CN101128577B - 一种提高有机酸产量的重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产生有机酸的重组微生物。该重组微生物表达一种用于戊糖磷酸循环的具有酶活性的多肽。该重组微生物可以包括已经被转化的，可以表达6-磷酸葡糖脱氢酶(Zwf)基因的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)。该重组微生物可以用于产生有机酸的发酵过程，例如，琥珀酸和乳酸。本发明还涉及一种用于转化微生物以产成表达如Zwf酶的重组微生物的新的质粒。

Description

一种提高有机酸产量的重组微生物
美国政府支持声明
本发明是在美国能源部资助的No.DE-FC36-02GO12001合作协议的支持下完成。美国政府对本发明具有一定的权力。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求于2005年1月26日提交的美国分案申请第60/647,141号和于2004年12月22日提交的美国分案申请第60/639,443号中的利益，前述专利申请通过全部引用并入本发明。
背景技术
许多目前源于石油化学材料的化学品都可以从天然碳水化合物制备而来。特别是有可能成为高容量日用化学品的琥珀酸，一种四碳二羧酸，琥珀酸可以作为商业工艺过程的起始材料，用于产生消费用品工业上许多重要的中间体和精细化工材料。并且这些日用化学品目前依靠于来源于非可再生石油化工材料的源材料。例如，作为日用化学品的琥珀酸可以代替石油化工起始材料，用于制备1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物，而1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)是许多工业中有用的溶剂和起始材料。例如，1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物用于生产汽车车身用树脂，家用电器用热塑材料和纺织业中莱卡等的弹性聚合物。此外，1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物在农业化工和制药工业中还有许多特殊的用途。值得注意的是，BDO的世界消费量正以每年4％的速度增长。
目前，用于生产BDO和THF的石油化学品包括乙炔、甲醛、丁烷、丁二烯和环氧丙烷。所有这些原料都具有各种不同的缺点，如极度易燃性、化学不稳定性和毒性。而且，由于这些材料都是来源于石油，会使不可再生资源耗尽。他们的处理或者破坏，最终会向大气中释放碳(以二氧化碳的形式)。因此，研制琥珀酸替代石油化工源原料可以减少有害原料的处理和储藏，提高工业和社区安全性，减少污染和环境成本，并减少对石油的依赖性。
通过糖发酵生产琥珀酸和其他有机化合物是一种经济可行的方法，许多微生物已经被用于以谷物糖作为碳源生产琥珀酸。这样，开发琥珀酸作为石油化工起始原料的替代品，将扩大那些可以提供发酵糖的谷物、其他农产品和/或生物量的市场。
正式地讲，制备琥珀酸的生物化学途径就是向三碳化合物磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)上添加一个二氧化碳分子，产生四碳化合物草酰乙酸盐(OAA)。产生琥珀酸途径中的下一个步骤是反三羧酸循环(TCA循环)的一部分，包括两个专性还原步骤。在从OAA到琥珀酸盐的生化工艺中，OAA必须首先被还原产生L—苹果酸盐，L—苹果酸盐然后脱水产生延胡索酸盐和水。然后，延胡索酸盐被还原产生琥珀酸。在化学技术中，“还原”是指向化合物添加氢分子。
通常来讲，自由分子氢在细胞内生物系统中未发现存在。因此，还原反应是通过辅酶作为氢的生物化学等效物(即，作为分子氢的载体)来实现的，术语表述为“还原当量”。还原当量包括辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)和还原型黄素单核苷酸(FMNH)。一般情况下，在一些微生物中，NADH和NADPH可以在吡啶二核苷酸转氢酶作用下相互转化。
将OAA转化为琥珀酸盐的还原当量通过NAD(P)H2，FADH2，或者其他辅助因子提供。在OAA转化为琥珀酸盐的反应中，必须保证足够量的还原当量。如果没有足够量的还原当量，生物化学途径就不会有效地进行，仅会有一部分OAA被转化为所需的琥珀酸盐。
还原当量在很多常见于细胞代谢的生物过程中都可以产生。例如，戊糖磷酸循环(PPC)过程中可以产生还原当量。在戊糖磷酸循环过程中，葡萄糖—6—磷酸在葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的作用下，被转化为D—6—磷酸—葡萄糖酸-δ-内酯，葡萄糖—6—磷酸脱氢酶也称间酶或者Zwf。NADP作为转化反应的一部分，被转化为NADPH，作为还原当量的受体。
很少的微生物被发现可以产生足够浓度的琥珀酸，而用于商业生产。其中一个微生物是Actinobacillus succinogenes，一种可以从牛瘤胃中分离出来的兼性厌氧微生物。这种微生物可以产生高浓度的琥珀酸，并可以耐受高浓度糖。Actinobacillus succinogenes是研究的最清楚的琥珀酸生产菌株之一，但是其该菌株的发酵产物因为缺乏还原当量而受限。因此，提高发酵生产琥珀酸的产量，包括采用改进的产生琥珀酸的微生物菌株是人们所殷切希望的。
发明内容
本发明涉及一种产生有机酸的重组微生物。所述的重组微生物表达具有一个或者多个生物化学酶活性的多肽，该生物化学酶用于戊糖磷酸循环中。一个实施例中，该酶是葡萄糖—6磷酸—1—脱氢酶，也称间酶或者Zwf。例如，重组微生物可以表达编码具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸。另一个实施例中，重组微生物是一种通过DNA分子转化后，表达具有Zwf酶活性的多肽的琥珀酸生产微生物的重组菌株。
典型的重组微生物可以产生适合商业生产用的一定水平的一种或者多种有机酸。一些实施例中，重组微生物是一种可以产生琥珀酸的微生物。例如，该微生物可以产生适合商业生产用的浓度的琥珀酸。适合商业生产用的浓度可以至少约20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L和/或者140g/L。期望地，重组微生物能产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸。
重组微生物可以是经筛选和/或重组工程后，耐受相对高浓度的琥珀酸，这样可以便于发酵系统中产生适合商业生产用浓度的琥珀酸。一些实施例中，重组微生物可以是经筛选后，产生相对低的不希望的副产物，如乙酸盐、甲酸盐和/或丙酮酸盐(例如不超过约2.0g/L乙酸盐，不超过约2.0g/L甲酸盐，和/或不超过约3.0g/L丙酮酸盐)。该重组微生物可以是抗一定浓度的氟乙酸钠的菌株衍生而来的(或其突变菌株)，能抵抗至少约1g/L，2g/L，4g/L，和/或8g/L。另一个实施例中，重组微生物的突变菌株可以是筛选出来的，抗一定浓度的，至少约1g/L，2g/L，4g/L，和/或8g/L的氟乙酸钠。
一个实施例中，重组微生物衍生于Actinobacillus succinogenes菌株(例如“A.succinogenes”)，或与Actinobacillus succinogenes近似种的微生物。一个合适的A.succinogenes菌株是美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)保藏的细菌130Z，ATCC保藏号为55618。见美国5,504,004中描述的细菌130Z和其他合适菌株。
其他合适微生物可选来制备重组微生物，可以包括经16S rRNA序列相同性鉴定的与A.succinogenes近似的微生物。例如，一个合适的A.succinogenes近似微生物可以是其16S rRNA序列与A.succinogenes的16SrRNA实质序列相同(即，与A.succinogenes的16S rRNA至少约90％的序列相同，或者更合适的是，与A.succinogenes的16S rRNA至少约95％的序列相同的微生物)。许多巴斯德菌科家族的代表性微生物的16S rRNA与A.succinogenes的16S rRNA至少约90％的序列相同。例如，见Guettler etal.，INT’L J.SYSTEMATIC BACT.(1999)，49，207-216，209页表2。合适的微生物可以包括例如Bisgaard Taxon6和Bisgaard Taxon10的微生物。
一些实施例中，重组微生物可以由除了A.succinogenes以外的生物制备而来。例如，重组微生物可以由任何适于在发酵系统中产生有机酸的微生物制备而来。合适的微生物可以包括大肠杆菌(E.coli)。合适的E.coli菌株是本领域技术人员熟知的。
抗氟乙酸钠的微生物突变菌株也可以适于制备重组微生物。例如，见U.S.5,521,075和U.S.5,573,931。一个实施例中，重组微生物由A.succinogenes的一个突变株制备而来，此A.succinogenes的一个突变株能抗至少约1g/L氟乙酸钠。一个合适的突变菌株是FZ45，见U.S.5,573,931。保藏在ATCC，保藏号为PTA-6255的重组菌株，是来源于A.succinogenes的一个突变株，能抗至少约1g/L氟乙酸钠(即FZ45)。
