MX2007007834A - Microorganismos recombinantes para la produccion incrementada de acidos organicos. - Google Patents

Abstract

Se divulgan microorganismo recombinantes para producir acidos organicos. Los microorganismos recombinantes expresan un polipeptido que tiene la actividad enzimatica de una enzima que se utiliza en el ciclo de fosfato de pentosa. El microorganismo recombinante puede incluir Actinobacillus succinogenes recombinante que se ha transformado para expresar un gen Zwischenferment (Zwf). Los microorganismos recombinantes pueden ser utiles en procesos de fermentacion para producir acidos organicos tales como acido succinico y acido lactico. Tambien se divulgan plasmidos novedosos que son utiles para transformar microorganismos para producir microorganismos recombinantes que expresan enzimas tal como Zwf.

Description

MICROORGANISMOS RECOMBINANTES PARA LA PRODUCCIÓN INCREMENTADA DE ÁCIDOS ORGÁNICOS ANTECEDENTES Muchas sustancias químicas que son actualmente derivadas de materiales petroquímicos podrían ser producidas a partir de carbohidratos que ocurren naturalmente. En particular, el ácido succínico, un ácido dicarboxílico de cuatro carbonos, tiene el potencial para llegar a ser una sustancia química de mercancía de alto volumen que podría ser utilizada como material de partida para procesos comerciales que producen muchas sustancias químicas intermediarias y de especialidad importantes para las industrias de productos de consumo y que actualmente dependen de materiales de partida derivados de materiales petroquímicos no renovables. Por ejemplo, como una sustancia química de mercancía, el ácido succínico podría reemplazar los materiales de partida petroquímicos en la producción de los compuestos 1, 4-butanodiol (BDO) y tetrahidrofurano (THF), que son útiles como solventes y materiales de partida para muchas industrias. Por ejemplo, los compuestos BDO y THF son útiles para producir resinas para carrocerías automotrices, termoplásticos para el uso en electrodomésticos y polímeros elásticos tal como Lycra™ en la industria textil. Además, los compuestos BDO y THF también tienen muchos usos de especialidad en las " industrias agroquímicas y farmacéuticas.

Notablemente, el consumo mundial de BDO se espera que se incremente en una proporción anual tan alta como 4%. Los petroquímicos actualmente utilizados para producir BDO y THF incluyen acetileno, formaldehído, butano, butadieno y óxido de propileno. Todos estos tienen varias propiedades peligrosas, tal como flamabilidad extrema, inestabilidad química y toxicidad. Además, como estos materiales se derivan del petróleo, ellos agotan un recurso no renovable, y en el desecho o la destrucción, finalmente liberan carbonos (como dióxido de carbono) a la atmósfera. Así, el desarrollo de ácido succínico como un reemplazo para materiales petroquímicamente derivados reduciría el manejo y almacenamiento de materiales peligrosos, mejoraría la seguridad industrial y de la comunidad, reduciría la contaminación y los costos ambientales y reduciría la dependencia sobre el petróleo. La producción de ácido succínico y otros compuestos orgánicos mediante la fermentación de azúcares es económicamente factible. Un número de microorganismos se han utilizado para producir ácido succínico utilizando azúcares de maíz como una fuente de carbono. Como tal el desarrollo del ácido succínico como reemplazo para materiales de partida petroquímicos expandiría los mercados para el maíz, y otros productos agrícolas y/o biomasa que pueden proporcionar azúcares fermentables .

