BRPI0819273B1 - Célula microbiana eucariótica recombinante e processo para a preparação de um ácido dicarboxílico - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO DE ÁCIDO DICARBOXÍLICO EM EUCARIONTES. A presente invenção relaciona-se a uma célula microbiana eucariótica recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima heteróloga catalisando a conversão de fosfoenolpiruvato ao oxaloacetato onde ATP é gerado. A invenção ainda relacionase a um processo para a preparação de um ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico e ácido fumárico, compreendendo fermentar a célula microbiana eucariótica de acordo com a invenção em um meio de fermentação apropriado.

Description

A presente invenção relaciona-se a uma célula eucariótica recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a conversão de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, e um processo para a produção de um ácido dicarboxílico.

Os ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos, ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico são precursores potenciais para numerosos produtos químicos. Por exemplo, ácido succínico pode ser convertido em 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano, e gama-butirolactona. Outro produto derivado de ácido succínico é um polímero de poliéster que é feito por ligação de ácido succínico e BDO.

O ácido succínico é predominantemente produzido através de processos petroquímicos por hidrogenação de butano. Estes processos são considerados prejudiciais para o ambiente e caros. A produção fermentativa de ácido succínico pode ser um processo alternativo atrativo para a produção de ácido succínico, em que a matéria-prima renovável como uma fonte de carbono pode ser usada.

Várias bactérias diferentes, tais como Escherichia coli, e as bactérias de rúmen Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, ou Succinimonas, sp. são conhecidas por produzir ácido succínico. A engenharia metabólica destas cepas bacterianas tem melhorado o rendimento e/ou a produtividade de ácido succínico, ou reduzido a formação de subproduto.

WO2007/061590 divulga uma levedura negativa de piruvato descarboxilase para a produção de ácido málico e/ou ácido succínico que é transformado com uma enzima piruvato carboxilase ou uma fosfoenolpiruvato carboxilase, uma enzima de malato desidrogenase, e uma proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Apesar das melhorias que foram feitas na produção fermentativa de ácido dicarboxílico, permanece uma necessidade para microrganismos melhorados para a produção fermentativa de ácidos dicarboxílicos.

O objetivo da presente invenção é um microrganismo eucariótico alternativo para a produção de um ácido dicarboxílico. O objetivo é conseguido de acordo com a invenção com uma célula microbiana eucariótica recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima catalisando a conversão de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato onde ATP é gerado, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5.

Preferivelmente, a enzima tem a atividade de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase, preferivelmente a enzima é uma fosfoenolpiruvato (PEP) carbóxiquinase (E.C. 4.1.1.49). Preferivelmente, a PEP carbóxiquinase está ativa sob condições anaeróbicas ou limitadas de oxigênio na presença de uma fonte de carbono ou glicerol fermentável. Uma fonte de carbono fermentável pode ser glicose, frutose, galactose, rafinose, arabinose, ou xilose. Descobriu-se vantajosamente que a célula eucariótica compreende uma PEP carbóxiquinase de acordo com a presente invenção, já que a PEP carbóxiquinase catalisando a conversão de PEP a OAA fixa CO2 e gera energia na forma de ATP.

Surpreendentemente, descobriu-se que uma célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção produz uma quantidade aumentada de ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico e ácido fumárico em comparação à quantidade de ácido dicarboxílico produzida por uma célula eucariótica tipo selvagem. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção produz pelo menos 1,2, preferivelmente pelo menos 1,5, 1,6, 1,8 preferivelmente pelo menos 2 vezes mais de um ácido dicarboxílico do que uma célula eucariótica tipo selvagem que não compreende a sequência de nucleotídeo codificando uma enzima catalisando a conversão de fosfoenolpiruvato para oxaloacetato da invenção.

Preferivelmente, uma célula microbiana eucariótica de acordo com a presente invenção expressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase, preferivelmente um PEP carbóxiquinase em que a PEP carbóxiquinase compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 55%, preferivelmente pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5. Preferivelmente a PEP carbóxiquinase compreende a SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5.

A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucléicos (polinucleotídeo), como determinado comparando as sequências. Geralmente, as identidades de sequência ou similaridades são comparadas sobre o comprimento inteiro das sequências comparadas. Na técnica, “identidade” também significa o grau de relacionamento de sequência entre as sequências de aminoácido ou ácido nucléico, conforme o caso pode ser, como determinado pela combinação entre fitas de tais sequências.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador públicos. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem BLASTP e BLASTN, publicamente disponíveis de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e col., NCBI NLM NIH Bethesda, DM 20894). Os parâmetros preferidos para comparação de sequências de aminoácido usando BLASTP são abertura gap 11.0, extensão gap 1, matriz Blosum 62.

Uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima expressa na célula da invenção pode também ser definida por sua capacidade para hibridizar com sequências de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase de SEQ ID N°s: 1, 3 e/ou 5, ou com a sequência de nucleotídeo codificando uma malato desidrogenase de SEQ ID N°: 14 ou com a sequência de nucleotídeo codificando fumarase de SEQ ID N°: 16, sob condições de hibridização moderadas, ou preferivelmente estritas. As condições de hibridização estritas são definidas aqui como condições que permitem uma sequência de ácido nucléico de pelo menos aproximadamente 25, preferivelmente aproximadamente 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos, para hibridizar em uma temperatura de aproximadamente 65°C em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando em 65°C em uma solução compreendendo aproximadamente 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo aproximadamente 90% ou mais de identidade de sequência.

As condições moderadas são definidas aqui como as condições que permitem uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos, hibridizar em uma temperatura de aproximadamente 45°C em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando em temperatura ambiente em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é realizada pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo até 50% de identidade de sequência. A pessoa hábil na técnica poderá modificar estas condições de hibridização a fim de especificamente identificar sequências variando em identidade entre 50% e 90%.

Uma célula microbiana eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção é definida aqui como uma célula que contém, ou é transformada ou geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeo que não ocorre naturalmente na célula eucariótica, ou contém cópia ou cópias adicionais de uma sequência de ácido nucléico endógeno. Uma célula eucariótica tipo selvagem é definida aqui como a célula progenitora da célula recombinante.

O termo “homólogo” quando usado para indicar a relação entre uma dada molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo (recombinante) e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, é compreendido por significar que na natureza a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por uma célula ou organismos hospedeiros da mesma espécie, preferivelmente da mesma variedade ou cepa.

O termo “heterólogo” quando usado com relação a um ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína refere-se a um ácido nucléico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou RNA em que está presente, ou que é encontrado em uma célula ou posição ou posições no genoma ou na sequência de DNA ou RNA que diferem daquela que se encontra na natureza. Os ácidos nucléicos ou proteínas heterólogos não são endógenos à célula em que são introduzidos, mas foram obtidos de outra célula ou sinteticamente ou recombinantemente produzidos.

O termo “gene”, como usado aqui, refere-se a uma sequência de ácido nucléico contendo um molde para uma polimerase de ácido nucléico, em eucariotos, polimerase de RNA II. Os genes são transcritos em mRNAs que são então traduzidos em proteína.

O termo “ácido nucléico” como usado aqui, inclui referência a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, isto é um polinucleotídeo, na forma de fita simples ou dupla, e a menos que limitado de outra maneira, engloba análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais que hibridizam aos ácidos nucléicos de fita simples em uma maneira similar aos nucleotídeos naturais (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo). Um polinucleotídeo pode ser completo ou uma subsequência de um gene regulatório ou estrutural heterólogo ou nativo. A menos que indicado de outra maneira, o termo inclui referência à sequência especificada assim como a sequência complementar do mesmo.

Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados permutavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido no qual um ou mais resíduos de aminoácido são um análogo químico artificial de um aminoácido natural correspondente, assim como polímeros de aminoácido naturais. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos naturais é que, quando incorporados em uma proteína, essa proteína é especificamente reativa aos anticorpos eliciados à mesma proteína, mas consistindo inteiramente em aminoácidos naturais. Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são também inclusivos de modificações incluindo, mas não limitadas a, glicosilação, ligação de lipídio, sulfatação, gama carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

O termo “enzima” como usado aqui é definido como uma proteína que catalisa a reação (bio)química em uma célula. Para aumentar a probabilidade que a enzima introduzida seja expressa na forma ativa em uma célula eucariótica da invenção, a sequência de nucleotídeo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso de codon ao da célula hospedeira eucariótica escolhida. Diversos métodos para a otimização de códon são conhecidos na técnica. Um método preferido para otimizar o uso de códon das sequências de nucleotídeo para a célula eucariótica de acordo com a presente invenção é tecnologia de otimização de pares de códon como divulgado em WO2008/000632. A otimização de par de códons é um método para produzir um polipeptídeo em uma célula hospedeira, em que as sequências de nucleotídeo codificando o polipeptídeo foram modificadas com relação a seu uso de códon, em particular os pares de códon que são usados para obter expressão melhorada da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo e/ou a produção melhorada do polipeptídeo. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

Geralmente, uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima, tal como uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase, ou qualquer outra enzima divulgada aqui é operavelmente ligada a um promotor que causa expressão suficiente da sequência de nucleotídeo correspondente na célula eucariótica de acordo com a presente invenção para conferir à célula a habilidade de produzir um ácido dicarboxílico.

Como usado aqui, o termo “operavelmente ligada” refere-se a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou sequências de codificação ou sequência de ácido nucléico) em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucléico é “operavelmente ligada” quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou melhorador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação, se afeta a transcrição da sequência de codificação.

Como usado aqui, o termo “promotor” refere-se a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, situados a montante com relação à direção de transcrição do local de iniciação de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um local de ligação para a polimerase de RNA dependente de DNA, locais de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA conhecidos a um hábil na técnica. Um promotor “constitutivo” é um promotor que está ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor “induzível” é um promotor que está ativo sob a regulação ambiental ou de desenvolvimento.

Um promotor que poderia ser usado para conseguir a expressão de uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima, por exemplo, uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase pode não ser nativo à sequência de nucleotídeo codificando para enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo à sequência de nucleotídeo (sequência de codificação) a qual é operavelmente ligado. Preferivelmente, o promotor é homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira.

Os promotores apropriados em células hospedeiras eucarióticas são conhecidos ao hábil na técnica. Os promotores apropriados podem ser, mas não são limitados a, TDH, GPDA, GAL7, GAL10, ou GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, e AOX1. Outros promotores apropriados incluem PDC, GPD1, PGK1, e TEF1.

Geralmente uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima compreende um terminador. Qualquer terminador, que é funcional na célula, pode ser usado na presente invenção. Os terminadores preferidos são obtidos de genes naturais da célula hospedeira. As sequências de terminador apropriadas são conhecidas na técnica. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que previnem a degradação de mRNA mediada sem sentido na célula hospedeira da invenção (veja, por exemplo: Shirley e col., 2002, Genetics 161: 1465-1482).

Em uma modalidade preferida, uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima, tal como uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase é superexpressa. Descobriu-se que uma produção aumentada de ácido málico, ácido fumárico ou ácido succínico pela célula pode ser conseguida quando as sequências de nucleotídeo são superexpressas.

Há métodos conhecidos na técnica para superexpressão de sequências de nucleotídeo codificando enzimas. Uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima pode ser superexpressa aumentando o número de cópias da codificação de gene para a enzima na célula, por exemplo, integrando cópias adicionais do gene no genoma da célula, expressando o gene de um vetor centromérico, de um vetor de expressão multicópia epissomal ou introduzindo um vetor de expressão (epissomal) que compreende múltiplas cópias de um ou mais genes. Preferivelmente, a superexpressão de uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima de acordo com a invenção é conseguida com um promotor constitutivo (forte).

A invenção também relaciona-se a uma construção de nucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo selecionadas de SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 10.

Uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima pode ser ligada em uma construção de ácido nucléico, por exemplo, um plasmídeo, tal como uma baixa cópia de plasmídeo ou alta cópia de plasmídeo. A célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode compreender uma única cópia, mas preferivelmente compreende múltiplas cópias da sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a conversão de PEP a OAA, por exemplo, por múltiplas cópias de uma construção de nucleotídeo.

Uma construção de ácido nucléico pode ser mantida epissomalmente e assim compreende uma sequência para a replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Se a célula eucariótica é de origem fúngica, uma construção de ácido nucléico epissomal apropriada pode, por exemplo, ser baseada nas leveduras de 2μ ou plasmídeos pKD1 (Gleer e col., 1991, Biotechnology 9:968-975), ou plasmídeos AMA (Fierro e col., 1995, Curr Genet. 29:482489). Alternativamente, cada construção de ácido nucléico pode ser integrada em uma ou mais cópias no genoma da célula eucariótica. A integração no genoma da célula pode ocorrer aleatória por recombinação não homóloga, mas preferivelmente, a construção de ácido nucléico pode ser integrada no genoma da célula por recombinação homóloga como é conhecida na técnica.

Em uma modalidade preferida, uma célula microbiana eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma enzima tendo a atividade de PEP carbóxiquinase, em que a enzima é uma enzima heteróloga, preferivelmente a enzima heteróloga é derivada de uma bactéria, mais preferivelmente a enzima tendo a atividade de PEP carbóxiquinase é derivada de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., ou Anaerobiospirillum sp., mais preferivelmente Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, ou Anaerobiospirillum succiniciproducens.

Em uma modalidade preferida uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase na célula eucariótica de acordo com a presente invenção é expressa no citosol. Surpreendentemente a atividade citosólica da enzima resultou em uma produção aumentada de um ácido dicarboxílico pela célula eucariótica.

Descobriu-se que uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase pode compreender um sinal alvo peroxissomal ou mitocondrial, por exemplo, como determinado pelo método divulgado por Schlüter e col., Nucleic acid Research 2007, Vol 25, D815-D822.

Descobriu-se que PEP carbóxiquinase derivada de Actinobacillus succinogenes compreende um sinal alvo peroxissomal. Surpreendentemente descobriu-se que quando o sinal de ataque peroxissomal foi substituído com a porção correspondente na PEP carbóxiquinase derivada de Mannheimia succiniproduces, o ataque peroxissomal foi prevenido.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção expressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo PEP carbóxiquinase, em que a enzima é uma PEP carbóxiquinase, compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5. Preferivelmente, a PEP carbóxiquinase compreende a SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5.

Em uma modalidade pode ser preferido que a atividade de uma enzima nativa ou endógena ou homóloga catalisando a conversão de OAA à PEP na célula eucariótica de acordo com a presente invenção seja reduzida ou completamente desativada. A desativação ou redução da atividade de uma enzima catalisando a conversão de OAA à PEP são métodos conhecidos ao hábil na técnica. Isto pode, por exemplo, ser conseguido por mutação, rompimento ou deleção da sequência de nucleotídeo codificando a enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase. Uma atividade reduzida de uma PEP carbóxiquinase nativa é preferida a fim de prevenir a reação reversa de OAA à PEP ocorrer.

