏PDC2（附图19）

3.pPDC2::BLE用于利用zeocin选择来破坏PDC2（附图20）

这些载体用在之前构建的PDC1::NPT破坏体中。

ii）组合的敲除和基因插入

构建载体使得能够同时破坏靶基因和导入另一个基因。由于在载体中存在长段DNA，为了在第二轮转化中使由于载体中存在长DNA区段而导致的不想要的重组的发生最小化，以及为了提高载体构建过程中的克隆效率，减小了新载体中启动子和终止子序列的大小。利用PCR，将GPD启动子的大小从2208bp减至538bp，以及TrpC终止子被从763bp减至278bP。这些是载体pCH#PDC1和载体pCL1H#PDC1（参见附图21和22）。pCH#PDC1载体用于通过潮霉素选择来破坏PDC1。pCL1H#PDC1载体用于通过潮霉素选择来破坏PDC1和导入LDH。从这些载体获得的转化体分别有被破坏的PDC1基因以及被破坏的PDC1基因和插入的LDH基因。构建载体pCN#PDC2是为利用遗传霉素选择来破坏PDC2基因（附图23）。

c）产生敲除转化体

i）PDC基因的敲除

从LF6LDH转化体t4和t5获得的孢子与敲除载体pPDC1::NPT或pPDC2::NPT用于转化实验。在用G418（遗传霉素）选择后，各菌株和载体的组合得到了50-80个遗传霉素抗性菌落。借助PCR用基因特异性引物测试了 40个转化体（20个LF6t4+pPDC2::NPT转化体和20个LF6t5+pPDC2::NPT转化体）DNA中NPTII基因的存在以及PDC2基因的破坏。用敲除载体观察到了PDC2基因的破坏。

ii）组合的敲除和基因插入

根据我们的标准程序，载体pCH#PDC1和PCL1H#PDC1用于转化40℃从野生型菌株LF6收集的孢子。在含有潮霉素的选择性平板上生长十天后，观察到生长的菌落，将其中的20个转移到新的含潮霉素平板上，并用PCR测试PDC1基因敲除。

PCR分析显示，来自pCH#PDC1的20个转化体中有一个，以及来自pCL1#PDC1的20个转化体中有三个，其中的PDC1基因已被破坏（表6）。

表5每种构建体的转化体数

构建体	菌落总数	转移的菌落数	PDC1敲除
				pCH#PDC1	53	20	1
pCL1H#PDC1	97	20	3

载体pCN#PDC2用于转化来自第一轮转化得到的PDC1敲除菌株的孢子。在含有遗传霉素的选择性平板上生长十天后，观察到了数个生长菌落，将其中的40个转移到新的含遗传霉素的平板上，并用PCR测试PDC2基因敲除。

菌株LF6KL19被证实为PDC1和PDC2的双敲除且含有重组的LDH基因。

d）转化体的分析

在2L的锥形瓶中，菌株LF6KL19预培养于含50g/l葡萄糖和1g/l Junlon的300mlpH2.8的Sc培养基中。初始孢子浓度为1x10⁵个孢子/mL。温育温度为30或35℃，搅拌速度设为75rpM。在30℃消耗了16.1g/l葡萄糖，产生了14.4g/l乳酸，在35℃消耗了18.8g/l葡萄糖，产生了18.6g/l乳酸，这表明实际产率介于0.9和1.0g/g之间。在这些条件下还获得了最高生产力：0.15g/l/h。

e）基因组和转录组分析

对在不同底物上生长的红色红曲霉LF6的基因组和红色红曲霉LF6及红色红曲霉LF6KL19（双PDC敲除，引入了牛LDH拷贝）的转录组进行测序，并通过自动注解程序鉴定了基因组上参与乙醇生产的相关基因。RNA序列信息用于改良这些基因的结构。在基因组上鉴定了许多参与乙醇形成的推定基因：丙酮酸脱羧酶（PDC）有7个和醇脱氢酶有12个。3个推定的PDC基因在 基因组中彼此相连，对RNA序列信息的分析显示，这三个推定的PDC基因属于一个基因。PDC2产物（SEQ ID NO:2）与该基因的翻译序列部分相同。