重组微生物典型地可以编码用于戊糖磷酸循环的具有一个或多个酶生化活性的多肽的多核苷酸转化而来。例如，重组微生物可以是编码具有一个或多个Zwf酶(即，葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性和/或NADP还原酶活性)生化活性的多肽的多核苷酸转化而来。优选地，该多核苷酸编码的多肽有助于NADP向NADPH转化。该多核苷酸或多肽可是微生物内生，或者源于微生物中正常存在的基因或酶。一些实施例中，多核苷酸或多肽可以与微生物的内生基因或酶同源。另一些实施例中，多核苷酸或多肽可以是异源的(即，源于正常情况下微生物中不存在的基因或酶；或者源于微生物以外的资源)。
此重组微生物可以表达一种编码多肽和/或者多肽的一种突变体的多核苷酸的突变体。该多核苷酸的一种突变体可以包括具有至少约90％的序列与该核苷酸相同的多肽，或者，优选的是至少约95％序列相同，该多核苷酸编码的多肽具有一个或多个Zwf酶的生物化学活性(例如，NADP还原酶活性)。一种突变体可以是至少约90％的序列与该多肽相同的多肽，或者，优选的是至少约95％序列相同，其中，该多肽具有一个或多个Zwf酶的生物化学活性(例如，NADP还原酶活性)。这样，合适的多核苷酸可以是编码与选定的Zwf酶至少约95％的序列相同的多肽的多核苷酸，其中，该多肽具有NADP还原酶活性。
此重组微生物可以是用编码表达具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸转化而来，其中，该重组微生物比不用具有表达Zwf酶活性的多肽的多核苷酸转化的微生物具有更高的Zwf酶活性。在一些实施例中，该重组微生物比不用具有表达Zwf酶活性的多肽的多核苷酸转化的微生物具有至少约5倍(5×)多的Zwf酶活性，(或者优选的具有至少约10倍(10×)多的Zwf酶活性，或者具有至少约50倍(50×)多的Zwf酶活性)。Zwf酶活性可以包括NADP还原酶活性。Zwf酶活性可以通过测量重组微生物中的NADPH水平而得到(例如，与不用具有表达Zwf酶活性的多肽的多核苷酸转化的微生物相比较)。
重组微生物可以表达编码Zwf酶的多核苷酸，如Zwf基因。多核苷酸的突变体可以包括由至少约90％序列与Zwf基因相同的多核苷酸，或者优选的至少约95％序列与Zwf基因相同的多核苷酸，并且该多核苷酸的突变体编码的多肽具有一个或者更多Zwf酶的生物化学活性。多核苷酸的突变体可以包括多核苷酸的核苷酸片段。例如，片段可以包括至少约90％的Zwf基因，或者至少约95％的Zwf基因。核苷酸片段可以是合适的长度，例如，该核苷酸片段是由至少10，50,100,250,500，1000和/或1400核苷酸组成。片段可以编码具有Zwf酶的一个或者多个生物化学活性的多肽。
合适的Zwf基因可以包括内生于或者重组微生物固有的Zwf基因(即，正常存在于微生物中的Zwf基因，而该重组微生物是源于此微生物)或者其突变体。其他合适的Zwf基因可以包括异源于微生物的Zwf基因(即，Zwf基因不是正常存在于该微生物体内，或者不是从用于制备重组微生物的源微生物中获得)，或者其突变体。合适的Zwf基因可以包括具有至少约90％的核苷酸序列与选定的Zwf基因相同的突变体(优选的是至少约95％的核苷酸序列与选定的Zwf基因相同)，并且该突变体编码的多肽具有一个或者多个Zwf酶活性(即，葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性和/或NADP还原酶活性)。
合适的Zwf基因可以包括E.coli Zwf基因或者其突变体。该E.coliZwf基因的多核苷酸序列保藏在GenBank中，登录号NC_000913，与核苷酸1,932,863到1,934,338(SEQ ID NO：1)的反向互补，且登录号M55005是核苷酸708到2180(SEQ ID NO：2)。合适的E.coli Zwf基因突变体可以包括至少约90％的序列与SEQ ID NO：1(或者SEQID NO：2)的多核苷酸序列相同(优选的是至少约95％的序列相同)，这样，该多核苷酸就可以编码具有Zwf酶的一个或多个生物化学活性的多肽(即，葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性和/或NADP还原酶活性)。
合适的Zwf基因可以包括A.succinogens Zwf基因或者其突变体。最近，已经建立并组装出A.succinogens Zwf130Z的基因组序列草图，从2005年9月开始，在美国能源部Joint基因组研究所的网站面向公众开放。Zwf基因被注释为“葡萄糖—6—磷酸1—脱氢酶”，存在于重叠群115(conting115)，核苷酸8738-10225(SEQ ID NO：5)。编码多肽(即A.succinogens Zwf酶)推测的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。使用国家生物技术信息中心网站上的“BLAST”比对算法版本BLASTP2.2.12，BLOSUM62matrix，可知Zwf酶的氨基酸序列与E.coli Zwf酶有43％相同，60％同源。合适的A.succinogens Zwf基因突变体可以包括至少约90％的序列与SEQ IDNO：5的多核苷酸相同(优选的是至少约95％的序列相同)的多核苷酸，这样该多核苷酸就可以编码具有Zwf酶的一个或者多个生物化学活性的多肽(即，葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性和/或NADP还原酶活性)。
重组微生物可以表达内生Zwf酶(即，Zwf酶存在于产生重组微生物的微生物体内)，或者其突变体。在其他一些实施例中，重组微生物可以表达与微生物异源的Zwf酶(即，Zwf酶不存在于、产生重组微生物的微生物体内，也不在该微生物体内表达)，或者其突变体。合适的Zwf酶可以包括至少约90％的氨基酸序列与选定的Zwf酶的氨基酸序列相同的突变体(优选的是至少约95％的氨基酸序列与选定的Zwf酶相同)，并且具有Zwf酶的一个或多个生物化学活性(如NADP还原酶活性和/或葡萄糖—6—磷酸脱氢酶活性)。合适的Zwf酶可以包括E.coli Zwf酶(例如，SEQ ID NO：3，NC_000913的核酸的1，932，863到1，934，338核苷酸序列的反向互补核苷酸编码的多肽)或者其突变体，和A.succinogens Zwf酶(例如，SEQID NO：6)或者其突变体。
突变体多肽可以包括Zwf酶的片段。例如，片段可以包括至少约90％的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者更优选的是至少约95％的SEQID NO：3的氨基酸序列。在其他一些实施例中，片段可以包括至少约90％的SEQ IDNO:6的氨基酸序列，或者更优选的是至少约95％的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。多肽片段可以是任何合适的长度。例如，多肽片段可以包括(例如是SEQID NO：3或者SEQ ID NO：6中的)至少约10，50，100，200，和/或300个氨基酸。多肽片段典型地具有Zwf酶的一个或多个生物化学活性。
重组微生物可以包括产生琥珀酸的微生物，该微生物已经被表达编码内生Zwf酶(即，固有的)的内生(即，固有的)Zwf基因的多核苷酸转化。在一些实施例中，重组微生物可以包括产生琥珀酸的微生物，该微生物已经被表达编码异源Zwf酶的异源Zwf基因的多核苷酸转化。该重组微生物保藏在美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)，ATCC登录号PTA-6255，是一种产生琥珀酸的微生物菌株(即，A.succinogens)，该微生物表达编码异源Zwf酶的异源Zwf基因(例如E.coli Zwf基因)。
该重组微生物可以相对高水平地表达具有Zwf酶活性的多肽(即，该多肽可以“过表达”)。例如，与非重组微生物相比较而言，该重组微生物可以相对高水平地表达内生Zwf酶。在一些实施例中，相对于没有被DNA分子转化的重组微生物而言，该重组微生物可以用相对高水平地表达内生Zwf酶的DNA分子(如，质粒)转化。
多核苷酸，例如Zwf基因，在所选微生物中的表达可以优化，所述的所选微生物产生重组微生物。例如，异源Zwf基因在非内生微生物中的表达可以优化。在一些实施例中，Zwf基因可以在A.succinogens中进行表达优化，或者在例如Bisgaard Taxon6或Bisgaard Taxon10等的微生物中表达优化。在其他一些实施例中，Zwf基因可以在E.coli中进行表达优化。
多核苷酸，例如Zwf基因，可以在重组微生物中通过任何合适的策略进行表达优化。例如，可以通过将Zwf基因可操作地连接到启动子序列上，以便于Zwf基因在重组微生物中的表达优化，该启动子是便于Zwf基因在重组微生物中表达的。该启动子序列可以优化，以便于相对高水平地在重组微生物中表达(例如，被优化以便于“过表达”)。Zwf基因可以可操作地连接到微生物的内生启动子序列上(即，微生物中固有的启动子)，或者微生物的异源启动子序列上(即，正常情况下该微生物内没有的启动子，或者源于除了该微生物的其他来源)。合适的启动子可以包括所选Zwf基因的非固有启动子(即，非Zwf基因启动子，可以是内生于微生物或异源于微生物的启动子)。合适的启动子可以包括诱导表达启动子或者组成型启动子。合适的启动子可以源于产生琥珀酸的微生物的启动子。
在其他一些实施例中，Zwf基因的表达可以在翻译水平上优化。例如，异源Zwf基因可以被修饰，以包括微生物中具有优化使用频率的编码子，所产生的重组微生物作为非天然基因宿主。
