BR112013009837B1

BR112013009837B1 - processo para a produção de ácido poliláctico usando monascus

Info

Publication number: BR112013009837B1
Application number: BR112013009837-6A
Authority: BR
Inventors: Ruud Alexander Weusthuis; Emil Johan Harald Wolbert; Jan Springer; John Van Der Oost; Gerrit Eggink
Original assignee: Total Research & Technology Feluy Sa
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2020-10-27
Also published as: BR112013010165A2; WO2012055997A1; WO2012055996A1; US9777298B2; KR101811907B1; EP2633028B1; BR112013010169B1; US20130288319A1; KR101616171B1; KR20160027234A; EP2806038A1; CN103502429A; KR101674361B1; KR20140052918A; PL2806038T3; BR112013010169A2; AR083612A1; CN103314098A; US20130303802A1; KR20130107319A

Abstract

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO POLILÁCTICO USANDO MONASCUS. A presente invenção refere- se a um processo para a produção de ácido poliláctico (PLA) compreendendo as etapas de: fermentação em um vaso de fermentação de um micro-organismo do gênero Monascus em um meio em um pH de menos de ou igual a 5 sob condições as quais produzem ácido láctico no meio, conversão do ácido láctico produzido em lactida, e polimerizaçâo da lactida para formar PLA.

Description

CAMPO TÉCNICO

[1] A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácido poliláctico a partir de ácido láctico produzido por micro- organismos em fermentação.

ANTECEDENTES

[2] O ácido poliláctico (PLA) é um poliéster alifático biodegradável e termoplástico que é fabricado a partir de fontes renováveis por fermentação microbiana, e tem ampla gama de aplicações. Como a maioria dos materiais termoplásticos, pode ser processado em uma fibra ou película. O ácido poliláctico tem uma ampla gama de aplicações, tais como camisas de malha, bandejas para micro-ondas, e aplicações do tipo hot-fill. O ácido poliláctico atualmente é usado em uma série de aplicações biomédicas, tais como suturas, stents, meios de diálise e dispositivos para liberação de fármacos. Em vista de sua bio- degradabilidade, também pode ser usado na preparação de bioplásti- co, útil para a produção de embalagem do tipo loose-fill, sacos de adubo, embalagens de alimentos, e louça descartável. Sob a forma de fibras e têxteis não tecidos, o ácido poliláctico também tem muitas aplicações potenciais, por exemplo como estofamento, roupas descartáveis, toldos, produtos de higiene feminina, e fraldas.

[3] A fermentação bacteriana atualmente é usada para produzir ácido láctico a partir de amido de milho ou açúcar de cana. No entanto, o ácido láctico não pode ser diretamente polimerizado para um produto útila, devido à produção de água a qual degrada o polímero em formação. Ao invés, é dimerizado para lactida. Ácido poliláctico de alto peso molecular é produzido a partir da lactida por polimerização de abertura de anel usando mais comumente um catalisador (por exemplo, esta- nho). Este mecanismo não gera água adicional e, portanto, uma ampla gama de pesos moleculares é acessível. Tipicamente o ácido polilácti- co tem um número médio de peso molecular (Mn) entre 75 000 e 100 000 Dalton.

[4] Uma série de micro-organismos são capazes de produzir ácido láctico por meio de processos de fermentação aeróbicos e anae- róbicos. Espécies de Lactobacillus são atualmente usadas extensivamente na indústria para produção de ácido láctico à base de amido. A maioria destas espécies carece da capacidade de fermentar açúcares de pentose tais como xilose e arabinose. Embora o Lactobacillus pen- tosus, o Lactobacillus brevis e o Lactococcus lactis sejam capazes de fermentar pentoses para ácido láctico, as pentoses são metabolizadas usando o caminho da fosfocetolase o qual é ineficaz para produção de ácido láctico. Na verdade, no caminho da fosfocetolase, 5-fosfato de é xilulose é clivado para 3-fosfato de gliceraldeído e acetil-fosfato. Com este caminho, a produção teórica máxima de ácido láctico é limitada a um por pentose (0,6 g de ácido láctico por g de xilose) devido à perda de dois carbonos para ácido acético.

[5] Na maioria das plataformas organismos hospedeiros tais como E. coli, a produção de ácido láctico em altos títulos ou é ineficaz ou é tóxica. A produção de ácido láctico em pH neutro tipicamente resulta na produção de lactato de Ca, o qual tem de ser convertido em ácido láctico pela adição de ácido sulfúrico, resultando na formação de CaSO4 (gipso) como subproduto. Para produzir ácido láctico diretamente, a fermentação deve ser executada em baixo pH (preferencialmente no mínimo uma unidade menor do que o valor da pKa do ácido láctico, 3,85). No entanto o ácido láctico é tóxico para os micro-organismos, uma vez que em sua forma protonada age como um de- sacoplador que destrói o potencial de membrana. Deste modo, enquanto alguns micro-organismos podem ser tolerantes a baixo pH somente um número limitado de organismos são adequados para produção de ácido orgânico pelo fato de que são tolerantes a ácidos orgânicos em pH reduzido.

[6] Uma importante desvantagem da fermentação microbiana é o custo. Como vários micro-organismos são incapazes de sintetizar alguns dos aminoácidos ou das proteínas que necessitam para crescer e para metabolizar açúcares de modo eficiente, frequentemente eles devem ser alimentados com um pacote de nutrientes um tanto complexo, aumentando o custo direto para operar a fermentação. Além disso, a aumentada complexidade do caldo o torna mais difícil para recuperar o produto da fermentação em forma razoavelmente pura, deste modo incorrendo em aumentados custos operacionais e de capital para recuperar o produto. Além disso, a utilização de milho como a matéria-prima compete diretamente com a alimentação humana e animal.

[7] Por conseguinte, continua a haver a necessidade de métodos aprimorados para produção de PLA os quais utilizem microorganismos tolerantes de altos níveis de ácido láctico em um caldo de fermentação mínima.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[8] A presente invenção proporciona métodos para a produção de PLA usando micro-organismos aprimorados os quais produzem ácido láctico. Em particular, são proporcionados processos para a produção de ácido poliláctico (PLA) compreendendo as etapas de:

[9] - fermentação em um vaso de fermentação de um micro organismo do gênero Monascus em um meio em um pH de menos de ou igual a 5 sob condições as quais produzem ácido láctico no meio,

[10] - conversão do ácido láctico produzido em lactida, e

[11] - polimerização da lactida para formar PLA.

[12] De acordo com modalidades particulares, o ácido láctico é recuperado do meio de fermentação antes da conversão em lactida por extração de fase. Por conseguinte, a recuperação por extração de fase pode compreender as etapas de:

[13] extração do ácido láctico livre do referido meio clarificado de debris contatando o referido meio com um solvente de extração, para formar:

[14] um extrato contendo ácido láctico e

[15] uma solução aquosa exaurida de ácido láctico; e

[16] separação do referido extrato contendo ácido láctico (i) da referida solução aquosa (ii),

[17] obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

[18] O solvente de extração para extração pode compreender um ou mais de 1-butanol, 2-etil hexanol, 1-octanol, metil isobutil ceto- na, ciclo-hexanona, disobutil cetona, éter isopropílico, acetato de etila, acetato de isobutila, lactato de etila, lactato de butila, lactato de octila, N.N-dibutil lactamida, e ácido hexanoico. De acordo com um aspecto preferencial da invenção, o solvente de extração compreende uma amina terciária de alquila, um solvente oxigenado que aumenta o coeficiente de partição, e uma fração de querosene que modifica a viscosidade da mistura solvente. O solvente de extração preferencialmente compreende uma amina terciária de alquila tricaprilil amina (por exemplo, Alamina 336 da Henkel). O solvente de extração pode compreender adicionalmente octanol ou metil isobutil cetona, e querosene (por exemplo, IsoPar K). De acordo com um aspecto da invenção, o solvente de extração contém 60 a 80 % em peso de amina terciária de alquila, tal como Alamina 336, 5 a 20 % de metil isobutil cetona, e 10 a 30 % de querosene (por exemplo, IsoPar K).

[19] A extração de fase pode ser seguida por uma etapa de stripping opcional. Por conseguinte, a recuperação pode compreen- deer adicionalmente as etapas de:

[20] stripping do ácido láctico extraído do referido extrato separado (i) usando um solvente de stripping para formar como fases imis- cíveis:

[21] iii) a solução de stripping contendo ácido láctico, e

[22] iv) solvente de extração exaurido de ácido láctico,

[23] separar a solução de stripping contendo ácido láctico (iii) do referido solvente de extração exaurido de ácido láctico (iv),

[24] obtendo deste modo ácido láctico recuperado. O solvente de stripping é um solvente aquoso, um solvente orgânico polar, ou misturas destes solventes.

[25] De acordo com outra modalidade da invenção, ácido láctico é recuperado a partir do meio de fermentação usando uma precipitação alcoólica para precipitar contaminantes. Por conseguinte, em uma modalidade da invenção ácido láctico é recuperado a partir do meio de fermentação antes da conversão em lactida, cuja recuperação compreende as etapas de:

[26] - precipitação de contaminantes no meio, opcionalmente clarificado de debris, por uso de um álcool, e

[27] - remoção do precipitado para obter uma solução alcoólica clarificada contendo ácido láctico,

[28] obtendo deste modo ácido láctico recuperado. O álcool pode ser um álcool de cadeia reta ou ramificado Ci a C4.

[29] A lactida no processo da invenção tipicamente é convertida a partir de ácido láctico diretamente ou através de policondensação de ácido láctico para formar oligômeros de ácido láctico. De acordo com modalidades particulares, 0 ácido láctico recuperado é convertido em lactida por aquecimento do ácido láctico recuperado para oligomerizar 0 ácido láctico, e aquecimento do oligômero de ácido láctico formado deste modo para produzir um vapor de lactida. O ácido láctico recuperado pode estar em um solvente hidrofóbico, preferencialmente Alami- na 336. A etapa de aquecimento do oligômero de ácido láctico para produzir um vapor de lactida oode ser realizada na presença de um catalisador, preferencialmente um catalisador de estanho, preferencialmente octanoato de estanho (II). De acordo com outras modalidades particulares, o ácido láctico está em uma solução aquosa, e é convertido em lactida por aquecimento da solução aquosa de ácido láctico recuperado para formar um vapor, e passando o vapor formado deste modo através de um reator mantido em temperatura elevada, no qual um catalisador é opcionalmente disposto. O catalisador pode ser alumina. De acordo com outras modalidades particulares, o ácido láctico está em uma solução aquosa, e é convertido em lactida pela remoção de água da solução aquosa.

[30] De acordo com modalidades particulares, a lactida é poli- merizada em PLA por uma abertura de anel na presença de um catalisador de metal. O catalisador de metal pode ter uma fórmula geral (I): em que

[31] R1 e R2 são cada um de modo independente C1-10 alquila,

[32] R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-10 alqui la, ou

[33] R3 e R4 são ligados de modo covalente um ao outro e são, cada um, um metileno e

[34] R5 é C1-10 alquila,

[35] X1 é selecionado entre C1-10 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-10 alquila, e R7é C1-6 alquila.

[36] A invenção usa micro-organismos os quais são altamente tolerantes a altas concentrações de ácido láctico em baixo pH e deste modo convenientes para utilização na produção de ácido láctico por engenharia genética. Em modalidades particulares adicionais a invenção usa fungos recombinantes, mais particularmente de uma espécie dentro do gênero Monascus em que alguns genes exógenos e/ou endógenos são superexpressados e/ou suprimidos de modo que as cepas recombinantes produzem níveis aumentados de ácido láctico quando cultivadas em um meio fermentável. Por conseguinte, as cepas de Monascus recombinantes da presente invenção podem ser usadas para produção reforçada de ácido láctico em baixo pH deste modo proporcionando um suprimento aumentado de ácido láctico para utilização na fabricação de PLA.

[37] A presente invenção portanto usa micro-organismos para a produção de ácido poliláctico, mais particularmente do gênero Monascus, os quais são tolerantes a altas concentrações de ácido láctico em baixo pH. Em modalidades particulares são tolerantes a concentrações aumentadas de ácido láctico em um pH 0 qual é de menos de 1,5 unidades acima do valor da pKa do ácido láctico (3,85). Mais particularmente os micro-organismos da invenção são tolerantes ao ácido láctico em um pH de menos de 5, mais particularmente de menos de 4, ainda mais particularmente de menos de 3, 0 mais particularmente de menos de 2,8. Em modalidades particulares adicionais, são capazes de crescer em meio contendo ácido láctico a 50 g/L, 0 mais particularmente a 100 g/L, e em modalidades particulares crescem em meio contendo ácido láctico dea té 150 a 175 g/L, em baixo pH, mais parti-cularmente em um pH de menos de 5, mais particularmente de menos de 4, ainda mais particularmente de menos de 3, 0 mais particularmente de menos de 2,8. Em modalidades particulares da invenção, a espécie dentro do gênero Monascus é Monascus ruber. Esta alta tolerância a ácido os torna particularmente adequados para utilização na produção industrial de ácido láctico, mesmo sob condições anaeróbi- cas ou quase anaeróbicas.

[38] Estes micro-organismos podem ser modificados por engenharia genética de modo a aumentar mais a produção de ácido láctico. Em modalidades particulares, os micro-organismos da invenção são capazes de crescer sobre açúcares de hexose e pentose e de converter estes açúcares em ácido láctico. Em modalidades mais particulares os micro-organismos da invenção crescem sobre glicose e xilose em uma concentração de no mínimo 50 g/L, mais particularmente em concentrações de no mínimo 70 g/L, no mínimo 100 g/L, no mínimo 200 g/L ou mais. Em determinadas modalidades específicas, a invenção usa cepas de Monascus geneticamente modificadas ou recombinantes que são capazes de produzir níveis aumentados de ácido láctico, mais particularmente de ácido L-láctico em baixo pH. Mais particularmente, ácido L-láctico é produzido em uma alta produção a partir de açúcares de hexose e/ou pentose.

[39] Em modalidades particulares, o micro-organismo compreende um gene de LDH heterólogo ou exógeno. Por conseguinte, em modalidades particulares, a invenção usa cepas de Monascus geneticamente modificadas ou recombinantes compreendendo um gene de LDH heterólogo ou exógeno. Em modalidades específicas adicionais, as cepas de Monascus geneticamente modificadas ou recombinantes usadas de acordo com a presente invenção compreendem um gene de LDH heterólogo ou exógeno que codifica uma proteína funcional que é no mínimo 80% idêntica a uma proteína codificada pela SEQ ID NO: 1.

[40] A invenção adicionalmente contempla que a produção de ácido láctico pode ser adicionalmente reforçada por inativação de ge- nes de Monascus endógenos codificando proteínas envolvidas em um caminho metabólico endógeno o qual produz um metabólito diferente de ácido láctico e/ou em que o caminho metabólico endógeno consume o ácido láctico. Em modalidades particulares, a produção do metabólito diferente do ácido láctico de interesse é reduzido. De acordo com modalidades particulares adicionais, os micro-organismos usados de acordo com a invenção compreendem no mínimo uma deleção e/ou inativação de gene manipulado de um caminho endógeno no qual é consumido ácido láctico ou um gene codificando um produto envolvido em um caminho endógeno o qual produz um metabólito diferente de ácido láctico.

[41] Em modalidades particulares, os micro-organismos da cepa Monascus usados de acordo com a invenção são micro-organismos recombinantes os quais compreendem um gene recombinante codificando ácido láctico desidrogenase (LDH) e/ou no mínimo uma deleção e/ou inativação de gene manipulado em um caminho de consumo de ácido láctico endógeno ou um gene codificando uma enzima envolvida em um caminho endógeno o qual produz um metabólito diferente de ácido láctico.

[42] As cepas de Monascus geneticamente modificadas ou re-combinantes usadas de acordo com a presente invenção contêm adi-cionalmente no mínimo uma inativação ou manipulação de gene.

[43] Em modalidades mais particulares, a no mínimo uma deleção ou inativação de gene manipulado está em um gene codificando uma enzima selecionada entre o grupo consistindo de piruvato des- carboxilase (pdc), fumarato redutase, desidrogenase alcoólica (adh), acetaldeído desidrogenase, , fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), D- lactato desidrogenase (d-ldh), L-lactato desidrogenase (l-ldh), lactato 2-mono-oxigenase, e qualquer combinação dos genes referidos. Em modalidades mais particulares, a no mínimo uma deleção e/ou inativa- ção de gene manipulado é em um gene endógeno codificando lactato desidrogenase.

[44] Em modalidades adicionais a no mínimo uma deleção e/ou inativação de gene manipulado é em um gene endógeno codificando piruvato descarboxilase (pdc). Mais particularmente, o gene é um gene PDC1, PDC2 e/ou PDC4 endógeno conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em modalidades particulares adicionais, a uma ou mais sequências codificando descarboxilase endógena que são inativadas e/ou deletadas são sequências correspondentes a uma ou mais de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ NO: 5.

[45] Em modalidades particulares, a no mínimo uma deleção ou inativação de gene manipulado é em um gene endógeno codificando uma lactato desidrogenase citocromo dependente, tal como uma L- lactato desidrogenase citocromo B2-dependente. Mais particularmente, a deleção ou inativação de gene manipulado é uma inativação de um gene compreendendo a SEQ ID NO: 2 e/ou em um gene compreendendo a SEQ ID NO: 6.

[46] Em modalidades particulares, os micro-organismos usados de acordo com a invenção são capazes de produzir o ácido láctico em uma produção de no mínimo 0,5 g/L de açúcares de hexose ou pentose ou combinações de açúcares de hexose e pentose. Mais particularmente, a produção é de no mínimo 2 g/L, o mais particularmente de no mínimo 5 g/L. Em modalidades particulares a conversão da produção de açúcar consumido para ácido láctico é de no mínimo 50%.

[47] Modalidades particulares da invenção usam cepas de Mo- nascus geneticamente modificadas ou recombinantes de acordo com a presente invenção, as quais são capazes de produzir ácido láctico, a partir de açúcares de hexose e/ou pentose em uma produção de no mínimo 2 g/L. Em modalidades particulares, etanol é formado como um subproduto. Em modalidades particulares, o ácido láctico é ácido L-láctico.

[48] Em algumas modalidades, os métodos de produção de (composições compreendendo) ácido láctico da presente invenção resultam em uma produção de ácido láctico que é de no mínimo 2 g/L. Em modalidades particulares adicionais, o título de ácido láctico é entre 50 a 100 g/L e a produtividade é de no mínimo 1g/L/hora, mais particularmente entre 2 a 3 g/L/hora.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[49] A presente invenção é ilustrada pelas seguintes Figuras as quais devem ser consideradas como ilustrativas somente e não limitam de qualquer modo o âmbito da invenção.

[50] A Figura 1 ilustra um exemplo de um vetor de transformação o qual pode ser usado para a transformação de cepas de Monascus de acordo com modalidades particulares da invenção.

[51] A Figura 2 ilustra um exemplo de um cassete modelo para construção de vetor de acordo com uma modalidade particular da invenção.

[52] A Figura 3 ilustra o vetor de transformação pCGHT3, para uso na transformação de cepas de Monascus de acordo com modalidades particulares da invenção.

[53] A Figura 4 ilustra a sequência do gene Bt-L-LDH de códon otimizado.

[54] A Figura 5 ilustra o vetor de transformação pCGHTGBtLT com o gene (Sos taurus Bt) LDH de códon otimizado, de acordo com uma modalidade particular da invenção.

[55] A Figura 6 ilustra o vetor de transformação pURGHTGBtLT com o gene (Sos taurus Bt) LDH de códon otimizado com base no plasmídeo pUR5750 de acordo com uma modalidade particular da invenção.

[56] A Figura 7 ilustra a atividade de LDH em extratos de proteína de E. coli depois de expressão do gene de LDH sintética, de acordo com uma modalidade particular da invenção.

[57] A Figura 8a ilustra a concentração de glicose no meio conforme determinado por HPLC para os transformantes LF5-T1 e LF5-T2 e LF5 controle de M. ruber não transformada de acordo com modalidades particulares da invenção. Figura 8b Concentrações de ácido láctico nos transformantes LF5-T1 e LF5-T2 e LF5 controle de M. ruber não transformada de acordo com modalidades particulares da invenção.

[58] A Figura 9 ilustra a atividade da enzima L-LDH na biomassa dos dois transformantes LF5-T1 e LF5-T2 e no LF5 controle de M. ruber não transformada de acordo com modalidades particulares da invenção.

[59] A Figura 10 ilustra o consumo de glicose pelos transformantes e por tipos selvagens das cepas LF4, LF5 e LF6, de acordo com modalidades particulares da invenção.

[60] A Figura 11 ilustra a produção de ácido láctico por transformantes e por tipos selvagens das cepas LF4, LF5 e LF6 de acordo com modalidades particulares da invenção.

[61] A Figura 12 Produção de etanol por transformantes e por tipos selvagens das cepas LF4, LF5 e LF6. As cepas foram precultiva- das em 10 ml de meio YEPD por 3 dias.

[62] A Figura 13 ilustra o consumo de açúcar (glicose ou xilose) e a formação de produto (etanol e ácido láctico) por transformantes e por cepas selvagens de LF4 sob condições aeróbicas e anaeróbicas, de acordo com modalidades particulares da invenção.

[63] A Figura 14 ilustra o consumo de açúcar (glicose ou xilose) e a formação de produto (etanol e ácido láctico) por transformantes e por cepas selvagens de LF5 sob condições severamente aeróbicas e anaeróbicas, de acordo com modalidades particulares da invenção.

[64] A Figura 15 ilustra o consumo de açúcar (glicose ou xilose) e e a formação de produto (etanol e ácido láctico) por transformantes e por cepas selvagens de LF6 sob condições severamente aeróbicas e anaeróbicas, de acordo com modalidades particulares da invenção.

[65] A Figura 16 ilustra a sequência do frame de leitura aberta PDC1 de Monascus ruber.

[66] A Figura 17 ilustra a sequência do frame de leitura aberta PDC2 de Monascus ruber.

[67] A Figura 18 ilustra um exemplo de um vetor de transformação o qual pode ser usado para a disrupção de PDC1 de cepas de Monascus usando seleção por geneticina de acordo com modalidades particulares da invenção.

[68] A Figura 19 ilustra um exemplo de um vetor de transformação o qual pode ser usado para a disrupção de PDC2 de cepas de Monascus usando seleção por geneticina de acordo com modalidades particulares da invenção.

[69] A Figura 20 ilustra um exemplo de um vetor de transformação o qual pode ser usado para a disrupção de PDC2 de cepas de Monascus usando seleção por zeocina de acordo com modalidades particulares da invenção.

[70] A Figura 21 proporciona uma representação esquemática do vetor pCH#PDC1 usado para a disrupção do gene de PDC1.

[71] A Figura 22 proporciona uma representação esquemática do vetor pCL1H#PDC1 usado para a disrupção do gene de PDC1 e a inserção do gene de LDH simultaneamente.

[72] A Figura 23 proporciona uma representação esquemática do vetor pCN#PDC2 usado para a disrupção do gene de PDC2 em um transformante PDC1-LDH+.

[73] A Figura 24 ilustra a sequência do frame de leitura aberta PDC4 de Monascus ruber (SEQ ID No: 5).

[74] A Figura 25 ilustra a atividade de Cyt-LDH em extratos de proteína de S. cerevisiae (Sc) e de Monascus cepas LF4, LF5, LF6, e da cepa CBS, de acordo com modalidades particulares da invenção.

[75] A Figura 26 ilustra a sequência do frame de leitura aberta CYB2 de Monascus ruber. (SEQ ID NO: 2); urn intron putativo na sequência genômica é indicado por letras minúsculas.

[76] A Figura 27 ilustra a sequência do gene Mona00569 de Monascus ruber codificando L-LDH citocromo dependente (SEQ ID No: 6).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[77] A menos que definido de modo diverso, todos os termos usados na revelação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado conforme comumente entendido por uma pessoa com conhecimento regular na técnica à qual pertence esta invenção. Por meio de orientações adicionais, definições de termos são incluídas para melhor apreciar o ensinamento da presente invenção.

[78] Antes do presente processo da invenção ser descrito, deve ser entendo que esta invenção não está limitada a processos ou produtos particulares descritos, uma vez que os processos ou produtos referidos, logicamente, podem variar. Além disso, deve ser entendido que não se pretende que a terminologia usada aqui, neste requerimento de patente, seja limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexadas.

[79] Referência do início ao fim desta especificação a "uma modalidade" significa que um aspecto, estrutura ou característica particular descrito em conexão com a modalidade é incluído em no mínimo uma modalidade da presente invenção. Deste modo, aparecimentos das expressões "em uma modalidade" em vários locais do início ao fim desta especificação não estão necessariamente se referindo todos à mesma modalidade, porém podem estar se referindo. Além do mais, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combinados em qualquer maneira adequada, conforme seria evidente para uma pessoa versada na técnica desta descoberta, em uma ou mais modalidades. Além disso, enquanto algumas modalidades descritas aqui, neste requerimento de patente, incluem algumas mas não outras características incluídas em outras modalidades, combinações de características de diferentes modalidades pretendem estar dentro do âmbito da invenção, e formam diferentes modalidades, conforme seria entendido por aqueles na técnica. Por exemplo, nas reivindicações que se seguem, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[80] Ao descrever a presente invenção, os termos usados devem ser considerados de acordo com as seguintes definições, a menos que um contexto dite de modo diverso.

[81] Sempre que o termo "substituído" é usado na presente invenção, pretende indicar que um ou mais hidrogénios sobre o átomo indicado na expressão usando "substituído" é substituído com uma seleção do grupo indicado, com a condição de que a valência normal do átomo indicado não seja excedida, e que a substituição resulte em um composto quimicamente estável, isto é, um composto que é suficientemente robusto para sobreviver a isolamento até um grau útil de pureza de uma mistura da reação.