PDC1产物与Mona10180的推定PDC基因产物部分相同。编码PDC1和PDC2的两种基因在所有环境下都高表达。此外，还有另一个PDC基因（Mona07809或PDC4，SEQ ID NO：5，附图24）在所有环境下都被转录，且可以从红色红曲霉被除去以降低乙醇的产生。

实施例4：通过消减内源乳酸代谢来进一步改进乳酸产率

a）红色红曲霉中的Cyt-LDH活性分析

从文献已知在真菌和酵母中乳酸通过（细胞色素）L-乳酸脱氢酶代谢。因此我们首先分析了在乳酸上生长的红色红曲霉的该酶活性。

红色红曲霉菌株生长于补充有5%葡萄糖或2%乳酸作为碳源的2%酵母提取物、1%蛋白胨培养基上。作为对照，酿酒酵母在相同条件下生长（Lodi和Guiard，1991）。生长24小时后收集生物质。所收集的生物质样品在液氮中冷冻，并用研钵和杵研磨。冷冻粉末在缓冲液（0.067M磷酸钠，pH7.4，0.001M EDTA）中解冻，并涡旋提取蛋白质。离心后上清液进行蛋白质分析和cyt-LDH-酶活性分析。分光光谱测定420nM处的铁氰化钾的减少速率。检测之前将酶溶解于含0.001M EDTA的0.067M磷酸盐缓冲液pH7.4中，以获得0.02-0.04ΔA/分钟的速率。

制备2.0ml0.1M焦磷酸钠、0.5ml0.5M DL乳酸钠、0.3ml0.01M EDTA和0.1ml铁氰化钾的混合物，并将其移液至微滴定板。加入10-20μl适当稀释的样品，并记录ΔA420/min。

附图25显示蛋白质样品中的cyt-LDH活性。“Gluc”意指在含有葡萄糖作为碳源的培养基上生长，“Lact”意指在含有L-乳酸作为碳源的培养基上生长。Cyt-LDH活性存在于所有被测试的红色红曲霉菌株中，并且通过以L-乳酸作为碳源生长被诱导。

b）分离基于序列同源性的CYB2基因的红色红曲霉同源物

以酿酒酵母CYB2基因作为查询进行BLAST，我们在黑曲霉基因组中发现了数种可以代表cyt-LDH编码基因的同源物。使用黑曲霉是因为其与红曲霉很近的关系。基于这些序列，我们设计了简并PCR引物以能够克隆部分红色红曲霉cyt-LDH。

对来自红色红曲霉菌株LF6的基因组DNA作PCR，产生1kB DNA片段，其被克隆进质粒。对该克隆的PCR片段进行测序，证实了存在与黑曲霉CYB2同源物具有高同源性以及与酿酒酵母CYB2基因足够同源性的开放阅读框，使得能够推论，我们已经克隆了红色红曲霉的CYB2类似物。红色红曲霉CYB2基因的开放阅读框示于SEQ ID NO:2和附图26；小写字母表示基因组序列中的推定内含子。

c）乳酸代谢的基因组和转录组分析

对在不同底物上生长的红色红曲霉LF6的基因组和红色红曲霉LF6及红色红曲霉KL19（双PDC敲除，引入了牛LDH拷贝）的转录组进行测序，并通过自动注解程序鉴定了基因组上参与乳酸代谢的相关基因。RNA序列数据用于改良这些基因的结构。为两种乳酸异构体都预测了数种编码乳酸脱氢酶的基因。对于L-乳酸，预测了4种细胞色素依赖性LDH，也即，Mona02475（部分对应于SEQ ID NO:2）、Mona00569、Mona05565和Mona06119。由于发现Mona00569是活性最高且在乳酸存在下高度上调，因而这是最明显的用于消除的候选物。该基因的序列示于SEQ ID No：6（附图27）。

还发现红色红曲霉含有利用D-乳酸作为底物的细胞色素依赖LDH的数个推定基因。又有一个基因（Mona05697）是最活跃的基因。由于Mona05697的表达仅导致乳酸非目的D-异构体的消耗，可以期望但可能无需删除该基因。