在其他一些实施例中，多核苷酸例如Zwf基因的表达可以通过向重组微生物中提供相对高拷贝数量的多核苷酸而优化。例如，Zwf基因可以存在于外遗传元件上，该外遗传元件可以复制，以在重组微生物中获得相对高的拷贝数量(例如，质粒)。
在一些实施例中，重组微生物是一个产生琥珀酸的微生物重组菌株，例如Actinobacillus succinogens或相关的微生物。这些微生物已用包括与Zwf基因可操作性连接的启动子的DNA分子转化。该Zwf基因可以是内生或异源的Zwf基因，可以包括例如，A.succinogens Zwf基因(如SEQID NO：5)和E.coli Zwf基因(例如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。其他的Zwf基因都是已知的，他们的核苷酸序列已经被公布(参见，如GenBank)。产生琥珀酸的微生物的合适的内源或固有的启动子序列可以包括，例如磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子序列。A.succinogens烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子序列保藏于GenBank，登录号AY308832，核苷酸1-258(SEQ ID NO：4)。烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子可以是Zwf基因的合适的异源启动子(即，非Zwf基因启动子)。
如上所述，重组微生物可以包括重组DNA分子作为外遗传元件和/或重组DNA分子可以并入微生物基因组(例如，通过合适的重组方法)。在一些实施例中，DNA分子是质粒、重组噬菌体、细菌人工染色体(BAC)和/或E.coliP1人工染色体(PAC)。该DNA分子可以包括可选的标记。合适的可选标记可以包括卡那霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性和这些可选标记的组合。在一些实施例中，可选标记是卡那霉素抗性。
如上所述，重组DNA分子可以包括一个合适的启动子，该启动子与编码具有Zwf酶的一个或多个生物化学活性多肽的多核苷酸可操作地连接，用于在重组微生物(例如A.succinogens)中表达多核苷酸。该启动子适合于在产生琥珀酸的微生物中表达多肽。在一些实施例中，重组DNA分子包括烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子(例如A.succinogens烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子)，该启动子与Zwf基因或者其突变体可操作地连接，(此突变体可以包括异源Zwf基因，如E.coli Zwf基因或A.succinogens Zwf基因)。如，DNA分子可以包括GenBank中登陆号AY308832(SEQ ID NO：4)的DNA序列中的核苷酸1-258或其突变体，并与GenBank中登陆号NC_000913(SEQID NO：1)的DNA序列中核苷酸1，932，863到1，934，338的反向互补核苷酸可操作地相连；或与GenBank中登陆号M55005(SEQ ID NO：2)的DNA序列可操作地相连；或与SEQ ID NO：5的DNA序列可操作地相连。一些实施例中，该启动子可以包括至少约95％的序列与SEQ ID NO：4的核苷酸序列相同的多核苷酸，并在重组微生物中具有启动子活性。
包括重组DNA分子的重组微生物可以用于在发酵系统中产生有机酸(例如琥珀酸或乳酸)。相对于不包括重组DNA分子的微生物，包括重组DNA分子的重组微生物可以在发酵系统中产生提高水平的有机酸(例如琥珀酸或乳酸)。
本发明还提供包括一个或多个前述重组DNA分子的DNA质粒。该DNA质粒可以包括一个可选标记。合适的可选标记可以包括一个或多个氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性和磺胺抗性的基因，并与合适的启动子可操作地连接(例如，一种组成型启动子)。在一些实施例中，DNA质粒包括卡那霉素抗性基因。
DNA质粒可以包括在一个或多个合适宿主细胞中维持和/或复制该质粒所需要的序列。在一些实施例中，DNA质粒可以在合适的宿主细胞间作为穿梭载体。DNA质粒可以在A.succinogens和E.coli间作为穿梭载体。
本发明还提供了包括一个或多个前述DNA分子的宿主细胞。例如，该宿主细胞可以包括包含DNA分子的DNA质粒。该宿主细胞可以用于产生和分离包含DNA分子的DNA质粒。
该宿主细胞适合于在发酵系统中，产生一种或多种有机酸。在一些实施例中，该宿主细胞可以在合适的水平下表达Zwf基因(进而是Zwf酶)，此水平下，在发酵系统中，可以提高一种或多种有机酸的产量(例如，琥珀酸或乳酸)。在一些实施例中，该宿主细胞可以在合适的水平下表达Zwf基因(进而产生Zwf酶)，此水平下，可以提高宿主细胞中还原当量(例如NADPH)的浓度。该宿主细胞可包括A.succinogens重组菌株，该A.succinogens重组菌株在合适的水平下表达Zwf基因(进而产生Zwf酶)，此水平下，可以提高菌株中还原当量(例如NADPH)的浓度。相对于不包括该重组DNA分子的菌株，这样的菌株可以用于在发酵系统中产生提高水平的琥珀酸。
在一些实施例中，该宿主细胞能产生琥珀酸，其浓度至少约20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L，140g/L，和/或160g/L(例如，在发酵系统中)。在一些实施例中，该宿主细胞能产生琥珀酸，其浓度约50g/L到130g/L。优选的方案是，该宿主细胞除了产生高浓度的琥珀酸以外，不产生选定的有机酸。在该宿主细胞产生除了琥珀酸以外的有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酮酸及其混合)时，优选的方案是，除了琥珀酸以外的有机酸的浓度不超过约30g/L，优选不超过约20g/L，更优选不超过约10g/L，甚至更优选不超过约5g/L。
前述所提到的重组微生物可以用于包括发酵营养基产生一种或多种有机酸的方法中。一些实施例中，该方法包括用表达Zwf基因(例如E.coliZwf基因)的重组微生物发酵营养基。该方法产生的有机酸可以包括琥珀酸和乳酸。进一步的实施例中，该方法适合于产生浓度为至少约20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L，和/或160g/L的琥珀酸。
特别是，该方法可包括用在适合于提高有机酸(例如琥珀酸)的产量的水平下，表达Zwf基因(进而是Zwf酶)的重组A.succinogens菌株发酵营养基。Zwf基因可以包括异源Zwf基因。表达异源Zwf基因(例如E.coliZwf基因)的A.succinogens重组菌株保藏于ATCC登录号PTA-6255。在一些实施例中，该重组微生物是在适合于提高有机酸(例如琥珀酸)的产量的水平下表达Zwf基因(可以是异源的)的Bisgaard Taxon6或Bisgaard Taxon10等微生物重组菌株。合适的重组微生物还还包括在适合于提高有机酸(例如琥珀酸)的产量的水平下表达Zwf基因(可以是异源的)的E.coli菌株。
在所述的方法中，优选的是，用产生相对高水平选定的例如琥珀酸和/或乳酸等的有机酸的重组微生物发酵营养基。这样，选定的重组微生物可以抗高水平的有机酸，例如琥珀酸和/或乳酸。该重组微生物也可以被选择，以产生相对低水平的不需要的副产物。例如，重组微生物可以产生相对少量的乙酸、甲酸、丙酮酸及其混合(例如至多约2.0g/L，至多约2.0g/L甲酸和/或至多约3.0g/L丙酮酸)。上面描述的重组微生物对浓度约1g/L，2g/L，4g/L，和/或8g/L的氟乙酸钠有抗性，这样的重组微生物适合于该方法。
在所述的方法中，营养基典型地包括可发酵的碳源。可发酵的碳源可以通过可发酵生物材料提供。在一些实施例中，可发酵碳源源于饲料，包括糖作物，淀粉作物，和/或纤维素作物残渣。一般来讲，可发酵碳源也可以包括糖，如葡萄糖。可发酵碳源也可包括糖醇。在合适的实施例中，该方法产生的琥珀酸的产率(g)相对于葡萄糖(g)而言，至少约100％。
附图说明
图1：采用葡萄糖批式发酵，A.succinogens突变体FZ45的代谢流分析。
图2：采用葡萄糖批式发酵，重组A.succinogens FZ45/pJR762.73的代谢流分析。
图3：转化菌株细胞抽提物Zwf酶活性。抽提物是通过以下描述制备，并用于Zwf酶活性试验。所有携带pJR762.73的菌株显示出Zwf酶活性以对数比例大幅增加。
详细描述较佳实施例
本发明揭示了一种表达具有一种或多种生物化学酶活性的多肽的重组微生物，该酶用于戊糖磷酸循环。所述的“微生物”包括任何合适的单细胞有机体，例如细菌、真菌和酵母。所述的“重组微生物”是指用一种方法修饰生成一种非自然存在的微生物的微生物。“重组微生物”可以包括已经被DNA分子(例如重组DNA分子)转化的微生物。
重组微生物可以包括已经被DNA分子转化的微生物，所述的DNA分子可以表达具有一种或多种Zwf酶生物化学活性的多肽。戊糖磷酸循环采用几种酶，包括葡萄糖—6—磷酸—1—脱氢酶，(也称间酶或Zwf酶)；6-磷酸葡糖酸内酯酶；6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，(也称Gnd)；核糖—5—磷酸异构酶A和B；核酮糖磷酸3—差向异构酶；转酮醇酶I和II；转醛基酶A和B。在这些酶中，Zwf和Gnd可以以NADPH的形式产生两个氢当量。