Formalmente, la ruta bioquímica para la producción de ácido succínico adiciona una molécula de dióxido de carbono al compuesto fosfoenolpiruvato (PEP), de tres carbonos, para producir el compuesto oxaloacetato (OAA) de cuatro carbonos. Las siguientes etapas en la ruta al ácido succínico son parte del ciclo de ácido tricarboxílico inverso (ciclo TCA) e incluye dos etapas de reducción obligadas. En el proceso bioquímico que conduce de OAA a succinato, OAA debe primero ser reducido para producir L-malato. L-malato luego se deshidrata para producir fumarato y agua. El fumarato luego se reduce para dar el ácido succínico. En las técnicas químicas, la "reducción" se refiere a la adición de hidrógeno molecular a un compuesto. Generalmente, el hidrógeno molecular libre no se encuentra en los sistemas biológicos intracelulares. Más bien, la reducción se realiza a través del uso de coenzimas que funcionan como equivalentes bioquímicos de hidrógeno (es decir, como portadores de hidrógeno moleculares) y son llamados "equivalentes de reducción". Los equivalentes de reducción incluyen las coenzimas nicotinamida adenina dinucleótido hidrógenos ("NADH"), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidrógeno ("NADPH"), flavina adenina dinucleótido hidrógenos ("FADH2") y flavina mononucleótido hidrógeno ("FMNH") . Generalmente, NADH y NADPH se pueden interconvertir en una gama de microorganismos mediante la enzima piridina dinucleótido transhidrogenasa . Los equivalentes de reducción requeridos para transformar OAA a succinato son proporcionados por NAD(P)H2, FADH2, u otros co-factores. Es esencial que una cantidad suficiente de equivalentes de reducción este disponible para la transformación de OAA a succinato. Si suficientes equivalentes de reducción no están disponibles, la ruta bioquímica no funcionará eficientemente, y solamente una porción del OAA será transformada en el succinato deseado. Los equivalentes de reducción se pueden producir en un número de procesos biológicos que son comúnmente encontrados en el metabolismo celular. Por ejemplo, los equivalentes de reducción se pueden generar en el ciclo de fosfato de pentosa (PPC) . En el PPC, glucosa-6-fosfato se convierte D-6-fosfo-glucono-d-lactona mediante la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que también es conocida como enzima Z ischenferment o Zwf . Como parte de esta conversión, NADP se convierte a NADPH como un aceptor de equivalentes de reducción. Se han descrito pocos microorganismos que producen suficientes concentraciones de ácido succínico para la producción comercial. Un microorganismo de tal clase es ñctinoba ci l l us succinogenes, un anaerobio facultativo que se aisló del rumen bovino. Este organismo produce alta-concentración de ácido succínico y tolera la alta concentración de azúcar. Actinoba cil l us succinogenes es uno de los mejores productores conocidos de ácido succínico, pero los rendimientos fermentativos de esta cepa pueden ser limitados por la falta de equivalentes de reducción. Como tal, son deseables mejoras para incrementar el rendimiento del ácido succínico producido por fermentación, incluyendo el uso de cepas mejoradas de microorganismos para producir ácido succínico . BREVE DESCRIPCIÓN Se divulgan microorganismos recombinantes para producir ácidos orgánicos. Los microorganismos recombinantes expresan un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de una enzima utilizada en el ciclo de fosfato de pentosa. En una modalidad, la enzima es glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa, también llamada enzima Zwischenferment o Zwf. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf. En una modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con una molécula de DNA que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf. El microorganismo recombinante típicamente es capaz de producir uno o más ácidos orgánicos en un nivel adecuado para la producción comercial. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es un microorganismo que produce ácido succínico. , Por ejemplo, el microorganismo puede producir ácido succínico en una concentración adecuada para la producción comercial. Una concentración adecuada para la producción comercial puede ser por lo menos de aproximadamente 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L, 120 g/L y/o 140 g/L. Deseablemente, el microorganismo recombinante es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L. El microorganismo recombinante puede ser seleccionado y/o recombinantemente diseñado para tolerar concentraciones relativamente altas de ácido succínico para facilitar la producción de ácido succínico en una concentración adecuada para la producción comercial en un sistema de fermentación. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede ser seleccionado para producir cantidades relativamente bajas de subproductos indeseables tales como acetato, formiato y/o piruvato (por ejemplo, no más de aproximadamente 2.0 g/L de acetato, no más de aproximadamente 2.0 g/L de formiato, y/o no más de aproximadamente 3.0 g/L de piruvato) . El microorganismo recombinante puede ser derivado de una cepa (o una variante de una cepa) que es resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio en concentración de por lo menos aproximadamente 1 g/L, 2 g/L, 4 g/L y/o 8 g/L. En otra modalidad, una variante del microorganismo recombinante puede ser seleccionada para ser resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio en concentración de por lo menos aproximadamente 1 g/L, 2 g/L, 4 g/L y/o 8 g/L. En una modalidad, el microorganismo recombinante se deriva de una cepa de Actinoba ci l l us succinogenes ( es decir "?. succinogenes" ) o un microorganismo relacionado con Actinoba cil l us succinogenes . Una cepa adecuada de A . succinogenes es la Bacteria 130Z depositada con la colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), bajo ATCC Acceso Número 55618. Ver la Patente Norteamericana 5,504,004 para descripción de la Bacteria 130Z y otras cepas adecuadas. Otros microorganismos adecuados pueden ser seleccionados para preparar el microorganismo recombinante y pueden incluir microorganismos que están relacionados a A . succinogenes como es determinado por la identidad de secuencia dentro del rRNA de 16S. Por ejemplo, un microorganismo adecuado relacionado con A . succinogenes puede tener rRNA de 16S que exhibe identidad de secuencia sustancial rRNA de 16S de A . succinogenes (es decir, un microorganismo que tiene rRNA de 16S que exhibe por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a rRNA de 16S de A . succinogenes o más adecuadamente, que exhibe por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a rRNA de 16S de A . succinogenes ) . Muchos microorganismos representativos de la familia Pasteurellaceae tienen rRNA de 16S que exhibe por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a rRNA de 16S de A . succinogenes . Por ejemplo, ver Guettler y colaboradores, INT'L J. SYSTEMATIC BACT . (1999), 49, 207-216 en pagina 209, Tabla 2. Los microorganismos adecuados pueden incluir microorganismos tales como Bisgaard Taxon 6 y Bisgaard Taxon 10. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante se puede preparar a partir de organismos diferentes a A . succinogenes . Por ejemplo, el microorganismo recombinante se puede preparar de cualquier microorganismo que es adecuado para el uso en sistemas de fermentación para producir ácidos orgánicos. Un microorganismo adecuado puede incluir E . col i . Las cepas adecuadas de E . col i son conocidas en la técnica. Variantes de microorganismos que son resistentes a monofluoroacetato de sodio también pueden ser adecuadas para preparar el microorganismo recombinante. Por ejemplo, ver U.S. 5,521,075 y U.S. 5,573,931. En una modalidad, el microorganismo recombinante se prepara de una variante de A . succinogenes que es resistente a por lo menos aproximadamente 1 g/L de monofluoroacetato de sodio. Una variante adecuada es FZ45. Ver U.S. 5,573,931. El microorganismo recombinante depositado bajo ATCC Acceso Número PTA-6255, se deriva de una variante de A . succinogenes que es resistente a por lo menos aproximadamente 1 g/L de monofluoroacetato de sodio (es decir, FZ45). El microorganismo recombinante típicamente se transforma con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tienen una o más actividades bioquímicas de una enzima utilizada en el ciclo de fosfato de pentosa. Por ejemplo, el microorganismo recombinante se puede transformar con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (es decir, actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o actividad de NADP reductasa) . Deseablemente, el polinucleótido codifica un polipéptido que facilita la conversión de NADP a NAD.PH. El polinucleótido o polipéptido puede ser endógeno al microorganismo o derivado de un gen o enzima normalmente presente en el microorganismo. En algunas modalidades, el polinucleótido o polipéptido puede ser homólogo a un gen endógeno o enzima del microorganismo. En otras modalidades, el polinucleótido o polipéptido puede ser el heterólogo (es decir, derivado de un gen o enzima normalmente no presente en el microorganismo o derivado de una fuente diferente del microorganismo) . El microorganismo recombinante puede expresar una variante del polinucleótido que codifica el polipéptido y/o una variante del polipéptido. Una variante del polinucleótido puede incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia al polinucleótido, o deseablemente, por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia al polinucleótido, donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (por ejemplo, actividad NADP reductasa) . Una variante puede incluir un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia al polipéptido, o deseablemente, por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia al polipéptido, donde el polipéptido tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (por ejemplo, actividad de NADP reductasa) . Como tal, los polinucleótidos adecuados