实施例5：红色红曲霉产乳酸菌株在发酵器中的生长

发酵在载有11.3升总工作体积的20升生物反应器中进行。所使用的菌株是红色红曲霉野生型LF6的LDH转化体，其中敲除了PDC1。加入10升S.C.培养基，其组成示于表6。用1.3升经两次预培养步骤的接种物接种。第一次预培养在四个各含25ml YPD培养基（组成参见表6）的100ml摇瓶中完成。各瓶用0.12ml KL78孢子溶液接种。孢子溶液含2.11x10⁷sp/ml（66%子囊孢子，34%分生孢子）和2.97x10⁵个闭囊壳（cleistothesia）/mL。这些在30℃以150rpm培养24小时。第二次预培养在四个各含300ml YPD培养基的2L带挡板的摇瓶中完成，用25ml第一次预培养物接种。各摇瓶的总体积为325mL。这些在30℃以75rpm生长52小时。用4x325ml预培养物接种生物反应器。

生物反应器维持在30℃。初始pH为3.96，之后降至2.8，并通过加入4M KOH维持恒定在2.8。初始搅拌速度为250rpm，并在发酵过程中人工提高至450rpM。通风速度为3.0l/分钟。反应器中的超压为0.2巴。

表6：培养基组成

发酵在有氧条件下起始以生产生物质。在发酵过程中加入葡萄糖。发酵进行137小时。从反应器中取出约10L发酵液。发酵液用厨房筛预过滤以除去生物质，之后通过更细的滤器进行过滤步骤。滤液用γ照射处理灭菌。γ照射处理后对滤液进行分析显示：葡萄糖（15.5g/l）、乳酸（3.4g/l）、乙醇（23.6g/l）、甘油（0.8g/l）。

实施例6：将水性溶液中的乳酸萃取进含三辛酰胺、辛醇和煤油的萃取溶剂

含48wt%三辛酰胺（Henkel's Alamine336）、30wt%辛醇和22wt%煤油的萃取溶剂通过将这些组分以所需比率混合制得。起始水性溶液通过将乳酸钠溶液与乳酸混合使其各自终浓度分别为2.9和1.5mol/kg（乳酸比乳酸钠的摩尔比为1:1.9）制得。室温下连续三次与有机相部分平衡。各平衡的比率为水性比有机wt2:1。然后分离相并分析其乳酸含量。结果显示水性相中83%的乳酸被提取。

实施例7：将水性溶液中的乳酸萃取进含三辛酰胺、辛醇和煤油的备选萃取溶剂

含48wt%三辛酰胺（Henkel's Alamine336）、20wt%辛醇和32wt%煤油的萃取溶剂通过将这些组分以所需比率混合制得。起始水性溶液通过将乳酸钠溶液与乳酸混合使其各自终浓度分别为0.32和0.71mol/kg制得。室温下将水性溶液与有机相部分平衡。然后分离相并分析其乳酸含量。所得水性溶液用另一有机相部分平衡、分离并分析。这些操作重复数次。这些连续接触的水相和有机相中的平衡乳酸浓度（mol/kg）分别为：1）0.37和1.16；2）0.14和0.33；以及3）0.009和0.1。

实施例8：将水性溶液中的乳酸萃取进含己醇的萃取溶剂中

于80℃用己醇逆流萃取含4mol/kg乳酸的水性进料液。水相与有机相的比率为1:2.3w/w，阶段数为6。萃取物和萃余液中的乳酸浓度分别为1.8mol/kg和0.2mol/kg。于30℃用水逆流反向萃取萃取物。水性与有机相的比率为1:1.5w/w阶段数为7。再生萃取物中的乳酸浓度低于0.1mol/kg，以及所得水性产物溶液中的乳酸浓度为约2.7mol/kg。本实施例显示用醇溶剂从水性溶液中回收乳酸。