该重组微生物可以表达任何适合的具有一种或多种Zwf酶(例如葡萄糖—6—磷酸—1—脱氢酶活性和NADP还原酶活性)生物化学活性的多肽或其突变体。例如，一种合适的Zwf酶是E.coli Zwf酶或其突变体。在一些实施例中，相对于非重组微生物而言，该重组微生物可以表达提高水平的Zwf酶(即“过表达”酶)。
该重组微生物可以表达突变多肽，该突变多肽至少约90％的氨基酸序列与Zwf酶相同，更优选至少约95％的氨基酸序列与Zwf酶相同。在一些实施例中，重组微生物可以表达Zwf酶突变体，该Zwf酶突变体至少约96％，97％，98％或99％的氨基酸序列与Zwf酶相同。优选地，该突变体多肽具有一种或多种Zwf酶生化活性。这种突变体多肽可以包括Zwf酶的片段。合适的Zwf酶包括A.succinogens Zwf酶，E.coli Zwf酶及其突变体。
该重组微生物可以表达编码具有一种或多种Zwf酶生化活性的多肽的多核苷酸，例如，Zwf基因或其突变体。例如，该重组微生物可以表达Zwf基因或其突变体，该突变体的DNA序列至少约90％与Zwf基因序列相同，优选地至少约95％与Zwf基因序列相同。在一些实施例中，该重组微生物可以表达包含至少约96％、97％、98％或99％的序列与Zwf基因相同的DNA序列的Zwf基因突变体。较佳地，该突变体多核苷酸编码具有一种或多种Zwf酶生化活性的多肽。突变体多核苷酸可以包括Zwf基因的片段。在一些实施例中，该重组微生物可以表达A.succinogens Zwf基因，E.coli Zwf基因，或其突变体。
该重组微生物可以源于任何合适的微生物。典型地，微生物可以产生适合商业生产水平的有机酸。这里的“有机酸”包括至少一个羧基基团。例如，“有机酸”包括琥珀酸和乳酸。这里的有机酸可以被有机酸阴离子或其盐交换代替；例如，“琥珀酸”可以指“琥珀酸盐”；“乳酸”可以指“乳酸盐”；“乙酸”可以指“乙酸盐”；“丙酮酸”可以指“丙酮酸盐”。
在此，制备重组微生物的合适微生物可以包括但不限于：包括A.succinogens在内的Ac tinobacillus genus成员；Bisgaard Taxon6；Bisgaard Taxon10；Mannheimia　succiniciproducens；E coli；Anaerobiospirillum succiniciproducens；Ruminobacter amylophilus；Succinivibrio dextrinosolvens；Prevotella ruminicola；Ralstoniaeutropha和棒状菌群(例如Corynebacterium glutamicum，Corynebacteriumammoniagenes，Brevibacterium flavum，Brevibacterium lactofermentum，Brevibacterium divaricatum)；乳酸菌属Lactobacillus genus的成员；酵母(例如Saccharomyces genus成员)；及其任何亚类。制备重组微生物的合适的微生物可以包括产生琥珀酸的微生物。
该重组微生物典型地表达Zwf基因，该Zwf基因可以是异源的。Zwf基因在此重组微生物中的表达可以优化。例如，Zwf基因可以与一启动子可操作地连接，与非重组微生物相比，该启动子可以促进基因的过表达。启动子可以是微生物内生的(即该重组微生物从中衍生出的微生物固有的)，或异源于微生物(即，重组微生物可以从除此微生物以外的来源获得)。启动子可以是内生的Zwf基因或异源于Zwf基因(即，非Zwf基因启动子)。启动子可以便于组成和/或诱导Zwf基因的表达，和/或启动子可以通过合适的方法被修饰后，促进组成和/或诱导Zwf基因的表达。
Zwf基因可以被修饰，以促进相应mRNA的翻译。例如，Zwf基因可以修饰包括不存在内生的或固有的基因内的密码子。这些非内生的密码子可以被选择，以反映其在重组微生物中的使用频率。许多对于一些微生物来说，密码子使用表已开发出并且本领域的技术人员熟知该表。Zwf基因被修饰，以反映其在A.succinogens中的使用频率。如下：
Actinobacillus succinogenes的典型密码子使用频率。
来源：GenBank Release144.0[2004年11月12日]
Triplet[frequency per thousand]
UUU[20.4]    UCU[1.9]       UAU[13.0]        UGU[7.4]
UUC[29.7]    UCC[14.8]      UAC[16.7]        UGC[3.7]
UUA[35.3]    UCA[13.0]      UAA[1.9]         UGA[0.0]
UUG[20.4]    UCG[5.6]       UAG[0.0]         UGG[16.7]
CUU[13.0]       CCU[5.6]        CAU[5.6]       CGU[20.4]
CUC[1.9]        CCC[0.0]        CAC[7.4]       CGC[9.3]
CUA[0.0]        CCA[3.7]        CAA[18.6]      CGA[1.9]
CUG[5.6]        CCG[35.3]       CAG[3.7]       CGG[0.0]
AUU[27.8]       ACU[18.6]       AAU[13.0]      AGU[7.4]
AUC[22.3]       ACC[31.5]       AAC[39.0]      AGC[3.7]
AUA[0.0]        ACA[5.6]        AAA[76.1]      AGA[1.9]
AUG[20.4]       ACG[18.6]       AAG[1.9]       AGG[0.0]
GUU[26.0]       GCU[13.0]       GAU[33.4]      GGU[61.2]
GUC[7.4]        GCC[13.0]       GAC[29.7]      GGC[24.1]
GUA[11.1]       GCA[22.3]       GAA[64.9]      GGA[0.0]
GUG[27.8]       GCG[35.3]       GAG[5.6]       GGG[5.6]
该重组微生物可以包括表达Zwf基因(例如内生Zwf基因和/或异源Zwf基因，如E.coli Zwf基因等)的A.succinogens重组菌株。其他产生重组微生物的合适微生物包括Bisgaard Taxon6(保藏在瑞典G
Figure S05848242720070828D00014081259QIETU
teborg大学的培养物中心(CCUG)，保藏号15568)；Bisgaard Taxon10(保藏在CCUG，保藏号15572)；和任何合适的本领域人员熟知的E coli菌株。该重组微生物可以源于可以产生高水平的一种或多种有机酸如琥珀酸和乳酸的菌株，和/或重组微生物可以被筛选出和/或工程化后，相对于非重组微生物而言，产生高水平或提高产量的一种或多种有机酸如琥珀酸和乳酸。
该重组微生物可以源于对相对高水平的副产物具有抗性的菌株，和/或产生相对低水平的副产物的微生物。这些副产物可以包括甲酸盐(或甲酸)、乙酸盐(或乙酸)和/或丙酮酸盐(或丙酮酸)。筛选产生低水平乙酸盐的菌株的方法是本领域内公知的。见例如U.S.5,521,075和U.S.5,573,931，以上通过引用并入本发明。例如，产生相对低水平乙酸盐的微生物菌株可以通过将微生物培养在毒性乙酸盐衍生物，如浓度约为1.0到8.0g/L的氟乙酸钠条件下筛选。筛选出的菌株在葡萄糖发酵中可以产生相对低水平的乙酸盐(如不大于2.0g/L)、甲酸盐(如不大于2.0g/L)和/或丙酮酸盐(如不大于3.0g/L)。一种合适的产生重组微生物的氟乙酸钠抗性菌株为A.succinogens菌株即FZ45，其是A.succinogens的衍生物，保藏在ATCC，保藏号55618。见U.S.5,573,931，该文献中描述了制备氟乙酸钠抗性微生物菌株的方法。
该重组微生物可以被筛选和/或工程化，以对相对高水平的不需要的副产物具有抗性和/或产生相对低水平的不需要的副产物。例如，转化后，重组微生物菌落可以培养在氟乙酸钠条件下，筛选出对相对高水平乙酸盐具有抗性和/或可以产生相对低水平的乙酸盐的菌株。
编码具有一种或多种Zwf酶生化活性的多肽的DNA序列可以通过本领域内已知方法得到(例如，对带有合适的引物的Zwf基因与进行PCR扩增，克隆为合适的DNA载体)。合适的Zwf基因的多核苷酸序列已公开(见例如GenBank)。例如，A.succinogens的Zwf基因的多核苷酸序列已经被公布(SEQID NO：5&6)。(见美国能源部基因研究所网站)。该E.coli Zwf基因在GenBank中有(例如GenBank中登录号NC_000913(SEQID NO：1)和GenBank中登录号M55005(SEQID NO：2))。Zwf基因及其突变体可以通过对带有合适的引物的微生物基因组DNA进行PCR扩增得到。
DNA载体可以是在重组微生物中表达基因的合适载体。合适的载体包括质粒、人工染色体(例如细菌人工染色体)和/或修饰过的噬菌体(例如噬菌粒)。该载体可以被设计为外遗传元件和/或与微生物基因组重组。