[82] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, as formas singulares "um", "uma", "o", e "a" incluem tanto referentes singulares quanto plurais a menos que o contexto claramente dite de modo diverso.

[83] Os termos "compreendendo", "compreende" e "consistindo de" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, são sinônimos com "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém", e são inclusivos ou em aberto e não excluem membros, elementos ou etapas de méto- dos adicionais não mencionados. Onde é feita referência a modalidades compreendendo alguns elementos ou etapas, isto implica que também são previstas modalidades as quais consistem essencialmente dos elementos ou etapas mencionados.

[84] A menção de alcances numéricos por extremidades inclui todos os números e frações englobados dentro dos alcances respectivos, bem como as extremidades mencionadas.

[85] O termo "cerca de" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, quando se refere a um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal, e semelhantes, pretende englobar variações de +/-10% ou menos, preferencialmente de +/-5% ou menos, mais preferencialmente de +/-1% ou menos, e ainda mais preferencialmente de +/-0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, na medida em que semelhantes variações são apropriadas para representar a invenção revelada. Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" se refere é o próprio também revelado especificamente e preferencialmente.

[86] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "homologia" denota similaridade estrutural entre duas macromo- léculas, particularmente entre dois polipeptídeos ou polinucleotídeos, do mesmo ou de diferentes táxons, em que a referida similaridade é devida a ancestralidade compartilhada. Deste modo, o termo "homólogos" denota macromoléculas relacionadas deste modo tendo a referida similaridade estrutural.

[87] Todos os documentos citados na presente especificação são por este incorporados por meio de referência em sua totalidade.

[88] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a identidade de sequências entre dois polipeptídeos pode ser determinada alinhando otimamente (alinhamento ótimo de duas sequências de proteínas é o alinhamento que maximiza a soma de escores de pa- res menos qualquer penalidade para gaps introduzidos; e pode ser conduzido preferencialmente por implementações computadorizadas de algoritmos, tais como "Clustal" W usando o método de alinhamento de Wilbur e Lipman, 1983 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730). Métodos alternativos incluem "Gap" usando o algoritmo de Needleman e Wunsch 1970 (J Mol Biol 48: 443-453), ou "Bestfit", usando o algoritmo de Smith e Waterman 1981 (J Mol Biol 147: 195—197), conforme disponível, por exemplo, no pacote GCG™ v. 11.1.2 da Accelrys) as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos e classificando, por um lado, o número de posições no alinhamento nas quais os polipeptídeos contêm o mesmo resíduo aminoácido e, por outro lado, o número de posições no alinhamento no qual os dois polipeptídeos diferem em sua sequência. Os dois polipeptídeos diferem em sua sequência em uma dada posição no alinhamento quando os polipeptídeos contêm diferentes resíduos aminoácidos naquela posição (substituição de aminoácido), ou quando um dos polipeptídeos contém um resíduo aminoácido naquela posição enquanto o outro não ou vice versa (inserção ou de- leção de aminoácido). A identidade de sequências é calculada como a proporção (percentagem) de posições no alinhamento nas quais os polipeptídeos contêm o mesmo resíduo aminoácido versus o número total de posições no alinhamento. Em uma modalidade particular o algoritmo para realizar alinhamentos de sequências e determinação de identidade de sequências é um algoritmo baseado na Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST, Basic Local Alignment Search Tool) descrito originalmente por Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10), mais particularmente o algoritmo "Blast 2 sequences" descrito porTatusova e Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247- 250), tal como usando ajustes defaults do mesmo.

[89] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a "similaridade de sequências" entre dois polipeptídeos pode ser deter- minada alinhando otimamente (vide acima) as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos e classificando, por um lado, o número de posições no alinhamento nas quais os polipeptídeos contêm o mesmo resíduo aminoácido ou similar (isto é, substituído conservadoramente) e, por outro lado, o número de posições no alinhamento nas quais os dois polipeptídeos de modo diverso diferem em sua sequência. Os dois polipeptídeos de modo diverso diferem em sua sequência em uma dada posição no alinhamento quando os polipeptídeos contêm resíduos aminoácidos não conservadores naquela posição, ou quando um dos polipeptídeos contém um resíduo aminoácido naquela posição ao passo que o outro não contém ou vice versa (inserção ou deleção de aminoácido). A similaridade de sequências [e calculada como a proporção (percentagem) de posições no alinhamento nas quais os polipeptídeos contêm o mesmo resíduo aminoácido ou similar versus o número total de posições no alinhamento.

[90] O termo "ácido láctico" neste requerimento se refere a ácido 2-hidroxipropiônico quer sob a forma de ácido livre ou de sal. A forma de sal de ácido láctico é referida como "lactato" independente do agente neutralizante, isto é, carbonato de cálcio ou hidróxido de amónio. Conforme referido aqui, neste requerimento de patente, ácido láctico pode se referir a qualquer forma estereoisomérica de ácido láctico (ácido L-láctico ou ácido D-láctico). O termo lactato pode se referir a qualquer forma estereoisomérica de lactato (L-lactato ou D-lactato). Ao se referir à produção de ácido láctico este inclui a produção de quer um único estereoisômero de ácido láctico ou lactato ou uma mistura de ambos os estereoisômeros de ácido láctico ou lactato. Nas modalidades particulares onde os fungos recombinantes da presente invenção produzem exclusivamente um único estereoisômero de ácido láctico ou lactato, diz-se que o estereoisômero de ácido láctico ou de lactato que é produzido é "quiralmente puro". A expressão "quiralmente puro" indica que não há contaminação detectável de uma forma estereoiso- mérica de ácido láctico ou lactato com a outra forma estereoisomérica (a pureza quiral do estereoisômero especificado é no mínimo, maior de (ou maior de ou igual a) 99,9%).

[91] Foi visto que os organismos usados de acordo com a presente invenção são altamente tolerantes a ácidos lácticos e,m baixo pH.

[92] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "tolerância a alta concentração de ácido láctico" se refere à capacidade dos micro-organismos para crescerem em um meio compreendendo no mínimo 50 g/L de ácido láctico, ou no mínimo 75 g/L porém potencialmente até mais de 100 g/L, ou ainda mais de 150 g/L, tal como 175 g/L ou 200 g/L. Em modalidades particulares, o termo "alta concentração de ácido láctico", pode se referir a uma solução saturada do ácido láctico.

[93] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "baixo pH", se refere a um pH de entre 2,0 e 5,0, tal como menos de 4,0, mais particularmente menos de 3,0, mais particularmente um pH de 2,8 ou menos.

[94] Será entendido pela pessoa versada que ao se referir a uma tolerância a um ácido láctico em um baixo pH, é de particular relevância a capacidade para tolerar um ácido láctico em um pH o qual corresponde a ou é menor do que o valor da pKa do ácido láctico, mais particularmente em um pH o qual é entre 1,5 unidade maior e 1,5 unidade menor do que o valor da pKa do ácido láctico. Onde o ácido láctico tem dois valores de pKa (devido à presença de dois grupos ácidos), a pKa relevante é o menor valor da pKa.

[95] "Atividade de lactato desidrogenase" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à capacidade da proteína para catalisar a reação de piruvato para lactato. Enzimas lactato desidro- genase incluem (mas não estão limitadas a) as enzimas categorizadas pelos números da Enzyme Commission EC1.1.1.27 e EC1.1.1.28.

[96] Os termos "recombinantes" ou "geneticamente modificados" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com referência a organismos, micro-organismos ou células hospedeiros, engloba os referidos organismos, micro-organismos ou células hospedeiros nos quais uma molécula de ácido nucleico foi introduzida ou os quais foram geneticamente modificados de modo diverso, bem como a progénie recombinante de semelhantes organismos, micro-organismos ou células hospedeiros. Isto inclui tanto organismos nos quais sequências genéticas endógenas são introduzidas em uma posição diferente de sua posição natural no genoma e organismos nos quais sequências genéticas endógenas foram modificadas ou deletadas.

[97] O termo "recombinante" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com referência a uma sequência de nucleotídeos presente em alguns organismos, micro-organismos ou células hospedeiros se refere a uma sequência de nucleotídeos a qual não está presente naturalmente nos referidos organismos, micro-organismos ou células. Isto inclui sequências de nucleotídeos as quais são estranhas aos referidos organismos, micro-organismos ou células e sequências de nucleotídeos as quais são introduzidas em uma posição diferente de sua posição natural no genoma e sequências genéticas endógenas foram modificadas.

[98] O termo "transformação" engloba a introdução ou transferência de um ácido nucleico estranho tal como um ácido nucleico recombinante em um organismo, micro-organismo ou célula hospedeiro. O ácido nucleico introduzido deste modo ou a deleção resultante de ácido nucleico endógeno é preferencialmente mantida por todo o crescimento adicional e a divisão celular do referido organismo, micro- organismo ou célula hospedeiro. Quaisquer métodos convencionais de transferência de gene ou de modificação genética podem ser usados para obter transformação, tais como sem limitação eletroporação, ele- tropermeação, transformação química, lipofecção, transfecção mediada por vírus ou bacteriófago, etc.

[99] O termo "gene" conforme usado de modo geral aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma sequência a qual contém uma sequência codificando um promotor e quaisquer outras regiões reguladoras requeridas para expressão em uma célula hospedeira.

[100] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "promotor" se refere a uma sequência não traduzida localizada dentro de 50 pb a montante do sítio de início de transcrição e a qual controla o início de transcrição do gene estrutural. Geralmente está localizada dentro de cerca de 1 a 1000 pb, preferencialmente 1 a 500 pb, especialmente 1 a 100 pb a montante (isto é, 5') para o códon de início de translação de um gene estrutural. De modo similar, o termo "terminador" se refere a uma sequência não traduzida localizada a jusante (isto é, 3') para o códon de interrupção de translação (translation stop codon) de urn gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 1 a 1000 pb, mais tipicamente 1 a 500 pares de bases e especialmente 1 a 100 pares de bases) e a qual controla a extremidade de transcrição do gene estrutural. Um promotor ou terminador é "encadeado operativamente" a um gene estrutural se sua posição no genoma em relação à do gene estrutural é tal que o promotor ou terminador, conforme o caso, realiza sua função de controle transcripcional.

[101] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "heterólogo" ou "exógeno" se refere ao fato de que o gene ou a sequência codificante em questão não é nativo ou endógeno para o hospedeiro.

[102] O termo "nativo" ou "endógeno" é usado aqui, neste requerimento de patente, com respeito a materiais genéticos (por exemplo, um gene, promotor ou terminador) que são encontrados (além de mutações de indivíduo-para- indivíduo as quais não afetam a função) dentro do genoma de células selvagens da cepa hospedeira.

[103] Por "codificante" significa que uma sequência de ácido nucleico ou parte(s) da mesma corresponde, em virtude do código genético de um organismo em questão, a uma sequência de aminoácidos em particular, por exemplo, a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo desejado ou de uma proteína desejada. A título de exemplo, ácidos nucleicos "codificando" um polipeptídeo ou proteína em particular pode englobar ácidos nucleicos genômicos recombinantes ou sintéticos, hnRNA, pré-mRNA, mRNA, cDNA.

[104] Preferencialmente, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo ou proteína em particular pode compreender um frame de leitura aberta (ORF) codificando o referido polipeptídeo ou a referida proteína. Um "frame de leitura aberta" ou "ORF" se refere a uma suc- cessão de tripletos de nucleotídeos codificantes (códons) iniciando com um códon de iniciação de translação e fechando com um códon de terminação de translação conhecido per se, e não contendo qualquer códon de terminação de translação in-frame interno, e potencialmente capaz de codificar um polipeptídeo. Deste modo, o termo pode ser sinônimo com "sequência codificante" conforme usado na técnica.

[105] A presente invenção se refere a um método para a preparação de ácido poliláctico (PLA) a partir de um processo de fermentação usando micro-organismos. Mais em particular, o método descreve a preparação de lactida a partir de ácido láctico produzido pelo microorganismo, e a preparação de PLA a partir da lactida.

[106] Os micro-organismos da ordem de Monascus são usados de acordo com a presente invenção, têm uma excelente tolerância a altas concentrações de ácido láctico em baixo pH. Mais particularmente, são tolerantes a ácidos lácticos em um pH de 5 ou menos.

[107] A tolerância a ácido láctico dos micro-organismos usados de acordo com a presente invenção os torna particularmente adequados para utilização na produção industrial de ácido láctico. Enquanto em algumas situações industriais, o ácido láctico de interesse pode ser extraído durante a produção de tal modo que não sejam mantidas concentrações extremamente elevadas, não obstante será vantajosa a tolerância da cepa ao ácido láctico. Mais particularmente, é de interesse ser capaz de permitir a fermentação da cepa em um meio cujo pH cai durante o curso da fermentação, preferencialmente até um valor abaixo do pKa do ácido láctico de 3,85.

[108] Os micro-organismos da presente invenção têm uma tolerância excepcional ao ácido láctico em um pH de menos de 3.

[109] Além disso, foi visto que os organismos usados de acordo com a presente invenção podem ser manipulados para assegurar a produção de ácido láctico. Mais particularmente podem ser manipulados para fermentar açúcares simples para um ácido láctico em alta produção. O fato de que em modalidades particulares estes organismos podem ser cultivados sob condições anaeróbicas ou quase- anae- róbicas, proporciona uma vantagem adicional no contexto de métodos de produção industrial.

[110] Os micro-organismos usados de acordo com a invenção são de uma espécie dentro do gênero Monascus. Surpreendentemente foi visto que podem ser identificadas as cepas de Monascus as quais são tolerantes a altas concentrações de ácido láctico em baixo pH. Tipicamente os micro-organismos representam uma cepa de uma espécie que é escolhida entre o grupo compreendendo Monascus al- bidulus, Monascus arqentinensis, Monascus aurantiacus, Monascus barken, Monascus bisporus, Monascus eremophilus, Monascus flori- danus, Monascus fuliqinosus, Monascus fumeus, Monascus kaoliang, Monascus lunisporas, Monascus mucoroides, Monascus olei, Monas- cus pallens, Monascus paxii, Monascus pilosus, Monascus pubiqerus, Monascus purpureus, Monascus ruber, Monascus rubropunctatus, Monascus rutilus, Monascus sanguineus, Monascus serorubescens e Monascus vitreus. Em modalidades particulares da presente invenção, os micro-organismos da presente invenção são cepas da espécie Monascus ruber.

[111] Cepas exemplares usadas de acordo com a presente invenção, referidas aqui, neste requerimento de patente, também como LF4, LF5 e LF6, foram depositadas junto ao Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) em Utrecht, Países Baixos e foram atribuídos os números de acesso CBS 127564, CBS 127565 e CBS 127566, respectivamente.

[112] Em modalidades particulares, a invenção usa micro- organismos da ordem de Monascus conforme descrito acima, os quais foram manipulados geneticamente para aumentar a produção de ácido láctico a partir de açúcares simples tais como açúcares de hexose ou de pentose ou combinações de açúcares de hexose e de pentose. Isto pode ser realizado de diferentes modos, os quais não são mutuamente exclusivos.

[113] Em modalidades particulares, as técnicas de engenharia genética previstas no contexto da presente invenção têm por objetivo o aumento da produção de ácido láctico por expressão de um gene (exógeno) codificando uma enzima envolvida na produção de ácido láctico.

[114] A lactato desidrogenase (LDH) catalisa a última etapa na conversão de açúcares para ácido láctico, por meio da qual piruvato é convertido para lactato. A aumentada expressão e/ou atividade de genes de LDH deste modo assegura um aumento na produção de ácido láctico. Por conseguinte, em modalidades particulares, a invenção proporciona cepas de Monascus geneticamente modificadas ou re- combinantes compreendendo no mínimo um gene de lactato desidrogenase funcional integrado em seu genoma. Em modalidades particulares, o gene de LDH compreende uma sequência codificante de LDH heteróloga ou exógena.

[115] A introdução de um gene de LDH exógeno permite que a cepa de Monascus modificada produza quantidades aumentadas do estereoisômero de L- e/ou D- ácido láctico. De acordo com algumas modalidades particulares da presente invenção, os micro-organismos geneticamente modificados ou recombinantes usados da ordem de Monascus compreendem (ou contêm exclusivamente) um ou mais genes de L-LDH exógenos (e não um gene de D-LDH exógeno), de modo que os organismos produzem um ácido L-láctico oticamente ou qui- ralmente puro. Alternativamente, a produção de ácido D-láctico quiral- mente puro pode ser prevista por introdução de um gene de D-LDH exógeno. Em modalidades específicas da presente invenção os orga-nismos geneticamente modificados ou recombinantes da presente invenção da ordem de Monascus contêm uma ou mais sequências codificantes de L-LDH exógenas e uma ou mais sequências codificantes de D-LDH sequências exógenas, de modo que a cepa recombinante produz uma mistura racêmica de ácido L- e D-láctico.

[116] O gene de LDH exógeno usado no contexto da presente invenção, é um gene que codifica para uma enzima lactato desidrogenase ou um fragmento ativo da mesma, isto é, uma proteína tendo atividade de lactato desidrogenase.

[117] Em modalidades particulares, o gene de LDH exógeno ou sequência codificante é um gene ou sequência codificante derivado de outro organismo que tenha sido geneticamente modificado (por exemplo, códons alterados) para aprimorada expressão em Monascus.

[118] No contexto da presente invenção, genes de LDH adequados incluem os obtidos a partir de fontes bacterianas, fúngicas, de le- veduras ou mamíferas. Exemplos de genes L-LDH específicos são os obtidos a partir de Lactobacillus helveticus, L. casei, Bacillus megate- rium, Pediococcus acidilactici, Rhizopus oryzae e fontes mamíferas tais como bovino ou suíno. Em particular Bos taurus. Exemplos de genes de D-LDH específicos são os obtidos a partir de L. helveticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum, L. pentosus e P. acidilactici. São adequadas sequências codificantes funcionais que têm um escore de identidade de no mínimo 70% em relação às sequências codificantes nestes genes no nível de aminoácido e codificam proteínas funcionais. Os genes nativos obtidos a partir de qualquer uma destas fontes podem ser submetidos a mutagênese caso necessário para proporcionar uma sequência codificante iniciando com o códon de partida eucariótico códon usual (ATG), ou para outros fins. Em modalidades particulares, o gene de L-LDH é o obtido a partir de L. helveticus ou um que tem uma identidade de sequências com o mesmo de no mínimo 80%, 85%, 90% ou 95%. De acordo com outras modalidades específicas, o gene de L-LDH que é obtido a partir de B. megaterium ou um no mínimo 80%, 85%, 90% ou 95% comparado com semelhante gene. De acordo com algumas modalidades particulares adicionais, o gene de L-LDH é o obtido a partir de Bos taurus ou um que tem um escore de identidades de no mínimo 80%, 85%, 90% ou 95% comparado com semelhante gene. Em modalidades particulares, o gene de D-LDH é o obtido a partir de L. helveticus ou um que tem um escore de identidade no mínimo 80%, 85%, 90% mais particularmente no mínimo 95% comparado com semelhante gene.

[119] Sequências codificantes de LDH particularmente adequadas incluem as que codificam para uma enzima com uma sequência de aminoácidos que tem um escore de identidade de no mínimo 80%, 85% ou 95%, comparada com a sequência identificada como SEQ. ID. NO. 1. Genes de LDH particularmente adequados também incluem os que codificam uma enzima funcional tendo uma sequência de proteína que tem um escore de identidades de no mínimo, 80%, 85% ou 95% comparada com a sequência de proteína codificada pela SEQ ID NO: 1; em modalidades particulares genes de LDH adequados incluem os que codificam uma enzima funcional e tendo uma sequência que tem um escore de identidades de no mínimo 80%, 85% ou 95% comparada com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou idêntica à SEQ ID NO: 1. As cepas de Monascus geneticamente modificadas ou recombinantes da presente invenção podem conter um único gene exógeno codificando uma enzima envolvida na produção do ácido láctico de interesse ou múltiplos genes exógenos. Deste modo, por exemplo, a cepa recombinante pode compreender um único gene de LDH exógeno ou múltiplos genes de LDH exógenos, tal como a partir de 1 até 10 genes de LDH exógenos, especialmente a partir de 1 até 5 genes de LDH exógenos. Quando a cepa transformada contém múltiplos genes de LDH exógenos, os genes individuais podem ser cópias do mesmo gene, ou incluem cópias de dois ou mais genes de LDH diferentes. Múltiplas cópias do gene de LDH exógeno podem ser integradas em um único locus (portanto estão adjacentes umas às outras), ou em vários loci dentro do genoma da cepa hospedeira.

[120] A sequência codificante recombinante codificando a enzima de interesse é colocada sob o controle transcricional de um ou mais promotores e de um ou mais terminadores, ambos os quais são funcionais na célula fúngica modificada.

[121] Sequências de promotores e de terminadores podem ser nativas para a cepa hospedeira de Monascus ou exógenas para a célula. Sequências de promotores e de terminadores úteis incluem as que são altamente idênticas (isto é, têm um escore de identidades de 90% ou mais, especialmente de 95% ou mais, o mais preferencialmente de 99% ou mais) em suas porções funcionais comparadas com as porções funcionais de sequências de promotores e de terminadores, respectivamente, que são nativas para a cepa hospedeira, particularmente quando a inserção do gene exógeno é direcionada em um sítio específico no genoma da cepa.

[122] Em modalidades particulares o promotor tem um escore de identidade de no mínimo 90%, 95% ou 99% em relação a um promotor que é nativo para um gene fúngico. Mais particularmente o promotor tem um escore de identidade de no mínimo 90%, 95% ou 99% comparado com um promotor para um gene que é nativo para a cepa hospedeira de Monascus. Em modalidades particulares, o terminador tem um escore de identidade de no mínimo 90%, 95% ou 99% comparado com um terminador para um gene que é nativo para um fungo. O terminador pode ter um escore de identidade de no mínimo 90%, 95% ou 99% com um terminador para um gene que é nativo para a cepa hospedeira de Monascus. O uso de promotores e terminadores nativos (para a cepa hospedeira), junto com suas respectivas regiões flanque- antes a montante e a jusante, pode permitir a integração direcionada do gene recombinante em loci específicos do genoma da cepa hospedeira, e para integração simultânea do gene recombinante e deleção de outro gene nativo. É possível para as diferentes sequências codificantes exógenas tais como as sequências codificantes de LDH serem colocadas sob o controle de diferentes tipos de promotores e/ou terminadores.

[123] O gene recombinante pode ser integrado aleatoriamente no genoma da cepa hospedeira ou inserido em uma ou mais localizações direcionadas. Exemplos de localizações direcionadas incluem os loci de um gene que desejavelmente sofre deleção ou disrupção.

[124] Os presentes inventores adicionalmente visam aumentar a produção de ácido láctico nos micro-organismos da ordem de Monascus de acordo com a invenção, mas limitando a produção de metabóli- tos endógenos para o hospedeiro e/ou reduzindo o consumo endógeno do ácido láctico de interesse. Na verdade, isto não somente previne a perda de material e energia pelo hospedeiro, mas estimula o hospedeiro até contar totalmente com o caminho de produção da enzima de interesse criada pela introdução do gene recombinante.

[125] Em fungos tais como Monascus, o ácido láctico é consumido na presença de oxigênio. Isto é assegurado pela lactato desidroge- nase citocromo dependente. Por consedguinte, adicionalmente ou alternativamente, de acordo com modalidades particulares da presente invenção, os micro-organismos são modificados para reduzir o consumo de ácido láctico endógeno. Mais particularmente, isto é assegurado por redução da expressão do gene de LDH endógena. Isto aumenta a produção de ácido láctico sob condições aeróbicas.

[126] Deste modo, de acordo com uma modalidade particular, os micro-organismos usados na presente invenção têm um ou mais genes de LDH citocromo dependente endógenos inativados. Os presentes inventores identificaram e caracterizaram o gene de LDH endógena de Monascus ruber. Em modalidades particulares, a LDH endógena compreende a sequência codificante de SEQ ID NO: 2 ou a sequência codificante de SEQ ID NO: 6. Conforme detalhado abaixo aqui, neste requerimento de patente, sequências de nucleotídeos derivadas das sequências codificantes, não codificantes, e/ou reguladoras do gene de LDH endógena de Monascus ruber podem ser usadas para prevenir ou reduzir a expressão de LDH em Monascus.

[127] Em modalidades particulares adicionais, as técnicas de engenharia genética usadas no contexto da presente invenção têm por objetivo a redução da produção endógena de metabolites diferentes do ácido láctico de interesse. Mais particularmente, são proporcionados micro-organismos recombinantes os quais são caracterizados pelo fato de que foram inativadas ou suprimidas atividades enzimáticas envolvidas na produção de metabólitos diferentes de ácido láctico tais como etanol.

[128] Neste contexto é indicado por "inativar" que toda ou parte da região codificante do gene é eliminada (deleção), ou o gene ou sua região promotora e/ou terminadora é modificado (tal como por deleção, inserção, ou mutação) de modo que o gene não produz mais uma enzima ativa, ou produz uma enzima com atividade severamente reduzida. Inativação inclui adicionalmente silenciamento tal como por abordagens antissenso, de tripla hélice, e de ribozima, todas de conhecimento da pessoa versada.