实施例9：将水性溶液中的乳酸萃取进含己醇的萃取溶剂中

于25℃用磷酸三丁酯（TBP）逆流萃取含4.5mol/kg乳酸的水性进料液。水相与有机相的比率为1:2.3w/w，阶段数为6。萃取物和萃余液中的乳酸浓度分别为2.0mol/kg和0.2mol/kg。于85℃用水逆流反向萃取萃取物。水相与有机相的比率为1:1.57w/w，阶段数为8。再生萃取物中的乳酸浓度为约0.03 mol/kg，以及所得水性产物溶液中的乳酸浓度为约3.5mol/kg。本实施例显示用氧化含磷化物从水性溶液中回收乳酸。

实施例10：将粗原料中的乳酸萃取进含n-丙醇的萃取溶剂

在室温将100g含11%乳酸的液体粗生物质原料与45g n-丙醇（nPrOH）混合，由此CSL借助该烷醇变为饱和，正如分离出小有机相所证明的；经处理的原料变得相当可流动，用25g nPrOH在四个阶段对其反向萃取。萃取物干燥后剩余15.3g。其中9.5g经分析为乳酸。

实施例11：将粗原料中的乳酸萃取进含secBuOH的萃取溶剂

将15g secBuOH和含11%乳酸的100g液体粗生物质原料混合，并加热至约100℃以确保烷醇的完全分解。离心收集所分离出的固体。将澄清的液体冷却至室温，由此从中分离出19g烷醇相，其中含6.1g乳酸浓度为87%的固体。

实施例12：将粗原料中的乳酸萃取进含nPrOH和三月桂胺的萃取溶剂

在五个阶段中将100g含11%乳酸的液体粗生物质材料与由110g nPrOH和33g三月桂胺构成的萃取溶剂逆流接触。所提取的水相含低于1%的乳酸以及仅痕量的植酸。在有机相中，以不含溶剂计，植酸为25%及乳酸为68.5%。

实施例13：将乳酸萃取进萃取溶剂，低级芳香族煤油（Isopar K）中的三月桂胺（Alamine304，Henkel）中

制备含低级芳香族煤油（Isopar K，Exxon）中的54%trilauryl amine（Alamine304，Henkel）的萃取溶剂。于50℃用20.00克0.75mol/kg乳酸水性溶液平衡3.00克萃取溶液。静置相，并测定两相中的乳酸浓度。结果显示乳酸分配系数为0.28。

实施例14：将乳酸萃取进含Alamine304和Isopar K和增强剂的萃取溶剂中

将3.051克如上述实施例13制备的萃取溶剂与0.112克含2.95mol/kg H₂SO₄的水性溶液接触。与萃取溶剂接触后，水相中的H₂SO₄浓度低于可检测水平。然后于50℃用20.00克0.75mol/kg乳酸水性溶液平衡载有H₂SO₄的萃取溶剂，并静置相。经0.1N NaOH滴定测定水相和有机相中的总质子浓度。通 过HPLC（OAKC柱）测定乳酸浓度。结果显示，乳酸分配系数为0.55，有机相中的H₂SO₄浓度为约0.1mol/kg，以及水相中的H₂SO₄浓度低于可检测水平。

实施例15：将乳酸萃取进含Alamine304和Isopar K和增强剂的萃取溶剂中

重复以上实施例13中所述程序，其中萃取溶剂的量和乳酸溶液的量分别为3.01克和20.02克。H₂SO₄溶液的量提高至0.311克。结果显示，乳酸分配系数为0.70，有机相中的H₂SO₄浓度为约0.3mol/kg。水相中的H₂SO₄浓度仍低于可检测水平。

实施例16：将乳酸萃取进含Alamine304和Isopar K和增强剂的萃取溶剂中

重复以上实施例13中所述程序，其中萃取溶剂的量和乳酸溶液的量分别为3.02克和20.01克。H₂SO₄溶液的量提高至0.514克。结果显示，乳酸分配系数为0.68，有机相中的H₂SO₄浓度为约0.5mol/kg。水相中的H₂SO₄浓度仍低于可检测水平。