DNA分子典型地包括与编码具有Zwf酶活性多肽的多核苷酸可操作地连接的一个启动子。该启动子可以是产生重组微生物的微生物内生的或固有的，或异源于该微生物(即，除了重组微生物的其他来源)。此外，该启动子也可以是对选定的Zwf基因的固有的启动子或对选定的Zwf基因的固有的启动子以外的启动子(即，非Zwf基因启动子)。当该重组微生物是A.succinoggens菌株的时候，合适的内生或固有启动子为A.succinoggens磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子(SEQID NO：4)，保藏在GenBank，登录号为AY308832，包括核苷酸1—258，或其突变体。该启动子可以是采用现有技术中的克隆方法与Zwf基因可操作地连接。例如，该启动子与Zwf基因可以采用包括配伍限制性酶识别位点的引物，进行PCR扩增。扩增的启动子和基因然后用酶消化，并克隆入合适的包括多个克隆位点的载体中。
此外，DNA分子可以包括可选标记。该可选标记可以对一个或多个抗生素试剂赋予抗性。例如，可选标记可以包括氨苄青霉素抗性基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、磺胺抗性基因或这些标记基因的组合。典型地，该可选标记与利于标记表达的启动子可操作地相连。包括可选标记的质粒和其他克隆载体是现有技术已知的。
DNA分子典型地用于转化宿主细胞。合适的宿主细胞包括用于保存和/或产生DNA分子的任何细胞。
合适的宿主细胞可以包括表达DNA分子上任何基因的细胞。合适的宿主细胞还可以包括可以在发酵过程中产生有机酸的细胞，如浓度适于商业生产的琥珀酸(例如至少约20g/L，优选地至少约为50g/L，更优选地至少约为100g/L)。
产生有机酸的方法典型地包括用表达Zwf基因的重组微生物在培养基上发酵。例如，该方法可以包括表达Zwf基因(例如异源Zwf基因，如E.coliZwf基因)的重组A.succinoggens在培养基上发酵。发酵中产生的有机酸可以包括琥珀酸。该方法中一种合适的重组微生物为表达E.coli Zwf基因的A.succinogens重组菌株，保藏在ATCC，保藏号PTA—6255。该方法还可以包括在培养基上发酵表达Zwf基因(例如异源Zwf基因，如E.coli Zwf基因)的Bisgaard Taxon6或Bisgaard Taxon10重组菌株，产生琥珀酸。该方法还可以包括在培养基上发酵表达Zwf基因(或过表达Zwf基因)的E.coli重组菌株，产生一种或多种如乳酸等的有机酸。
该方法可以使用对产生的相对高水平的有机酸(如琥珀酸)有抗性的重组微生物。该方法还可以使用对相对高水平的不需要的副产物有抗性的微生物菌株，和/或产生相对低水平的不需要的副产物的微生物菌株。
该培养基典型地包括可发酵性碳源。该可发酵性碳源可以通过可发酵生物材料得到。可发酵生物材料可以源于各种作物和/或饲料，包括：糖作物(例如，糖、甜菜、甜高粱、甘蔗、饲料甜菜)；淀粉作物(例如，谷物类如玉米、小麦、高粱、大麦和块茎类如马铃薯和甘薯)；纤维类作物(例如，玉米秆、玉米纤维、小麦秆和草料类如苏丹草和高粱)。此生物材料可以被处理以便于释放可发酵碳源(例如糖)。例如，生物材料可以用如纤维素酶和/或木聚糖酶等酶处理，释放简单的糖。可发酵碳源可以包括简单的糖和糖醇，如葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和其混合。
该方法典型地会产生相对于输入碳源如葡萄糖相对高产率的琥珀酸。例如，该方法可以相对于葡萄糖输入量(g)产生琥珀酸至少约90％。可以代替的是，产率可以用琥珀酸产量(mol)/葡萄糖输入量(mol)计算。因此，该方法可以有琥珀酸产率(mol)相对于葡萄糖输入(mol)至少约140％。优选地，该方法为，琥珀酸(mol)的产率相对于葡萄糖输入量(mol)至少约130％或至少约170％。
该方法也典型地产生相对高浓度的琥珀酸(例如，相对发酵中使用非重组微生物的方法而言)。例如，发酵可以产生浓度至少约50g/L的琥珀酸。优选地是，发酵可以产生浓度至少约90g/L的琥珀酸，或更优选的是，产生浓度至少约130g/L的琥珀酸。在一些实施例中，发酵典型地并不产生大量的不需要的副产物，如乙酸盐、甲酸盐、丙酮酸盐和其混合(例如，不多于2.0g/L的乙酸盐，不多于2.0g/L的甲酸盐，和/或不多于3.0g/L的丙酮酸盐)。
该方法可以用于产生相对高浓度的乳酸(例如，相对于发酵中采用非重组微生物的方法而言)。例如，在发酵过程中采用的该重组微生物产生乳酸的浓度为至少约25g/L。在一些实施例中，发酵产率可以是每克葡萄糖生成约0.5g乳酸。产生乳酸的方法可以包括将表达(或过表达)具有一种或多种Zwf基因的生化活性的多肽的重组E.coli在合适的碳源上发酵。例如，该方法可以包括将表达源于如质粒等的外遗传元件的E.coliZwf基因的重组E.coli在合适的碳源上发酵，
具体实施方式
一实施例中，该重组微生物是一种表达异源Zwf基因的Actinobacillus.succinogens的重组菌株。该异源Zwf基因在Actinobacillus.succinogens中可以优化表达。异源Zwf基因可以编码E.coli Zwf酶，该重组菌株可以包括保藏在ATCC，保藏号PTA—6255的重组Actinobacillus.succinogens。该重组菌株可以产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸(例如，在利用合适碳源的发酵系统中)。该重组菌株可以抗至少约1g/L的氟乙酸钠。
一些实施例中，重组菌株是一种表达异源Zwf基因的属于Bi sgaardTaxon6或Bi sgaard Taxon10的重组菌株。异源Zwf基因可以编码E.coli Zwf酶。
另一实施例中，重组菌株是包含包括Ac tinobacillus.succinogens的转录启动子与异源Zwf基因可操作性相连的DNA分子的Actinobacillus.succinogens重组菌株，该转录启动子可以包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子或其突变体(例如SEQ ID NO：4的多核苷酸或与SEQ ID NO：4至少约95％序列相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子活性)。异源Zwf基因可以编码E.coliZwischenferment酶或其突变体(例如SEQ ID NO：1的多核苷酸或与SEQ IDNO：1至少约95％序列相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有E.coliZwischenferment酶活性)。异源Zwf基因可以包括E.coli Zwf基因。可选择的是，该Zwf基因可在Actinobacillus.succinogens中的表达可以优化。DNA分子可以是外遗传的(例如存在于质粒上)。该DNA分子可以包括可选标记(例如，卡那霉素抗性，氨苄青霉素抗性，链霉素抗性，磺胺抗性，四环素抗性，氯霉素抗性或其混合)。
另一实施例中，重组微生物是一种包括异源Zwf酶的Actinobacillus.succinogens的重组菌株。该异源Zwf酶可以由Actinobacillus.succinogens已被优化表达的Zwf基因表达而来。该异源Zwf酶可以包括E.coli Zwischenferment酶。该重组菌株可以包括保藏在ATCC，保藏号PTA—6255的重组A.succinogens。
该重组菌株可以产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸。可选择的是，该重组菌株可以抗至少约1g/L的氟乙酸钠。
一实施例中，产生琥珀酸的方法包括用表达异源Zwf基因的重组微生物在培养基上发酵。该重组微生物可以包括Actinobacillus.succinogens重组菌株(例如，保藏在ATCC，保藏号PTA—6255的A.succinogens重组菌株)。该重组微生物可以包括Bisgaard Taxon6重组菌株或Bisgaard Taxon10重组菌株。该异源Zwf基因可以包括E.coll Zwf基因。可以选择的是，该重组菌株能抗至少约1g/L的氟乙酸钠。可以选择的是，该重组菌株可以产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸。该培养基可以包括可发酵糖(例如葡萄糖)。典型的是，该方法的琥珀酸产率(g)相对于葡萄糖的量(g)至少约为100％。
一实施例中，该重组DNA分子包括与异源Zwf基因可操作性连接的A.succinogens转录启动子。例如，该转录启动子可以包括A.succinogens磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子或其突变体(如SEQ ID NO：4的多核苷酸或与SEQ ID NO：4至少约95％序列相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有Actinobacillus.succinogens磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子活性)。
一实施例中，该重组DNA分子存在于DNA质粒中。典型地，该DNA质粒包括一个可选标记(例如，氨苄青霉素抗性，卡那霉素抗性，链霉素抗性，四环素抗性，氯霉素抗性，磺胺抗性和其混合的基因)。存在于质粒中的DNA分子可以存在于宿主细胞中，该宿主细胞可以在发酵系统中产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸。