[129] De acordo com modalidades particulares, as cepas de Monascus geneticamente modificadas ou recombinantes usadas de acordo com a presente invenção compreendem no mínimo uma deleção e/ou inativação genética manipulada, mais particularmente em um gene endógeno codificando uma enzima envolvida no caminho de produção de etanol. Nestas modalidades, a no mínimo uma deleção ou inativação genética manipulada pode estar, por exemplo, em um gene endógeno codificando uma enzima que está envolvida no caminho de produção de etanol ou na produção de metabólitos outros que não ácido láctico na cepa hospedeira, tal como um gene codificando uma enzima selecionada entre o grupo consistindo de piruvato descarboxilase (pdc), fumarato redutase, desidrogenase alcoólica (adh), acetilal- deído desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), D-lactato desidrogenase (d-ldh), L-lactato desidrogenase (l-ldh), lactato 2-mono- oxgenase e qualquer combinação dos genes referidos. Em modalidades mais particulares, a no mínimo uma deleção e/ou inativação genética manipulada pode estar em um gene endógeno codificando piruvato descarboxilase (pdc). A piruvato descarboxilase catalisa a primeira etapa no caminho do álcool. Por conseguinte, micro-organismos tendo uma atividade substancialmente reduzida de piruvato descarboxilase (PDC) são particularmente visados. O termo "atividade substancialmente reduzida de piruvato descarboxilase" significa ou uma concentração reduzida de enzima na célula (em consequência de no mínimo uma modificação genética afetando a expressão) e/ou atividade catalítica reduzida ou inespecífica da enzima (em consequência de no mínimo uma modificação genética afeatando a atividade).

[130] Em modalidades particulares, a invenção usa microorganismos da ordem de Monascus em que as atividades da piruvato descarboxilase se aproximam de zero ou estão reduzidas comparadas com as atividades normais da piruvato descarboxilase em cepas selvagens. Por conseguinte, em modalidades particulares as atividades da piruvato descarboxilase nas cepas da presente invenção são, por exemplo, no mínimo 60% menores, preferencialmente no mínimo 80% menores e ainda mais preferencialmente no mínimo 90% menores do que a atividade da piruvato descarboxilase detectável em cepas selvagens.

[131] Em modalidades particulares, a invenção proporciona micro-organismos compreendendo um ou mais genes de piruvato descarboxilase endógena inativados. Os presentes inventores identificaram e caracterizaram genes de piruvato descarboxilase endógena de Monascus ruber. Em modalidades particulares, o gene de pdc endógena compreende a sequência codificante de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4 ou de SEQ ID NO: 5. Em modalidades particulares, a invenção proporciona cepas de Monascus ruber nas quais todos os três genes pdc são inativados ou deletados. Conforme detalhado abaixo aqui, neste requerimento de patente, sequências de nucleotídeos derivadas a partir das sequências codificantes, não codificantes, e/ou reguladoras de um ou mais dos genes de pdc endógena de Monascus ruber podem ser usadas para prevenir ou reduzir a expressão de pdc em Monascus.

[132] De acordo com modalidades particulares da presente invenção, são proporcionadas cepas, as quais são caracterizadas pela característica de que a produção de etanol pela referida cepa se aproxima de zero ou é no mínimo reduzida em comparação com a produção de etanol de base na cepa selvagem. Por conseguinte, em modalidades particulares, a produção de etanol nas cepas da presente invenção é, por exemplo, no mínimo 60% menor, preferencialmente no mínimo 80% menor e ainda mais preferencialmente no mínimo 90% menor do que a produção de etanol na cepa selvagem correspondente.

[133] De acordo com modalidades particulares da invenção, são proporcionadas cepas de Monascus, as quais são adicionalmente modificadas para aumentar o consumo de açúcares C5 tais como xilose. Isto pode ser realizado por meio de métodos conhecidos na técnica, mais particularmente por introdução de genes codificando enzimas capazes de converter glicose para xilose e/ou de reduzir xilose para xilu- lose. Em modalidades particulares são usados um ou mais genes endógenos ou exógenos codificando xilose isomerase e/ou xilose redu- tase. Em modalidades particulares adicionais, são usados genes de xilose isomerase e/ou de xilose redutase exógenas. Exemplos de genes de xilose isomerase adequados são conhecidos na técnica e incluem mas não estão limitados a xilose isomerase de Piromyces sp. e o gene de redutase de P. stipitis. Portanto em modalidades particulares, a invenção proporciona adicionalmente cepas de Monascus as quais foram transformadas com um ou mais genes envolvidos no metabolismo de açúcares C5, mais particularmente xilose isomerase e/ou xilose redutase. A modificação genética das cepas hospedeiras é realizada em uma ou mais etapas através do design e construção de vetores apropriados e transformação da cepa hospedeira com estes vetores. Podem ser usados métodos de eletroporação e/ou de transformação química (tal como à base de cloreto de cálcio ou de acetato de lítio) ou métodos de transformação mediada por Agrobacterium tume- faciens conforme é de conhecimento na técnica. Os vetores podem ser ou cortados com enzimas de restrição particulares ou usados como DNA circular. O vetor usado para modificação genética das cepas hospedeiras pode ser qualquer vetor na medida que possa se integrar no genoma da cepa hospedeira. Os vetores da presente invenção podem ser operáveis como vetores de clonagem ou vetores de expressão na cepa hospedeira selecionada. Numerosos vetores são de conhecimento dos profissionais versados na técnica, e a seleção de um vetor apropriado é uma questão de escolha. Os vetores podem ser, por exemplo, o vetor de transformação pUR5750, o vetor de transformação pCGHT3 ... etc.

[134] Em geral, é preparado um vetor que contém a sequência codificante de interesse e sequências de promotor e terminador associados. O vetor pode conter sítios de restrição de vários tipos para linearização ou fragmentação. Os vetores podem conter adicionalmente uma porção de espinha dorsal (tal como para propagação em E. coli) muitos dos quais são convenientemente obtidos a partir de vetores de levedura ou bacterianos disponíveis comercialmente. O vetor preferencialmente contém um ou mais cassetes de marcadores genéticos de seleção. Um "marcador genético de seleção" é um marcador genético que codifica uma proteína necessária para a sobrevida e/ou o crescimento da célula transformada em um meio de cultura seletivo. Marcadores genéticos de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas tais como zeocina (gene sh ble de Streptoalloteichus hindustanus), genetecina, melibiase (MEL5), higromicina (gene de E. coli de resistência a antibiótico de aminoglicosídeo), ampicilina, tetraciclina, ou canamicina (gene de Tn903 de resistência à canamicina), (b) complementam deficiências auxotróficas da célula. Dois exemplos proeminentes de deficiências auxotróficas são a deficiência do aminoácido leucina (por exemplo, gene LEU2) ou a deficiência de uracila (por exemplo, gene URA3). Células que são negativas para orotidina-5'-fosfato descarboxilase (ura3-) não podem crescer sobre meios carecendo de uracila. Deste modo um gene UBA3 funcional pode ser usado como um marcador sobre uma célula tendo uma deficiência de uracila, e transformantes bem sucedidos podem ser selecionados sobre um meio carecendo de uracila. Somente células transformadas com o gene URA3 funcional são capazes de sintetizar uracila e crescer sobre um meio semelhante. Se a cepa selvagem não tiver uma deficiência de uracila (conforme é o caso com I. orientalis, por exemplo.), um mutante auxotrófico tendo a deficiência deve ser produzido de modo a usar URA3 como um marcador de seleção para a cepa. Métodos para realizar isto são de conhecimento geral na técnica.

[135] Marcadores de seleção preferenciais incluem o gene de resistência à zeocina, o gene de resistência a G418, o gene de resistência à higromicina. O cassete de marcadores de seleção tipicamente inclui adicionalmente uma sequência de promotor e terminador, encadeada operativamente ao marcador genético de seleção, e as quais são operáveis na cepa de Monascus hospedeira.

[136] Transformantes bem sucedidos podem ser selecionados na maneira conhecida, levando em conta os atributos contribuídos pelo marcador genético, ou por outras características (tais como capacidade para produzir ácido láctico, incapacidade para produzir etanol, ou capacidade para crescer sobre substratos específicos) contribuídas pelos genes inseridos. Pode ser realizada triagem por PCR ou análise Southern para confirmar que ocorreram as inserções e deleções desejadas, para confirmar o número de cópias e para identificar o ponto de integração de genes no genoma da cepa hospedeira. A atividade da enzima codificada pelo gene inserido e/ou a falta de atividade de enzima codificada pelo gene deletado pode ser confirmada usando métodos de teste conhecidos.

[137] As deleções ou inativações previstas aqui, neste requerimento de patente, podem ser realizadas por métodos de engenharia genética , evolução forçada ou mutagênese e/ou seleção ou triagem. Na verdade, o presente estado da técnica proporciona uma ampla variedade de técnicas que podem ser usadas para a inativação, deleção ou substituição de genes. As técnicas moleculares referidas incluem mas não estão limitadas a:

[138] técnicas de inativação de gene baseadas em métodos de silenciamento genético natural incluindo RNA antissenso, ribozinmas e formação de triplex de DNA,

[139] técnicas para mutação genética única tal como inativação de gene por cruzamento (crossing-over) único com plasmídeo não replicative e inativação de gene com um plasmídeo não replicativo ou um fragmento de DNA linearizado capaz de integração cromossômica de duplo cruzamento (crossover) (Finchham, 1989, Microbiological Reviews, 53: 148-170; Archer et al.,2006, Basic Biotechnology: 95- 126), e

[140] técnicas para múltiplas mutações não marcadas na mesma cepa, tais como, mas não limitadas a:

[141] deleção e substituição do gene alvo por um gene de resistência a antibiótico por uma integração de duplo crossover através de recombinação homóloga de um plasmídeo integrativo, proporcionando mutantes segregacionalmente altamente estáveis;

[142] remoção do gene de resistência a antibiótico com o sistema de Flp recombinase de Saccharomyces cerevisiae possibilitando o uso repetido do método para construção de múltiplas mutações não marcadas na mesma cepa e

[143] produção de uma cepa deletada para o gene upp, codificando uracila fosforibosil transferase, deste modo possibilitando o uso de 5-fluorouracila como um marcador contra selecionável e uma seleção positiva dos integrantes de duplo crossover.

[144] Em modalidades particulares, a deleção ou a disrupção do gene endógeno é realizada de acordo com o método descrito por Oliveira et al (2008) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 80, 917-924).

[145] Em modalidades não limitantes particulares da presente invenção, a deleção ou disrupção do gene endógeno, pode incluir a introdução de um ou mais genes estruturais funcionais, a saber um gene codificando uma enzima envolvida na produção do ácido láctico, tal como um gene de LDH conforme descrito acima, inserido entre as porções flanqueantes 5' e 3' de um dos genes endógenos da cepa hospedeira. O gene funcional preferencialmente inclui sequências de promotor e terminador funcionais encadeadas operativamente ao gene estrutural. Esta abordagem permite a deleção simultânea do gene en-dógeno e inserção do gene exógeno ou heterólogo funcional. O vetor pode incluir um marcador genético de seleção ao invés de ou além do gene estrutural. Novamente, o marcador genético de seleção é posicionado sobre o vetor entre as porções flanqueantes 5' e 3' do um ou mais genes endógenos sendo direcionados, e se torna inserido no locus do gene endógeno funcional. O uso de um marcador genético de seleção tem a vantagem de introduzir um meio de seleção para transformantes bem sucedidos. No entanto, também é possível selecionar transformantes bem sucedidos com base nas características funcionais resultantes. Por exemplo, dependendo dos genes deletados e introduzidos pode ser possível triagem sobre a capacidade reduzida ou eliminada para crescer sobre blocos de construção específicos, para produzir ácido láctico em altas concentrações ou sobre sua capacidade reduzida para produzir metabólitos específicos tais como etanol.

[146] Por conseguinte, um aspecto adicional da presente invenção proporciona métodos de obtenção de micro-organismos produtores de ácido láctico em alto rendimento, cujos métodos compreendem:

[147] obtenção de um micro-organismo do gênero de Monascus tendo uma alta tolerância ao ácido láctico em baixo pH;

[148] transformação do micro-organismo com uma ou mais sequências de ácido nucleico recombinante as quais assseguram uma aumentada produção do ácido láctico e/ou uma redução da produção endógena de metabólitos; e

[149] seleção de um micro-organismo capaz de produção de ácido láctico em alto rendimento.

[150] A etapa de identificação de um micro-organismo tendo uma alta tolerância ao ácido láctico em baixo pH pode ser realizada por seleção do micro-organismo sobre um meio contendo altas concentrações do ácido láctico. Mais particularmente a seleção é realizada por seleção sobre um meio contendo o ácido láctico em um pH o qual é uma unidade maior do que o valor do seu pKa. Em modalidades particulares adicionais o pH é menos do valor de seu pKa. Em modalidades particulares, o pH é de menos de 3,8, mais particularmente de menos de 3.

[151] Em modalidades particulares, os micro-organismos são se-lecionados sobre um meio contendo o ácido láctico a 50 g/L, o mais particularmente 100 g/L, e em modalidades particulares os microorganismos são selecionados sobre um meio contendo o ácido láctico de até 150 a 175 g/L.

[152] Surpreendentemente foi visto pelos presentes inventores que podem ser identificados micro-organismos da ordem de Monascus os quais são tolerantes a altas concentrações de ácido láctico em um baixo pH, mais particularmente em um pH o qual é menos do pKa do ácido láctico. Mais particularmente foi visto que podem ser identificados micro-organismos da ordem de Monascus os quais são tolerantes a concentrações aumentadas de ácido láctico em um pH de menos de 3,0.

[153] A etapa de transformação do micro-organismo é descrita em detalhes acima. Conforme detalhado acima, diferentes modificações genéticas são previstas as quais aumentam o rendimento da produção de ácido láctico.

[154] A etapa de seleção de um micro-organismo capaz de alto rendimento da produção da produção de ácido láctico é uma etapa de seleção de conhecimento da pessoa versada e inclui, mas não está limitada à medição da atividade de enzimas envolvidas na produção do ácido láctico de interesse por métodos tais como os descritos para LDH nos Exemplos aqui, neste requerimento de patente. Adicionalmente ou alternativamente nos métodos de acordo com a invenção, a etapa de seleção pode ser baseada em reduzida produção de etanol, reduzido consumo de ácido láctico, etc.

[155] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona processos para a produção de ácido láctico, mais particularmente em alto rendimento. Na verdade, a produção em alto rendimento de ácidos lácticos é de interesse em vista de suas numerosas aplicações industriais. Os métodos da presente invenção são de interesse para a produção para ácido láctico para produção de ácido poliláctico.

[156] Em modalidades particulares, os métodos da presente invenção compreendem as etapas de obtenção de um micro-organismo da ordem de Monascus o qual é tolerante a altas concentrações de ácido láctico em baixo pH, modificação geneticamente deste para aumentar a produção do ácido láctico e cultura do micro-organismo obtido deste modo na presença de substratos específicos ou blocos de construção química em um pH de menos de 5, mais particularmente de menos de 4, mais particularmente em um pH o qual é menos de 1,5 unidades acima do pKa do ácido orgânico.

[157] Em modalidades particulares, os métodos da presente invenção compreendem as etapas de

[158] obtenção de uma cepa da order de Monascus, a qual é tolerante ao ácido láctico em baixo pH, mais particularmente em um pH o qual é menos de 1,5 unidades acima do pKa do ácido láctico; (ii) modificação da cepa referida de tal modo que seja capaz de produzir o ácido láctico de interesse em alta produção a partir de açúcares de hexose ou de pentose ou combinações de açúcares de hexose e de pentose; e (ii) cultura da referida cepa na presença de um substrato adequado, mais particularmente em um pH o qual é menos de 1,5 unidade acima do pKa do ácido orgânico, o mais particularmente em um pH de menos de 5, o mais particularmente de menos de 4. O mais par-ticularmente, o ácido láctico produzido é ácido L-láctico. Métodos para obtenção de um micro-organismo tolerante a ácido láctico da ordem de Monascus e métodos de modificação do referido organismo para aumentar a produção de ácido láctico são descritos acima e ilustrados na seção de Exemplos.

[159] Em modalidades particulares do processo da invenção, o micro-organismo ou cepa da ordem de Monascus pode ser cultivado em um meio que inclui um açúcar que é fermentável pela cepa transformada. O açúcar pode ser um açúcar de hexose tal como glicose, glicano ou outros polímeros de glicose, oligômeros de glicose tais como maltose, maltotriose e isomaltotriose, panose, frutose, e oligômeros de frutose. Em modalidades particulares, o micro-organismo é modificado para ter a capacidade de fermentar açúcares de pentose, e o meio inclui um açúcar de pentose tal como xilose, xilano ou outro oli- gômero de xilose. Em modalidades particulares, os organismos são cultivados sobre combinações de açúcares de hexose e de pentose.

[160] Os açúcares podem ser hidrolisados de uma biomassa contendo hemicelulose ou celulose. Em modalidades particulares, o micro- organismo é modificado para assegurar a degradação da biomassa para monômeros (por exemplo, expressão de genes de celulase). Por conseguinte, em modalidades particulares, o substrato compreende um oligômero de açúcar ou polímero tal como celulose, hemicelulose ou pectina.

[161] Adicionalmente ou alternativamente, enzimas podem ser adicionadas ao meio de cultura para assegurar a degradação do substrato em monômeros fermentáveis.

[162] Em modalidades particulares da invenção, o meio contém no mínimo (o equivalente de) 5 g/L, no mínimo 10 g/L, no mínimo 20 g/L, no mínimo 30 g/L, mais particularmente no mínimo 40 g/L, e ainda mais particularmente no mínimo 50 g/L glicose. Em modalidades particulares adicionais, o meio compreende no mínimo 100 g/L, mais particularmente no mínimo 200 g/L. Glicose pode ser adicionada ao meio durante o curso da fermentação.

[163] O meio pode conter opcionalmente nutrientes adicionais conforme requerido pela cepa de Monascus em particular, incluindo fontes inorgânicas de nitrogênio tais como sais de amónia ou amónio, e semelhantes, e minerais e semelhantes. No entanto, em modalidades mais particulares, o meio é um meio mineral completo compreendendo um açúcar de pentose ou de hexose como a única fonte de carbono. A capacidade das cepas da presente invenção para crescerem sobre este meio simples reduz muito o custo da cultura e simplifica a purificação do ácido láctico produzido.

[164] Um meio de fermentação preferencial é meio S.C. o qual compreende (NH4)2SO4 (a por exemplo, 4 a 6 g/l, preferencialmente 5 g/l), KH2PO4 (a por exemplo, 2 a 4 g/l, preferencialmente 3 g/l), MgSO4.7H2O (a por exemplo, 0,3 a 0,7 g/l, preferencialmente 0,5 g/l), ZnSO4.7H2O (a por exemplo, 3,5 a 5,5 mg/l, preferencialmente 4,5 mg/l), MnCl2.2H2θ (a por exemplo, 0,6 a 1 mg/l, preferencialmente 0,84 mg/l), COCI2.6H2O (a por exemplo, 0,2 a 0,4 mg/l, preferencialmente 0,3 mg/l), C11SO4.5H2O (a por exemplo, 0,2 a 0,4 mg/l, prefe- rencialmente 0,3 mg/l), Na2Moθ4.2H2θ (a por exemplo, 0,2 a 0,4 mg/l, preferencialmente 0,4 mg/l), CaCl2.2H2θ (a por exemplo, 10 a 14 mg/l, preferencialmente 12,25 mg/l), FeSθ4.7H2θ (a por exemplo, 2 a 4 mg/l, preferencialmente 3 mg/l), H3BO3 (a por exemplo, 0,5 a 1,5 mg/l, preferencialmente 1 mg/l), Kl (a por exemplo, 0,05 a 0,15 mg/l, prefe- rencialmente 0,1 mg/l), Glicose.H2O (a por exemplo, 40 a 70 g/l, prefe- rencialmente 55 g/l). Pode ser empregado agente anti-espuma tal como anti-espuma Sigma 204.

[165] Outras condições de crescimento, tais como tempo de fermentação total, temperatura, densidade celular, e semelhantes são geralmente selecionadas de modo a proporcionar um processo econômico. As temperaturas durante cada uma entre a fase de crescimento e a fase de produção podem variar a partir de acima da temperatura de congelamento do meio até cerca de 50°C. Uma temperatura preferencial, particularmente durante a fase de produção, é a partir de cerca de 30 a 45°C. O tempo de fermentação pode ser igual a ou maior do que 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 horas, ou um valor na faixa entre quaisquer dois dos valores supracitados, preferencialmente entre 100 e 140 horas. O pH pode ser opcionalmente ajustado durante a fermentação de modo a manter um pH estável condutivo para crescimento ótimo. Em modalidades particulares, 0 pH é mantido a menos de 4, mais particularmente a menos de 3,8, ainda mais particularmente a menos de 3, 0 mais preferencialmente a 2,8.

[166] A etapa de cultura dos métodos da invenção pode ser conduzida anaerobicamente, microanaerobicamente ou ananaerobica- mente. Também podem ser usadas condições quasi- anaeróbicas ou condições de limitado oxigênio, nas quais nenhum oxigênio é adicionado durante o processo porém oxigênio dissolvido está presente no meio no início do processo de produção.

[167] Em modalidades particulares, os métodos da presente invenção compreendem cultura de micro-organismos (cepas) da ordem de Monascus os quais apresentam a capacidade de converter açúcares para ácido láctico sob condições anaeróbicas ou de limitado oxigênio.

[168] A etapa de cultura dos métodos de acordo com este aspecto da invenção pode ser conduzida de modo contínuo, em lotes, ou alguma combinação dos mesmos.

[169] A produção de ácido láctico obtida pelas ferramentas e métodos de acordo com a presente invenção dependerá das condições de cultura usadas.

[170] Em algumas modalidades, os métodos para produzir um ácido láctico de acordo com a presente invenção resultam em uma produção de ácido láctico que é de no mínimo 0,5 g/L, particularmente de no mínimo 2 g/L, mais particularmente de no mínimo 3 g/L. São previstas produções tão elevadas quanto 50 g/L, e mais particularmente entre 50 a 100 g/L. Em modalidades particulares adicionais a produção é de cerca de 2 a 3 g/L/hora.

[171] Em modalidades particulares, os micro-organismos da presente invenção são capazes de converter no mínimo 50%, mais particularmente no mínimo 60%, ainda mais particularmente 75%, o mais particularmente no mínimo 95%, e até 100% da glicose consumida. Na prática, a produção obtida em modalidades particulares dos métodos da presente invenção é de no mínimo 0,5 g/g de açúcar, mais particularmente de no mínimo 0,6 g/g de açúcar, mas pode ser de até 0,95 g/g de açúcar.

[172] Um meio de cultura compreendendo cerca de 4 a 100 g/litro de material de ácido láctico total é tipicamente proporcionado para processamento adicional. O meio de cultura é clarificado para remover impurezas brutas e outros insolúveis, por exemplo, por centrifugação ou por passagem através de um filtro ou através de floculação, centrifugação ou uma combinação destas várias técnicas. Este filtro pode ser um filtro de ponta morta ou um filtro de fluxo cruzado usando membranas de micro- ou ultrafiltração. Em alguns casos, pré- tratamento com carbono ativado também pode ser conduzido para purificar a mistura. O meio clarificado pode ter um pH de 5 ou menos, preferencialmente de 3,85 ou menos, mais preferencialmente de 3 ou menos, mais preferencialmente entre 2 e 3. O pH pode ser reduzido opcionalmente usando um ácido tal como ácido sulfúrico. Compostos secretados pelos micro-organismos durante o curso da fermentação, a saber ácido láctico, reduzem o pH do meio, deste modo pode não ser necessário ajuste do pH.

[173] O ácido láctico presente no meio de cultura é convertido em lactida, cuja lactida é um substrato para polimerização em PLA. A conversão para lactida é bastante simplificada em vista do fato de que os organismos podem ser cultivados sobre um meio mineral contendo somente açúcares como uma fonte de carbono.

[174] O ácido láctico pode ser primeiro recuperado do meio de cultura antes de uma conversão subsequente para lactida. Alternativamente o ácido láctico pode ser convertido em lactida no meio de cultura, opcionalmente com etapas para remover impurezas do meio de cultura antes da conversão.

[175] Dependendo do solvente presente com o ácido láctico, a conversão para lactida pode prosseguir através de policondensação de ácido láctico em ácido láctico oligomérico, cujos oligômeros são despolimerizados em lactida. Tipicamente o ácido láctico presente em um solvente não aquoso facilita as reações referidas de despolimeri- zação ou 'back biting'. O ácido láctico oligomérico pode ter um peso molecular médio de entre 600 e 800.

[176] Quando o ácido láctico está presente em um solvente subs-tancialmente aquoso, conversão pode, alternativamente, evitar a formação de ácido láctico oligomérico, isto é, há conversão direta de ácido láctico para lactida, facilitando a conversão diretamente usando uma alimentação aquosa a partir de um fermentador de ácido láctico.

[177] Antes de conversão em lactida, o ácido láctico pode primeiro ser recuperado do meio de cultura conforme mencionado anteriormente.

[178] Tipicamente o ácido láctico é extraído em um solvente de extração que forma uma fase com o meio clarificado, no qual solvente de extração as partições de ácido láctico. A partição contendo ácido láctico é removida.

[179] Antes da extração, o caldo clarificado pode ser tratado op-cionalmente com um álcool para precipitar impurezas. A precipitação de contaminantes pode prosseguir usando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. US2009/0093034. A precipitação preferencialmente usa um álcool (por exemplo, um álcool Ci a C4 de cadeia reta ou ramificada), a saber metanol, etanol, propanol ou butanol ou uma mistura de um ou mais destes. Enquanto 0 ácido láctico tem uma boa solubilidade em metanol, etanol, propanol, e butanol, os componentes do meio contidos no licor de fermentação de ácido láctico e os agentes para uso na neutralização ou acidificação podem ter uma baixa solubilidade nestes solventes. O propanol pode ser qualquer um de 1-propanol (n- propanol) e 2-propanol (isopropanol). O butanol pode ser qualquer um de 1-butanol (n-butanol), 2-metil-1 -propanol (isobutanol), 2-butanol (sec-butanol), e 2-metil-2-propanol (terc-butanol).