实施例17：以DMSO为反萃取溶剂反萃取，和转化为丙交酯

将200ml二甲基亚砜（DMSO）和200ml之前用制得的Alamine336与18.4wt%乳酸的乳酸溶液加入带有搅拌杆、温度控制、冷凝器和加热罩的500ml圆底的3颈瓶。搅拌混合物，加热至140℃并于140℃维持15分钟。分离迅速稳定的两相，冷却至室温。底部DMSO相的样品滴定显示11.3wt%乳酸和0.58wt%。

气相色谱分析Alamine336。将40ml购自Exxon的IsoPar K加入分离斗中的DMSO相。室温下震荡该漏斗，从而允许相稳定和分离。底部DMSO相样品经Karl Fischer滴定显示11.4wt%乳酸、2.7wt%水，以及0.05wt%Alamine336。

之后将230.0g该DMSO和乳酸溶液置于带有搅拌杆、真空、冷凝器、热电偶和加热罩的500ml圆底的4颈瓶中。于大气压加热材料至180℃，收集42.0g顶部馏出物。冷却材料。底部相中的酸浓度经测定为12.4wt%，假设没有乳酸被蒸发，酸度损失表示发生了一些缩合。然后在60分钟将材料从室温加热至117℃，压强为60mm Hg。另从顶部馏出34.7g材料。此即完成乳酸寡 聚物形成步骤。

留下146.7g DMSO和乳酸寡聚物溶液用于丙交酯形成部分。加入1.53gFASCAT9102，一种丁基锡三(2-乙基己酸盐)催化剂。增加干冰冷疏水器（trap）和氮气吹扫，将冷凝器更换为110℃的乙二醇介质。在80分钟将混合物从室温加热至145℃，压强10mmHg。瓶底仅保留7.8g材料。接收器中含116.2g材料。DMSO的沸点与丙交酯的沸点足够接近，由此可以预期大量的DMSO将被蒸馏。气相色谱分析证明顶部馏出物中有丙交酯存在。

实施例18：反萃取进各种不同的溶剂

通过将Alamine336与不同量和浓度的水性乳酸溶液接触制备两种乳酸与Alamine336的溶液。得到含4.35wt%和18.85wt%乳酸的Alamine336混合物。将2mlAlamine336和乳酸溶液分别与以下反萃取溶剂接触：二甲基亚砜（DMSO）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；1,4-二氧六环；N-甲基吡咯烷酮（NMP）；和1,3-二氧戊环（dioxalane）。将样品在油浴中保持在特定温度约45至60分钟并定期搅拌。1,4-二氧己烷和1,3-二氧戊环样品在20℃至约80℃的温度形成一个单液相。将类似程序应用于Alamine336和乳酸溶液与丙交酯和四亚甲基砜（TMSF）接触。在特定温度下静置相，然后通过将底部相用导管输出来快速分离相。采样以用于氢氧化钠溶液滴定并以酚酞作为指示剂以确定乳酸浓度，并进行气相色谱分析以确定Alamine336浓度。在所有情况中，Alamine336相都是密度最低相或者顶部相。

表7报告了顶部相和底部相中的乳酸和Alamine336浓度。用Alamine336顶部相中的乳酸浓度除以底部极性液相中的乳酸浓度计算得到分配系数。结果显示，在这些条件下大量乳酸分配进极性液相。对于一些溶剂，有大量Alamine336共萃取进了极性液相中。二甲基亚砜因其对乳酸比对Alamine336的良好的选择性而像是一种有利于本类方法的溶剂。本实施例表明，乳酸可有效地从初始萃取溶剂中被反萃取进极性液体中。本实施例支持利用乳酸反萃取进第二极性液中的方法的可行性。

表7.

n.d.未测。

实施例19：反萃取进三乙胺

将Alamine336和水性乳酸溶液接触得到Alamine336相中的26.74wt%乳酸。在125ml分离斗中，将载有十克乳酸的Alamine336相与5克三乙胺（反萃取溶剂）接触。在24℃摇瓶一分钟，静置相。顶部相含Alamine336的量高于三乙胺，且实质上不含乳酸，而底部相含43wt%乳酸和三乙胺。用氢氧化钠滴定测定酸浓度。按比例提高反萃取规模以允许进行蒸馏实验。