Uma célula microbiana eucariótica de acordo com a presente invenção, preferivelmente é selecionada do grupo consistindo de uma levedura e um fungo filamentoso. Uma célula eucariótica preferivelmente pertence aos gêneros Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Rhizopus, Zygosaccharomyces, Pachysolen ou Yamadazyma. Preferivelmente, a célula eucariótica pertence a uma espécie Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, P. symplissicum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus orizae ou Zygosaccharomyces bailii.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a invenção é uma levedura, preferivelmente Saccharomyces cervisiae, preferivelmente uma Saccharomyces cervisiae compreendendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo selecionadas de SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 10. A célula eucariótica pode também ser um fungo filamentoso, preferivelmente A. niger, compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo selecionadas de SEQ ID N°: 7, e SEQ ID N°: 8.

Além de uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase, a célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente geneticamente modificada ou transformada com sequências de nucleotídeo quem codificam enzimas homólogas e/ou heterólogas quem catalisam reações na célula resultando em um fluxo aumentado para ácido málico, ácido fumárico e/ou ácido succínico. Pode, por exemplo, ser favorável introduzir e/ou superexpressar sequências de nucleotídeo codificando: i) uma malato desidrogenase que catalisa a conversão de OAA para ácido málico; ii) uma fumarase, que catalisa a conversão de ácido málico para ácido fumárico; ou iii) uma fumarato redutase que catalisa a conversão de ácido fumárico para ácido succínico, dependendo do ácido dicarboxílico a ser produzido.

Preferivelmente uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção superexpressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma piruvato carboxilase (PYC), preferivelmente uma piruvato carboxilase que está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo, por exemplo, uma piruvato carboxilase compreendendo uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID N°: 26. Preferivelmente, uma piruvato carboxilase endógena ou homólogoa é superexpressa. Surpreendentemente, descobriu-se que superexpressar uma piruvato carboxilase endógena resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados pela célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreendendo uma fosfoenolpiruvato carbóxiquinase como descrita aqui. Descobriu-se que a (super)expressão concomitante de uma piruvato carboxilase e uma fosfoenolpiruvato carbóxiquinase resultou em aumento surpreendente de níveis de produção de ácido succínico de pelo menos 1,5 em comparação a uma célula eucariótica compreendendo piruvato carboxilase ou uma fosfoenolpiruvato carbóxiquinase como descrita aqui.

Em outra modalidade preferida uma célula de acordo com a presente invenção ainda compreende a sequência de nucleotídeo codificando uma malato desidrogenase (MDH) ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo. Uma MDH citosólica pode ser qualquer malato desidrogenase homóloga ou heteróloga apropriada. Preferivelmente a MDH é uma MDH de S. cerevisiae, tal como MDH3 ou MDH1. Preferivelmente, a MDH falta um sinal de ataque peroxissomal ou mitocondrial a fim de localizar a enzima no citosol. Alternativamente, a MDH é MDH2 de S. cerevisiae que foi modificada, tal que está não inativada na presença de glicose e está ativa no citosol. Sabe-se que a transcrição de MDH2 é reprimida e Mdh2p é degradado sob adição de glicose para células sem glicose. Mdh2p deletado para os 12 aminoácidos amino-terminais é menos suscetível para a degradação induzida por glicose (Minard e McAlister- Henn, J. Biol. Chem. agosto de 1992 25;267(24):17458-64).

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma malato desidrogenase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 14. Preferivelmente, a atividade de malato desidrogenase é aumentada superexpressando a sequência de nucleotídeo de codificação por métodos conhecidos na técnica.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção ainda compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico, que pode ser uma enzima heteróloga ou homóloga. Uma enzima que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico, por exemplo, uma fumarase, pode ser derivada de qualquer origem apropriada, preferivelmente da origem microbiana, por exemplo, uma levedura, tal como Saccharomyces ou um fungo filamentoso, tal como Rhizopus oryzae. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 16, preferivelmente a fumarase compreende a SEQ ID N°: 16.

Preferivelmente, a enzima catalisando a conversão de ácido málico ao ácido fumárico está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo. A atividade citosólica da enzima tendo a atividade de fumarase é preferida para uma alta produtividade de um ácido dicarboxílico pela célula eucariótica. Na invenção uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima tendo atividade de fumarase compreende um sinal de ataque peroxissomal ou mitocondrial (por exemplo, como determinado pelo método divulgado por Schlüter e col., Nucleic Acid Research 2007, Vol 25, D815-D822), pode ser preferido deletar o referido sinal de ataque para localizar uma enzima tendo atividade de fumarase no citosol. Preferivelmente, uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima catalisando a conversão de ácido málico ao ácido fumárico superexpressa por métodos conhecidos na técnica.

Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção é uma célula em que pelo menos um gene codificando a álcool desidrogenase não é funcional. Um gene de álcool desidrogenase que não está funcional é usado aqui para descrever uma célula eucariótica, que compreende uma atividade de álcool desidrogenase reduzida comparada a uma célula em que todos os genes codificando uma álcool desidrogenase são funcionais. Um gene pode se tornar não funcional por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por mutação, rompimento, ou deleção, por exemplo, pelo método divulgado por Gueldener e col. 2002, Nucleic Acids Research, Vol. 30, N°. 6, e23. Preferivelmente, a célula é uma Saccharomyces cervisiae, em que um ou mais genes adh1 e/ou adh2, codificando a álcool desidrogenase são inativados.

Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção ainda compreende pelo menos um gene codificando glicerol-3-fosfato desidrogenase que não está funcional. Um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase que é não funcional é usado aqui para descrever uma célula eucariótica, que compreende uma atividade de glicerol-3- fosfato desidrogenase reduzida, por exemplo por mutação, rompimento, ou deleção do gene codificando glicerol-3- fosfato desidrogenase, resultando em uma formação diminuída de glicerol em comparação à célula tipo selvagem.

Em outra modalidade preferida a célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um gene codificando succinato desidrogenase que não está funcional. Uma succinato desidrogenase que não está funcional é usada aqui para descrever uma célula eucariótica, que compreende uma atividade de succinato desidrogenase reduzida por mutação, rompimento, ou deleção, de pelo menos um gene codificando succinato desidrogenase resultando em uma formação aumentada de ácido succínico em comparação à célula tipo selvagem. Uma célula eucariótica compreendendo um gene codificando succinato desidrogenase que não está funcional pode, por exemplo, ser Aspergillus niger, preferivelmente um Aspergillus niger, em que um ou mais genes codificando succinato desidrogenase, tal como sdhA e não são funcionais.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreendendo qualquer uma das modificações genéticas descritas aqui é capaz de produzir pelo menos 0,3, 0,5, 0,7, g/l de ácido succínico, preferivelmente pelo menos 1 g/l de ácido succínico, preferivelmente pelo menos 1,5, preferivelmente pelo menos 2, ou 2,5, 4,5, preferivelmente pelo menos 8, 10, 15, ou 20 g/l de ácido succínico, mas geralmente abaixo de 200 ou abaixo de 150 g/l.

Uma célula eucariótica preferida de acordo com a presente invenção pode ser capaz de crescer em qualquer fonte de carbono apropriada conhecida na técnica e convertê-la a um ácido dicarboxílico desejável como mencionado aqui antes. A célula eucariótica pode ser capaz de converter diretamente biomassa de planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol. Portanto, um organismo hospedeiro preferido expressa enzimas, tais como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo- e exoxilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glicurônico e ácido galacturônico ou amílases para converter amido em monômeros de glicose. Preferivelmente, a célula é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de glicose, frutose, galactose, xilose, arabinose, sacarose, lactose, rafinose e glicerol.

Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona a um processo para a preparação de um ácido dicarboxílico, compreendendo fermentar a célula eucariótica de acordo com a presente invenção em um meio de fermentação apropriado e preparar o ácido dicarboxílico. Descobriu-se vantajoso usar uma célula eucariótica como definida aqui acima no processo para a produção de um ácido dicarboxílico tal como ácido succínico, pois a maioria das células eucarióticas não exige condições estéreis para propagação e são insensíveis às infecções bacteriófagas. O processo de acordo com a presente invenção pode ser feito sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Preferivelmente, o processo é realizado sob condições anaeróbicas ou sob condições limitadas de oxigênio ou microaerofílicas. Um processo de fermentação anaeróbica é definido aqui como um processo de fermentação feito na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, e em que as moléculas orgânicas servem como doadora de elétron e aceptora de elétron.

Um processo de fermentação limitado de oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás ao líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades de mistura real/transferência de massa do equipamento de fermentação usado. Preferivelmente, em um processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é pelo menos 5,5, mais preferivelmente pelo menos 6 e mais preferivelmente pelo menos 7 mmol/l/h.

O processo para a produção de um ácido dicarboxílico de acordo com a presente invenção pode ser realizado em qualquer pH apropriado entre 1 e 9. Preferivelmente, o pH no caldo de fermentação está entre 2 e 7, preferivelmente entre 3 e 5. Descobriu-se vantajoso ser capaz realizar o processo de acordo com a presente invenção em pH baixo, já que isto previne a contaminação bacteriana e menos sais alcalinos são necessários para titulação para manter o pH em um nível desejado no processo para a produção de um ácido dicarboxílico.

Uma temperatura apropriada em que o processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado está entre 5 e 60°C, preferivelmente entre 10 e 50°C, mais preferivelmente entre 15 e 35°C, mais preferivelmente entre 18°C e 30°C. O hábil na técnica conhece temperaturas ótimas para fermentar uma célula eucariótica específica.

O ácido dicarboxílico que é produzido no processo de acordo com a presente invenção pode ser ácido succínico, ácido fumárico ou ácido málico, preferivelmente ácido succínico. Preferivelmente, o ácido dicarboxílico é recuperado do caldo de fermentação por um método apropriado conhecido na técnica, por exemplo, por cristalização, precipitação de amônio ou tecnologia de troca iônica.

Preferivelmente, o ácido dicarboxílico que é preparado no processo de acordo com a presente invenção é ainda convertido um produto farmacêutico, cosmético, alimento, alimentação, ou químico. O ácido succínico pode, por exemplo, ainda ser convertido em um polímero, tal como succinato de polibutileno (PBS) ou outros polímeros apropriados derivados do mesmo. A presente invenção também se relaciona a um caldo de fermentação compreendendo um ácido dicarboxílico obtenível pelo processo de acordo com a presente invenção.

A invenção relaciona-se a um processo para a produção de um ácido dicarboxílico em que uma célula eucariótica é usada como produtor de ácido dicarboxílico, onde fosfoenolpiruvato carbóxiquinase é usado para aumentar a produção de ácido dicarboxílico, preferivelmente em que a fosfoenolpiruvato carbóxiquinase está ativa no citosol. Preferivelmente o fosfoenolpiruvato carbóxiquinase é uma enzima heteróloga preferivelmente derivada de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens.

Modificações genéticas

As técnicas genéticas padrões, tais como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridização, são métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Sambrook e Russel (2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, ou F. Ausubel e col., eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Os métodos para transformação, modificação genética etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos de, por exemplo, EP-A-O 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186.

Descrição das Figuras

Figura 1: Mapa do vetor pGBTOP-11 usado para a expressão de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase em A. niger. Figura 2: Mapa de plasmídeo pGB414SUS-01, codificando PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes para expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota par de códons otimizado. Figura 3: Mapa de plasmídeo pGB414SUS-04, codificando PEP carbóxiquinase de Mannheimia succiniciproducens para expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota par de códons otimizados.

Figura 4: Mapa de plasmídeo de pDEL-SDHA. Figura 5: Esquema de substituição de sdhA. Figura 6: Mapa de pGBTOPAn5, em que o promotor constitutivo gpdA conduz a expressão de PCKa. Os flancos de GIaA foram usados para integração. DNA de E. coli foi removido por digestão NotI.

Figura 7: Mapa de pGBTOPAn6, em que o promotor constitutivo gpdA conduz a expressão de PCKm. Os flancos de GIaA foram usados para integração. O DNA de E. coli foi removido por digestão NotI. Figura 8: Mapa de plasmídeo de pGBS416PPK-1, codificando PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes para a expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 9: Mapa de plasmídeo de pGBS416PEK-1, codificando PEP carbóxiquinase de Mannheimia succiniciproducens para expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado. Figura 10: Mapa de plasmídeo de pGBS415FUM-3, contendo fumarase de Rhizopus oryzae (FUMR) e malato peroxissomal desidrogenase de Saccharomyces cervisiae (MDH3) para expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas de TDH1 promotor-FUMR-TDH1 terminador e TDH3 promotor-MDH3-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS415. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 11: Níveis de ácido succínico (linhas tracejadas) e fumárico (linhas contínuas) em cepas SUC-101 (O, controle de vetores vazios), SUC-152 (□, superexpressão de PCKa, MDH3, FUMR), SUC-154 (■, PCKm, MDH3, FUMR). Todos genes superexpressos eram pares de códons otimizados para expressão em S. cerevisiae. Todos os dados representam médias e desvios padrões de 3 experimentos de crescimento independentes de SUC-152 e 2 experimentos de crescimento independentes de SUC-154 e médias e desvios padrões de 6 experimentos de crescimento independentes de SUC-101.

Figura 12: Mapa de plasmídeo de pGBS414PPK-3, contendo PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes (PCKa) e fumarato redutase glicossomal de Trypanosoma brucei (FRDg) para expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas TDH1 promotor-PCKa-TDH1 terminador e TDH3 promotor-FRDg-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS414.

Figura 13: Mapa de plasmídeo de pGBS426PYC-2, contendo piruvato carboxilase de Saccharomyces cervisiae para expressão em Saccharomyces cervisiae. A sequência de nucleotídeo de codificação de PYC2 foi obtida por PCR usando DNA genômico da cepa CEN.PK113-5D como molde e o produto de PCR foi clonado no vetor de expressão p426GPD.

Figura 14: Mapa de plasmídeo de pGBS414FRE-1, codificando fumarato redutase glicossomal (FRDg) de Trypanosoma brucei para expressão em Saccharomyces cervisiae. A construção de gene sintética de TDH3 promotor- FRDg-TDH3 terminador foi clonada no vetor de expressão pRS414.

Figura 15: Os níveis de ácido succínico em cepas SUC- 226 (□, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), -227 (▲, PYC2, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-228 (■, PYC2, MDH3, FUMR, FRDg) e SUC-230 (O, MDH3, FUMR, FRDg). Os dados representam a média de 3 experimentos de crescimento independentes. Os seguintes exemplos são para finalidades ilustrativas somente e não devem ser interpretados como limitantes da invenção.