[180] Aqui, todos os componentes do meio são solúveis em água, mas somente poucos componentes entre os componentes do meio podem ser solúveis em um álcool inferior.

[181] Adicionando ao licor de fermentação de ácido láctico contendo os componentes do meio um álcool tal como metanol, etanol, propanol, ou butanol, o qual funciona como um solvente pobre, preferencialmente com agitação, contaminantes tais como os componentes do meio e semelhantes podem se tornar insolúveis no mesmo e precipitar, e o componente de ácido láctico pode ser coletado sob a forma de sobrenadante líquido usando a extração subsequente. O precipitado pode ser removido por centrifugação.

[182] A extração de ácido láctico a partir do meio de fermentação, opcionalmente removido de impurezas, pode ser realizada por técnicas conhecidas na técnica, conforme descrito, por exemplo, na patente dos Estados Unidos No. US 98/15517, na publicação de patente Internacional No. WO 99/19290, na publicação de patente dos Estados Unidos No. US 5.831.122, na publicação de patente Internacional No. WO 97/35489, na publicação de patente dos Estados Unidos No. US 2002/0102672 as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Mais preferencialmente é realizada extração usando extração de duas fases.

[183] De acordo com um aspecto da invenção, ácido láctico é recuperado a partir de meio clarificado por meio de um método compreendendo as seguintes etapas:

[184] extração de ácido láctico do referido meio clarificado por contato do referidocontat meio com um solvente de extração, para formar:

[185] um extrato contendo ácido láctico e

[186] uma solução aquosa exaurida de ácido láctico; e

[187] separação do extrato contendo ácido láctico referido (i) da solução aquosa referida (ii),

[188] obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

[189] Os extratos (i) e a solução aquosa (ii) estão em fases separadas. O solvente de extração é no mínimo parcialmente, preferencialmente totalmente imiscível em água. A escolha do solvente de extração é importante para a eficiência global e a economia do processo de separação. Uma medida da eficiência da extração é o coeficiente de partição conforme calculado pela concentração (base em peso) de ácido láctico na fase orgânica (extratante) dividida pela concentração do ácido láctico na fase aquosa (fase a partir da qual ocorre a extração). É desejável ter um coeficiente de partição maior do que 0,1, ainda mais desejável é um coeficiente de partição maior do que 1,0, e ainda é melhor se o coeficiente de partição for maior do que 3,0. Este último pode ser realizado selecionando o solvente apropriado ou mistura de solventes entre os solventes preferenciais que se seguem. Logicamente na prática em escala comercial, a eficiência da extração é a capacidade para obter uma combinação de alto rendimento, baixo volume de extratante, e produto concentrado. Isto pode ser realizado com as técnicas discutidas aqui, neste requerimento de patente.

[190] Solventes de extração que proporcionam particionamento favorável incluem: solventes oxigenados, ésteres de fosfato, óxidos de fosfina, aminas, e misturas destes solventes. Solventes oxigenados que são adequados incluem alcoóis, cetonas, éteres, ésteres, ácidos ou solventes que têm um número múltiplo destes grupos funcionais. Solventes incluindo no mínimo 60% em peso, mais preferencialmente no mínimo 80% em peso / peso e o mais preferencialmente no mínimo 90% em peso / peso (tipicamente 95% ou mais), componente(s) o qual é (são) geralmente água imiscível (solubilidade de não mais de cerca de 50 gramas per litro em água a 25 °C) são preferenciais.

[191] Todas as percentagens aqui, neste requerimento de patente, são em peso (peso / peso), a menos que determinado de modo diverso.

[192] Solventes utilizáveis específicos são 1-butanol, 2-etil hexa- nol, 1-octanol, metil isobutil cetona, ciclo-hexanona, disobutil cetona, éter isopropílico, acetato de etila, acetato de isobutila, lactato de etila, lactato de butila, lactato de octila, N.N-dibutil lactamida, e ácido hexa- noico. Compostos de fosfato adequados incluem tributil fosfato (TBP), trifenil fosfato, ácido dietil-hexilfosfórico, e óxido de trioctilfosfina. Aminas adequadas podem ser escolhidas entre o grupo consistindo de aminas primárias, secundárias e terciárias, com um número total de no mínimo 18 átomos de carbono. Preferenciais, sobretudo são aminas terciárias. Aminas adequadas incluem trietilamina, dioctilamina, triocti- lamina, tridecilamina, metil didodecilamina e preparações industriais tais como Amberlite LA- 1 (uma mistura de dialquil amina com doze átomos de carbono em cada cadeia alquila), Alamina 304 (tridodecila- mina), Alamina 308 (uma mistura de trialquil de cadeias ramificadas com um total de 8 átomos de carbono em cada cadeia), e Alamina 336 (uma mistura disponível comercialmente de trioctila; tridecit; dioctildeci- la. e dideciloctil aminas). O solvente de extração também pode conter preferencialmente uma fração de hidrocarboneto, tal como querosene, tipicamente (caso utilizado de todo) a 1 a 40% em peso / peso. Uma fração de hidrocarboneto semelhante modifica favoravelmente a viscosidade, a coalescência de fases, e outras propriedades físicas do sistema.

[193] De acordo com um aspecto preferencial da invenção, o solvente de extração compreende uma alquil amina terciária, um solvente oxigenado que aumenta o coeficiente de partição, e uma fração de querosene que modifica a viscosidade da mistura de solvente.

[194] O solvente de extração preferencialmente compreende uma alquil amina terciária tricaprilil amina (por exemplo, Alamina 336 da Henkel). O solvente de extração pode compreender adicionalmente octanol ou metil isobutil cetona, e querosene (por exemplo, IsoPar K). De acordo com um aspecto da invenção, o solvente de extração contém 60 a 80% em peso de alquil amina terciária, tal como Alamina 336, 5 a 20% de metil isobutil cetona, e 10 a 30% de querosene (por exemplo, IsoPar K).

[195] De acordo com outro aspecto da invenção, o solvente de extração compreende 45 a 55% de tricaprilil amina (Alamina 336 da Henkel), 25 a 25% de octanol, e o restante sendo querosene. Preferencialmente, o solvente de extração compreende 48% de tricaprilil amina (Alamina 336 da Henkel), 30% de octanol, e 22% de querosene. Um solvente de extração utilizável, e frequentemente preferencial, compreende, por peso, 0 a 15% de etanol; 65 a 85% de Alamina 336 e 15 a 35% de querosene.

[196] De acordo com outro aspecto da invenção, o solvente de extração compreende:

[197] - no mínimo uma alquil amina secundária ou terciária, na qual o número agregado de átomos de carbono é no mínimo 20, como um extratante primário; e

[198] - um composto orgânico, polar, estericamente impedido, tendo no mínimo 5 átomos de carbono, uma basicidade mais fraca do que a do extratante primário referido, e propriedades modificadores da extração, sensíveis à temperatura.

[199] O composto orgânico, polar, estericamente impedido pode ser selecionado entre o grupo consistindo de alcanóis, ácidos carboxí- licos, aminas terciárias, ou trialquilfosfatos, tendo um substituinte estericamente impedindo anexado ao carbono carregando o grupo polar referido, ou a um carbono o qual é alfa, beta, ou gama para o referido carbono.

[200] Dependendo do processo desejado e da natureza do ácido ou sal e do extratante primário, o referido composto orgânico, polar, estericamente impedido pode ser um inibidor de extração, funcionan- do, por exemplo, como um inibidor fraco em baixa temperatura, e como um inibidor mais forte em maior temperatura; ou como um reforça- dor de extração tendo atividades de reforço de extração mais fortes em baixas temperaturas do que em maiores temperaturas.

[201] Compostos orgânicos polares, e particularmente próticos, agem como reforçadores da extração de ácido por aminas, devido a sua capacidade para solvatar o par de ions aminoácidos formo sobre semelhante extração. Compostos orgânicos adequados para uso como reforçadores na presente invenção têm no mínimo um grupo polar ou prótico semelhante, cujas propriedades de solvatação são impedidas pela estrutura da molécula. O grupo polar é preferencialmente uma hidroxila, um éster, um aldeído, uma carboxila, uma cetona, ou uma amina, ou o referido grupo polar pode compreender um átomo de halogeno, enxofre, nitrogênio ou fosfato. O impedimento pode ser realizado através de substituição de um átomo de hidrogênio na cadeia alquila por um grupo alifático, isto é, ramificação sobre o átomo de carbono carregando o grupo polar, ou sobre um carbono o qual é alfa, beta, ou gama para o carbono referido.

[202] O reforçador deve ser uma base mais fraca do que a amina usada como o extratante primário na composição de extratante. Em uma equilibração deste com uma solução aquosa de HCI a 0,1 M em uma proporção que provê proporção molar de reforçador para HCI de 2, o pH da fase aquosa permanecerá abaixo de 2. Em uma equilibração similar, com a amina agindo a própria como o extratante não reforçado, o pH da fase aquosa aumenta até cerca de 2,5 ou mais.

[203] O solvente de extração pode compreender no mínimo uma alquil amina secundária ou terciária, cujo número agregado de átomos de carbono é de no mínimo 20, como o extratante primário. Aminas particularmente adequadas são as trioctila, tricaprilila, tridecila, e trido- decil aminas disponíveis comercialmente.

[204] Além do extratante primário e do composto reforçador orgânico, polar, estericamente impedido, o solvente de extração pode compreender um solvente imiscível em água, polar ou não polar, por exemplo, hidrocarboneto alifático ou aromático, hidrocarbonetos carregando substituintes nitro ou halo, e alcoóis.

[205] Em modalidades preferenciais da presente invenção, o referido composto de reforço da extração, polar, estericamente impedido é selecionado entre o grupo consistindo de alcanóis secundários ou terciários, tris-2-etil-hexil amina, e fosfato de tris-2-etil-hexil.

[206] Conforme indicado, o presente processo aprimorado é es-pecialmente aplicável para a recuperação de ácidos hidroxicarboxílicos tais como ácido cítrico e ácido láctico, e pode ser usado para modificar e substituir o processo usado comercialmente para a preparação de ácido cítrico, por exemplo, por substituição de 1-octanol na composição de extratante com um composto orgânico, polar, estericamente impedido tendo no mínimo 5 átomos de carbono e uma basicidade mais fraca do que a do referido extratante primário, conforme ensinado pela presente invenção.

[207] A etapa de stripping (etapa (C) - vide abaixo) pode ser realizada em uma temperatura de no mínimo 20 graus Celsius maior do que a temperatura na qual a referida extração é realizada. O composto orgânico, polar, estericamente impedido referido tanto modifica a potência de extração da referida composição de extratante primário quanto facilita a operação de stripping sensível à temperatura referida.

[208] De acordo com um aspecto da invenção, o solvente de extração compreende no mínimo um Cs-Cs alcanol. Em particular, o solvente de extração contém até 50% de uma amina graxa tendo no mínimo 18 átomos de carbono. Preferencialmente, o Cs-Cs alcanol é n- propanol, 2-butanol. De acordo com um aspecto, o solvente de extração compreende 2-butanol e tridocilamina. De acordo com um aspecto, o solvente de extração compreende n-propanol e tridocilamina.

[209] De acordo com um aspecto da invenção, o solvente de extração compreende uma amina insolúvel em água. A utilização de um solvente de amina é preferencial devido ao particionamento de ácido láctico e à seletividade de ácido láctico favoráveis. Preferencialmente, a amina é imiscível em água e contém no mínimo 18 átomos de carbono. O mais preferencialmente, a extração é conduzida com uma amina terciária. Vide por exemplo as Patentes dos Estados Unidos. Nos. 4.771.001; 5.132.456; e 5.510.526; e Shimizu et al, J. of Fermentation and Bioengineering (1996), Vol. 81 pp. 240-246; Yabannavar and Wang, Biotech Bioeng., (1991) Vol. 37, p. 1095-1100; e, Chen and Lee, Appl. Biochem. Biotech, (1997), Vol. 63-65, pp. 435-447.

[210] Aminas adequadas incluem aminas alifáticas, aralifáticas ou aromáticas, ou aminas alifáticas-aralifáticas ou alifáticas-aromáticas mistas, ou misturas de semelhantes aminas. Exemplos de aminas incluem trietilamina, dioctilamina, trioctilamina, tridecilamina, metil dido- decilamina e preparações industriais tais como Amberlite LA-1 (uma mistura de dialquil amina com doze átomos de carbono em cada cadeia alquila, disponível na Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.), Alamina 304 (tridodecilamina, disponível na Cognis, Tuscon, Ariz., anteriormente Henkel Corp.), Alamina 308 (uma mistura de trialquila de cadeias ramificadas com um total de 8 átomos de carbono sobre cada cadeia, disponível na Cognis, Tucson, Ariz.), e Alamina 336 (uma mistura de trioctiT; tridecil-; dioctildecil- e dideciloctil aminas, disponíveis na Cognis, Tucson, Ariz.).

[211] O solvente de extração também pode conter preferencialmente uma fração de hidrocarboneto para modificar a viscosidade, a coalescência das fases, e outras propriedades físicas do sistema. Um exemplo de um hidrocarboneto adequado é querosene. Por exemplo, os produtos da Exxon da família IsoPar são produtos de querosene adequados. IsoPar K é particularmente preferencial. O hidrocarboneto é tipicamente (caso de todo utilizado) incluído no solvente de extração a cerca de 1% em peso até cerca de 70% em peso. Um sistema solvente preferencial compreende, por peso, 30% em peso até 70% em peso de Alamina 304, 0% em peso até 20% em peso de reforçador orgânico polar tal como octanol ou tributil fosfato, e 30% em peso até 70% em peso de querosene. Em composições de solvente com baixa concentração de reforçador, pode se formar uma segunda fase orgânica durante a extração de ácido láctico. De modo geral, a segunda fase orgânica inclui uma alta concentração de ácido láctico. No entanto, a presença de uma segunda fase orgânica pode provocar algumas dificuldades operacionais.

[212] O solvente de extração também pode incluir um reforçador para aumentar o coeficiente de partição do ácido láctico. Reforçadores são especialmente úteis quando a concentração de ácido láctico livre na fase aquosa é baixa, isto é, menos de 15% em peso. De modo geral, o ácido láctico se divide em partes mais fortemente na fase orgânica na presença de um reforçador e mais fortemente na fase aquosa na ausência de um reforçador. O reforçador é tipicamente selecionado com base em sua potência de reforço, volatilidade, reatividade, ou qualquer outra propriedade requerida para eficiência da extração ou facilidade de operação. Reforçadores típicos são compostos orgânicos polares incluindo alcoóis, cetonas, ésteres, amidas, e outros líquidos orgânicos polares. Um reforçador volátil é preferencial porque pode ser destilado do solvente carregado antes de retroextração aquosa.

[213] Foi visto que o ácido sulfúrico também age como um reforçador e tende a aumentar o particionamento do ácido láctico em um solvente orgânico, particularmente um solvente à base de amina, mais particularmente um solvente à base de amina terciária, em baixas concentrações de ácido láctico. Semelhantes solventes à base de amina carregados com ácido sulfúrico também são referidos como solventes contendo ácido sulfúrico ou sulfato ou solventes reforçados com ácido sulfúrico ou sulfato.

[214] A temperatura na qual a extração usando o solvente de extração é realizada pode variar, dependendo de uma série de parâmetros, incluindo as eficiência da extração e a viscosidade. Tipicamente, a extração é realizada em uma temperatura entre cerca de 0°C e 95°C, preferencialmente 20°C e cerca de 70°C, mais preferencialmente entre cerca de 30°C e 60°C.

[215] A solução aquosa de ácido láctico e o solvente de extração podem ser contatados em um modo contra corrente, por exemplo, em uma coluna agitada mecanicamente; uma coluna comprimida; uma coluna de placa perfurada; uma coluna pulsada; um contator do tipo raining bucket contator, um contator centrífugo; ou, equipamento mis- turador/sedimentador (mixer/settler). A escolha do equipamento pode depender da tendência para formação de emulsão, e de outros parâmetros operacionais tais como temperatura e pressão. Os fluxos de saída do processo de extração são uma solução aquosa exaurida de ácido láctico e um extrato contendo ácido láctico.

[216] A proporção de solvente de extração para extrato contendo ácido láctico pode ser de 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0,5:1, preferencialmente de 3:1.

[217] O extrato contendo ácido láctico (i) pode ser convertido em lactida em uma etapa subsequente. O solvente de extração é tipicamente não aquoso, permitindo que a conversão em lactida prossiga através de um oligômero de ácido láctico. Técnicas para conversão em lactida através de oligômeros de ácido láctico são descritas posteriormente aqui, neste requerimento de patente.

[218] Alternativamente, o extrato contendo ácido láctico (i) pode ser submetido a uma etapa de stripping, isto é, o ácido láctico é extraí- do de volta em um solvente de stripping em pureza aumentada, antes da conversão para lactida.

[219] A utilização de uma etapa de stripping pode ser determinada em parte pelo solvente de extração, por exemplo, quando o solvente de extração é um solvente hidrofóbico de extração, pode ser desnecessária uma etapa de stripping. Um exemplo de um solvente de extração hidrofóbico adequado é um solvente de extração com uma alta proporção de alquilaminas de cadeia longa, e opcionalmente no mínimo 1 a 35% de querosene por peso. Exemplos específicos incluem Alamina-334, tolueno, xileno, mesileno, etilbenzeno e espírito mineral.

[220] Antes da conversão para lactida, o extrato contendo ácido láctico (i) pode ser opcionalmente submetido a uma etapa de stripping conforme mencionado em outra parte aqui, neste requerimento de patente. O stripping pode ser realizado de acordo com técnicas conhecidas na técnica, conforme descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. US 98/15517 e na Patente Internacional No. WO 99/19290.

[221] Deste modo, depois das etapas (A) e (B) acima, o método pode adicionalmente compreender a etapa de:

[222] stripping do ácido láctico extraído do referido extrato (i) usando um solvente de stripping para formar:

[223] iii) uma solução de ácido láctico na solução de stripping, e

[224] iv) um solvente de extração exaurido de ácido láctico.

[225] Em uma etapa (D) subsequente, a solução de stripping con tendo ácido láctico (iii) é separada do referido solvente de extração exaurido de ácido láctico (iv), obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

[226] A solução de ácido láctico (iii), e o (iv) solvente de extração exaurido de ácido láctico são formados em fases separadas. O stripping (etapa C) pode ser realizado por extração de volta do ácido láctico no extrato (i) em um solvente de stripping que é parcialmente ou totalmente imiscível com o solvente de extração. O solvente de stripping usado para formar a fase imiscível pode ser um solvente aquoso (por exemplo, água), um solvente orgânico polar, ou misturas destes solventes. Foi visto que alguns solventes orgânicos polares são imiscíveis com o solvente de extração preferencial descrito acima. À medida que a fração de peso da trialquil amina e do querosene aumenta, aumenta a probabilidade de que um composto orgânico polar seja imiscível com o solvente de extração. Solventes orgânicos polares de interesse incluem: metanol; etanol; lactida; oligómeros de ácido láctico; dimetil sulfóxido (DMSO); N,N-dimetil foramida (DMF); N-metil pir- rolidinona (NMP); 1,4-dioxana; 1,3-dioxana; tetrametileno sulfona (TMSF) e sulfolano. Em geral os solventes orgânicos polares de interesse são aqueles os quais têm uma solubilidade em água maior do que 1 g por 10 g de água. Quando água é usada como o solvente de stripping, também pode incluir um composto básico para aumentar a distribuição de ácido láctico na fase aquosa, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio ou hidróxido de cálcio.

[227] A retroextração preferencialmente será realizada em uma temperatura maior do que a extração inicial de ácido láctico no solvente de extração (tipicamente 30°C a 160°C ou superior, geralmente em 90°C a 160°C). Existem exceções a isto e ao usar um solvente de extração compreendendo uma grande proporção de álcool tal como he- xanol ou octanol, pode ser favorável realizar a extração de volta em uma temperatura menor do que a extração inicial. Como a temperatura é aumentada acima de 100°C no caso de um solvente aquoso, a extração de volta é tipicamente realizada sob pressão tipicamente usando nitrogênio. A composição do solvente de extração pode ser alterada entre a extração de ácido láctico para a frente e a retroextração.

[228] O solvente de stripping também pode conter um composto básico para aumetar a distribuição do ácido láctico de volta para a segunda fase imiscível. Foi visto que o sistema ternário de trietilamina- ácido láctico-trioctilamina em temperatura ambiente tem duas fases. Isto é um tando surpreendente porque a trietilamina e a trioctilamina são miscíveis. A fase de trioctilamina contém pouco ácido láctico se a quantidade de trietilamina adicionada for ligeiramente mais do que es- tequiométrica. A fase rica em trietilamina é quase uma proporção molar a 1:1 de ácido láctico para trietilamina, a qual dá uma percentagem em peso de ácido láctico de 47%. Deste modo, este sistema é capaz de concentrar o ácido láctico durante a extração de volta. A trietilamina é substancialmente mais volátil do que o ácido láctico e pode ser destilada para obter um produto de ácido láctico bruto. Espera-se que tri- metilamina, amónia, e outras aminas com um peso molecular de menos de 200 venham a apresentar comportamento similar à trietilamina. Bailey et al. revelam o uso de trialquil aminas terciárias em um solvente orgânico com extração de volta em uma fase aquosa (com uma base relativamente forte tal como amónia) na patente dos Estados Unidos No. 4.771.001 incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[229] A retroextração em uma mistura de trietilamina em solvente polar com volatilidade relativamente baixa é um processo eficiente uma vez que a proporção de solvente para trietilamina pode ser cuidadosamente controlada. A presença do solvente permite que a viscosidade permaneça baixa durante a destilação da amina a partir do ácido láctico e proporcionaria um meio para reações posteriores do ácido láctico para produtos de ácido láctico.

[230] Esta última opção mencionada de extração de volta do ácido láctico foi descrita de modo gerqal como tendo um solvente não polar com um extratante básico, tal como uma alquilamina de cadeia longa (18 átomos de carbono ou mais), e usando um solvente orgânico polar como a fase de extração de volta. Logicamente, o oposto pode ser verdadeiro. O solvente de extração inicial pode ser relativamente polar, porém ainda imiscível com água, e o líquido de retroextração pode ser um solvente não polar com um extratante básico. O conceito fundamental é a capacidade para extrair ácido láctico a partir de uma solução aquosa com um solvente de extração e extração de volta do ácido láctico para um segundo líquido. Em alguns casos este líquido será água, mas também pode ser um líquido orgânico que é apropriado para separação eficiente do ácido láctico ou para produzir e separar produtos de ácido láctico.

[231] Ao retroextrair o ácido láctico em uma segunda fase de líquido polar, haverá uma quantidade residual dos componentes do solvente de extração na fase de retroextração rica em ácido láctico. Caso desejado, o solvente de extração residual pode ser reduzido contatando a fase de retroextração com um solvente não polar tal como IsoPar K.

[232] O solvente de stripping e o extrato contendo ácido láctico podem ser contatados durante a retro extração em um modo contra corrente quer em: uma coluna agitada; uma coluna comprimida; uma coluna de placa perfurada; um contator do tipo raining bucket contator, um contator centrífugo; ou, equipamento misturador/sedimentador (mi- xer/settler). Os fluxos de saída do processo de extração são um solvente de extração exaurido de ácido láctico e um solvente de stripping contendo ácido láctico.

[233] A proporção de solvente de stripping para solvente de extração pode ser de 5:1,4:1, 3:1,2:1, 1:1, preferencialmente de 3:1.

[234] O ácido láctico recuperado é subsequentemente convertido para lactida. O solvente de stripping pode ser removido da solução de ácido láctico por evaporação onde apropriado, e o resíduo ressuspen- dido em um solvente hidrofóbico para conversão direta em lactida através de oligõmeros de ácido láctico. Onde o solvente de stripping é aquoso, a solução contendo ácido láctico pode ser convertida diretamente em lactida usando processos discutidos em outra parte aqui, neste requerimento de patente.

[235] Conforme mencionado acima, lactida pode ser preparada essencialmente a partir do meio de fermentação clarificado. O meio de fermentação clarificado opcionalmente pode ser tratado para remover impurezas. Exemplos de tratamento adequado incluem uma precipitação de contaminantes usando uma técnica conhecida na técnica, por exemplo, na patente dos Estados Unidos No. US2009/0093034 a qual é incorporada aqui por meio de referência. A precipitação usa um álcool (por exemplo, um álcool Ci a C4 de cadeia reta ou ramificada), a saber metanol, etanol, propanol ou butanol ou uma mistura de um ou mais destes. Enquanto 0 ácido láctico tem uma boa solubilidade em metanol, etanol, propanol, e butanol, os componentes do meio contidos no licor de fermentação de ácido láctico e os agentes para utilização em neutralização ou acidificação podem ter uma baixa solubilidade nestes solventes. O propanol pode ser qualquer um de 1-propanol (n-propanol) e 2-propanol (isopropanol). O butanol pode ser qualquer um de 1-butanol (n-butanol), 2-metil-1 -propanol (isobutanol), 2-butanol (sec-butanol), e 2-metil-2-propanol (terc-butanol).

[236] Aqui, todos os componentes do meio são solúveis em água, mas somente poucos componentes entre os componentes do meio podem ser solúveis em um álcool inferior.