将30克三乙胺混合物中的43wt%乳酸加入到配有干冰疏水器、压力计、冷凝器、热电偶和加热罩的500ml圆底的3颈瓶中。三乙胺最初在23℃和10mm Mg蒸发。将温度提高至120℃，并将混合物维持在该温度90分钟。蒸发 出约69%的三乙胺。加热后乳酸的手性纯度没有显著改变。

在溶剂存在下，可以显著提高三乙胺的去除。三乙胺和N-甲基-2-吡咯烷酮中的21.5wt%乳酸溶液于55℃和10mm Hg压力加热两小时，从该溶液中蒸发出48%三乙胺。所余混合物加热至110℃，并在该温度维持80分钟。至此，96%三乙胺被蒸发。材料的手性纯度未发生显著变化。本实施例显示从萃取溶剂中反萃取乳酸，以及之后蒸发反萃取溶剂从而得到浓缩的乳酸产物的能力。

实施例20：以Alamine336作萃取溶剂将乳酸转化为丙交酯

在室温将600ml碱洗的Alamine336、800ml15wt%水性乳酸溶液和100ml50wt%水性乳酸溶液添加到分离斗中并混合。相静置过夜。分离相，离心顶部有机相以除去携出（entrained）的水相。用氢氧化钠溶液滴定测定有机相中的乳酸浓度为19.75wt%，并以酚酞作指示剂。将304.6克Alamine336和乳酸溶液加入到配有搅拌棒、热电偶、冷凝器、加热罩和氮气吹扫的圆底4颈瓶中。在45分钟内在大气压加热溶液至200℃。之后使其冷却至约64℃。之后在30分钟内在60mm Hg压力加热至200℃。于70mm Hg压力下保持该瓶于200℃45分钟。冷却瓶，冷却后瓶底分为两相。气相色谱分析测定顶部相基本上全为Alamine336。底部相粘稠，由乳酸寡聚物和小量Alamine336组成。

将185.9克Alamine336和乳酸寡聚物溶液（约54.8wt%寡聚物，平均M.W.为476）加入到配有搅拌棒、高真空系统、氮气吹扫、冷凝器、热电偶和加热罩的500ml圆底4颈瓶中。于125℃，将来自Atochem的900μl FASCAT9102，一种丁基锡三(2-乙基己酸盐)催化剂加入到该溶液中。在4小时内将溶液加热至200℃，混合物维持在200℃60分钟。整个加热过程中，将压力维持恒定在约1mm Hg。冷凝器介质温度维持在110℃。顶部馏出材料在冷却过程中结晶。加热后经气相色谱分析确定瓶底实质全为Alamine336。伴随几乎全部寡聚物被转化为丙交酯并从顶部馏出，139g材料从顶部馏出。由于高温和低压，顶部也可馏出一些Alamine336；这可通过气相色谱分析证实。所得丙交酯的手性纯度低于80%。通过采用低温，以及采用配有高表面区域从而利于丙交酯向反应器外运送的丙交酯反应器，可以提高手性纯度。

实施例21：将水性溶剂中的乳酸转化为丙交酯

为三颈的1升圆底瓶配备机械搅拌器、氮气喷射，以及，对冷凝器的直馏分接（straight distillation take-off），以及真空分接（vacuum take-off）的接口输出口和压力剂。向瓶中装入650ml（770.4g）88%L-乳酸进料，于120℃-130℃加热并搅拌和氮气鼓泡。于150-200托用吸水器蒸馏出水分。加热过程中取等分试样，并滴定确定其DP（聚合化程度）特征。然后，在用重氮甲烷甲基化后，通过气相色谱（GC）表征确定等分试样。结果表明，DP为约2时存在丙交酯峰。

实施例22：将水性溶剂中的乳酸转化为丙交酯

实验用蒸汽反应器中供给含10-20孔硅土筛/氧化铝催化剂（Akzo-L1A-30-5P催化剂，87%硅土/13%氧化铝，Akzo Chemicals B.V.）的催化剂。调整氮气流速为1600ml/min，并将其与乳酸进料以表面蒸汽速度0.12ft/秒通过反应器。内容物的时空时间（space time）为2.8秒。乳酸进料含有商业“85%乳酸”（61%L-乳酸，20%L-L，lactoylactic acid，4%L,L,L-lactollactoyllactic，和15%水），其在运行之前已稀释于另外的11%重量水中。所记录的结果示于表8：