Exemplos Exemplo 1

Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes e Mannheimia succiniciproducens em Aspergillus niger 1.1. Construções de expressão Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49], número de acesso GenBank 152977907, de Actinobacillus succinogenes foi analisada para a presença de sequências de sinal usando SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. e col. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 e TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. e col. (2007), Nature Protocols 953-971. A análise como descrita por Schlüter e col., (2007) NAR, 35, D815-D822 revelou uma sequência de sinal PTS2 putativa na posição 115-123. A sequência de A. succinogenes (aminoácido SEQ ID N°: 1, sequência de nucleotídeo SEQ ID N°: 2) foi modificada para se assemelhar à sequência de proteína de Mannheimia succiniciproducens ao substituir os aminoácidos EGY na posição 120-122 com DAF (sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 3; sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 4). A sequência de SEQ ID N°: 3 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para A. niger. A sequência resultante de SEQ ID N°: 7 foi colocada atrás da sequência de promotor GPDA constitutiva de SEQ ID N°: 11, em que as últimas 10 sequências de nucleotídeo foram substituídas com a sequência de Kozak ótima CACCGTAAA. Os locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). O fragmento foi SnaBI, SfiI clonado no vetor de expressão de A. niger pGBTOPH (veja a Figura 1) usando locais de restrição apropriados. Do mesmo modo fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49], número de acesso GenBank 52426348, de Mannheimia succiniciproducens foi analisada para a presença de sequências de sinal como descrito em Schlüter e col., (2007) NAR, 35, D815-D822. A sequência como mostrada em SEQ ID N°: 5 (sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 6) não exigiu modificações. Subsequentemente, a sequência foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para A. niger. A sequência resultante de SEQ ID N°: 8 foi colacada atrás da sequência de promotor GPDA constitutiva de SEQ ID N°: 11, e locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). O fragmento foi SnaBI, SfiI clonado em vetor de expressão de A. niger pGBTOPH (veja a Figura 1) usando locais de restrição apropriados. Após a clonagem do gene de PCKa em pGBTOPH, o vetor foi renomeado pGBTOPAn5 (Figura 6). Após a clonagem do gene de PCKa em pGBTOP11, o vetor foi renomeado pGBTOPAn6 (Figura 7).

1.2. Transformação de A. niger A. niger WT-1: Esta cepa de A. niger é CBS513.88 compreendendo deleções dos genes codificando glucoamilase (glaA), amílase fúngica e amílase ácida. A. niger WT-1 foi construído usando a abordagem de “MARKER-GENE FREE” como descrito em EP 0 635 574 B1.

As construções de expressão são co-transformadas para cepa A. niger WT-1 de acordo com o método descrito por Tilburn, J. e col., (1983) Gene 26, 205-221 e Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J. 4, 475-479 com as seguintes modificações:

Os esporos são germinados e cultivados por 16 horas em 30°C em um frasco de agitação colocado em um agitador rotatório em 300 rpm em meio mínimo de Aspergillus (100 ml). O meio mínimo de Aspergillus contém por litro: 6 g de NaNO3, 0,52 g de KCl, 1,52 g de KH2PO4, 1,12 ml de KOH 4 M, 0,52 g de MgSO4.7H2O, 10 g de glicose, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnSO4^7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeSO4^7H2O, 1,7 mg de CoCl2^6H2O, 1,6 mg de CuSO4^5H2O, 5 mg de MnCl2^2H2O, 1,5 mg de Na2MoO4 • 2H2O, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCl, 0,2 mg de ácido pantotênico, 4 mg de biotina, 10 ml de solução de Estreptomicina (5000 UG/ml) Penicilina (5000 IU/ml) (Gibco). - Novozym 234™ (Novo Industries) em vez de helicase é usado para a preparação de protoplastos; - Após a formação de protoplasto (60-90 minutos), tampão de KCL (KCL 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) é adicionado a um volume final de 45 ml, a suspensão de protoplasto é centrifugada por 10 minutos em 3000 rpm em 4°C em um rotor de cuba oscilante. Os protoplastos são ressuspensos em 20 ml de tampão KC e subsequentemente 25 ml de tampão de STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é adicionado. A suspensão de protoplasto é centrifugada por 10 minutos em 3000 rpm em 4°C em um rotor de cuba oscilante, lavada no STC-tampão e ressuspensa em STC-tampão em uma concentração de 10E8 protoplastos/ml; - A 200 microlitros da suspensão de protoplasto, o fragmento de DNA, dissolvido 10 microlitros de tampão TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) e 100 microlitros de solução PEG (20% de PEG 4000 (Merck), sorbitol 0,8 M, Tris- HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é adicionado; - Após a incubação da suspensão de DNA-protoplasto por 10 minutos em temperatura ambiente, 1,5 ml de solução PEG (60% de PEG 4000 (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é lentamente adicionada, com mistura repetida dos tubos. Após incubação por 20 minutos em temperatura ambiente, as suspensões são diluídas com 5 ml de sorbitol 1,2 M, misturadas por inversão e centrifugadas por 10 minutos em 4000 rpm em temperatura ambiente. Os protoplastos são ressuspensos delicadamente em 1 ml de sorbitol 1,2 M e colocados em placas em meio de regeneração seletivo sólido consistindo em meio mínimo de Aspergillus sem riboflavina, tiamina.HCL, nicotinamida, piridoxina, ácido pantotênico, biotina, casaminoácidos e glicose. No caso de seleção de acetamida o meio contém acetamida 10 mM como a única fonte de nitrogênio e sacarose 1 M como osmoticum e C-fonte. Alternativamente, os protoplastos são colocados em placas em PDA (ágar de dextrose de batata, Oxoid) suplementados com 1-50 mg/ml de fleomicina e sacarose 1 M como osmosticum. As placas de regeneração são solidificadas usando 2% de ágar (ágar N°.1, Oxoid L11). Após incubação por 6-10 dias em 30°C, os conidioesporos de transformantes são transferidos às placas consistindo de meio seletivo de Aspergillus (meio mínimo contendo acetamida como a única fonte de nitrogênio no caso da seleção de acetamida ou PDA suplementado com 1-50 mg/ml de fleomicina no caso de seleção de fleomicina) com 2 % de glicose e 1,5 % de agarose (Invitrogen) e incubados por 5 dias em 30°C. Os únicos transformantes são isolados e esta etapa de purificação seletiva é repetida uma vez sob os quais os transformantes purificados são armazenados.

1.3. Crescimento em frasco de agitação de A. niger No total 10 transformantes são selecionados para cada construção e a presença da construção é confirmada por PCR usando primers específicos para construções. Subsequentemente os esporos são inoculados em 100 ml de meio enriquecido mínimo de Aspergillus compreendendo 100 g/l de glicose. As cepas são crescidas em uma incubadora em 250 rotações por minuto por quatro dias em 34°C. O sobrenadante do meio de cultura é analisado para a formação de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico por HPLC e comparado a uma cepa não transformada.

1.4 Análise de HPLC A HPLC é realizada para a determinação de ácidos orgânicos e açúcares em tipos diferentes de amostras. O princípio da separação em uma coluna de Phenomenex Rezex- RHM-Monossacarídeo é baseado na exclusão de tamanho, exclusão de íon e troca iônica usando mecanismos de fase reversa. A detecção ocorre por índice refrativo diferencial e detectores ultravioletas.