[237] Ao adicionar ao licor de fermentação contendo ácido láctico os componentes do meio um álcool tal como metanol, etanol, propanol, ou butanol, 0 qual funciona como um solvente fraco, preferencialmente com agitação, contaminantes tais como os componentes do meio e semelhantes podem se tornar insolúveis no mesmo e ser precipitados, e o componente de ácido láctico pode ser coletado sob a forma de sobrenadante líquido, obtendo deste modo ácido láctico recuperado. O precipitado pode ser removido por centrifugação.

[238] Quando a taxa de teor de água no licor de fermentação é reduzida por desidratação antecipadamente, é aumentado o efeito do álcool funcionando como um solvente fraco. Portanto, uma aumentada quantidade de contaminantes é precipitada, e deste modo uma aumentada extensão de solutos diferentes de ácido láctico é removida do licor de fermentação produzindo ácido láctico com uma menor quantidade de impurezas.

[239] O sobrenadante resultante pode ser adicionalmente processado como tal para formar lactida. Alternativamente, o sobrenadante pode ser destilado para obter LA em forma concentrada e ressus- pendida em um solvente aquoso ou orgânico. Será reconhecido que realizar separação por destilação e semelhantes depois da extração usando um álcool com 5 ou mais átomos de carbono apresenta dificuldades uma vez que tem um alto ponto de ebulição. Por exemplo, enquanto o metanol tem um ponto de ebulição de 65°C, o etanol tem um ponto de ebulição de 78°C, o n-propanol tem um ponto de ebulição de 97°C, o isopropanol tem um ponto de ebulição de 82°C, o isobutanol tem um ponto de ebulição de 108°C, o terc-butanol tem um ponto de ebulição de 82,5°C, o 2-butanol tem um ponto de ebulição de 100°C, e o 1-butanol tem um ponto de ebulição de 118°C, os pontos de ebulição de isômeros de pentanol são de 112 a 137°C, com a exceção de que 2-metil-2-butanol tem um ponto de ebulição de 102°C. Além disso, o custo destes alcoóis é maior do que o de um álcool de baixo peso molecular. A temperatura na extração pode ser uma temperatura variando a partir de temperatura ambiente até o ponto de ebulição de cada solvente. Por exemplo, no caso do etanol, a extração pode ser realizada em uma temperatura variando a partir de temperatura ambiente até 78°C. Além disso, em um caso onde os solventes são usados em combinação, é desejável que a temperatura seja estabelecida levando em conta o ponto azeotrópico dos solventes combinados e da água. Por conseguinte, quando o sobrenadante contendo ácido láctico é aquecido no mínimo até o ponto azeotrópico do solvente e da água, a água pode ser evaporada do sistema de reação para desidratar o sobrenadante. O aquecimento é realizado preferencialmente com agitação. A desidratação do sobrenadante conforme descrito acima pode ser realizada também por aquecimento sob pressão reduzida.

[240] O ácido láctico pode ser suspendido em um solvente adequado, por exemplo, por exemplo, Alamina 336, DMSO, tolueno, mesi- tileno, etilbenzeno e espírito mineral preferencialmente em um solvente hidrofóbico. A solução de ácido láctico recuperado é convertida em lactida em uma etapa subsequente.

[241] O ácido láctico, obtido por extração (etapas (A) e (B)), por stripping (etapa (C) e (D)) ou presente no meio de fermentação clarificado, é convertido em lactida usando métodos conhecidos na técnica.

[242] De modo geral, métodos conhecidos compreendem conversão através de policondensação de ácido láctico para formar oligô- meros de ácido láctico os quais em seguida formam lactida; a oligome- rização ocorre particularmente quando o ácido láctico está presente em um solvente não aquoso ou orgânico. Os métodos referidos são descritos, por exemplo, na patente internacional No. WO 99/19290, na patente dos Estados Unidos No. US 5.332.839, na patente internacional No. WO 92/05167, e na patente internacional No. WO 95/09142 as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, by referência.

[243] Alternativamente, métodos conhecidos compreendem a conversão de ácido láctico diretamente em lactida sem a formação de oligômeros de ácido láctico intermediários. A conversão direta é facilitada particularmente quando o ácido láctico está presente em um solvente essencialmente aquoso. Os métodos referidos são descritos, por exemplo, na patente internacional No. WO 92/05167, na patente dos Estados Unidos No. US 5.274.127, na patente internacional No. WO 95/09142, na patente dos Estados Unidos No. US 5.319.107, na patente dos Estados Unidos No. US 5.332.839 e na patente dos Estados Unidos No. US 5.420.304 as quais são incorporadas aqui, a este re-querimento de patente, por referência.

[244] Outras técnicas são descritas na patente Alemã No. DE 1234703, na patente Alemã No. DE 267826, na patente dos Estados Unidos No. US 5.053.522, na patente internacional No. WO95/09879, na patente dos Estados Unidos No. US 1.995.870 e na patente dos Estados Unidos No. US 4.797.468 as quais também são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, by referência.

[245] Onde o ácido láctico recuperado de uma etapa está presente em um solvente orgânico (por exemplo, DMSO, Alamina 336, toluene, mesitileno, etilbenzeno e mineral spirit), particularmente em um solvente hidrofóbico, a mistura é aquecida até uma temperatura para direcionar a condensação de ácido láctico para oligõmeros de ácido láctico. Dependendo do solvente, esta etapa de aquecimento pode ser realizada a 160°C a 50 mm de Hg no caso da Alamina 336, ou a 180°C em pressão atmosférica no caso do DMSO. O aquecimento também pode servir para evaporar adicionalmente água, além de direcionar a condensação para oligõmeros de ácido láctico. Opcionalmente, o aquecimento pode ser precedido por uma etapa inicial de remoção de água, por exemplo, por evaporação através de aquecimento. O peso molecular médio dos oligõmeros é tipicamente cerca de 600 a 800. A mistura da reação é em seguida resfriada. O resfriamento é tipicamente na faixa de 60°C a 120°C. Quando o solvente é Alamina 336, a mistura é resfriada até 60°C, quando é DMSO, é resfriada até 117°C. Com alguns solventes (por exemplo, Alamina 336), a mistura pode se dividir em duas fases; uma fase a qual é solvente de extração quer puro, e outra contendo oligômero de ácido láctico. Estas fases são fisicamente separadas. A solução contendo oligômero de ácido láctico é aquecida de modo que é obtida lactida na fase de vapor o qual pode ser condensado. O aquecimento é na faixa de 140 a 180°C, e uma pressão de 5 a 10 mm de Hg. Quando o solvente é Alamina 336, o aquecimento pode ser até 180°C a 5 mm de Hg; quando é DMSO, o aquecimento pode ser até ser 145°C a 10 mm de Hg. Um catalisador semelhante pode ser adicionado a solução de oligômero de ácido láctico. Exemplos de catalisadores adequados incluem um catalisador de estanho, por exemplo, octanoato de estanho (II), e FASCAT 9102 (um tris-2-etil-hexanoato de butilestanho). O catalisador pode ser adicionado a cerca de 0,1 a 0.5% em peso. A lactida condensada é coletada. Este processo pode ser realizado sobre o extrato contendo ácido láctico (i), particularmente onde Alamina 336 foi usada como o solvente de extração. Também é adequado para utilização diretamente sobre o extrato contendo ácido láctico (i) sem uma etapa de stripping.

[246] Alternativamente, onde o ácido láctico recuperado de uma etapa anterior está presente em uma fase aquosa, por exemplo, do meio de fermentação purificado ou depois de stripping (etapa (C)), pode ser convertido em lactida por vaporização do ácido láctico recuperado. As técnicas referidas são de conhecimento geral na técnica, conforme descrito por exemplo na patente dos Estados Unidos No. US 5.332.839 a qual é incorporada aqui por meio de referência. O vapor é passado através de um reator mantido em temperatura elevada, e no qual opcionalmente é disposto um catalisador de alumina. É retirado do reator o produto lactida, água, e alimentação de ácido láctico aquoso não reagido as quais são submetidas a separação para recuperação do produto lactida. A alimentação de ácido láctico não reagido se-parada é elegível para readmissão no processo para produzir lactida adicional. Este processo cíclico compreende as etapas de passar composição de alimentação de ácido láctico aquoso para dentro de uma zona de vaporização junto com filtrado de ácido láctico aquoso não reagido de outro etapa do processo e formação na mesma de vapores de alimentação de ácido láctico aquoso. Os vapores gerados deste modo são então passados através de uma zona de reação de fase de vapor mantida em temperatura elevada para formar lactida na mesma. Lactida como um sólido é separada do filtrado de ácido láctico aquoso não reagido; e o filtrado é reciclado para dentro da zona de vaporização na etapa inicial do processo. A solução aquosa de ácido láctico podem ser enriquecida primariamente em ácido láctico mono- mérico (L1A), e ácido láctico dimérico (L2A), e algum ácido láctico tri- mérico (L3A), e exaurida em oligômeros superiores (LnA). A solução aquosa de ácido láctico podem ser proporcionada como uma alimentação.

[247] A solução aquosa de ácido láctico pode ser convertida em lactida por: (a) conversão de ácido láctico aquoso para sua fase de vapor; (b) passagem dos vapores através de uma zona de reação da fase de vapor mantida em temperatura elevada; e (c) retirada da referida zona de reação da lactida, da água, e da alimentação de ácido láctico aquoso não reagido. A temperatura elevada preferencialmente varia a partir de cerca de 150°C a 225°C. Os vapores são preferencialmente passadas através da referida zona de reação da fase de vapor com o auxílio de um gás de veículo. O gás de veículo preferencialmente compreende nitrogênio. A zona de reação da fase de vapor preferencialmente contém um catalisador de alumina. O método pode compreender uma etapa adicional (d) de passar a retirada referida de lactida, água, e alimentação de ácido láctico aquoso não reagido através de um ciclone a frio para separação. Qualquer ácido láctico oligomérico na solução aquosa de ácido láctico (alimentação) pode ser convertido para um ou mais de L1A, L2A, ou L3A com água para sua conversão para sua fase de vapor. A solução aquosa de ácido láctico (alimentação) pode ser ácido láctico monomérico (L1 A).

[248] A solução aquosa de ácido láctico pode ser convertida para lactida por: (a) passagem da composição de ácido láctico aquoso (por exemplo, de uma alimentação) para dentro de uma zona de vaporização junto com filtrado de ácido láctico aquoso não reagido de outra etapa do processo e na mesma formação de vapores de alimentação de ácido láctico aquoso; (b) passagem dos vapores referidos através de uma zona de reação da fase de vapor mantida em temperatura elevada para formar lactida na mesma; (c) separação da lactida como um sólido do filtrado de ácido láctico aquoso não reagido; e (d) passagem do referido filtrado para dentro da zona de vaporização referida na etapa (a) do processo. A temperatura elevada preferencialmente varia a partir de cerca de 150°C até 225°C. Os vapores de alimentação são preferencialmente passados através da referida zona de reação da fase de vapor com o auxílio de um gás de veículo. O gás de veículo preferencialmente compreende nitrogênio. A zona de reação da fase de vapor preferencialmente contém um catalisador de alumina. Qualquer ácido láctico oligomeico na solução aquosa de ácido láctico (alimentação) pode ser convertido para um ou mais de L1A, L2A, ou L3A com água para sua conversão para sua fase de vapor. A solução aquosa de ácido láctico (alimentação) pode ser ácido láctico monomérico (L1 A). A lactida pode ser separada como um sólido a partir de fil-trado de ácido láctico aquoso não reagido por filtração por centrifugação a frio. O filtrado pode ser submetido à destilação para concentrar o teor de ácido láctico do mesmo antes de ser passado para dentro da zona de vaporização referida. O filtrado pode ser desidratado por destilação até um grau de polimerizaçâo (DP) de não substancialmente acima de cerca de 2.

[249] Onde o ácido láctico está presente a partir do processo anterior em uma solução aquosa, lactida pode ser formada por remoção de água da solução aquosa de ácido láctico. A lactida formada deste modo pode ser separada do produto bruto. A técnica referida é de conhecimento geral na técnica, por exemplo, na patente internacional No. WO 92/05167 a qual é incorporada aqui por meio de referência. A remoção de água pode ser realizada por qualquer técnica, por exemplo, por aquecimento, por osmose ou pela adição de um absorvente de água o qual preferencialmente reagecom água para formar um composto que é inócuo para a formação de lactida. Onde o aquecimento é empregado, a água pode ser removida por destilação em uma temperatura elevada (por exemplo, 150°C a 225°C), a qual leva a oligomeri- zação do ácido láctico; a destilação prossegue até o grau de polimerização não ser substancialmente acima de 2. Preferencialmente a destilação é conduzida sob vácuo. Onde um absorvente de água é usado, pode incluir um composto tal como um anidrido (por exemplo, anidrido acético), um acetal (por exemplo, dietil acetal de acetaldeído), uma carbodiimida e cetal (por exemplo, dimetil cetal de acetona). Separação pode ser realizada por lavagem com água fria, destilação fracionária, extração por solvente ou recristalização de solvente. Um solvente de codestilação pode ser empregado, tal como um benzeno de alquila. Um benzeno de alquila pode ser selecionado entre o grupo consistindo de dodecil benzeno, tridecil benzeno e misturas dos mesmos.

[250] Outra técnica adequada para formação de lactida a partir de uma solução aquosa de ácido láctico por remoção de água pode ser conforme descrito na patente dos Estados Unidos No. US 5.319.107. A água pode ser removida por uma variedade de métodos, incluindo, mas não limitados a, remoção da água como um azeótropo no qual os componentes reativos são diluídos em um solvente azeo- trópico, aquecimento em uma temperatura elevada abaixo da tempera- tura de vaporização do ácido láctico em uma pressão apropriate quer na ausência ou presença de um solvente orgânico não azeotrópico, adicionando um absorvente de água o qual preferencialmente reage com água, usando peneiras moleculares ou membranas de particio- namento (por exemplo, osmóticas), usando sais anídricos que formam cristais hidratados com água, contatando o fluxo de alimentação com água e materiais absorptivos, tais como polissacarídeos (por exemplo, Ficoll) ou sílica.

[251] Exemplos de solventes azeotrópicos incluem solventes aromáticos imiscíveis em água, solventes de hidrocarboneto alifáticos ou cíclicos imiscíveis em água e solventes homogêneos. Exemplos particulares são discutidos abaixo. Exemplos de solventes não azeotrópicos incluem compostos aromáticos, tais como aromáticos haloge- nados, tais como aromáticos clorados e aromáticos fluorados, naftale- no, e anilina. Exemplos de absorvente de água incluem anidridos, tais como anidrido acético; cetais, tais como dimetil cetal de acetona; ace- tais, tais como dietil acetal de acetaldeído; e carbodiimidas. Exemplos de peneiras moleculares incluem zeólitos. Exemplos de sais anídricos incluem sulfato de sódio anídrico e sulfato de magnésio anídrico.

[252] Métodos preferenciais para remoção de água incluem remoção de água como um azeótropo com um solvente orgânico e aquecimento do fluxo de alimentação sob pressão reduzida.

[253] Um método mais preferencial é remoção da água como um azeótropo de um fluxo de alimentação de ácido láctico, o qual é discutido como se segue. O tratamento de um fluxo de alimentação contendo ácido láctico para formar ésteres cíclicos pode ser influenciado por vários parâmetros incluindo temperatura, pressão, tempo de reação, presença de um catalisador, e presença de agentes de bloqueio. A temperatura do tratamento do fluxo de alimentação controla tanto a taxa de remoção de água livre quanto a taxa de esterificação. A tem- peratura do tratamento do fluxo de alimentação para ciclização e remoção de água é uma temperatura, para um dado conjunto de outros parâmetros de tratamento, que é suficientemente elevado para forma-ção eficaz de ésteres cíclicos e não tão elevada de modo a converte os componentes de ácido láctico em aldeídos, monóxido de carbono ou outros produtos de degradação. Preferencialmente, a temperatura da produção de lactida varia a partir de cerca de 55°C até cerca de 250°C. Mais preferencialmente a temperatura é a partir de cerca de 60°C até cerca de 225°C. Quando usado, a escolha do solvente influencia a temperatura da reação, particularmente quando a reação está sendo conduzida no ponto de ebulição do solvente

[254] A pressão do tratamento do fluxo de alimentação também pode influenciar a formação de lactida. Por exemplo, em maiores pressões, podem ser usadas maiores temperaturas de reação para um dado solvente o qual resulta em taxas de reação mais rápidas, particularmente em um tratamento de fase de vapor. No entanto, a pressão pode ser ou atmosférica, maior do que atmosférica ou menor do que atmosférica. Uma pressão preferencial da presente invenção é pressão atmosférica.

[255] O tratamento do fluxo de alimentação pode ser conduzido por tempos variáveis e tipicamente é conduzido até a formação de ésteres cíclicos ser substancialmente maximizada conforme determinado por técnicas analíticas apropriadas. O tempo da reação logicamente variará de acordo com outros parâmetros tais como temperatura e a presença de catalisador. Por exemplo, a formação de lactida a partir de ácido láctico diluído em tolueno por remoção de água como um azeótropo com tolueno por aquecimento a partir da temperatura ambiente é substancialmente maximizada dentro de cerca de 2 a cerca de 5 horas. Tempos mais curtos podem ser preferenciais de modo a mi-nimizar a degradação de lactida e racemização.

[256] Um catalisador pode ser usado para aumentar a taxa de ciclização. Embora não sejam necessários catalisadores, é preferencial o uso de catalisadores estáveis que não degradam na reação. Para métodos de produção de fase líquida, há muitos, os quais incluem catalisadores de esterificação de fechamento de anel, os quais podem ser usados incluindo, mas não limitados a catalisadores acidíferos de permuta de íons, tais como Nation e Dowex 50; catalisadores acidíferos solúveis, tais como ácido sulfúrico, ácido metano sulfônico, ácido trifluorometano sulfônico, e ácido tolueno sulfônico; catalisadores à base de sílica, tais como alumina-silicato; outros catalisadores acidíferos heterogêneos sólidos, tais como alumina, eta, teta, delta e gama alumina, sílica, sulfato de alumínio, óxido de chumbo, trióxido de anti- mônio, trifluoreto de boro, berília, ítria; catalisadores de ésteres metálicos, tais como octoato estanoso e tetra(isopropóxido) de titânio; enzimas, tais como hidrolases; zeólitos; os chamados catalisadores modelo, tais como óxido de di-n-butilestanho; catalisadores micelares, incluindo catalisadores polares tais como sais de sulfossuccinato tais como di(2-etil-hexil) sulfosuccinato de sódio vendido como Aerosol OT pela Pfizer, catalisadores não polares tais como polioxiletileno nonil fenol, e fosfatas. Catalisadores preferenciais incluem zeólitos e catalisadores acidíferos, tais como Dowex 50, gama alumina, e ácido tolueno sulfônico.

[257] A quantidade de catalisador usada vai variar dependendo dos parâmetros de tratamento, tais como temperatura e pressão, reati- vidade do catalisador e o aumento da taxa de reação desejado. Deste modo, dependendo da cinética da reação e do tratamento de um fluxo de alimentação, podem existir quantidades ótimas de catalisador para produção de éster cíclico. Em maiores ou menores quantidades de catalisador, as taxas de conversão podem diminuir.

[258] A utilização de alguns catalisadores e outros parâmetros de reação pode ser controlada para obter um produto de éster meso- cíclico desejado. Por exemplo, a lactida tem dois átomos de carbono assimétricos, portanto, pode ser obtida em três forma estereoisoméri- cas: L-lactida na qual ambos os átomos de carbono assimétricos possuem a configuração L (ou S); D-lactida na qual ambos os átomos de carbono assimétricos possuem a configuração D (ou R); e meso- lactida na qual um átomo de carbono assimétrico tem a configuração L e o outro tem a configuração D. L-lactida e D-lactida são enantiômeros ao passo que meso-lactida é um diastereômero de L-lactida e D- lactida no qual os grupos metila são trans um para o outro no anel dioxanadiona. A manutenção da quiralidade em ácido L-láctico levará exclusivamente à formação de L-lactida a qual tem utilidade na produção de polímeros degradáveis. No entanto, a racemização da quiralidade originalmente em ácido L-láctico levará à produção de meso- lactida a qual também tem uma utilidade chave como um comonômero com L-lactida na produção de polímeros degradáveis. Variando as condições e os catalisadores usados em cada uma das modalidades descritas para esta invenção, a lactida obtida a partir de matéria-prima de ácido L-láctico, ou fluxo de alimentação, pode ser ou quase exclusivamente L-lactida ou pode conter quantidades controladas de meso-lactida além de L-lactida. Por exemplo, foi visto que a utilização de um catalisador acidífero na produção de lactida resulta em pro-dução aumentada de meso-lactida.

[259] Em outra modalidade da presente invenção, agentes de bloqueio ou de grupo final podem ser empregados para bloquear a formação de oligõmeros de ácido hidróxi carboxílico maiores em tamanho do que o ácido láctico dimérico. São úteis agentes de bloqueio, tais como anidridos, cetonas, e aldeídos. Em particular, acredita-se que os agentes de bloqueio referidos bloqueiem grupo de álcool sobre o hidróxo ácido, deste modo prevenindo a formação de ésteres. Preferencialmente com a utilização de agentes de bloqueio, o fluxo de ali- mentação pode ser enriquecido para formação de dímeros de ácido láctico a partir de ácido láctico sem formação significativa de trímeros de ácido láctico ou de oligômeros superiores. Subsequentemente, os agentes de bloqueio podem ser removidos para permitir a formação de lactida a partir de dímero de ácido láctico.

[260] Onde o ácido láctico de uma etapa anterior está em solução aquosa, lactida pode ser formada pela destilação de ácido láctico em pressão reduzida, por exemplo, opcionalmente na presença de catalisador conforme revelado na patente alemã No. DE 1234703, na patente alemã No. DE 267826, na patente dos Estados Unidos No. US 5.053.522, na patente Internacional No. WO95/09879, na patente dos Estados Unidos No. US 1.995.870 e na patente dos Estados Unidos No. US 4.797.468, as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. A lactida está presente no destilado. A destilação pode ser realizada em uma temperatura na faixa entre 130°C a 230°C. A pressão pode ser entre 13 e 25 torr. O catalisador pode ser pó de estanho, um haleto de estanho ou um composto de estanho orgânico derivado de um ácido carboxílico tendo até 20 átomos de carbono.

[261] A lactida obtida pode ser polimerizada em PLA por meio de métodos conhecidos per se, por exemplo, por polimerização por abertura de anel na presença de um catalisador de metal, tal como um catalisador de estanho ou um livre de estanho. Exemplos de técnicas são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. US 2.758.987, na Patente No. BE1008099, na Patente Internacional No. W02004014889, na Patente dos Estados Unidos No. US 7.488.788, e na Patente dos Estados Unidos No. US 6.166.169 as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

[262] O método de polimerização geralmente produz PLA de alto número médio de peso molecular (Mn) entre 75.000 e 100.000 Dál- tons. O PLA pode ter uma polidispersidade entre 1,4 e 1,9. O termo polidispersidade, conhecido na técnica, é a proporção de peso médio de peso molecular (Mw) e número médio de peso molecular (Mn). A polimerização de lactida em PLA pode prosseguir em uma temperatura entre 160°C e 195°C. A lactida é preferencialmente contatada com um catalisador de metal. Catalisadores adequados podem ser catalisador de fórmula geral M(Y1,Y2, ...Ym)n, na qual M é um metal selecionado entre o grupo compreendendo os elementos das colunas 3 a 12 da tabela periódica de elementos, bem como os elementos Al, Ga, In, TI, Ge, Sn, Pb, Sb, Ca, Mg e Bi; ao passo que Y1, Y2, ... Ym são cada um substituintes selecionados entre o grupo compreendendo radicais alquila com 1 a 20 átomos de carbono, radicais aril tendo de 6 a 30 átomos de carbono, radicais alcóxi tendo de 1 a 20 átomos de carbono, radicais arilóxi tendo de 6 a 30 átomos de carbono, e outros grupos óxido, carboxilato, e haleto bem como elementos do grupo 15 e/ou 16 da tabela periódica; men são inteiros entre 1 e 6. Como exemplos de catalisadores adequados, podemos mencionar especialmente os compostos de Sn, Ti, Zr, Zn, e Bi; preferencialmente um alcóxido ou um carboxilato e mais preferencialmente Sn(Oct)2, Ti(OiPr)4, Ti(2-etil- hexanoato)4, Ti(2-etil-hexilóxido)4, Zr(0iPr)4, Bi(neodecanoato)3 ou Zn(lactato)2. Outros catalisadores adequados podem ser catalisador de fórmula geral (I): em que

[263] R1 e R2 são cada um de modo independente C1-1 o alquila,

[264] R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-10 alqui la, ou

[265] R3 e R4 são unidos um ao outro de modo covalente e são cada um metileno e

[266] R5 é C1-10 alquila,

[267] X1 é selecionado entre C1-10 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-10 alquila, e R7 é Ci-6 alquila.

[268] O termo "C1-10 alquila", como um grupo ou parte de um grupo, se refere a um radical hidrocarbila de Fórmula CnH2n+i em que n é um número variando de 1 a 10. De modo geral, os grupos alquila compreendem de 1 a 10 átomos de carbono, preferencialmente de 3 a 10 átomos de carbono, mais preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos de carbono. Os grupos alquila podem ser lineares, ramificados ou cíclicos e podem ser substituídos conforme indicadas aqui, neste requerimento de patente. Quando um subscrito é usado aqui, neste requerimento de patente, depois de um átomo de carbono, o subscrito se refere ao número de átomos de carbono que o grupo denominado pode conter. Deste modo, por exemplo, C1-10 alquila inclui todos os grupos alquila lineares, ou ramificados ou cíclicos com entre 1 e 10 átomos de carbono, e deste modo inclui, por exemplo, metila, etila, n- propila, /-propila, 2-metil-etila, butila e seus isômeros (por exemplo, n- butila, /-butila e f-butil); pentila e seus isômeros, hexila e seus isômeros, heptila e seus isômeros, octila e its isomers, nonila e seus isômeros, decila e seus isômeros e semelhantes. Por exemplo, Ci-6 alquila inclui todos os grupos alquila lineares, ou ramificados ou cíclicos com entre 1 e 6 átomos de carbono, e deste modo inclui, por exemplo, metila, etila, n-propila, /-propila, 2-metil-etila, butila e seus isômeros (por exemplo, n-butila, /-butila e f-butil); pentila e seus isômeros, hexila e seus isômeros.