表8：结果

催化剂床层温度℃	乳酸进料(g)	全部产物(g)	LD产物(g)	LD产率
					206	128.6	115.8	22.73	25.7

实施例23：将丙交酯转化为PLA

在实施例和比较实施例中，在35℃通过氯仿中的大小排阻层析测定PLA的数均分子量（Mn），起始时以已知平均分子质量数值为600至1700000道尔顿的八个聚苯乙烯校准。大小排阻层析采用Agilent Technologies1200Series装置。以0.1%（w/v）溶解于氯仿中的样品以1ml/min通过一个PL凝胶保护柱（10μm）和两个PL凝胶梯度坡柱（5μm）混合洗提。注入量为100μL.

实施例和比较实施例中，聚合后和PLA的任何重结晶前（总PLA）直接确定PLA的颜色。

1.合成(2,4-二-叔丁基-6-(((2–二甲基氨)乙基)(甲基)氨基)甲基)苯氧基)(乙氧基)锌，下文称作DDTBP-Zn（OEt）。

根据Williams等人在J.Am CheM.Soc.,2003，125，11350-11359中描述的程序完成合成。

2.实验1和2

在下式表示的催化剂DDTBP-Zn（OEt）存在下，在惰性环境下大量聚合L-丙交酯：

在存在作为引发剂的1-辛醇、容积为50ml的反应器中、在惰性气体环境下，用5gL-丙交酯、如表9所述催化剂和引发剂的量进行聚合。对于各次反应，使用1ml溶于甲苯的催化剂溶液。用前述从氯仿和乙醇混合物中重结晶并真空干燥得到的聚合物聚合30分钟后测定L-丙交酯向聚丙交酯的转化。

4.实验3-6

在不同于本发明方法中提到的那些催化剂的存在下，在惰性气体环境下大量聚合L-丙交酯。在容量为50ml的玻璃反应器中，用5g L-丙交酯、催化剂和1-辛醇（引发剂）在惰性气体环境下发生聚合，催化剂和引发剂的用量示于表9。对于各次反应，使用1ml甲苯中的催化剂溶液。以如上述实验1和2所述的相同方式测定L-丙交酯在聚丙交酯中的转化程度。

所测试的催化剂为

-双[双（三甲基硅基）酰胺]锌，以下称作Zn[N(SiMe3)2]2,

-二乙基锌，以下称作DEZ

-三氟甲烷磺酸锌，以下称作Zn(OTf)2。

结果示于下表9。至于实验7（阴性对照），在三氟甲磺酸锌存在下无聚合反应发生。

表9

关键词：“TP”–聚合温度（℃）；“L/O”–丙交酯/辛醇（mol/mol）；“L/C”–丙交酯/催化剂（mol/mol）；“Conv”–丙交酯向聚丙交酯的转化（%）；颜色-聚丙交酯的颜色（总PLA）；“PD”–多分散性（Mw/Mn）；“-”未提供（non applicable）。

显然对于本领域技术人员而言，本发明并不限于前述例示性实施例的具体内容，且本发明可以其他具体形式具化化而并不背离本发明的主要属性，并因此而期望，参照所附权利要求书，而非前述说明书，本发明的实施方案和实施例在所有方面均被视为示例性的而非限制性的，并且落入权利要求书等同物含义及范围内的所有变化由此而被确定为包含在本文内。

PCT

只用于受理局

只用于国际局

Claims (21)

1.用于生产聚乳酸(PLA)的方法，包括步骤：

-在发酵容器中pH低于或等于5的发酵培养基中、以及向培养基中生产乳酸的条件下发酵重组红色红曲霉种微生物，所述微生物已通过外源乳酸脱氢酶(LDH)基因的导入和内源丙酮酸脱羧酶(PDC)基因PDC1和PDC2的缺失或失活而遗传修饰以产生提高的乳酸水平，且其能够在低于5的pH下在包含至少50g/L乳酸的培养基中生长，