一实施例中，重组微生物是已经被表达具有Zwf酶活性的多肽的DNA分子转化的、可以产生琥珀酸的微生物的重组菌株。该DNA分子可以包括编码具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸，所述的Zwf酶活性包括NADP还原酶活性。该DNA分子可以包括编码具有至少约90％的氨基酸序列(或优选地至少95％序列相同)与Zwf酶(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6)相同的多肽的多核苷酸，该多肽具有Zwf酶活性(如NADP还原酶活性)。该DNA分子可以包括至少约90％序列(或优选地至少约95％的序列)与Zwf基因的多核苷酸(例如SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；或SEQ ID NO：5)相同的多核苷酸，其中该多核苷酸编码具有Zwf酶活性的多肽。一实施例中，该重组微生物可以源于至少约90％的16S rRNA与Actinobacillus.succinogens的16SrRNA序列相同的微生物。例如，该重组微生物可以源于Actinobacillus.succinogens、Bisgaard Taxon6或Bisgaard Taxon10。
另一实施例中，该重组微生物为已被异源Zwf基因转化的产琥珀酸的微生物重组菌株。该异源Zwf基因在微生物中的表达可以被优化。一些实施例中，该异源Zwf基因可以编码E.coli Zwf酶。一些实施例中，Zwf基因可以包括至少约95％序列与SEQ ID NO：1相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有Zwf酶活性。
另一实施例中，该重组微生物为已被DNA分子转化的产琥珀酸的微生物重组菌株，该DNA分子包括酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶转录启动子，该转录启动子与编码具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸可操作地相连。该转录启动子可以包括Actinobacillus.succinogens的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子。在一些实施例中，该启动子可以包括至少约95％序列与SEQ IDNO：4相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有启动子活性。
另一实施例中，该重组微生物是被外遗传DNA分子转化的重组菌株，该DNA分子可以存在于质粒中。
另一实施例中，该重组微生物为可以产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸的重组菌株。
该重组菌株对至少约1g/L的氟乙酸钠有抗性。在一些实施例中，该重组菌株是重组Actinobacillus.succinogens，保藏在ATCC，保藏号PTA—6255。
另一实施例中，该重组微生物被用于产生琥珀酸的方法中，该方法包括将重组微生物在培养基中发酵。培养基典型地包括可发酵的糖，如葡萄糖。该方法相对于葡萄糖(g)，可以产生琥珀酸的产率(g)至少约100％。
一些实施例中，DNA分子包括产生琥珀酸的微生物的转录启动子与异源Zwf基因可操作地相连。该转录启动子可以包括酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子。在一些实施例中，该启动子包括至少约95％序列与SEQ ID NO：4相同的多核苷酸，其中该多核苷酸具有启动子活性。该DNA分子可以存在于质粒中。该DNA分子可以存在于宿主细胞中(例如，该宿主细胞可以产生浓度约为50g/L到130g/L的琥珀酸)。
具体实施例
微生物菌株和质粒
A.succinogens菌株FZ45是一种稳定的Actinobacillus.succinogens130Z的细菌突变体，其对氟乙酸钠有抗性。见Guettler et al.，INT’L SYST.BACT.(1999)49：207-216；和美国专利5,573,931。E.coli-A.succinogens穿梭载体pLS88(保藏在美国典型微生物菌种保藏中心ATCC，保藏号no.86980)，可以从加拿大Manitoba大学Dr.Leslie Slaney处获得。质粒pLS88已经从Haemophilus ducreyi中分离出来，并具有磺胺抗性、链霉素抗性和卡那霉素抗性。
遗传操作
重组DNA操作一般可参照现有技术的方法。采用碱性裂解法抽提质粒DNA。用标准50ul溶剂重悬1.5ml细菌培养物所得的高拷贝质粒。较大量的质粒提取采用Qiagen中量或大量质粒纯化试剂盒，方法按照生产厂家的说明书操作。限制性内切酶分子量标准物，和预染标记从New EnglandBiolabs和Invitrogen公司购买，除了用约5倍过量的酶进行消化外，其余按照生产厂家的说明书操作。DNA在含有溴乙非啶的Tris-醋酸琼脂糖胶分离后，采用Qiagen公司的胶回收试剂盒，按照说明书提供的方法，回收琼脂糖中的DNA。采用罗氏公司的虾碱性磷酸酶和消化产物合并后去磷酸化。磷酸酶在70摄氏度灭活15分钟。连接反应采用20ul反应体积，3到5倍摩尔过量的插入片断与载体DNA混合，加入lulT4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)，25摄氏度反应1小时。E.coli转化采用Invitrogen公司的“建库用高效感受态细胞”，步骤按照厂商说明进行。
连接混合物转化菌株不经稀释涂布在含有适当的抗生素的标准LB平板。按照Perkin Elmer手册进行PCR扩增。PCR引物按照发表的序列设计(如国家生物技术信息中心(NCBI)数据库所提供的)。引物中包含了工程性限制性酶切位点。引物还经过Vector NTI程序进行二聚体和发夹结构的检测。所有的引物都从密西根州Macromolecular structure Facility订购。PCR扩增是在Eppendorf梯度Master PCR仪上进行的，或者在Perkin ElmerPCR进行。起始的退火温度根据Vecter NTI程序对每对引物检测。用于消化扩增产物的限制性内切酶购于Invitrogen或New England Biolabs。
质粒pJR762.55
从A.succinogensFZ45基因组DNA扩增出A.succinogens的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子序列(Ppepck，SEQ ID NO：4，GenBank登记号AY308832，包括核苷酸1—258)采用以下引物扩增：正向引物，5’-AAAGAATTCTTAATTTCTTTAATCGGGAC(SEQ ID NO：7)；和反向引物5’-GCGTCGACATACTTCACCTCATTGAT(SEQ ID NO：8)；包括EcoRI和SalI限制序列(下划线核苷酸)，便于克隆，结果当EcoRI/SalI片段插入PLS88时，0.27-kb Ppepck片段也被插入到PLS88，由此产生质粒pJR762.55。
质粒pJR762.73
从菌株BL21(DE3)基因组DNA(ATCC保藏号NC_000913)扩增出E.coliZwf基因，采用以下引物：正向引物，
5’-CCGCTCGAGGGCGGTAACGCAAACAGC(SEQ ID NO：9)；反向引物5’-CCGCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGG SEQ ID NO：10)。XhoI限制序列(下划线核苷酸)被包括进去，以便于克隆，并确保1.5kbZwf片段插入pJR762.55的Sall位点，产生质粒pJR762.73。
A.succinogens的转化
Succinogenes的电转感受态细胞是用大豆肉汤培养基(TSB)中生长到OD600约为0.6的细胞制备的。细胞离心下来后，用无菌水洗两次，10％甘油洗两次，然后用含有10％甘油的0.01×的原始培养体积重悬。细胞急速冷冻后保存在-80摄氏度。约40微升的细胞解冻后用于电转化，电转化在BioRad GenePulser仪器上进行，参数设置如下：400w，25mF，1.8kV，使用0.1cm反应器。电转化后，1ml室温的TSB培养基立即加入，在37摄氏度下培养l小时，然后涂布在含有卡那霉素(100ug/ml)的TSB琼脂平板上。
A.succinogens的光学密度测定
样品经镁中和发酵后于420×g离心2分钟使MgCO3沉淀，然后用0.5N的HCl稀释以溶解其它残留的沉淀，后于OD660测值。
A.succinogens的批式发酵
A.succinogens发酵是在包含以下培养基(除非特别指出)的51个发酵罐中进行，80g/L葡萄糖，85g/L液体饲料浆(liquid feed syrup)(LFS)，0.2mg/L生物素，5mM磷酸，3g/L酵母提取物，Sensient AG900。用Mg(OH)2调节PH保持在7.0。搅拌速度设置在250rpm，温度38℃，二氧化碳以0.025v.v.m.的速度喷入。发酵罐中接种量为1.25％，种子在含有上述培养基的血清瓶中培养。A.succinogens重组菌株的发酵基含有100μg/ml卡那霉素。