[269] O termo "C6-30 arila", como um grupo ou parte de um grupo, se refere a um grupo hidrocarbila, aromático poliinsaturado tendo um único anel (isto é, fenil) ou múltiple anéis aromáticos fundidos juntos (por exemplo, naftaleno), ou encadeados de modo covalente, tipicamente contendo 6 a 30 átomos; em que no mínimo um anel é aromático. Exemplos não limitantes de Ce soaril compreendem fenila, bifenilila, bifenilenila, ou 1-ou 2-natanelila.

[270] R1 e R2 são cada um de modo independente C1-10 alquila; preferencialmente, R1 e R2 são cada um de modo independente Ci-6 alquila; preferencialmente, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-4 alquila; por exemplo, R1 e R2 pode ser cada um de modo independente selecionado entre o grupo consistindo de metila, etila, n- propila, /-propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila; preferencialmente, R1 e R2 pode ser cada um de modo independente selecionado entre o grupo consistindo de metila, etila, /-propila e f-butila; por exemplo R1 e R2 pode ser cada um de modo independente selecionado entre /-propil ou f-butila; preferencialmente, R1 e R2 são f-butila,

[271] R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-10 alqui la, preferencialmente, R3, R4 e R5 são cada um de modo independente Ci-6 alquila, preferencialmente R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-4 alquila, por exemplo, R3, R4 e R5 pode ser cada um de modo independente selecionado entre o grupo consistindo de metila, etila, n-propila, /-propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila; por exemplo, R3, R4 e R5 pode ser cada um de modo independente selecionado entre o grupo consistindo de metila, etila, /-propila e f-butila; por exemplo, R3, R4 e R5 são cada um de modo independente selecionado entre metila ou etila; preferencialmente, R3, R4 e R5 são cada um de modo independente metila, ou R3 e R4 são unidos um ao outro de modo covalente e são cada um metileno e R5 é C1-10 alquila; preferencial- mente R5 é C1-6 alquila; preferencialmente, R5 é C1-4 alquila; por exemplo R5 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, n-propila, /-propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila; por exemplo R5 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, /- propila e f-butila; por exemplo R5 pode ser selecionado entre metil ou etila; por exemplo R5 pode ser metila;

[272] X1 é selecionado entre C1-10 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-10 alquila, e R7 é C1-6 alquila; preferencialmente, X1 é selecionado entre C1-6 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-6 alquila, e R7 é C1-6 alquila; preferencialmente, X1 é selecionado entre C1-4 alquila, -OR6, ou - N(SiR73)2, R6 é C1-4 alquila, e R7 é C1-4 alquila; por exemplo X1 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, n-propila, /- propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila, ou -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, n- propila, /-propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila, e R7 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, n-propila, /- propila, 2-metil-etila, n-butila, /-butila e f-butila; preferencialmente, X1 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, /- propila e n-butila, ou -OR6, R6 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, 7-propi e f-butila; preferencialmente, X1 pode ser selecionado entre -OR6, R6 pode ser selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, /-propila e f-butila; preferencialmente, X1 pode ser -OR6, e R6 é etila.

[273] Em uma modalidade, R1 e R2 são cada um de modo independente Ci-6alquila. Preferencialmente, R1 e R2 pode ser cada um de modo independente selecionado entre 0 grupo consistindo de metila, etila, /-propila e f-butila; por exemplo R1 e R2 pode ser cada um de modo independente selecionado entre /-propil ou f-butila; preferencialmente, R1 e R2 são f-butila.

[274] Em uma modalidade, R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-6 alquila. Por exemplo, R3, R4 e R5 pode ser cada um de modo independente selecionado entre o grupo consistindo de metila, etila, /-propila e f-butila; preferencialmente, R3, R4 e R5 pode ser cada um de modo independente selecionado entre metil ou etila; mais preferencialmente, R3, R4 e R5 podem ser metila.

[275] Por exemplo, o processo pode ser realizado com um catalisador de Fórmula (I) em que, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-6 alquila; R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-6 alquila; e X1 é selecionado entre Ci-6 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-6 alquila, e R7 é C1-6 alquila.

[276] Por exemplo, o processo pode ser realizado com um catalisador de Fórmula (I) em que, R1 e R2 são cada um de modo independente Ci-6 alquila; R3 e R4 são unidos um ao outro de modo covalente e são cada um metileno e R5 é Ci-6 alquila; e X1 é selecionado entre Ci-6 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é Ci-6 alquila, e R7 é Ci-6 alquila.

[277] Por exemplo, a polimerizaçâo de lactida em PLA pode ser realizada com um catalisador de Fórmula (I) em que, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-4 alquila; R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-4 alquila, X1 é selecionado entre C1-4 alquila, - OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-4 alquila, e R7 é C1-4 alquila.

[278] Por exemplo, a polimerizaçâo de lactida em PLA pode ser realizada com um catalisador de Fórmula (I) em que, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-4 alquila; R3 e R4 são unidos um ao outro de modo covalente e são cada um metileno e R5 é C1-14 alquila; e X1 é selecionado entre C1-4 alquila, -OR6, ou -N(SiR73)2, R6 é C1-4 alquila, e R7 é C1-4 alquila.

[279] Em uma modalidade preferencial, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-4 alquila, preferencialmente t-butil ou isopropila; R3, R4 e R5 são cada um de modo independente C1-2 alquila, X1 é - OR6, e R6 é C1-2 alquila.

[280] Em uma modalidade preferencial, R1 e R2 são cada um de modo independente C1-4 alquila, preferencialmente t-butil ou isopropila; R3 e R4 são unidos um ao outro de modo covalente e são cada um me- tileno e R5 é C1-2 alquila; X1 é -OR6, R6 é C1-2 alquila.

[281] Em uma modalidade, 0 catalisador é de Fórmula (la), (lb), (lc) ou (Id),

em que R1, R2, R3, R4, R5 e X1 têm 0 mesmo significado que 0 definido acima.

[282] Em uma modalidade, o referido catalisador de Fórmula (I) é (2,4-di-terc-butil-6-(((2- (dimetilamino)etil)(metil)amino)metil)fenóxi)(etóxi)zinco, também referido como "DDTBP-Zn (OEt)" representado pela Fórmula (III)

[283] (2,4-di-terc-butil-6-(((2- (dimetilamino)etil)(metil)amino)metil)fenóxi)(etóxi)zin-co pode ser pre-parado conforme descrito em Williams et al. (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 11350-59) por este incorporado por meio de referência.

[284] Em geral, a polimerização de lactida é realizada na presença deste tipo de catalisador, o qual é usado em uma quantidade tal que a proporção molar de lactida / catalisador é entre 1000 / 1 e 10.000 / 1, preferencialmente entre 2000 / 1 e 8000 / 1 e mais preferencialmente entre 4000 / 1 e 6000 / 1.

[285] O processo de polimerização desta invenção para polimeri- zar lactida na configuração D ou L é feito em volume, contatando a lactida com o catalisador em um reator preferencialmente equipado com um agitador para alta viscosidade ou extrusão em um extrusor (ou reator horizontal) de parafusos únicos, duplos ou múltiplos em uma atmosfera inerte na presença de argônio ou nitrogênio. No entanto, também pode ocorrer sob atmosfera ambiente.

[286] O processo de polimerização geralmente pode ser feito em uma temperatura entre 160°C e 195°C, preferencialmente entre 165°C e 190°C.

[287] A polimerização de lactida em PLA também pode ser feita na presença de estabilizantes e/ou antioxidantes de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Entre os agentes estabilizantes comumente usados incluem o (2,4-diterc-butilfenil) pentaeritritol difosfi- to também conhecido como Ultranox 626. A polimerização pode ser realizada de modo contínuo ou de modo intermitente.

[288] Preferencialmente, a lactida usada no processo da invenção é a configuração de L-lactida (LL lactida) ou configuração de lactida D (DD lactida), mais preferencialmente a configuração de lactida L.

[289] Em uma modalidade particular da invenção, o método também pode incluir o uso de um iniciador. O iniciador pode ser água residual contida na lactida, um álcool ou uma amina. Preferencialmente, o iniciador da polimerização de lactida é um álcool ou uma amina.

[290] O álcool ou a amina pode ser alifático ou aromático da fórmula R-(A)P onde p é 1 ou 2, A é OH ou NH2 e R é um radical alquila contendo 1 a 20 átomos de carbono ou aril tendo 6 a 30 átomos de carbono (C6-30 arila). Preferencialmente, R é um radical alquila tendo 3 a 12 átomos de carbono ou arila tendo 6 a 10 átomos de carbono. O alquila ou arila pode ser substituído ou não substituído. O alquila pode ser linear, cíclico, saturado ou insaturado. Entre as aminas incluem isopropilamina, 1,4-butanodiamina, 1,6-hexanodiamina, 1,4 ciclo- hexanodiamina. Entre os alcoóis incluem isopropanol, 1-octanol, 1,3- propanodiol, 1,3-butanediol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol, 1,7- heptanodiol, xileno glicol.

[291] A proporção molar de lactida e do iniciador, quando é um álcool ou uma amina pode ser entre 50/1 e 1500/1, preferencialmente entre 100/1 e 750/1, mais preferencialmente entre 300/1 e 600/1.

[292] O uso de catalisador livre de estanho, conforme descrito acima, permite a polimerização em massa de lactida em uma temperatura entre 160°C e 195°C com uma alta taxa de conversão de lactida em polilactida enquanto obtendo uma polilactida incolor, diretamente depois da polimerização, e alto número médio de peso molecular e baixa polidispersidade, este fenômeno de evitar a degradação do catalisador durante a polimerização. Este resultado foi bastante inesperado porque não pode ser obtido com outras espécies de catalisadores à base de zinco geralmente usados com tanto êxito para a solução de polimerizaçâo de lactida.

[293] A presente invenção será agora adicionalmente ilustrada por meio dos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento de três cepas de Monascus ruber LF4, LF5 e LF6 como cepas altamente tolerantes ao ácido láctico

[294] As cepas foram isoladas a partir do solo e de silagem de milho e trigo por incubação em meio em baixo pH, aumentando a con-centração de ácido láctico e variando as concentrações de concentrações de glicose e xilose.

[295] Uma cepa (LF4) foi isolada por incubação em meio DSMZ402 com 50 g/l de glicose, 50 g/l de xilose e 100 g/l de ácido láctico em pH 2,8 a 40°C.

[296] Outra cepa (LF5), foi isolada conforme descrito para LF4, mas em pH 2,4

[297] Uma terceira cepa (LF6), foi isolada por incubação em meio DSMZ402 com 25 g/l de xilose e 150 g/l de ácido láctico em pH 2,8 e 32°C.

[298] Estas três cepas da ordem de Monascus, mais particular-mente Monascus ruber foram consideradas capazes de crescer em baixo pH (2 a 3) na presença de concentrações elevadas de ácido láctico (até 150 g/L).

[299] As cepas LF4, LF5 e LF6 tolerantes a ácido láctico foram depositadas como depósito segundo o Tratado de Budapest pelo de-partamento de Food & Biobased Research da Stichting Dienst Land- bouwkundig Onderzoek, Bornseweilanden 9, 6708 WG Wageningen, Países Baixos em 21 de julho de 2010 e foram atribuídos os números de depósito CBS 127564, CBS 127565 e CBS 127566, respectivamen- te.

Exemplo 2: Transformação estável com um gene marcador selecioná- vel Materiais e métodos Transformação

[300] A maioria dos protocolos para modificação genética de Mo-nascus ruber envolve a transformação de protoplastos usando eletro- poração ou por combinação de CaCh e polietileno glicol. No entanto estes métodos frequentemente tiveram baixa eficiência de transformação e baixa estabilidade mitótica. Um método de transformação usando integração de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens com alta eficiência foi reportada em M. ruber (Yang 2008).

[301] Foi utilizado este sistema de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens para nossas cepas de M. ruber LF4, LF5 e LF6 e duas cepas de CBS selecionadas CBS 135.60 e CBS 503.70.

[302] As cepas de Agrobacterium contendo o vetor binário pUR 5750, descrito por de Groot et.al, 1998, foram obtidas da Plant Research International, WUR. Estas foram cultivadas a 30°C por 48 horas em meio mínimo suplementado com canamicina (100 pg/ml). As células (OD6OO~1.0) foram lavadas com meio de indução sem Acetosyrin- gone (AS) e cultivadas com e sem AS por 6 horas a 28°C. AS foi usada para indução de virulência e transferência de T-DNA. Conidiospores de Monascus ruber (107 esporos/ml) foram coletados de lâminas de PDA depois de 10 dias de cultura. Quando os conídios foram transformados, um volume igual de conídios foi misturado com um volume igual de A. tumefaciens e laminado sobre filtros de nylon colocados sobre meio de indução com e sem AS. As lâminas foram incubadas a 25°C por 4 dias. Os filtros foram em seguida transferidos para meio YM contendo 200 pg/ml de cefotaxima para matar as células de Agrobacterium e 100 pg/ml de higromicina para selecionar para trans- formantes.

[303] Depois de 10 a 14 dias colônias fúngicas de rápido cresci-mento foram transferidas para lâminas de YM fresco + higromica e ce- fotaxima. Depois de 5 dias de crescimento a borda da colônia foi trans-ferida de novo para algumas lâminas de YM fresco + higromicina e ce- fotaxima.

[304] A aplicação deste procedimento resulta em transformantes resistentes a higromicina para cada uma das cepas de Monascus se-lecionadas (vide a Tabela 1). Tabela 1. Número de transformantes por cepa de M. ruber

b) Estabilidade dos transformantes

[305] A primeira propriedade dos transformantes que nós abor-damos é a estabilidade genética. Com respeito a isto, são importantes duas características das cepas geneticamente modificadas:

[306] o gene alvo tem de ser integrao no genoma, e

[307] o gene tem de ficar no local e ativo mesmo sem a pressão de seleção do antibiótico

[308] A presença do DNA vetorial nos transformantes foi primeiro demonstrada por meio de PCR.

[309] DNA foi isolado de 7 transformantes (5 transformantes LF4 e 2 transformantes CBS 503.70) e de três cepas selvagens (LF4, CBS 503.70 e CBS 135.60) e submetidas a uma reação de PCR com iniciadores de DNA capazes de apresentar o gene de higromicina.

[310] O DNA dos transformantes claramente produz um fragmento de PCR do mesmo tamanho que o DNA vetor controle ao passo que a cepa selvagem não apresenta este fragmento de PCR. Isto demonstra a presença do gene de higromicina nos transformantes.

[311] De modo a estabelecer a integração do DNA vetorial no DNA genômico dos transformantes de M. ruber, foi realizada uma análise Southern blot. O DNA genômico foi blotted antes e depois de digestão com uma enzima de restrição. O blot foi hibridizado com uma sonda mostrando a presença do gene de higromicina.

[312] Nas alamedas com o DNA genômico, os sinais sobre o blot coincidem com a posição do DNA genômico significando integração do gene de higromicina no genoma. Nas alamedas com o DNA digerido os sinais são visíveis em diferentes posições (=diferentes fragmentos de DNA) significando integração aleatória do gene de higromicina.

[313] Em conclusão, nós estabelecemos integração genômica aleatória do DNA vetorial nas cepas de M. ruber.

[314] De modo a testar a estabilidade dos transformantes sem a pressão seletiva do antibiótico, as cepas foram cultivadas sobre lâminas de PDA (agar de dextrose de batata). Depois de crescimento por aproximadamente 14 doias, uma parte da borda externa da cultura foi transferida para uma lâmina de PDA fresco novamente sem higromicina. Este processo foi repetido 3 vezes. Finalmente uma parte da borda externa da cultura foi transferida para uma lâmina de PDA fresco com higromicina para ver se a cepa ainda era capaz de crescer na presença deste antibiótico.

[315] O número de transformantes ainda capazes de crescerem sobre lâminas seletiva depois deste procedimento foi classificado (Tabela 2). Tabela 2. Transformantes de M. rt/ber triad os pela estabilidade da re-sistência a higromicina.

[316] Uma segunda abordagem foi coletar esporos da lâmina depois de 3 transferências sem seleção de antibiótico e comparar o número de colônias aparecendo depois de disseminação dos esporos sobre lâminas de PDA com e sem higromicina (lâminas seletivas). Os esporos foram filtrados através de lã de vidro para minimizar a contaminação com fragmentos miceliais. Se o gene de higromicina for perdido ou inativado o número de colônias sobre lâminas seletivas é reduzido.

[317] Um teste com todas as cepas não mostrou redução no nú-mero de colônias sobre lâminas seletivas e não seletivas.

[318] Em conclusão, não há nenhuma evidência de instabilidade ou inativação do gene introduzido nos transformantes de M. ruber.

[319] Como um teste final o experimento de Southern blot descrito acima foi repetido com 27 cepas transgênicas depois da transferência sequencial sobre lâminas não seletivas e em seguida cultivadas em meio sem pressão seletiva.

[320] Esta análise Southern blot confirmou a presença do gene de higromicina no genoma dos transformantes de M. ruber depois de crescimento em meio não seletivo.

c) Construção de vetores de transformação

[321] De modo a ser capz de realizar transformações sequenciais sobre cepas de M. ruber, por exemplo, para introduzir múltiplos genes e/ou para combinar a introdução de genes com eventos de nocaute, nós ajustamos para construir vetores de transformação com outros marcadores selecionáveis.

[322] O vetor que tinha sido usado na transformação descrita no parágrafo anterior é o plasmídeo pUR5750. A Figura 1 mostra um mapa deste plasmídeo ("RB" = borda direita; "LB" = borda esquerda; "Hpt" = gene de higromicina fosfotransferase).

[323] Durante transformação a parte de DNA entre a RB (borda direita) e a LB (borda esquerda) é transferida para o genoma fúngico. O gene Hpt está localizado sobre esta parte. A atividade deste gene, sob regulação do gpd-promotor e do trpC-terminador, resulta em resistência à higromicina nos transformantes. De modo a facilitar a clonagem e a permuta de promotores, genes e terminadores neste vetor, nós designamos um cassete modelo. Conforme demonstrado na Figura 2, esta estratégia de clonagem nos permite permutar promotores, terminadores e genes no vetor mas também combinar 2 cassetes ge-néticos em uma fileira.

[324] Hpt é o gene da higromicina fosfotransferase dando resis-tência à higromicina a qual nós já usamos. Ble é o gene de bleomicina dando resistência à fleomicina ou à zeocina. Nptll é o gene da neomi- cina fosfotransferase dando resistência à neomicina (G418).

[325] Como o vetor de transformação pUR5750 é um vetor grande, o qual se tornará ainda maior quando genes adicionais são inseridos (vide a Figura 2), nós decidimos usar também uma versão mais curta deste vetor para a transformação de M. ruber. Em geral se presume que vetores menores podem ser manipulados mais facilmente durante experimentos de construção e de transformação.

[326] Este vetor menor é um derivado do pUR5750 e é codificado pCB301 (Xiang et al. 1999). Elementos de DNA típicos necessários para transformação de plantas, a função original da sequência básica de pUR5750, foram removidos deste plasmídeo deixando um vetor de 3574 pb. A Figura 3 mostra o pCB301 contendo o cassete de Hpt de- nominado pCGHT3 ("RB" = borda direita; "LB" = borda esquerda; "Hpt" = gene da higromicina fosfotransferase). Este vetor tem a metade do tamanho do vetor de Hpt original.

[327] De modo a ser capaz de usar um marcador selecionável como o gene Ble ou o gene Nptll, nós primeiro confirmamos a incapacidade do Monascus ruber para crescer em meios contendo concentrações de Zeocin ou G418 usadas principalmente em sistemas de transformação fúngica. Conídios e esporos das cepas LF4 e LF6 de Monascus ruber não foram capazes de crescer sobre lâminas de PDA contendo 600 pg/ml de Zeocina ou 200 pg/ml de G418.

[328] Usando os dois vetores básicos e três marcadores selecio-náveis, foram produzidos seis vetores (Tabela 3). Tabela 3. Os construtos vetoriais produzidos

d) Transformação com os seis vetores recém-construídos

[329] Uma mistura de conídios e ascosporos da cepa LF5 de M. ruber foi transformada com os seis vetores conforme descrito acima. Depois da etapa de cocultura os filtros com os conídios e ascosporos crescendo excessivamente foram transferidos para lâminas seletivas.

[330] As lâminas seletivas contêm meio YM com 200 pM de cefo- taxima para matar as células de Agrobacterium e ou 100 pg/ml de Hi-gromicina, ou 200 pg/ml de Zeocina, ou 200 pg/ml de Geneticina para selecionar para transformantes.

[331] Depois de aproximadamente 12 dias, as primeiras colônias em crescimento se tornaram visíveis sobre as lâminas seletivas.

[332] A Tabela 4 mostra o escore dos transformantes. Tabela 4. Transformantes obtidos a partir de conídios LF5.

[333] Crescimento disperso geral, nenhuma colônia específicavi- sível.

[334] As colônias foram transferidas para lâminas de PDA com antibióticos apropriados e depois de suficiente crescimento foram usadas como um inoculo para crescimento em meio líquido (YPD) contendo o antibiótico. O micélio foi colhido depois de 4 dias e o DNA foi isolado.

[335] De modo a estabelecer a integração do marcador genético selecionável no genoma dos transformantes LF5 de M. ruber, foram realizadas duas análises por PCR sobre uma série de transformantes. A primeira análise a qual mostrará a presença do marcador selecionável no DNA isolado é uma reação de PCR com iniciadores específicos para os marcadores genéticos. A segunda análise por PCR a qual excluiu a presença de DNA vetorial contaminante, possivelmente originário de bactérias A. tumefaciens sobreviventes, foi realizada com iniciadores específicos para o gene da GPD (gliceraldeído fosfato desidrogenase) de A. tumefaciens.

[336] Em conclusão foi demonstrados que os vetores Hpt e Nptll os quais tinham sido construídos de acordo com a estratégia de cassete são eficazes na transformação de M. ruber. A utilização do menor vetor à base de pCB301 parece resultar em mais transformantes do que os vetores à base de pUR5750. A análise por PCR mostra inte- gração dos marcadores genéticos selecionáveis no genoma de M. ruber e também mostra que as bactérias A. tumefaciens foram destruídas de modo eficaz pelo Cefotaxim.

11. Transformação com um gene de LDH Construção do Vetor

[337] Para a introdução de no mínimo uma cópia do gene de LDH Bovino (Sos taurus) no genom das cepas de Monascus ruber, a abor-dagem mais direta é a introdução de um gene de LDH Bovino de códon otimizado no cassete conforme descrito acima. As sequências de promotor e de terminador orientando a expressão do gene de LDH serão as mesmas que as sequências orientando o marcador genético selecionável.

[338] Para otimização de códon nós primeiro analisamos o uso de códons de Monascus. Como somente estão disponíveis dois genes de M. ruber, nós comparadmos o uso de códons de M. pilosus e de M. purpureus com o uso de códons dos genes de M. ruber. As três espécies são intimamente relacionadas e foi encontrada uma grande quantidade de similaridade entre a preferência de códons das três espécies de Monascus.

[339] Com base no uso de códons nós fomos capazes de projetar um gene de LDH Bovino otimizado para expressão nas cepas de M. ruber selecionadas (SEQ ID NO: 1 e Figura 4) e um gene semelhante foi sintetizado pela Genscript Corporation. Depois de obter este gene, este foi clonado em ambos os tipos de de vetores Hpt construídos e testados. A clonagem foi realizada de acordo com a estratégia de cassete demonstrada na Figura 2 a qual teve a vantagem de que o vetor original é inalterado com exceção de para a inserção do cassete pro- motor-LDH-terminador. Isto resulta em vetores pCGHTGBtLT com base no plasmídeo pCB301 (Figura 5) e pURGHTGBtLT com base no plasmídeo pUR5750 (Figura 6).

b) Clonagem e expressão do gene Bt-LDH em E. coli.

[340] De modo a confirmar a correta translação e a atividade do gene de LDH sintética usado para transformar M. ruber, o gene foi clo- nado em um vetor de expressão em E. coli. O vetor de expressão usado é o vetor pBAD102 da InVitrogen o gual expressará a proteína depois de indução por Arabinose.

[341] LDH foi altamente expressada em E. coli mas foi visto que é parcialmente solúvel.

[342] As proteínas de E. coli solúveis foram usadas para analisar a atividade enzimática da LDH.

[343] A reação catalisada pelo btLDH é:

[344] (L)-lactato + NAD(+) <=> piruvato + NADH

[345] Neste teste de atividade um excesso de piruvato e NADH é adicionado de modo que a atividade é refletida pela conversão de NADH para NAD a qual pode ser medida espectrofotometricamente a 340 nM.

[346] Como um controle positivo foi usada enzima LDH obtida da Sigma-Aldrich.

[347] A velocidade da reação foi determinada por uma redução na absorvéncia a 340 nm resultante da oxidação de NADH. Uma unidade causa a oxidação de um micromol de NADH por minuto a 25°C e em pH 7,3, sob as condições especificadas.

[348] Foi preparado 0,2 M de tampão Tris-HCI. A enzima LDH foi diluída antes do uso para obter uma taxa de 0,02 a 0,04 ΔA/min. em tampão Tris e mantida fria.