-将所述生产的乳酸转化为丙交酯(lactide)，和

-将所述丙交酯聚合形成PLA，

其中所述PDC1基因是核酸序列SEQ ID NO:3，并且其中所述PDC2基因是核酸序列SEQID NO:4。

2.根据权利要求1的方法，其中所述乳酸在转化为丙交酯之前从所述发酵培养基中回收，所述回收包括步骤：

(A)通过使所述培养基与萃取溶剂接触从已清除碎片的所述培养基中萃取游离的乳酸，从而形成：

(i)含乳酸的萃取物和

(ii)去乳酸的水性溶液；和

(B)将所述水性溶液(ii)与所述含乳酸的萃取物(i)分离，

由此获得回收的乳酸。

3.根据权利要求2的方法，其中的萃取溶剂包含1-丁醇、2-乙基己醇、1-辛醇、甲基异丁酮、环己酮、二异丁基酮、异丙醚、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乳酸乙酯、乳酸丁酯、乳酸辛酯、N,N-二丁基乳酰胺、己酸、烃基叔胺三辛酰胺、Henkel's Alamine 336中的一或多种。

4.根据权利要求2或3的方法，其中所述回收还包括步骤：

(C)使用反萃取溶剂从所述分离的萃取物(i)反萃取所述萃取的乳酸从而形成为不混溶相：

(iii)含乳酸的反萃取溶液，和

(iv)去乳酸的萃取溶剂，

(D)将所述含乳酸的反萃取溶液(iii)与所述去乳酸的萃取溶剂(iv)分离，

由此得到回收的乳酸。

5.根据权利要求4的方法，其中所述反萃取溶剂是水性溶剂、极性有机溶剂或这些溶剂的混合物。

6.根据权利要求1的方法，其中所述乳酸在转化为丙交酯之前从所述发酵培养基中回收，所述回收包括步骤：

-通过使用醇来沉淀所述培养基中的污染物，所述培养基任选地已清除碎片，和

-除去沉淀物以获得澄清的含乳酸的醇溶液，

由此得到回收的乳酸。

7.根据权利要求6的方法，其中所述醇为C₁至C₄直链或支链醇类。

8.根据权利要求1的方法，其中从乳酸直接地或经由乳酸缩聚形成乳酸寡聚物而转化成丙交酯。

9.根据权利要求2或6的方法，其中所述回收的乳酸通过如下转化为丙交酯：

-加热所述回收的乳酸以使所述乳酸寡聚化，和

-加热由此形成的乳酸寡聚物以产生丙交酯蒸汽。

10.根据权利要求9的方法，其中所述回收的乳酸是在疏水性溶剂中。

11.根据权利要求10的方法，其中所述疏水性溶剂为Henkel's Alamine 336。

12.根据权利要求9的方法，其中所述加热乳酸寡聚物以产生丙交酯蒸汽的步骤是在催化剂存在下进行的。

13.根据权利要求10至11中任一项的方法，其中所述加热乳酸寡聚物以产生丙交酯蒸汽的步骤是在催化剂存在下进行的。

14.根据权利要求12的方法，其中所述催化剂为锡催化剂。

15.根据权利要求13的方法，其中所述催化剂为锡催化剂。

16.根据权利要求14或15的方法，其中所述锡催化剂为辛酸亚锡(II)。

17.根据权利要求2或6的方法，其中所述乳酸在水性溶液中，且通过以下转化为丙交酯：

-加热所述回收乳酸的水性溶液以形成蒸汽，

-使所述形成的蒸汽通过维持在升高温度下的反应器，所述反应器中任选地放置有催化剂。

18.根据权利要求17的方法，其中所述催化剂为氧化铝。

19.根据权利要求1的方法，其中所述乳酸在水性溶液中且通过从所述水性溶液中除去水转化为丙交酯。

20.根据权利要求1的方法，其中所述丙交酯在金属催化剂存在下通过开环聚合成PLA。

21.根据权利要求1的方法，其中所述微生物来自选自保藏为CBS 127564,CBS 127565和CBS 127566菌株的菌株。