LFS清洗
要求通过光学密度测量生长的发酵来讲，采用LFS的冷水抽提的方法。在Sorvall GSA离心机中在转速9,000rpm下离心20分钟，去除LFS中悬浮固体和一些油类。上清液可以放在分离漏斗中，室温条件下放置3h。下层水相代表57％(w/v)粗LFS。
生物化学试验验证Zwf的表达
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测按照Choi等2003年发表的文献描述的方法进行(见Choi，Jae-Chulk，Shin，Hyun-Dong，Lee，Yong-Hyun(2003)Enzyme and Microbial Technology32，p178-185；“Modulation of3-hydroxyvalerate molar fraction onpoly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate)using Ralstonia eutrophatransformant co-amplifying phbC and NADPH generation-related Zwfgenes”)。D-6-磷-葡萄糖-δ-内酯的合成速度通过检测NADPH的增长得知，而NADPH则通过检测在340nm的吸收值获得。反应体系为1ml，含有50ul[1M]的Tris-HCl，pH7.5,200ul[50mM]的MgCl2，100ul[10mM]的NADP，100ul[10mM]葡萄糖-6-磷酸，450ul H2O，和100ul细胞提取物。按照以下公式计算特异酶活：特异酶活＝dA/dt/0.623×(蛋白浓度)，或umol/min mg-1。在所有含有A.succinogenes PEPCK启动子表达E.coli Zwf基因的pJR762.73质粒的重组菌株中都检测到Zwf活力的增加。在转化质粒pJR762.73的Actinobacillus菌株(FZ45)，Bisgaard Taxon6(BT6)和Bisgaard Taxon10(BT10)菌株中活力都有提高。这些结果如图3所示。
E.coli的发酵
E.coli菌株DH5α/pJR762.73(Zwf)、DH5α/pJR762.17(Zwf)和DH5α/pLS88在NBS5-liter Bioflo III发酵罐中培养，用4升含有以下成分的培养基培养：900AG酵母提取物15克，玉米浆15克，Na2HPO41.16克；NaH2PO4·H2O，0.84克；(NH4)2SO4，3克；MgSO4·7H2O，0.61克；CaCl2·2H2O，0.25克；葡萄糖，45克每升。通过自动添加K2CO3(3.3N)使pH值稳定在6.7。发酵通过加入1.25％的种子开始。开始时，在适合E.coli快速生长的有氧环境中培养，500rpm的转速搅拌，对培养基以0.5升/升.分的频率喷射空气。当细胞密度达到6.20D660的最小值时，在缺氧的环境中培养，该环境有利于有机酸的产生；然后以0.2升/升-分钟的频率喷射CO2和H2的混合物(95：5)，搅拌速度降至250rpm。定时取样，通过HPLC检测有机酸和残余葡萄糖的浓度。
发酵肉汤分析
琥珀酸，葡萄糖，乳酸，丙酮酸盐，乙醇和甲酸浓度通过反向高压液相色谱(HPLC)测定，具体包括Waters1515等度泵，Waters717自动进样器和一个Waters2414示差折光检测器，温度35℃。该HPLC系统采用WatersBreeze软件(3.3版本)进行控制、数据采集和处理。采用Bio-Rad AminexHPX-87H(300mm×7.8mm)柱，阳离子H保护柱，55℃进行。移动相为0.021N硫酸，速度为0.5ml/min。样品通过0.45μm过滤器过滤，向柱中注入5.0μl，运行时间为三十分钟。
CO 2 测定
质量流量控制器(Brooks model 5850I)用于向发酵罐喷入系统监控和提供CO2，速度为100ml/min。质量流量计(Brooks model 5850I)通过排气冷凝器系统测定发酵罐中存在的CO2。两个CO2流量计通过4—20maBio-Command Interface与计算机相连，该BioCommand plus生物处理软件每60秒处理一次入口和出口处的CO2。CO2消耗速率(ml/min)在任何特定时间，就是入口和出口处速率之差(CO2使用＝CO2入口—CO2出口)。在任何特定发酵间隔期间CO2的消耗体积等于该间隔内每分钟的总速率。CO2消耗的摩尔数通过理想气体法则计算(消耗升除以22.4升/mol＝消耗摩尔数)。
质量流量计通过CO2生产者校准和精确度为l％或2ml/m。发酵设备通过气体泄漏监控，该泄漏的气体是在CO2混入5％氢。氢泄漏是采用Tif8800CO/可燃气体分析仪。
A.succinogens发酵的代谢流量分析
Actinobacillus.succinogens厌氧琥珀酸生产的代谢流量分布(MFA)采用流量分析仪软件包进行分析。流量分析仪软件包是从SteffenKlamt教授(Max Planck Institute，Magdeburg，Germany)处获得。并根据手册中提供的说明书操作。流量分析仪软件包通过提供MATLAB编程软件的图形用户界面分析代谢流量，执行真实的数学运算。MATLAB软件从MathWork公司购买。通过测量整个代谢通路中已知的组分和期望组分的细胞外浓度的变化，采用下面描述的代谢网络模型，计算主要细胞内代谢的细胞内流量。对20个已知的代谢、27个下面显示的反应(没有考虑生物材料成分和生长率)建立了专门的网络(标记的A.succinogens)。
A.succinogens的代谢网络模型
葡萄糖(内)→葡萄糖                    (R1)
葡萄糖→葡萄糖-6P                     (R2)
葡萄糖-6P+2NAD→2PEP+2NADH            (R3)
PEP→丙酮酸盐                         (R4)
PEP+CO2→OAA                      (R5)
丙酮酸盐(内)→丙酮酸盐                (R6)
丙酮酸盐+NAD→乙酰-coA+NADH+CO2
                                      (R7)
丙酮酸盐+NADH+CO2→苹果酸         (R8)
乙酰-coA→乙酸盐                      (R9)
乙酸盐→乙酸盐(外)                    (R10)
乙酸盐+OAA→柠檬酸盐                  (R11)
柠檬酸盐+NAD→CO2+NADH+α-KG       (R12)
OAA+NADH→苹果酸+NAD                   (R13)
苹果酸→延胡索酸盐                     (R14)
延胡索酸盐+NADH→琥珀酸+NAD               (R15)
琥珀酸→琥珀酸(外)                        (R16)
CO2(内)→CO2                     (R17)
甘油(内)→甘油                            (R18)
甘油+2NAD→PEP+2NADH                      (R19)
山梨醇(内)→山梨醇                        (R20)
山梨醇+NAD→葡萄糖-6P+NADH                (R21)
木糖(内)→木糖                            (R22)
木糖→R5P                                 (R23)
R5P+5/3NAD→5/3PEP+5/3NADH                (R24)
葡萄糖-6P+2NADP→R5P+CO2+2NADPH
                                          (R25)
乙酰-coA+2NADH→乙醇+2NAD                 (R26)
乙醇(内)→乙醇                            (R27)
采用以前描述的分析方法对发酵样品的发酵过程进行分析。葡萄糖、甘油、阿拉伯糖、木糖、山梨醇、琥珀酸、乙酸、乙醇、丙酮酸盐、乳酸和发酵体积在每一个采样时间测定。代谢量根据公式计算：(代谢物，g＝V(发酵罐，1)*C(代谢物，g/1)。t0-t1时间内，在时间段t0-t1期间代谢物消耗率或代谢物生产率采用下面的公式计算：代谢物消耗率(mol/h，t0和t1)＝[量(代谢物，g，t0)—量(代谢物，g，t1)]/[(t1-t0)*代谢物分子量]。所有时间段的代谢流量比较，在流量图上代谢物的消耗率或生产率被校正，假设葡萄糖的消耗率在流量图上为100。在图上代谢物消耗率或生产率在图上“Mcp”通过以下公式计算：Mcp＝(代谢消耗率/或代谢生产率)×100/(葡萄糖消耗率)。
各种代谢物的消耗率或生产率根据操作说明，输入到流量分析软件包的代谢网络模型中。函数“计算/平衡率”用于计算所有可计算的率。如果系统是非冗余的，可以从优化的程序开始，线性目标函数最小。如果系统是冗余的，三种方法中(简单的最小二乘法、方差加权最小二乘法I和方差加权最小二乘法II)中一个或多个可以用于率的计算。流量率直接显示在流量图中。最后流量图被拷贝在Microsoft Excel文档保存。
A.succinoggensFZ45生物化学途径的代谢流量分析