Exemplo 2A

Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens em Saccharomyces cervisiae. 2A.1. Construções de expressão Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49] número de acesso GenBank 152977907 de Actinobacillus succinogenes foi analisada para a presença de sequências de sinal como descrita sob § 1.1. SEQ ID N°: 3 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. A sequência resultante de SEQ ID N°: 9 foi colocada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva de SEQ ID N°: 12 e antes da sequência de terminador TDH1 de SEQ ID N°: 13, e locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). A construção de expressão pGBS414SUS-01 foi criada após uma restrição BamHI/NotI de vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e

Hieter P, Genetics, 1989, 122(1): 19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (origem de Actinobacillus succinogenes) (Figura 2). A mistura de ligação é usada para a transformação de E. coli DH10B (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura PGBS414SUS-01 (Figura 2). Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49] número de acesso GenBank 52426348 de Mannheimia succiniciproducens identificada e modificada como descrito sob § 1.1. SEQ ID N°: 5 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. A sequência resultante de SEQ ID N°: 10 foi colocada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva SEQ ID N°: 12 e antes da sequência terminadora TDH1 SEQ ID N°: 13, e locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). A construção de expressão pGBS414SUS-04 foi criada após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo na construção de gene sintética de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (origem de Mannheimia succiniciproducens) (Figura 3). A mistura de ligação é usada para transformação de E. coli DH10B (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura PGBS414SUS-04 (Figura 3). 2A.2. Transformação e crescimento em frasco de agitação As construções pGBS414SUS-01 e pGBS414SUS-04 são independentemente transformadas em cepas de S. cerevisiae CEN.PK1 13-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), RWB066 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox) e RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox). As misturas de transformação são colocadas em placas em Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose suplementada com aminoácidos apropriados. Os transformantes são inoculados em meio de Verduyn compreendendo glicose, suplementados com aminoácidos apropriados (Verduyn e col., 1992, Yeast. Julho; 8(7):501-17) e crescidos sob condições aeróbicas, anaeróbicas e limitadas de oxigênio em frascos de agitação. O meio para cultivo anaeróbico é suplementado com 0,01 g/l de ergosterol e 0,42 g/l de Tween 80 dissolvido em etanol (Andreasen e Stier, 1953, J. Cell. Physiol, 41, 23-36; Andreasen e Stier, 1954, J. Cell Physiol, 43:271-281). Todas as culturas de levedura são crescidas em 30°C em uma incubadora de agitação em 250-280 rpm. Em tempos de incubação diferentes, as alíquotas das culturas são removidas, centrifugadas e o meio foi analisado por HPLC para formação de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico como descrito sob a seção 1.4.

Exemplo 2B Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens em Saccharomyces cervisiae. 28.1. Construções de expressão

Em uma maneira similar como divulgada no Exemplo 2A.1 o gene de PCKa (SEQ ID N°: 9) foi ligado no vetor de expressão pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27). A mistura de ligação foi usada para a transformação de células de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS416PPK-1 (Figura 8).

Do mesmo modo, o gene de PCKm (SEQ ID N°: 10) foi ligado em pRS416. A mistura de ligação foi usada para a transformação de células de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS416PEK-1 (Figura 9). 28.2. Transformação e experimentos de crescimento de microplacas de título (MTP’s)

As construções pGBS416PPK-1 e pGBS416PEK-1 foram independentemente transformadas na cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATA ura3-52). Como controle negativo, o vetor vazio pRS416 foi transformado na cepa CEN.PK 113-5D. As misturas de transformação foram colocadas em placas em Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose. Os seguintes números de transformantes individuais foram inoculados in duplo em 250 ml de meio Verduyn compreendendo 2% de glicose em MTP de 96 poços profundos; e pre-cultivados em 30°C, 550 rpm, e uma umidade de 80% em incubadora de agitação Infors Microplate: transformantes de controle de vetor vazios 12 pGBS416PPK-1 (PCKa), 12 pGBS416PEK-1 (PCKm) e 24 pRS416. Após 3 dias, 25 ml da pré- cultura presentes nos poços dos MTP's foram transferidos às novas placas de MTP de 96 poços profundos contendo o meio Verduyn contendo glicose e CaCO3 (concentrações finais: glicose 10%, CaCO3 1% peso/vol em um volume total de 250 ml). Após 7 dias de crescimento em 30°C, 550 rpm, e uma umidade de 80% em incubadora de agitação Infors Microplate, os MTP's foram centrifugados por 2 minutos em 2000 rpm, 200 microlitros de sobrenadante foram colhidos usando Multimek 96 (Beckman), e o sobrenadante foi analisado por HPLC como descrito no Exemplo 1.4 para a presença de ácido succínico. Os resultados são mostrados na tabela 2.

Tabela 1. Efeito de inserção de PCKa e PCKm em S. cerevisiae em níveis de produção de ácido succínico, comparado à cepa controle compreendendo o vetor vazio pRS416 após 7 dias de cultivo.

Os resultados na Tabela 1 mostram que a introdução e a superexpressão de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens resultou em um nível de produção aumentado de ácido succínico em S. cerevisiae (1,28 vezes, p=4,92E-, e 1,32 vezes, p=2,95E-6 teste t de Estudo, respectivamente).

Exemplo 2C Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens, malato desidrogenase de Saccharomyces cervisiae e fumarase de Rhyzopus oryzae em Saccharomyces cervisiae. 2C.1. Sequências de gene Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase: As sequências de gene de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa) e M. succiniciproducens (PCKm) foram projetadas e sintetizadas como descritas sob 2A.1. Malato desidrogenase: A malato desidrogenase peroxissomal (Mdh3) [E.C. 1.1.1.37], número de acesso GenBank 1431095, foi analisada para ataque peroxissomal em fungos filamentosos usando o preditor PTS1 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1preditor.jsp com a função de predição fungo específica. Os aminoácidos C-terminais na posição 341-343 (SKL) foram removidos resultando na proteína de SEQ ID N°: 14. A SEQ ID N°: 14 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae resultando na SEQ ID N°: 15. O códon de parada TGA na SEQ ID N°: 15 foi modificado para TAAG. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 15 contendo TAAG como códon de parada foi sintetizada atrás da sequência promotora TDH3 constitutiva de SEQ ID N°: 18 (600 pb a montante do códon de partida) e antes da sequência terminadora TDH3 de SEQ ID N°: 19 (300 pb a jusante de códon de parada), e locais de restrição convenientes foram adicionados. A construção sintética TDH3p-MDH3-TDH3t (SEQ ID N°: 20) foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). Fumarase:

Fumarase [E.C. 4.2.1.2], número de acesso GenBank 469103, de Rhizopus oryzae foi analisada para a presença de sequências de sinal usando SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. e col. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 e TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. e col. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. Uma sequência alvo mitocondrial putativa nos primeiros 23 aminoácidos da proteína foi identificada. Para evitar o ataque potencial às mitocôndrias em S. cerevisiae, os primeiros 23 aminoácidos foram removidos resultando na SEQ ID N°: 16 e um aminoácido de metionina foi reintroduzido. A SEQ ID N°: 16 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae liberando a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 17. O códon de parada TAA na SEQ ID N°: 17 foi modificado para TAAG. A SEQ ID N°: 17 contendo TAAG como códon de parada foi sintetizada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva SEQ ID N°: 12 e antes da sequência terminadora TDH1 SEQ ID N°: 13 e os locais de restrição convenientes foram adicionados. A construção sintética TDH1p-FumR-TDH1t (SEQ ID N°: 21) foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). 2C.2. Construção de construções de expressão

A construção de expressão pGBS415FUM-3 (Figura 10) foi criada após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS415 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo na construção de gene sintética de fumarase (origem Rhizopus oryzae) (SEQ ID N°: 21). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS415FUM-1. Subsequentemente, pGBK415FUM-1 foi restringida com AscI e NotI. Para criar pGBS415FUM-3, um fragmento de restrição AscI/NotI consistindo de malato desidrogenase peroxissomal da construção de gene sintética S. cerevisiae (MDH3) (SEQ ID N°: 20) foi ligado no vetor pGBS415FUM-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura PGBS415FUM-3 (Figura 10).