[349] Foi preparada uma mistura da reação de 2,8 mL de Tris-HCI, 0,2 M pH 7,3 e 0,1 mL de NADH a 6,6 mM.

[350] A atividade de LDH foi medida com e sem substrato adicio-nado, de modo a monitorar a conversão de NADH de base.

[351] A análise da expressão e da atividade da LDH sintética em E. coli mostra que o gene sintético codifica uma proteína do correto Mw e com atividade de LDH. A produção de glicose e lactose por estas cepas de E coli durante o tempo são mostradas na Figura 7 ("Coli- LDH 1, 2, e 3" correspondem a três extratos independentes de E. coli com a proteína LDH sintética expressada presente; "Coli-controle" é um extrato de E. coli expressando uma proteína diferente).

c) Transformação de Monascus ruber com os vetores de LDH.

[352] Uma mistura de conídios e ascosporos das cepas LF4, LF5 ou LF6 de M. ruber foi usada para transformação com os vetores de LDH pCGHTGBtLT e pURGHTGBtLT. Portanto no total foram realizadas 6 transformações. Depois de aplicar o procedimento de transformação conforme descrito acima e seleção sobre lâminas contendo higromicina somente foram obtidos três transformantes de LF5.

[353] Um transformante resultou do uso do vetor pCGHTGBtLT (LF5-t1) e dois do vetor pURGHTGBtLT (LF5-t2, LF5-t5).

d) Análise dos transformantes de M. ruber LF5-T1 e LF5-T2-LDH

[354] Em um primeiro experimento, foram analisados dois transformantes LF5-T1 e LF5-T2.

[355] LF5-T1 foi transformado com pCGHTGBtLT, e LF5-T2 com pURGHTGBtLT.

[356] De modo a analisar a atividade enzimática de LDH e a pos-sível produção de L-lactato, os dois transformantes e a cepa wt-LF5 foram cultivados em meio S.c. + 50 g/L de glicose pH 6,0.

[357] Amostras de meio e biomassa foram colhidas de culturas individuais depois de 24, 48, e 72 horas de cultura.

Consumo de glicose e produção de lactato

[358] As Figuras 8a e 8b mostram claramente o consumo de gli-cose em todas as culturas ao passo qeu no meio de LF5-T2 ácido láctico é detectado em concentração crescente com o tempo (os números 24, 48 e 72 indicam amostras de duas culturas separadas cultivadas por 24, 48 e 72 horas; "M" corresponde a meio). LF5-T2 consumiu aproximadamente 8 g/L de glicose e produziu aproximadamente 1,5 a 2 g/L de ácido láctico, indicando que foi atingido um rendimento entre 0,18 e 0,25 g/g. O rendimento teórico máximo é de 1,00 g/g.

(ii) Análise enzimática

[359] Como a análise por HPLC não discrimina entre ácido L- e D-láctico uma série de amostras foram analisadas por um método en-zimático. Um kit de análise de ácido L-láctico (Megazyme) confirmou a presença de ácido L-láctico nas amostras LF5-T2 (Figura 9).

[360] As amostras de biomassa colhidas foram congeladas em nitrogênio líquido e trituradas usando um almofariz e um pilão. O pó congelado foi degelado em tampão (0,2 M de Tris-HCI, pH 7,3) e a pro-teína foi extraída por turbilhonamento. Depois de centrifugação o so-brenadante foi submetido a análise de proteína e a uma análise de ati-vidade da enzima LDH conforme descrito no parágrafo anterior.

[361] Esta análise demonstrou claramente a presença de atividade de L-LDH no transformante LF5-T2, ao passo que não foi encontrada nenhuma atividade no controle (Figura 9).

(iii) Análise Southern blot

[362] Hibridização foi realizada usando o gene de LDH. Análise Southern blot confirma uma única integração do gene de LDH no genoma do M. ruber transformante t2, depois de crescimento em meio não seletivo.

[363] Foi visto que o transformante t1 não continha o gene de LDH. Uma segunda análise Southern com o gene de higromicina mostra integração do gene de higromicina em ambos os transformantes. Isto indica que no transformante t1, os cassetes genéticos, LDH e hi-gromicina entre ambas as bordas não foram completamente integrados.

(iv) Conclusão

[364] Usando os vetores de transformação construídos com uma combinação de um marcador selecionável e um gene de LDH sintético foram obtidos 27 transformantes de M. ruber. Um transformante, LF5- T2 mostra produção de ácido láctico quando cultivado sobre meio de glicose.

[365] A produção de ácido láctico, a atividade de L-LDH e southern blots corroboram a conclusão de que nós inserimos um L- LDH codificando gene heterólogo no genoma deste transformante LF5-T2 de M. ruber em um modo tal que é expressado e metabolica- mente ativo.

e) Análise de transformantes LF4-, LF5-, e LF6-LDH de M. ruber

[366] Em um experimento seguinte, um total de 35 transformantes foi analisado, isto é, 4 de LF4, 16 de LF5 e 15 de LF6. As cepas foram pré-cuItivadas em 10 ml de meio YEPD por 3 dias. A biomassa foi lavada em meio Sc com 10 g/L de glicose em pH 2,8 e foi cultivada em 15 ml de meio Sc com a mesma composição. O consumo de glicose pelas cepas é ilustrado na Figura 10. Dezenove (54%) destes transformantes, isto é, dois derivados de LF4, doze derivados de LF5 e cinco derivados de LF6, produziram ácido láctico a partir de glicose (Figura 10). Nos experimentos positivos, foram encontradas quantidades variáveis de ácido láctico, variando a partir de 0,5 até 3,3 g/L, correspondendo a 5 a 33% do rendimento teórico máximo (Figura 11). Etanol foi formado como subproduto, sua concentração inversamente relacionada com a concentração de ácido láctico (Figura 12).

[367] Dois transformantes de cada cepa foram selecionados (4t3, 4t4, 5t2, 5t21, 6t4, 6t5), um com a maior produção de ácido láctico e um com a menor produção de etanol. As cepas foram em seguida cultivadas em frascos de agitação (sobre ou glicose ou xilose (ambos 10 g/L)), sob duas condições de aeração diferentes: aeróbicas e oxigênio severamente limitado.

[368] Sob condições aeróbicas, as cepas foram pré-cuItivadas em frascos de agitação de 100 ml sobre 10 ml de YEPD por três dias. As culturas foram em seguida lavadas duas vezes com 25 ml de meio Sc, em pH 2,8. A biomassa foi homogeneizada em 10 ml do meso meio usando uma haste de agitação magnética triangular. 750 microlitros foram usados para inocular 15 ml de meio Sc, pH 2,8, contendo 10 g/L de glicose ou xilose (Figuras 13 a 15).

[369] Alternativamente, sob condições de oxigênio severamente limitado, as culturas foram realizadas em frascos fechados com uma rolha de borracha de butila capeada com alumínio equipada com válvulas de tubo de bicicleta para criar condições de oxigênio severamente limitado, quase anaeróbicas. Pré-cuItivadas em frascos de agitação de 100 ml sobre 10 ml de YEPD durante 3 dias. As culturas foram em seguida lavadas duas vezes com 25 ml de meio S.c, em pH 2,8. A bi-omassa foi homogeneizada em 10 ml do mesmo meio usando uma haste de agitação magnética triangular. 750 microlitros foram usados para inocular 15 ml de meio Sc, pH 2,8, contendo 10 g/L de glicose ou xilose.

[370] Nas culturas aeróbicas (painéis esquerdos das Figuras 13 a 15) parte do ácido láctico foi produzido (aproximadamente 0,5 a 1 g/L) a partir de glicose. O ácido láctico foi consumido depois da glicose ter sido totalmente consumida. Não foi formado nenhum etanol. Sob condições de oxigênio severamente limitado (painéis direitos das Figuras 13 a 15) a concentração de ácido láctico foi entre 2,0 e 3,3 g/L, e foi produzido etanol em concentrações variando entre 0,5 e 1,0 g/L.

Exemplo 3: Aprimoramento adicional da produção de ácido láctico por eliminação da produção de etanol. Identificação dos genes de piruvato descarboxilase usando homoloqia de sequências

[371] De modo a aumentar a produção de ácido láctico, foi previsto um sistema de nocaute genético para reduzir a produção de produtos diferentes do ácido láctico por um lado e para reduzir o metabolismo do ácido láctico por Monascus por outro lado. Mais particularmente, de modo a evitar a produção de álcool, foi previsto um sistema de nocaute com base em genes codificando homólogos de M. ruber do gene PDC1 de S. cerevisiae codificando piruvato descarboxilase (EC 4.1.1.1).

[372] M. ruber produz etanol sob condições de oxigênio limitado. Como tanto etanol quanto ácido láctico são produzidos a partir de pi-ruvato, a produção de etanol deve ser evitada uma vez que reduz a produção de ácido láctico.

[373] Usando BLAST com o gene de PDC1 de S. cerevisiae como a query nós descobrimos vários homólogos no genoma do Aspergillus niger os quais podem representar um gene codificando PDC. A. niger ioi usado devido a sua íntima relação com Monascus. Com base nestas sequências nós projetamos iniciadores de PCR degenerados de modo a ser capaz de clonar parte de um PDC de M. ruber.

[374] RT-PCR sobre RNA da cepa LF6 de M. ruber resultou em dois fragmentos de DNA de 1,3 kB os quais foram clonados em um plasmídeo. O sequenciamento destes fragmentos de PCR clonados confirmou a presença de dois frames de leitura aberta com alta homo- logia com os homólogos de PDC de Aspergillus niger e suficiente ho- mologia com o gene PDC1 de S. cerevisiae para concluir que clona- mos dois análogos de PDC1 de Monascus ruber.

[375] O quadro de leitura aberta para os genes de PDC de M. ruber PDC1 e PDC2 é proporcionado como SEQ ID NO: 3 e 4 (e Figu- rea 16 e 17).

b) Construção de um vetor de nocaute genético

[376] Nocaute de genes de PDC

[377] Usando PCR, as metades 5' e 3' dos genes PDC1 e PDC2 foram isoladas e sítios de restrição adequados são adicionados às ex-tremidades. As metades 5' são em seguida 5' clonadas do cassete promotor-marcador-terminador dos vetores pCGNTI e pCGBT2 (e 3' da sequência da Borda Direita). Estes vetores são idênticos ao vetor pCGHT3 previamente descrito, com a exceção de que os genes NPTII e BLE são usados como marcadores selecináveis ao invés do gene HPT. Do mesmo modo, as metades 3' correspondentes são 3' clonadas do cassete promotor-marcador-terminador (e 5' da sequência da Borda Direita). Desta maneira, são gerados três vetores:

[378] pPDC1::NPT para disrupção de PDC1 usando seleção por geneticina (Figura 18)

[379] pPDC2::NPT para disrupção de PDC2 usando seleção por geneticina (Figura 19)

[380] pPDC2::BLE para disrupção de PDC2 usando seleção por zeocina (Figura 20)

[381] Estes vetores são usados em um disruptante PDC1::NPT previamente construído

[382] Nocaute e inserção genética combinados

[383] Vetores foram construídos para permitir disrupção simultânea de um gene alvo e introdução de outro gene. De modo a minimizar recombinação indesejável em uma segunda rodada de transformação devido à presença de longos trechos de DNA no vetor e de modo a aumentar a eficiência de clonagem durante a construção do vetor , o tamanho das sequências de promotor e terminador foram reduzidos em novos vetores. Usando PCR o tamanho do promotor GPD foi reduzido de 2208 pb para 538 pb e o terminador TrpC foi reduzido de 763 pb para 278 pb. Estes são o vetor pCH#PDC1 e o vetor pCL1H#PDC1 (vide as Figuras 21 e 22). O vetor pCH#PDC1 é usado para a disrupção de PDC1 usando seleção por higromicina. O vetor pCL1H#PDC1 é usado para a disrupção de PDC1 e introdução de LDH usando seleção por higromicina. Os transformantes resultantes destes vetores têm disrupção de um gene PDC1 e um disrupção de um gene PDC1 + um gene de LDH inserido respectivamente. O vetor pCN#PDC2 foi construído para disrupção do gene PDC2 usando seleção por geneticina (Figura 23).

c) Produzindo transformantes de nocaute

[384] Nocaute de genes de PDC

[385] Esporos obtidos a partir do transformante de LF6 LDH t4 e t5 são usados em experimentos de transformação com os vetores de nocaute pPDC1::NPT ou pPDC2::NPT. Depois de seleção sobre G418 (geneticina) cada combinação de cepa e vetor resulta em 50 a 80 co-lônias resistentes a geneticina. Por meio de PCR com iniciadores gene específicos, o DNA de 40 transformantes ( 20 transformantes LF6t4 + pPDC2::NPT e 20 transformantes LF6t5 + pPDC2::NPT) são testados para a presença do gene NPTII e para a disrupção do gene PDC2. Observa-se disrupção do gene PDC2 com o vetor de nocaute.

[386] Nocaute e inserção de gene combinados

[387] Os vetores pCH#PDC1 e pCL1H#PDC1 foram usados para transformar os esporos, coletados da cepa selvagem LF6 a 40°C, de acordo com nosso procedimento padrão. Depois de 10 dias de cresci-mento sobre lâminas seletivas contendo higromicina, foram observadas colônias em crescimento e 20 destas foram transferidas para novas lâminas contendo higromicina e testadas por PCR para nocaute do gene PDC1.

[388] Análise por PCR mostra que em 1 dos 20 transformantes de pCH#PDC1 e em 3 de 20 transformantes de pCL1#PDC1 o gene PDC1 tinha sofrido disrupção (Tabela 6). Tabela 5. Número de transformante por construto

[389] O vetor pCN#PDC2 foi usado para transformar esporos de uma cepa de nocaute de PDC1 da rodada de transformação 1. Depois de 10 dias de crescimento sobre lâminas seletivas contendo genetici- na, foram observadas várias colônias em crescimento e 40 destas foram transferidas para novas lâminas contendo geneticina e testadas por PCR para nocaute de gene PDC2.

[390] Foi confirmado que a cepa LF6KL19 é um duplo nocaute de PDC1 e PDC2 e contém o gene de LDH recombinante.

c) Análise de transformantes

[391] A cepa LF6KL19 foi pré-cultivada em 300 ml de meio Sc contendo 50 g/l de glicose e 1 g/l de Junlon em um erlenmeyer de 2 L em pH 2,8. A concentração de esporos inicial foi de 1x105 esporos/ml. A temperatura de incubação foi de 30 ou 35°C e a velocidade de agitação foi ajustada a 75 rpm. A 30°C 16,1 g/l de glicose foi consumido e 14,4 g/l de ácido láctico foi produzido, a 35°C 18,8 g/l de glicose foi consumido e 18,6 g/l de ácido láctico foi produzido, indicando que o rendimento real foi entre 0,9 e 1,0 g/g. Sob estas condições também foram obtidas as maiores produtividades: 0,15 g/l/h.

d) Análise de genoma e de transcriptoma

[392] O genoma de M. ruber LF6 e os transcriptomas de M. ruber LF6 e M. ruber LF6KL19 (duplo noucaute de PDC, cópia de LDH bovino introduzida), crescendo sobre diferentes substratos de crescimento, foram sequenciados e os genes relevantes envolvidosn a produção de álcool foram identificados sobvre o genoma por um procedimento de anotação automatizado. Os dados das sequências de RNA foram usados para aprimorar a arquitetura destes genes. Muitos genes putativos que estão envolvidos na formação de etanol foram identificados sobre o genoma: 7 para piruvato descarboxilases (PDCs) e 12 para desidro- genases alcoólicas. 3 genes de PDC putativos estavam adjacentes uns aos outros no genoma, Análise dos dados da sequência de RNA mostrou que estes 3 genes de PDC putativos pertencem a um único gene. O produto de PDC2 (SEQ ID NO: 2) foi idêntico à parte da sequência traduzida deste gene.

[393] O produto de PDC1 foi idêntico à parte do produto genético de PDC putativo de Mona10180. Tanto genes codificando PDC1 quanto PDC2 foram altamente expressadas sob todas as circunstâncias. Além destes, também outro gene de PDC (Mona07809 ou PDC4, SEQ ID NO: 5, Figura 24) foi transcrito sob toda as circunstâncias e pode ser eliminado do genoma de M. ruber para reduzir a produção de etanol.

Exemplo 4: Aprimoramento adicional da produção de ácido láctico por eliminação do metabolismo de ácido láctico endógeno. Análise da atividade de Cyt-LDH e, M. ruber

[394] Da literatura é sabido que em fungos e leveduras o ácido láctico é metabolizado por uma (citocromo) L-lactato desidrogenase. Portanto nós primeiro analisamos cepas de M. ruber cultivadas sobre ácido láctico para esta atividade enzimática.

[395] As cepas de M. ruber foram cultivadas sobre 2% de extrato de levedura, 1% de meio de peptona suplementado com 5% de glicose ou com 2% de ácido láctico como fonte de carbono. Como um controle, S. cerevisiae foi cultivada sob as mesmas condições (Lodi e Guiard, 1991). A biomassa foi colhida depois de 24 horas de crescimento. As amostras de biomassa colhidas foram congeladas em nitrogênio líquido e trituradas usando um almofariz e um pilão. O pó congelado foi degelado em tampão (0,067 M de fosfato de sódio, pH 7,4 com 0,001 M de EDTA) e a proteína foi extraída por turbilhonamento. Depois de centrifugação o sobrenadante foi submetido a análise de proteína e a análise da atividade da enzima cyt-LDH. A taxa de redução de ferricia- nedo de potássio é determinada espectrofotometricamente a 420 nm. Antes do teste, a enzima foi dissolvida em 0,067 M de tampão de fosfato, pH 7,4 com 0,001 M de EDTA para obter uma taxa de 0,02 a 0,04 ΔA/minuto.

[396] Uma mistura de 2,0 ml de pirofosfato de sódio a 0,1 M, 0,5 ml de DL lactato de sódio a 0,5 M, 0,3 ml de EDTA a 0,01 M, e 0,1 ml de ferricianeto de potássio foi preparada e pipetada para uma lâmina de microtítulo. 10 a 20 pl de amostra adequadamente diluída foi adicionado e a ΔA420/min foi registrada.

[397] A Figura 25 mostra a atividade de cyt-LDH nas amostras de proteína. "Gluc" significa crescimento em meio com glicose e "Lact" significa crescimento em meio com ácido L-láctico como uma fonte de carbono. A atividade de Cyt-LDH está presente em todas as cepas de M. ruber testadas e é induzida por crescimento sobre ácido L-láctico como uma fonte de carbono.

b) Isolamento de homólogos de M. ruber do gene CYB2 com base na homologia de seguência

[398] Usando BLAST com o gene CYB2 de S. cerevisiae como a query nós descobrimos vários homólogos no genoma de Aspergillus niger os quais podem representar um gene codificando cyt-LDH. A. niger foi usado devido a sua íntima relação com Monascus. Com base nestas sequências nós projetamos iniciadores de PCR degenerados de modo a serem capazes de clonar parte de um cyt-LDH de M. ruber.

[399] PCR sobre DNA genômico da cepa LF6 de M. ruber resultou em um fragmento de DNA de 1 kB o qual foi clonado em um plasmídeo. Sequenciamento deste fragmento de PCR clonado confirmou a presença de um frame de leitura aberta com alta homologia com os homólogos CYB2 de Aspergillus niger e suficiente homologia com o gene CYB2 de S. cerevisiae para concluir que nós clonamos um CYB2 análogo de Monascus ruber. O frame de leitura aberta para gene CYB2 de M. ruber é proporcionado como SEQ ID NO: 2 e Figura 26; um íntron putativo na sequência genômica é indicado por letras minúsculas.

c) Análise do genoma e transcriptoma do metabolismo do ácido láctico

[400] O genoma de M. ruber LF6 e os transcriptomas de M. ruber LF6 e M. ruber KL19 (duplo nocaute de PDC, introduzida cópia de LDH bovina), crescendo sobre diferentes substratos de crescimento, foram sequenciados e os genes relevantes envolvidos no metabolismo do ácido láctico foram identificados sobre o genoma por um procedimento de anotação automatizado. Os dados das sequências de RNA foram usados para melhorar a arquitetura destes genes. Vários genes codificando ácido láctico desidrogenases foram previstos para ambos os isômeros de ácido láctico. Para ácido L-láctico, foram previstas 4 LDH's citocromo dependentes, isto é, Mona 02475 (parcialmente correspondente à SEQ ID NO: 2), Mona 00569, Mona 05565 e Mona 06119. Como Mona00569 foi considerada a mais ativa e estava altamente regulada para cima na presença de ácido láctico, esta é a candidata mais óbvia para eliminação. A sequência deste gene é dada na SEQ ID No: 6 (Figura 27).

[401] Além disso, foi visto que M. ruber contém vários genes pu-tativos para LDH's citocromo dependentes que usam ácido D-láctico como um substrato. Novamente, um gene (Mona05697) foi o gene mais ativo. Como a expressão de Mona05697 somente levará ao consumo do D-isõmero de ácido láctico indesejável, pode ser desejável, porém provavelmente não é necessário eliminar este gene.

Exemplo 5: Crescimento da cepa de M. Ruber produtora de ácido láctico em um fermentador

[402] A fermentação foi realizada em um biorreator de 20 L tendo um volume de elaboração total de 11,3 litros. A cepa usada foi M. ru- ber, LDH transformante de LF6 selvagem com nocaute de PDC1. 10 litros de meio S.c. tendo uma composição mostrada na Tabela 6 foram adicionados. Este foi inoculado com 1,3 litros de inoculado obtido por duas etapas de pré-cultura. A primeira pré-cultura foi feita em frascos de agitação de 4 x 100 ml com 25 ml de meio YPD cada (composição vide a Tabela 6). Cada frasco foi inoculado com 0,12 ml de solução de esporos KL78. A solução de esporos contém 2,11 x 107 sp/ml (66% de ascosporos, 34% de conidiósporos) e 2,97 x 105 cleistothesia/ml. Estes foram incubados a 30°C a 150 rpm por 24 horas. A segunda pré- cultura foi realizada em frascos de agitação baffled de 4x 2 L com 300 ml de meio YPD cada e inoculada com os 25 ml da primeira pré- cultura. O volume total de cada frasco foi de 325 ml. Estas foram cultivadas a 30°C a 75 rpm por 52 horas. O biorreator foi inoculado com 4 x 325 ml de pré-cultura.

[403] O biorreator foi mantido a 30°C. O pH inicial foi 3,96, e foi reduzido para 2,8, e mantido constante a 2,8 por adição de 4 M de KOH. A velocidade do agitador inicial foi de 250 rpm, e durante a fermentação foi aumentada manualmente para 450 rpm. A taxa de aera- ção foi de 3,0 l/min. A sobrepressão no reator foi de 20 KPa (0,2 bar). Tabela 6: Composição de meios

[404] A fermentação foi iniciada sob condições aeróbicas para produzir biomassa. Glicose foi adicionada durante o curso da fermen-tação. A fermentação prosseguiu por 137 horas. Aproximadamente 10 L de caldo de fermentação foi removido do biorreator. O caldo foi pré- filtrado com uma peneira de cozinha para remover a biomassa, seguida por etapas adicionais de filtração através de filtros mais finos. O filtrado foi esterilizado por tratamento com radiações gama. A análise do filtrado depois do tratamento com radiações gama revelou glicose (15,5 g/l), ácido láctico (3,4 g/l), etanol (23,6 g/l), glicerol (0,8 g/l).

Exemplo 6: Extração de ácido láctico a partir de uma solução aquosa em um solvente de extração compreendendo tricaprilil amina, octanol e querosene

[405] Um solvente de extração contendo 48% em peso de tricaprilil amina (Alamina 336 da Henkel), 30 em peso de octanol e 22 em peso de querosene é preparado misturando os componentes na proporção desejada. Uma solução aquosa de partida é preparada misturando soluções de lactato de sódio e de ácido láctico de modo que suas concentrações finais foram de 2,9 e 1,5 mol/kg respectivamente (proporção moltar de ácido láctico para lactato de sódio de 1:1,9). A solução aquosa é equilibrada em temperatura ambiente com três porções sucessivas da fase orgânica. Cada equilibração foi em proporção em peso de aquosa para orgânica de 2:1. As fases foram em seguida separadas e analisadas para seu teor de ácido láctico. Os resultados mostram que 83% do ácido láctico na fase aquosa é extraído.

Exemplo 7: Extração de ácido láctico a partir de uma solução aquosa em um solvente de extração alternativo compreendendo tricaprilil amina, octanol e querosene

[406] Um solvente de extração contendo 48% em peso de tricaprilil amina (Alamina 336 da Henkel), 20% em peso de octanol e 32% em peso de querosene é preparado misturando os componentes na proporção desejada. Uma solução aquosa de partida é preparada misturando soluções de lactato de sódio e de ácido láctico de modo que suas concentrações finais são de 0,32 mol/kg de lactato de sódio e 0,71 mol/kg de ácido láctico. A solução aquosa é equilibrada em temperatura ambiente com uma porção da fase orgânica. As fases são em seguida separadas e analisadas para seu teor de ácido láctico. A fase aquosa resultante é equilibrada com outra porção da fase orgânica, separada e analisada. Estas operações são repetidas várias vezes. As concentrações de ácido láctico de equilíbrio (mol/kg) nos sucessivos contatos nas fasess aquosas e orgânicas, respectivamente, são de: 1) 0,37 e 1,16; 2) 0,14 e 0,33; e 3) 0,009 e 0,1.