代谢流量分析用于评估不同碳源在A.succinogens FZ45批式发酵中生产琥珀酸中的效果。对A.succinogens FZ45中生产琥珀酸的主要途径分析通过以下方式：酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)→草酰乙酸盐(OAA)→苹果酸盐→延胡索酸盐→琥珀酸。乙醛酸支路和PEP运输系统(PTS)并没有大量的用于有机体中。葡萄糖发酵到浓度为61.7g/L，琥珀酸产率约94％，(琥珀酸(g)/葡萄糖(g))。发酵采用还原性更强的碳源，如山梨醇，产生更多的琥珀酸(77.3g/L)，并具有更高的产率(108％琥珀酸(g)/葡萄糖(g))，表明还原性能可能成为葡萄糖发酵的限速因子。
通过过表达Zwf提高由葡萄糖产生琥珀酸的产量
菌株FZ45、FZ45/pLS88和FZ45/pJR762.73培养在标准生产条件下，除了在转化菌株的发酵培养基中添加100μg/ml的卡那霉素以外。FZ45/pLS88作为第二对照物，用不带PEP羧激酶启动子或Zwf基因的克隆载体转化。碳源为葡萄糖。菌株FZ45/pJR762.73显示出较对照菌株FZ45和FZ45/pLS88增加的琥珀酸产量，琥珀酸最终浓度有相应的增加。由葡萄糖生产琥珀酸的总量从284g增加到302g，琥珀酸的摩尔产率从144％增加到155％(摩尔琥珀酸/100摩尔葡萄糖)，重量产率从94.7％增加到101.9％，在发酵肉汤中琥珀酸最终浓度从62g/L提高到65g/L。这些结果在表1.中有所总结。所有转化的FZ45衍生物相对于未转化的FZ45显示出较慢的生长，这可能是染色体外质粒DNA复制所引起。
表1FZ45、FZ45/pLS88和FZ45/pJR762.73菌株从葡萄糖生产琥珀酸的产量
 
菌株 摩尔产率(％) 重量产率(％) g/L 琥珀酸总量(g)
FZ45 144 94.7 61.7 284
FZ45/pLS88 149 98.0 60.4 272
FZ45/pJR762.73 155 101.9 65.4 302
此外，菌株FZ45/pJR762.73也产生较少的2种代谢物，乙酸和丙酮酸，如表2所示。
表2用FZ45和FZ45/pJR762.73菌株生成其它的代谢物
 
菌株 琥珀酸[g/L] 丙酮酸[g/L] 乙酸[g/L]
FZ45 61.7 3.7 1.5
FZ45/pLS88 60.4 2.1 1.4
FZ45/pJR762.73 65.4 2.7 1.4
FZ45和FZ45/pJR762.73的代谢流量分析显示，相对于未转化的FZ45，FZ45/pJR762.73有更多的碳源加入戊糖磷酸途径(见Figure1和Figure2)。因此，在葡萄糖作为碳源时候，Zwf蛋白的过表达足以提高琥珀酸的产率，并减少其他代谢物的产生。
采用还原型碳源发酵A.succinogens FZ45/pJR762.73
采用甘露醇作为碳源，对A.succinogens FZ45/pJR762.73进行发酵。甘露醇是6—碳糖醇，较葡萄糖具有更强的还原性。采用甘露醇的时候，Zwf的表达也可以提高琥珀酸的产量(见Table3)。然而，采用该糖醇发酵，即使用未转化的FZ45菌株也显示出提高的产量。可见增加代谢还原当量的量可提高琥珀酸的产量。
表3用甘露醇作碳源生产琥珀酸
 
菌株 碳源 摩尔产率(％) 重量产率(％) g/L 琥珀酸总量(g)
FZ45 葡萄糖 144 94.7 61.7 284
FZ45 甘露醇 179 116.0 85 406
FZ45/pJR762.73 甘露醇 193 125.4 88 421
Zwf在重组Bisgaard Taxon6和Bisgaard Taxon10菌株中表达的效果
Zwf在其他物种中的表达效果通过Bisgaard Taxon6(BT6)和Bisgaard Taxon10(BT10)有机体验证。这两种有机体都属于巴斯德菌科，与A.succinogens菌株相近似。而且，这两种有机体都是已知产生琥珀酸的菌株。采用上面描述的方法和相同的质粒pJR762.73(携带A.succinogensPEPCK启动子控制下的Zwf基因)，Bisgaard Taxa被转化。使用葡萄糖作为碳源，这些转化菌株都显示出提高产量的琥珀酸。这些结果显示在Table4中。
表4BT6/pJR762.73和BT10/pJR762.73菌株从葡萄糖生产琥珀酸的产量
 
菌株 摩尔产率(％) 重量产率(％) g/L 琥珀酸总量(g)
BT6/pLS88 92 60.3 40 174
BT6/pJR762.73 96 62.8 39 180
BT10/pLS88 132 86.5 56 255
BT10/pJR762.73 136 89.0 57 258
Bisgaard Taxa菌株参与的这些发酵的流量分析显示，在携带质粒的菌株中，戊糖磷酸途径的适用确实提高了。BT6/pJR762.73通过戊糖磷酸途径较对照组利用了更多的碳源(33mol％vs.20mol％)。与此相类似，BT10/pJR762.73通过戊糖磷酸途径利用了35mol％的碳源，而对照组仅利用5mol％。
很明显，对于本领域的技术人员，可以对此发明进行修改和替代，只要不背离本发明的范围和主旨。本文件中阐述的发明可以在缺少一种或几种因素的条件下完成，这里并没有特别的限制。本发明作用的术语和表达方式只是用于描述，而不是限制性的。除了已知的、被描述的特征的任何等同，使用这些术语和表达的并没有特别的意图，但是，可以看出，各种修改都可能在本发明的范围内。因此，应该理解为尽管该发明采用具体的实施例、选择的一些特征来描述，各种概念的修改和/或改变可以归为该领域内的常识，这样的修改和变化应落入本发明的范围内。
此外，在本发明的特征和方面可以用马库什组(Markush group)或其他可代替物描述的地方，本发明也可以以马库什组或其他组的成员或亚组来描述。
除非指明是相反的，采用任何两种不同数值描述实施例和附加实施例中的各种数值为范围的端点值，这样的范围也属于本发明的范围。
说明书中所有的参考，专利和/或引用作为参考整体并入本发明，包括任何表格，图表。
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Claims (13)

1.一种包含与Actinobacillus.succinogens的16S rRNA至少90％的序列相同的16S rRNA序列的重组微生物，其特征在于，所述微生物被至少一个编码一个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸序列转化，所述多核苷酸序列与一个启动子序列可操作连接，其中，与不被至少一个多核苷酸序列转化的本源细菌相比，所述微生物产生提高水平的琥珀酸。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物选自Actinobacillus.succinogens，Bisgaard Taxon6和BisgaardTaxon10。
3.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述多核苷酸编码一个E.coli葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
4.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多核苷酸至少95％的序列与SEQ ID NO：1相同。
5.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶至少95％的氨基酸序列与SEQ ID NO：3相同。
6.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述启动子序列是一种与编码一个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的所述多核苷酸可操作连接的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子。
7.如权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述启动子包括一个Actinobacillus.succinogens酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶启动子。
8.如权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述启动子具有至少95％的序列与SEQ ID NO：4相同。
9.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，该多核苷酸序列与可操作连接的启动子序列是外遗传的。
10.如权利要求9所述的重组微生物，其特征在于，该多核苷酸序列与可操作连接的启动子序列存在于质粒中。
11.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，该重组微生物可以产生浓度为50g/L到130g/L的琥珀酸。
12.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，该重组微生物对至少1g/L的氟乙酸钠具有抗性。
13.一种产琥珀酸的方法，该方法包括在足够产琥珀酸的条件下培养权利要求1-12中任一项所述的重组微生物。
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