A construção de construções de expressão pGBS414SUS-01 e pGBS414SUS-04 é descrita no exemplo 2A.1. 2C.3. Cepas de S. cerevisiae Os plasmídeo pGBS414SUS-01, pGBS415FUM-3 e pRS416 foram transformados na cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) para criar a cepa SUC-152. Os plasmídeos pGBS414SUS-04, pGBS415FUM-3 e pRS416 foram transformados na cepa S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) para criar a cepa SUC-154. Uma cepa de controle superexpressando somente vetores vazios (SUC-101) foi criada pela transformação de pRS414, pRS415 e pRS416. Todos os genes eram pares de códons otimizados para expressão em S. cerevisiae. Os vetores de expressão foram transformados em levedura por eletroporação. As misturas de transformação foram colocadas em placas na Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose. Os genes superexpressos em cepas SUC-152 e SUC-154 são descritos na Tabela 2. Tabela 2: As cepas de levedura construídas para o

2D.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido fumárico e ácido succínico Os transformantes foram inoculados em 20 ml de meio de pré-cultura consistindo de meio Verduyn (Verduyn e col., 1992, Yeast. Julho; 8(7):501-17) compreendendo 2% de galactose (peso/vol) e crescido sob condições aeróbicas em frascos de agitação de 100 ml em uma incubadora de agitação em 30°C em 250 rpm. Após 72 horas, a cultura foi centrifugada por 5 minutos em 4750 rpm. 1 ml de sobrenadante foi usado para medir os níveis de ácido succínico por HPLC como descrito na seção 1.5. O sobrenadante restante foi decantado e os grânulos (células) foram ressuspensos em 1 ml de meio de produção. O meio de produção consistiu de meio Verduyn com 10% de galactose (peso/vol) e 1% de CaCO3 (peso/vol). As células ressuspensas foram inoculadas em 50 ml de meio de produção em frascos de agitação de 100 ml e crescidas em uma incubadora de agitação em 30°C em 100 rpm. Em vários pontos de tempo, 1 ml de amostra foi tomada da cultura. Os níveis de ácido succínico e ácido fumárico foram medidos por HPLC como descrito na seção 1.4 (Figura 11).

As cepas transformadas com vetores vazios (cepa de controle) produziram até 0,3 g/l de ácido succínico (Figura 11, linha tracejada). A superexpressão de PEP carbóxiquinase de M. succiniciproducens (PCKm), malato desidrogenase peroxissomal (MDH3) de S. cerevisiae e fumarase de R. oryzae (FUMR) resultou em um nível de produção de 0,9 g/l de ácido succínico. A superexpressão de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa), MDH3 e FUMR resultou em um nível de produção de ácido succínico de 1,0 g/l. Estes resultados mostram que quando S. cerevisiae foi transformada com um MDH3 e FUMR truncadas além de PCKa ou PCKm, uma quantidade aumentada adicional de ácido succínico foi produzida em comparação a uma S. cerevisiae superexpressando PCKa ou PCKm sozinhas (Tabela 1).

As cepas transformadas com vetores vazios (cepa de controle) produziram até 14 mg/l de ácido fumárico após 8 dias de crescimento (Figura 11, linha contínua). A superexpressão de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa), malato desidrogenase de S. cerevisiae (MDH3) e fumarase de R. oryzae (FUMR) resultou em uma produção máxima de 55 mg/l de ácido fumárico após 7 dias de crescimento. A superexpressão de PEP carbóxiquinase de M. succiniciproducens (PCKm), malato desidrogenase de S. cerevisiae (MDH3) e fumarase de R. oryzae (FUMR) resultou na produção máxima de 52 mg/l de ácido fumárico após 8 dias de crescimento.

Estes dados mostram que a superexpressão de PCKa ou PCKm, MDH3 e FUMR em S. cerevisiae resultou em níveis de produção de ácido fumárico aumentados em comparação a uma S. cerevisiae tipo selvagem correspondente.

Exemplo 2D Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes, piruvato carboxilase de Saccharomyces cervisiae, malato desidrogenase de Saccharomyces cervisiae, fumarase de Rhyzopus oryzae em Saccharomyces cervisiae e fumarato redutase de Trypanosoma brucei.

2D.1. Sequências de gene A fumarato redutase de glicossomal (FRDg) [E.C. 1.3.1.6], número de acesso GenBank 23928422, de Trypanosoma brucei foi analisada para o ataque peroxissomal em fungos filamentosos usando o preditor PTS1 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.js p com a função de predição fungo específica. Os aminoácidos C-terminal na posição 1140-1142 (SKI) foram removidos da proteína, resultando na SEQ ID N°: 22. A SEQ ID N°: 22 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em PCT/EP2007/05594 para a expressão em S. cerevisiae. A sequência resultante de SEQ ID N°: 23 foi colocada atrás da sequência promotora de TDH3Sc constitutiva de SEQ ID N°: 24 e antes da sequência terminadora de TDH3Sc de SEQ ID N°: 25, e locais de restrição convenientes foram adicionados. O códon de parada na SEQ ID N°: 23 foi modificado para TAAG.

A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). A sequência de gene de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes foi descrita sob 2A.1. As sequências de gene de malato desidrogenase de S. cerevisiae e fumarase de R. oryzae foram descritas sob 2C.1.

A piruvato carboxilase citoplásmica de Saccharomyces cervisiae (Pyc2p) [E.C. 6.4.1.1.], número de acesso GenBank 1041734, SEQ ID N°: 26, é codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 27. DNA Genômico da cepa de S. cerevisiae CEN.PK1 13-5D (MATA ura3-52) foi usado como molde para amplificar a sequência de codificação PYC2 (SEQ ID N°: 29), usando primers P1 de SEQ ID N°: 28 e P2 SEQ ID N°: 29, e o polimerase de DNA Phusion (Finnzymes, Finlândia) de acordo com instruções do fabricante. Os locais de restrição convenientes foram incluídos nos primers para finalidades de clonagem adicionais. 2D.2. Construção de construções de expressão

A construção de expressão pGBS414PPK-3 (Figura 12) foi criada após uma restrição BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (origem Actinobacillus succinogenes) (veja 2A.1.). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PPK-1. Subsequentemente, pGBK414PPK-1 foi restringida com AscI e NotI. Para criar pGBS414PPK-3, um fragmento de restrição AscI/NotI consistindo de fumarato redutase glicossomal da construção de gene sintética de T. brucei (FRDg) (veja 2D.1.) foi ligado no vetor pGBS414PPK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PPK-3 (Figura 12).

A construção de expressão pGBS426PYC-2 (Figura 13) foi criada após uma restrição de SpeI/XhoI do vetor de expressão de S. cerevisiae p426GPD (Mumberg e col., Gene. abril 1995 14;156(1):119-22) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição SpeI/XhoI consistindo da sequência de nucleotídeo PYC2 amplificada (SEQ ID N°: 29). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS426PYC-2 (Figura 13).

A construção de expressão pGBS414FRE-1 (Figura 14) foi criada após uma restrição BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fumarato redutase glicossomal (origem Trypanosoma brucei) (veja 2D.1.). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414FRE-1 (Figura 14).

A construção de construção de expressão pGBS415FUM-3 foi descrita sob 2C.2. 2D.3. Cepas S. cerevisiae As cepas SUC-226, SUC-227, SUC-228 e SUC-230 foram obtidas pela transformação de combinações diferentes dos plasmídeo pGBS414FRE-1, pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-1, pGBS426PYC-2 e p426GPD na cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), como descritas na tabela 3. Tabela 3: Cepas de levedura construídas para o Exemplo 2D.

2D.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico

Os parâmetros de crescimento e análise de amostra foram realizados como descritos no exemplo 2C.4 com as seguintes modificações: a pré-cultura foi realizada usando 2% de glicose (peso/vol) como fonte de carbono. No meio de produção 10% de glicose (peso/vol) foi usada como fonte de carbono.