Exemplo 8: Extração de ácido láctico a partir de uma solução aquosa em um solvente de extração compreendendo hexanol

[407] Uma solução aquosa de alimentação contendo 4 mol/kg de ácido láctico é extraída contracorrente com hexanol a 80°C. A proporção de fase aquosa para orgânica é de 1:2,3 em peso / peso e o número de estágios foi 6. As concentrações de ácido láctico no extrato e no refinado são de 1,8 mol/kg e 0,2 mol/kg respectivamente. O extrato é extraído de volta contracorrente com água a 30°C. A proporção de fase aquosa para orgânica foi de 1:1,5 em peso / peso e o número de estágios foi 7. A concentração de ácido láctico no extratante regenerado é de menos de 0,1 mol/kg e a concentração de ácido láctico na solução de produto aquoso resultante é de cerca de 2,7 mol/kg. Este exemplo mostra a recuperação de ácido láctico a partir de uma solução aquosa com um solvente alcoólico.

Exemplo 9: Extração de ácido láctico a partir de uma solução aquosa em um solvente de extração compreendendo hexanol

[408] Uma solução aquosa de alimentação contendo 4,5 mol/kg de ácido láctico é extraída contracorrente com tri-butil-fosfato (TBP) a 25°C. A proporção de fase aquosa para orgânica é de 1:2,3 em peso / peso e o número de estágios é 6. As concentrações de ácido láctico no extrato e no refinado são de 2,0 mol/kg e 0,2 mol/kg respectivamente. O extrato é extraído de volta contracorrente com água a 85°C. A proporção de fase aquosa para orgânica é de 1:1,7 em peso / peso e o número de estágios é 8. A concentração de ácido láctico no extratante regenerado é de cerca de 0,03 mol/kg e a concentração de ácido láctico na solução de produto aquoso resultante é de cerca de é de cerca de 3,5 mol/kg. Este exemplo mostra a recuperação de ácido láctico a partir de uma solução aquosa com um composto de fósforo oxigenado.

Exemplo 10: Extração de ácido láctico a partir de material bruto em um solvente de extração compreendendo n-propanol

[409] 100 g de material de biomassa bruta líquida contendo 11% de ácido láctico é misturado em temperatura ambiente com 45 g de n- propanol (nPrOH), por meio do que o CSL se tornou saturado com este alcanol, conforme evidenciado pela separação de uma pequena fase orgânica; o material tratado, o qual se tornou bastante fluido, é extraído contra-corrente em quatro estágios, com 25 g de nPrOH. O extrato, na secagem, deixou um resíduo de 15,3 g; 9,5 g do mesmo é analisado como ácido láctico.

Exemplo 11: Extração de ácido láctico a partir de material bruto em um solvente de extração compreendendo secBuQH

[410] 15 g de secBuOH e 100 g de material de biomassa bruta líquida contendo 11% de ácido láctico, são misturados e aquecidos até cerca de 100°C para assegurar completa dissolução do alcanol. Os sólidos que separaram são coletados por centrifugação. O licor clarifi-cado é resfriado até a temperatura ambiente, depois do quê 19 g de uma fase alcanólica separou do mesmo, contendo 6,1 g de sólidos de 87% de concentração em ácido láctico.

Exemplo 12: Extração de ácido láctico a partir de material bruto em um solvente de extração compreendendo nPrQH e tridodecilamina

[411] 100 g de material de biomassa bruta líquida contendo 11% de ácido láctico, são contatados contra-corrente com um solvente de extração feito de 110 g de nPrOH e 33 g de tridodecilamina, em cinco estágios. A fase aquosa extraída contém menos de 1% de ácido láctico e somente traços de ácido fítico. Na fase orgânica, em uma base livre de solvente, o ácido fítico é 25% e o ácido láctico é 68,5%.

Exemplo 13: Extração de ácido láctico em um solvente de extração de trilauril amina, (Alamina 304, Henkel) em querosene de baixo teor de aromáticos (Isopar K)

[412] É preparado um solvente de extração o qual inclui 54% de trilauril amina, (Alamina 304, Henkel) em querosene de baixo teor de aromáticos (Isopar K, Exxon). 3,00 gramas da solução de extratante é equilibrado com 20,00 gramas de solução aquosa de ácido láctico a 0,75 mol/kg em 50°C. As fases são sedimentadas e são determinadas as concentrações de ácido láctico em ambas as fases. Os resultados mostram que o coeficiente de partição do ácido láctico é de 0,28.

Exemplo 14: Extração de ácido láctico em um solvente de extração compreendendo Alamina 304 e Isopar K e reforçador

[413] 3,051 gramas de solvente de extração preparado conforme descrito no Exemplo 13 acima é contatado com 0,112 gramas de uma solução aquosa contendo 2,95 mol/kg de H2SO4. Depois de ser conta-tada com 0 solvente de extração, a concentração de H2SO4 na fase aquosa está abaixo do nível de detecção. O solvente de extração car-regado de H2SO4é em seguida equilibrado com 20,00 gramas de solução aquosa de ácido láctico a 0,75 mol/kg em 50°C, e as fases são sedimentadas. As concentrações de prótons totais na fase orgânicas aquosa e na fase orgânica são determinadas por titulação com NaOH a 0,1 N. As concentrações de ácido láctico são determinadas por HPLC (OAKC coluna). Os resultados mostraram que 0 coeficiente de partição do ácido láctico é de 0,55, a concentração do H2SO4 na fase orgânica é de cerca de 0,1 mol/kg e as concentrações de H2SO4 nas fases aquosas estão abaixo do nível de detecção.

Exemplo 15: Extração de ácido láctico em um solvente de extração compreendendo Alamina 304 e Isopar K e reforçador

[414] O procedimento descrito no Exemplo 13 acima é repetido onde as quantidades do solvente de extração e a da solução de ácido láctico são de 3,01 gramas e 20,02 gramas, respectivamente. A quantidade da solução de H2SO4 é aumentada para 0,311 gramas. Os resultados mostraram que 0 coeficiente de partição do ácido láctico é de 0,70 e a concentração do H2SO4 na fase orgânica é cerca de 0,3 mol/kg. Novamente a concentração de H2SO4 nas fases aquosas está abaixo do nível de detecção.

Exemplo 16: Extração de ácido láctico em um solvente de extração compreendendo Alamina 304 e Isopar K e reforçador

[415] O procedimento descrito no Exemplo 13 é repetido onde as quantidades do solvente de extração e a da solução de ácido láctico são 3,02 gramas e 20.01 gramas, respectivamente. A quantidade da solução de H2SO4 é aumentada para 0,514 gramas. Os resultados mostram que o coeficiente de partição do ácido láctico é de 0,68 e a concentração de H2SO4 na fase orgânica é cerca de 0,5 mol/kg. Novamente a concentração de H2SO4 nas fases aquosas está abaixo do nível de detecção.

Exemplo 17: Stripping usando DMSO como solvente de stripping e conversão em lactida

[416] 200 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) e 200 ml de uma solu ção previamente preparada de Alamina 336 e ácido láctico com 18,4 % em peso de ácido láctico são adicionados a um frasco de 500 ml de fundo redondo e três gargalos com um eixo de agitação, controle de temperatura, condensador, e manta de aquecimento. A mistura é agitada e aquecida a 140°C e mantida a 140°C por 15 minutos. As duas fases sedimentaram rapidamente, são separadas, e são deixadas para esfriar até a temperatura ambiente. Amostras da fase de DMSO da parte de baixo mostram 11,3% em peso de ácido láctico por titulação e 0,58% em peso de Alamina 336 por cromatografia gasosa. 40 ml de IsoPar K da Exxon são adicionados à fase de DMSO em um funil de separação. O funil é agitado em temperatura ambiente, e as fases são deixadas para sedimentar e são separadas. Amostras da fase de DMSO da parte de baixo mostram 11,4% em peso de ácido láctico, 2,7% em peso de água por titulação de Karl Fischer, e 0,05% em peso de Alamina 336.

[417] 230,0 g desta solução de DMSO e ácido láctico são em se guida colocados em um frasco de 500 ml de fundo redondo e quatro gargalos com eixo de agitação, vácuo, condensador, par térmico, e manta de aquecimento. O material é aquecido em pressão atmosférica até 180°C, coletando 42,0 g por cima. O material é deixado para esfriar. A concentração de ácido na fase da parte inferior é determinada para ser 12,4% em peso, mostrando alguma condensação por perda de acidez presumindo que nenhum ácido láctico evaporou. O material é em seguida aquecido a partir da temperatura ambiente até 117°C com em torno de 60 mm de Hg de pressão durante 60 minutos. Outros 34,7 g de material são destilados por cima. Isto completa a etapa de formação de oligômero de ácido láctico.

[418] 146,7 g de solução de DMSO e oligômero de ácido láctico permanecem para a porção de formação de lactida. 1,53 g de FAS- CAT 9102, um catalisador de tris-2-etil-hexanoato de butilestanho, é adicionado. Um sifão (trap) gelado de gelo seco e purgação de nitrogênio é adicionado e o condensador é trocado para um meio de etileno glicol a 110°C. A mistura é aquecida a partir da temperatura ambiente até 145°C a 10 mm de Hg de pressão durante 80 minutos. Somente 7,8 g de material permaneceu no fundo do frasco. O recebedor contém 116,2 g de material. O ponto de ebulição do DMSO é suficientemente próximo ao lactida de modo que se esperava que uma quantidade significativa de DMSO seria destilada por cima. A presença de lactida nas partes superiores é confirmada por cromatografia gasosa.

Exemplo 18: Stripping em vários solventes

[419] Duas soluções de ácido láctico e Alamina 336 são produzidas contatando a Alamina 336 com várias quantidades e concentrações de soluções aquosas de ácido láctico. São obtidas misturas de Alamina 336 com 4,35% em peso e 18,85% em peso de ácido láctico. 2 ml das soluções de Alamina 336 e ácido láctico são contatados separadamente com os seguintes solventes de stripping - dimetil sulfóxi- do (DMSO); N,N-dimetil formamida (DMF); 1,4-dioxana; N-metil pirroli- dinona (NMP); e, 1,3-dioxalano. As amostras são mantidas na temperatura especificada em um banho de óleo por cerca de 45 a 60 minutos com mistura regular. As amostras de 1,4-dioxana e 1,3-dioxalano formam uma única fase líquida em temperaturas entre 20°C e cerca de 80°C. Um procedimento similar é usado para contatar soluções de Alamina 336 e ácido láctico com lactida e tetrametileno sulfona (TMSF). As fases são deixadas para sedimentar na temperatura especificada e em seguida separam rapidamente canalizando para para fora (piping out) a fase da parte inferior. São colhidas amostras para titulação com um hidróxido de sódio solução com fenolftaleína como um indicador para determinar a concentração de ácido láctico, e cro- matografia gasosa para determinar as concentrações de Alamina 336. Em todos os casos, a fase de Alamina 336 é a fase menos densa ou a fase superior.

[420] A Tabela 7 reporta as concentrações de ácido láctico e de Alamina 336 nas fases superior e inferior. O coeficiente de partição é calculado dividindo a concentração de ácido láctico na fase superior de Alamina 336 pela concentração de ácido láctico na fase de líquido polar do fundo. Os resultados mostram que quantidades significativas de ácido láctico se distribuem na fase de líquido polar nestas condições. Em alguns dos solventes, há uma quantidade significativa de Alamina 336 coextraída na fase de líquido polar. Dimetil sulfóxido parece ser um solvente favorável para este tipo de processo devido à boa seletividade para o ácido láctico em relação à Alamina 336. Este exemplo mostra que o ácido láctico pode ser extraído de volta em um líquido polar a partir do solvente de extração inicial com boa eficiência. Este exemplo corrobora a viabilidade de um processo que usa uma extração de volta do ácido láctico em um segundo líquido polar. Tabela 7.

n.d. não determinado

Exemplo 19: Stripping em trietilamina

[421] Alamina 336 e uma solução aquosa de ácido láctico são contatadas para obter um 26,74% em peso de ácido láctico na fase de Alamina 336. Dez gramas da fase de Alamina 336 carregada com ácido láctico é contatado com 5 gramas de trietilamina (solvente de stripping) em um funil de separação de 125 ml. O frasco é agitado por um minuto a 24°C, e as fases são deixadas para sedimentar. A fase superior contém trietilamina de excesso de Alamina 336, e virtualmente nenhum ácido láctico enquanto a fase inferior contém 43% em peso de ácido láctico e trietilamina. As concentrações de ácido são determinadas por titulação com hidróxido de sódio. A extração de volta é escalada para permitir o experimento de destilação.

[422] Trinta gramas de uma mistura a 43% em peso de ácido láctico em trietilamina são adicionados a um frasco de 500 ml de fundo redondo e três gargalos equipado com um sifão (trap) de gelo seco, calibre de pressão, condensador, par térmico, e manta de aquecimento. A trietilamina evapora inicialmente a 23°C e 10 mm de Mg. A temperatura é aumentada até 120°C e a mistura foi mantida nesta temperatura por 90 minutos. Cerca de 69% da trietilamina é evaporado. A pureza quiral do ácido láctico não é alterada significativamente depois do aquecimento.

[423] A remoção da trietilamina pode ser aumentada dramatica-mente na presença de um solvente. Uma solução a 21,5% em peso de ácido láctico em uma mistura de trietilamina e N-metil-2-pirrolidinona é aquecida a 55°C e 10 mm de Hg de pressão por duas horas e 48% da trietilamina é evaporado da solução. A mistura remanescente é aquecida até 110°C onde é mantida por 80 minutos. Neste ponto, 96% da trietilamina é evaporada. A pureza quiral do material não é alterada significativamente. Este exemplo mostra a extração de volta do ácido láctico a partir do solvente de extração e em seguida a capacidade para evaporar o solvente de retro extração para obter um produto de ácido láctico concentrado.

Exemplo 20: Conversão de ácido láctico para lactida usando Alamina 336 como solvente de extração

[424] 600 ml de Alamina 336 lavada cáustica, 800 ml de solução aquosa a 15% em peso de ácido láctico, e 100 ml solução aquosa a 50% em peso de ácido láctico são adicionados a um funil de separação e misturados em temperatura ambiente. As fases são deixadas para sedimentar de um dia para o outro. As fases são divididas e a fase orgânica superior é centrifugada para remover a fase aquosa entranhada. A concentração de ácido láctico na fase orgânica é determinada como sendo 19,75% em peso por titulação com uma solução de hidróxido de sódio com fenolftaleína como um indicador. 304,6 gramas da solução de Alamina 336 e ácido láctico são adicionados a um frasco de fundo redondo, de 4 gargalos com um eixo de agitação, par térmico, condensador, manta de aquecimento e purgação de nitrogênio. A solução é aquecida até 200°C e pressão atmosférica durante 45 minutos. Em seguida foi deixada para esfriar até cerca de 64°C. Em seguida é aquecida até 200°C em pressão de 60 mm de Hg durante 30 minutos. O frasco é mantido a 200°C e pressão de 70 mm de Hg por 45 minutos. O frasco é resfriado e as partes inferiores são divididas em duas fases depois de resfriamento. A fase superior é determinada como sendo virtualmente toda Alamina 336 por cromatografia gasosa. A fase inferior é viscosa e consistiu de oligômeros de ácido láctico e pequena quantidade de Alamina 336.

[425] 185,9 gramas de solução de Alamina 336 e oligômero de ácido láctico (cerca de 54,8% em peso de oligômero em peso molecular médio M.W. de 476) são adicionados a um frasco de fundo redondo de 500 ml, de 4 gargalos com um eixo de agitação, sistema de alto vácuo, purgação de nitrogênio, condensador, par térmico, e manta de aquecimento. Com a solução a 125°C, 900 pl de FASCAT 9102, é adi-cionado um catalisador de tris-2-etil-hexanoato de butilestanho da Ato-chem. A solução é aquecida até 200°C durante quatro horas, e a mistura é mantida a 200°C por 60 minutos. A pressão é mantida constante a cerca de 1 mm de Hg durante todo o tempo de aquecimento. A tem-peratura do meio condensador é mantida a 110°C. O material por cima cristaliza depois de resfriamento. As partes inferiores do frasco depois de aquecimento são determinadas por cromatografia gasosa como sendo virtualmente todas Alamina 336. 139 g de material passa por cima com virtualmente todo o oligômero sendo transformado para lactida e destilado por cima. Parte da Alamina 336 também pode ser destilada por cima devido à alta temperatura e à baixa pressão; isto pode ser confirmado por cromatografia gasosa. A lactida obtida tem uma pureza quiral de menos de 80%. A pureza quiral pode ser aprimorada usando temperaturas menores e usando equipamento de alta área superficial para o reator de lactida possibilitar boa transferência de massa de lactida para fora do reator.

Exemplo 21: Conversão de ácido láctico em um solvente aquoso para lactida

[426] Um frasco de fundo redondo de um litro, de três gargalos é equipado com um agitador mecânico, aspergido com nitrogênio, e uma saída da destilação direta para um condensador, e o receptor para uma saída de vácuo e manómetro. O frasco é carregado com 650 ml (770,4 g) de 88% de alimentação de ácido L-láctico e aquecido a 120°C a 130°C com agitação e borbulhamento de nitrogênio. A água foi destilada usando um aspirador de água a 150 a 200 Torr. As alíquotas são removidas durante o curso do aquecimento e caracterizadas por titulação para o grau de polimerização (DP). Em seguida, depois de metilação com diazometano, as alíquotas foram caracterizadas por cromatografia gasosa (GC). Os resultados indicam a presença de picos de lactida quando o grau de polimerização é cerca de 2.

Exemplo 22: Conversão de ácido láctico, em um solvente aquoso, em lactida

[427] Um reator de vapor experimental é provido com catalisador compreendendo malha 10-20 de catalisador de sílica gel / alumina (ca-talisador Akzo-L1 A-30-5P, 87% de sílica / 13% de alumina, Akzo Chemicals B.V.). A taxa de fluxo de nitrogênio é ajustada para 1600 ml/min. e este mais uma alimentação de ácido láctico foram passados através do reator em uma velocidade de vapor superficial de 0,12 pés/seg. O espaço-tempo do conteúdo é de 2,8 segundos. A alimentação de ácido láctico compreende "85% de ácido láctico" comercial (61% de ácido L-láctico, 20% de ácido L-L,lactoiláctico, 4% de ácido L,L,L-lactolactoilláctico, e 15% de água) o qual é diluído com um adicional de 11% em peso de água logo antes da operação. Os resultados registrados são determinados na Tabela 8 abaixo: Tabela 8: Resultados

Exemplo 23: Conversão de lactida em PLA

[428] Nos exemplos e nos exemplos comparativos, o número médio de peso molecular (Mn) do PLA foi determinado por cromato- grafia por exclusão de tamanho em clorofórmio a 35°C, com calibração no início de oito padrões de poliestireno de número conhecido de massas molares médias de 600 a 1 700 000 Dáltons. A cromatografia por exclusão de tamanho usou equipamento Agilent Technologies 1200 Series. As amostras dissolvidas em clorofórmio a 0,1% (em peso / volume) foram elutriadas em uma taxa de 1 ml / min através de uma coluna de guarda de gel PL (10 pm) e duas colunas de gradiente de gel PL (5 pm) misturado-d. O volume injetado foi de 100 pl.

[429] Nos exemplos e nos exemplos comparativos, a cor do PLA foi determinada diretamente depois da polimerização e antes de qualquer recristalização do PLA (PLA bruto). Síntese de (2,4-di-terc-butil-6-(((2 - (dimetilamino) etil) (metil) amino) metil) fenóxi) (etóxi) zinco, nas partes que se sequem conhecido como DDTBP-Zn (OEt).

[430] A síntese foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Williams et al. in J. Am Chem. Soc.,2003, 125, 11350-11359.

2. Experimentos 1 e 2

[431] Polimerização em massa de L-lactida foi realizada sob uma atmosfera inerte, na presença do catalisador DDTBP-Zn(OEt) repre-sentado pela seguinte fórmula:

[432] A polimerização ocorreu na presença de 1-octanol, como iniciador em um reator de vidro com uma capacidade de 50 ml sob uma atmosfera inerte, com 5 g de L-lactida, catalisador e o iniciador em quantidades conforme descrito na Tabela 9. A cada vez, foi usado 1 ml de solução de catalisador em tolueno. A conversão de L-lactida para polilactida foi determinada depois de 30 minutos de polimerizaçâo usando o polímero previamente recristalizado a partir de uma mistura de clorofórmio e etanol e secado a vácuo.

4. Experimentos 3 a 6

[433] A polimerizaçâo em massa de L-lactida foi realizada sob uma atmosfera inerte na presença de catalisadores diferentes daqueles mencionados no método da invenção. A polimerizaçâo ocorreu em um reator de vidro com uma capacidade de 50 ml e foi realizada sob uma atmosfera inerte com 5 g de L-lactida, catalisador e 1-octanol (iniciador) em tais quantidades indicadas na Tabela 9. Para cada reação, foi usado 1 ml de solução de catalisador em tolueno. A extensão da conversão de L-lactida em polilactida foi determinada no mesmo modo conforme descrito para os Experimentos 1 e 2 acima.

[434] Os catalisadores testados foram

[435] - Bis [bis (trimetilsilil) amida] de zinco identificada abaixo como Zn [N (SiMe3)2]2,

[436] - Dietil zinco identificado abaixo como DEZ

[437] - Trifluorometano sulfonato de zinco identificado abaixo como Zn(OTf)2.

[438] Os resultados são mostrados na Tabela 9 abaixo. Assim como para o Experimento 7 (controle negativo), não ocorreu reação de polimerizaçâo na presença de trifluorometano sulfonato de zinco. Tabela 9

[439] Chave: "TP" - Temperatura de polimerizaçâo (°C); "L/O" - Lactida / octanol (mol/mol); "L/C" - Lactida / catalisador (mol/mol); "Conv" - Conversão de lactida para polilactida (%); Cor - Cor da poli- lactida (PLA total); "PD" - Polidispersidade (Mw/Mn);não aplicável.

[440] Será evidente para as pessoas versadas na técnica que a invenção não está limitada aos detalhes dos exemplos ilustrativos precedentes e que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar dos atributos essenciais da mesma, e, portanto, é desejável que as presentes modalidades e os presentes exemplos sejam considerados em todos oos aspectos como ilustrativos e não restritivos, sendo feita referência às reivindicações anexadas, ao invés de à descrição precedente, e portanto se pretende que todas as alterações as quais são abrangidas pelo significado e da faixa de equivalência das reivindicações sejam englobadas na mesma.

Claims

1. Processo para a produção de ácido poliláctico (PLA), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - fermentação em um vaso de fermentação de um micro- organismo do gênero Monascus em um meio em um pH de menos de ou igual a 5 sob condições nas quais o referido Monascus produz ácido láctico, - conversão do ácido láctico produzido pelo referido Mo-nascus em lactida, e - polimerizaçâo da lactida para formar PLA.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico é recuperado do meio de fermentação antes da conversão em lactida, cuja recuperação compreende as etapas de: (A) extração do ácido láctico livre do referido meio clarificado de debris contatando o referido meio com um solvente de extração, para formar: (i) um extrato contendo ácido láctico e (ii) uma solução aquosa exaurida de ácido láctico; e (B) separação do referido extrato contendo ácido láctico (i) da referida solução aquosa (ii), obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o solvente de extração compreende um ou mais de 1-butanol, 2-etil hexanol, 1-octanol, metil isobutil cetona, ciclo- hexanona, disobutil cetona, éter isopropílico, acetato de etila, acetato de isobutila, lactato de etila, lactato de butila, lactato de octila, N,N- dibutil lactamida, ácido hexanoico, uma alquil amina tricaprilil amina terciária, Alamina 336 da Henkel.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, carac- terizado pelo fato de que a recuperação adicionalmente compreende as etapas de: (C) stripping do ácido láctico extraído do referido extrato separado (i) usando um solvente de stripping para formar como fases imiscíveis: iii) a solução de stripping contendo ácido láctico, e iv) solvente de extração exaurido de ácido láctico, (D) separação da solução de stripping contendo ácido láctico (iii) do referido solvente de extração exaurido de ácido láctico (iv), obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o solvente de stripping é um solvente aquoso, um solvente orgânico polar, ou misturas destes solventes.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico é recuperado do meio de fermentação antes da conversão em lactida, cuja recuperação compreende as etapas de: - precipitação de contaminantes no meio, opcionalmente clarificado de debris, por utilização de um álcool, e - remoção do precipitado para obter uma solução alcoólica clarificada contendo ácido láctico, obtendo deste modo ácido láctico recuperado.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o álcool é um álcool Ci a C4 de cadeia reta ou ra-mificada.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que lactida é convertida a partir de ácido láctico diretamente ou através de policondensação de ácido láctico para formar oligômeros de ácido láctico.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico recuperado é convertido em lactida por: - aquecimento do ácido láctico recuperado para oligomeri- zar o ácido láctico, e - aquecimento do oligômero de ácido láctico formado deste modo para produzir um vapor de lactida.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico recuperado está em um solvente hidrofóbico, preferencialmente Alamina 336.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac-terizado pelo fato de que a etapa de aquecimento do oligômero de ácido láctico para produzir um vapor de lactida é realizada na presença de um catalisador, preferencialmente um catalisador de estanho, pre-ferencialmente octanoato de estanho (II).

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico está em uma solução aquosa, e é convertido em lactida por: - aquecimento da solução aquosa de ácido láctico recuperado para formar um vapor, - passagem do vapor formado deste modo através de um reator mantido em temperatura elevada, no qual um catalisador é op-cionalmente disposto.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracteri-zado pelo fato de que o catalisador é alumina.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico está em uma solução aquosa, e é convertido em lactida pela remoção de água da solução aquosa.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a lactida é polimerizada em PLA por uma abertura de anel na presença de um catalisador de metal.