Como ilustrado na Figura 15 a cepa SUC-230, superexpressando MDH3, FUMR e FRDg, produziu até 3,0 g/l de ácido succínico. A superexpressão adicional de produção de ácido succínico aumentada PCKa até 3,4 g/l (cepa SUC-226), e a superexpressão adicional de PYC2 aumentaram a produção de ácido succínico até 3,7 g/l (cepa SUC-228). Surpreendentemente, a superexpressão de ambas PCKa e PYC2 (SUC-227) resultou no aumento de 1,5 dos níveis de produção de ácido succínico até 5,0 g/l, em comparação ao efeito de PCK e PYC sozinhos. Estes resultados mostram um efeito sinergístico de superexpressão combinada de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa) e piruvato carboxilase de S. cerevisiae (PYC2) em níveis de produção de ácido succínico em S. cerevisiae.

Exemplo 3

Inativação de genes de codificação de succinato desidrogenase em Aspergillus niger 3.1. Identificação O DNA de Genômico da cepa CBS513.88 de Aspergillus niger foi sequênciado e analisado. Dois genes com proteínas traduzidas notadas como homólogas às proteínas de succinato desidrogenase foram identificadas e nomeadas sdhA e sdhB respectivamente. As sequências dos loci de sdhA (An16g07150) e sdhB (An02g12770) estão disponíveis no genbank com números de acesso 145253004 e 145234071, respectivamente. Os vetores de substituição de gene para sdhA e sdhB foram projetados de acordo com princípios conhecidos e construídos de acordo com procedimentos de clonagem rotineiros (veja as Figuras 4 e 5). Os vetores compreendem as regiões de flanqueamento de aproximadamente 1000 pb da sdh ORFs para a recombinação homóloga nos loci genômico predestinado. Além disso, contêm o marcador de seleção amdS bidirecional de A. nidulans de A. conduzido promotor de gpdA, entre repetições diretas. O projeto geral destes vetores de deleção foi previamente descrito em EP635574B e WO 98/46772.

3.2. Inativação do gene de sdhA em Aspergillus niger. O DNA linear do vetor de deleção pDEL-SDHA (Figura 4) foi isolado e usado para transformar Aspergillus niger CBS513.88 como descrito em: Biotechnology of Filamentous Fungi: Technolofy and Products. (1992) Reed Publishing (EUA); Capítulo 6: Transformation p. 113 a 156. Este DNA linear pode integrar no genoma no locus sdhA, assim substituindo o gene de sdhA pelo gene de amdS como ilustrado na figura 6. Os transformantes foram selecionados nos meios de acetamida e colônia purificada de acordo com procedimentos padrões como descrito em EP635574B. Os esporos foram colocados em placas em meios de fluoro- acetamida para selecionar as cepas, que perderam o marcador amdS. As colônias crescentes foram diagnosticadas por PCR para integração no locus sdhA e as cepas candidatas testadas por análises Southern para a deleção do gene sdhA. A deleção do gene de sdhA foi detectável pela redução de tamanho de ~2,2 kb de fragmentos de DNA (4,6 kb de fragmento tipo selvagem contra 2,4 kb para uma deleção de sucesso de SDHA) cobrindo o locus inteiro e hibridizado para sondas apropriadas. Aproximadamente 9 cepas mostraram uma remoção do gene sdhA genômico de uma associação de aproximadamente 96 transformantes iniciais.

A cepa dSDHA foi selecionada como uma cepa representativa com um gene sdhA inativado. A produção de ácido succínico pela cepa dSDHA foi medida como descrita no Exemplo 4.

Exemplo 4

Clonagem de PCKa e PCKm no dSDHA de A. niger e crescimento em placas de microtítulo (MTP’s) Uma cepa de A. niger dSDHA do exemplo 3.2. foi transformada com a construção de expressão pGBTOPAn5 (Figura 6) compreendendo PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinigenes (PCKa, SEQ ID N°: 7) e construção de expressão pGBTOPAn6 (Figura 7) compreendendo PEP carbóxiquinase de Mannheimia succinicproducens (PCKm, SEQ ID N°: 8) como descrito no exemplo 1.1., de acordo com o método de transformação como descrito no Exemplo 1.2.

Os transformantes de A. niger foram escolhidos usando Qpix e transferidos em meios seletivos contendo MTP’s. Após 7 dias de incubação em 30°C a biomassa foi transferida aos MTP's contendo PDA à mão ou escolhedora de colônia. Após uma incubação de 7 dias em 30°C, a biomassa foi esporulada. Estes esporos foram ressuspensos usando o Multimek 96 (Beckman) em meio de Aspergillus enriquecido mínimo de 100 ml contendo glicose 10%. Subsequentemente 2 MTP's com meio enriquecido mínimo de Aspergillus de 170 ml contendo glicose 10% e CaCO3 1% foram inoculados com 30 ml da suspensão de esporo. Do mesmo modo dSDHA e a cepa controle de A. niger CBS513.88 foram inoculadas em MTP's. Estes MTP's foram incubados por 5 dias em 34°C, 550 rpm em umidade de 80%. Após 5 dias, 160 ml foram colhidos usando o Multimek 96 (Beckman). O ácido succínico nos meios foi medido por HPLC como descrito no exemplo 1.4. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 4. Efeito de deleção de succinato desidrogenase (SDHA) e inserção de PCKa e PCKm em A. niger em níveis de produção de ácido succínico.

Os resultados na Tabela 4 mostram que a inserção de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de ambas A. succinogenes ou M. succiniciproducens aumentou os níveis de produção de ácido succínico por A. niger.

Claims (10)

1. Célula microbiana eucariótica recombinante caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em uma levedura e um fungo filamentoso compreendendo uma sequência de nucleotídeo heteróloga selecionada entre SEQ ID N°: 7 e SEQ ID N°:9 codificando uma enzima heteróloga catalisando a conversão de fosfoenolpiruvato ao oxaloacetato onde ATP é gerado, em que a enzima é uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase de SEQ ID N°: 3, ou uma sequência de nucleotídeo heteróloga selecionada entre SEQ ID N°:8 e SEQ ID N°: 10 que codifica uma enzima heteróloga que catalisa a conversão de fosfoenolpiruvato em oxaloacetato onde ATP é gerado, onde a enzima é uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase de SEQ ID N°: 5, e em que a enzima é ativa no citosol.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima é derivada de uma bactéria, preferivelmente de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., ou Anaerobiospirillum sp., mais preferivelmente de Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, ou Anaerobiospirillum succiniciproducens.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae e o fungo filamentoso é Aspergillus niger.

4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a célula superexpressa uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 27, codificando uma piruvato carboxilase de SEQ ID N°: 26.

5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a célula ainda compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N° . 15 codificando uma malato desidrogenase de SEQ ID N°: 14, em que a malato desidrogenase está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo codificando malato desidrogenase.

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a célula ainda compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 17 codificando uma fumarase de SEQ ID N°: 16 que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico no citosol, sob expressão da sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a conversão de ácido málico à ácido fumárico.

7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é um Aspergillus niger compreendendo uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 7 e/ou SEQ ID N°: 8 codificando uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase de respectivamente SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5.

8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é uma Saccharomyces cervisiae compreendendo uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 9 e/ou SEQ ID N°: 10 codificando uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase de respectivamente SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 5.

9. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a célula ainda compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 23 codificando uma fumarato redutase de SEQ ID N°: 22.

10. Processo para a preparação de um ácido dicarboxílico caracterizado pelo fato de que compreende fermentar a célula microbiana eucariótica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em um meio de fermentação apropriado, e preparar o ácido dicarboxílico, em que o ácido dicarboxílico é ácido succínico, ácido fumárico ou ácido málico.

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