pueden incluir polinucleótidos que codifican un polipéptidos que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a una enzima Zwf seleccionada, donde el polipéptido tiene actividad de NADP reductasa. El microorganismo recombinante puede ser transformado con un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf, donde el microorganismo recombinante exhibe más alta actividad de enzima Zwf que un microorganismo que no se ha transformado con un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante exhibe por lo menos aproximadamente cinco veces (5x) más actividad de enzima Zwf, (o deseablemente por lo menos aproximadamente diez veces (lOx) más actividad de enzima Zwf, o más deseablemente por lo menos aproximadamente cincuenta veces (50x) más actividad de enzima Zwf), que un microorganismo que no se ha transformado con un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf. La actividad de enzima Zwf se puede incluir a actividad de NADP reductasa. La actividad de enzima Zwf que puede ser determinada al medir el nivel de NADPH presente en el microorganismo recombinante (por ejemplo, como es comparado con un microorganismo que no se ha transformado con un polinucleótido que expresa a un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf) . El microorganismo recombinante puede expresar un polinucleótido que codifica una enzima Zwf tal como un gen Zwf . Una variante del polinucleótido puede comprender un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a un gen Zwf, o deseablemente, por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a un gen Zwf y que codifica en polipéptido que tiene uno o más de actividades bioquímicas de la enzima Zwf. Una variante de un polinucleótido puede incluir un fragmento de ácido nucleico del polinucleótido. Por ejemplo, un fragmento puede incluir por lo menos aproximadamente 90% de un gen Zwf, o por lo menos aproximadamente 95% de un gen Zwf . Un fragmento de ácido nucleico puede ser de cualquier longitud adecuada. Por ejemplo, el fragmento de ácido nucleico puede comprender por lo menos aproximadamente 10, 50, 100, 250, 500, 1000 y/o 1400 nucleótidos. Un fragmento puede codificar un polipéptido que tiene una o más actividad bioquímica de la enzima Zwf. Los genes Zwf adecuados pueden incluir genes Zwf endógenos o nativos al microorganismo recombinante (es decir, genes Zwf normalmente presentes en el microorganismo del cual se deriva microorganismo recombinante) , o variantes de los mismos. Otros genes Zwf adecuados pueden incluir genes Zwf heterólogos al microorganismo (es decir, genes Zwf normalmente presentes en, u obtenidos de fuentes diferentes al microorganismo utilizado para preparar el microorganismo recombinante), o variantes de los mismos. Los genes Zwf adecuados pueden incluir variantes que tienen por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a la secuencia de polinucleótido del gen Zwf seleccionado (de preferencia por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la secuencia de polinucleótido del gen Zwf seleccionado) y que codifica un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (es decir actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o actividad de NADP reductasa) . Los genes Zwf adecuados pueden incluir el gen Zwf de E . coli o variantes del mismo. La secuencia de polinucleótido del gen Zwf de E. coli está depositada con gen GenBank bajo el acceso número NC_000913, el complemento inverso de nucleótidos 1,932,863 a 1,934,338 (SEQ ID NO: 1) y bajo el acceso número M55005, nucleótidos 708 a 2180 (SEQ ID NO: 2) . Las variantes adecuadas del gen Zwf de E . coli pueden incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia (deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia) al polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 2), tal que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (es decir, actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o actividad NADP reductasa) . Los genes Zwf adecuados pueden incluir el gen Zwf de A . succinogenes o variantes del mismo. La secuencia del genoma delineada para 130Z de A . succinogenes recientemente se ha establecido y ensamblado y está públicamente disponible desde septiembre del 2005, en el sitio de la red del Joint Genome Institute, Department o Energy website. El Zwf es anotado como "glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa" y está presente en 115 contig, nucleótidos 8738-10225 (es decir, SEQ ID NO: 5) . La secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido codificado (es decir, la enzima Zwf de A . succinogenes ) se presenta como SEQ ID NO: 6. La enzima Zwf exhibe 43% de identidad de secuencia de aminoácidos y 60% de homología de aminoácidos a la enzima Zwf de E . coli utilizando la versión del algoritmo de alineación "BLAST" BLASTP 2.2.12, matriz BLOSUM62, disponible en el sitio de la red de National Center for Biotechnology Information. Las variantes adecuadas del gen Zwf de A . succinogenes pueden incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia (deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia) al polinucleótido de la SEQ ID NO: 5, tal que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (es decir, actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o actividad de NADP reductasa) . El microorganismo recombinante puede expresar una enzima Zwf endógena (es decir, una enzima Zwf presente dentro del organismo del cual se deriva microorganismo recombinante), o variantes de la misma. En otra modalidad, el microorganismo recombinante puede expresar una enzima Zwf que es heteróloga al microorganismo (es decir, una enzima Zwf que no está presente o expresada en el microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante), o variantes de la misma. Las enzimas Zwf adecuados pueden incluir variantes que tienen por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de una enzima Zwf es seleccionada (deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos a la enzima Zwf seleccionada) y que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (por ejemplo, actividad de NADP reductasa y/o actividad de glucosa-e-fosfato deshidrogenasa) . Las enzimas Zwf adecuadas puede incluir la enzima Zwf de E . coli (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, polipéptido codificado por el complemento inverso de la secuencia nucleotídica de nucleótidos 1,932,863 a 1,934,338 de NC_000913) o variantes de la misma, y la enzima Zwf de A . succinogenes (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) o variantes de la misma. Un polipéptido variante puede incluir un fragmento de una enzima Zwf. Por ejemplo, un fragmento puede incluir por lo menos aproximadamente 90% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o más deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades, un fragmento puede incluir por lo menos aproximadamente 90% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o más deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En un fragmento de polipéptido puede ser de cualquier longitud adecuada. Por ejemplo, el fragmento de polipéptido puede comprender por lo menos aproximadamente 10, 50, 100, 200, y/o 300 aminoácidos (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 6) . Un fragmento de polipéptido típicamente tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf. El microorganismo recombinante puede incluir un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con un polinucleótido que expresa un gen Zwf endógeno (es decir, nativo) que codifica una enzima Zwf endógena (es decir, nativa). En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede incluir un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con un polinucleótido que expresa un gen Zwf heterólogo que codifica una enzima Zwf heteróloga. El microorganismo recombinante depositado con la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC) , bajo ATCC Acceso Número PTA-6255, es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico (es decir, A . succinogenes ) que expresan Zwf heterólogos (por ejemplo, el gen Zwf de E . coli ) que codifica una enzima Zwf heteróloga. El microorganismo recombinante puede expresar un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf en niveles relativamente altos (es decir, el polipéptido puede ser "sobreexpresado" ) . Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede expresar una enzima Zwf endógena en niveles relativamente altos como es comparado con un microorganismo no recombinante. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede ser transformado con una molécula de DNA (por ejemplo, un plásmido) que expresa una enzima Zwf endógena en niveles relativamente altos comparados con un microorganismo recombinante qué no se ha transformado con la molécula de DNA. Un polinucleótido, tal como un gen Zwf, puede ser optimizado para la expresión en un microorganismo seleccionado del cual se deriva el microorganismo recombinante. Por ejemplo, un gen Zwf heterólogo puede ser optimizado para la expresión en un microorganismo no nativo. En alguna modalidad, un gen Zwf puede ser optimizado para la expresión en A . succinogenes, o en donde un microorganismo tal como Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10. En otras modalidades, un gen Zwf puede ser optimizado para la expresión de E . col i . Un polinucleótido tal como un gen Zwf puede ser optimizado para la expresión en microorganismo recombinante mediante cualquier estrategia adecuada. Por ejemplo, un gen Zwf puede ser optimizado para la expresión en el microorganismo recombinante al enlazar operablemente el gen Zwf a una secuencia de promotor que facilita la expresión del gen Zwf en el microorganismo recombinante. La secuencia del promotor puede ser optimizada para facilitar niveles relativamente altos de expresión en microorganismos recombinantes (es decir, optimizado para facilitar la "sobreexpresión") . El gen Zwf puede ser operablemente enlazado por una secuencia de promotor que es endógena al microorganismo (es decir, un promotor nativo al microorganismo) o heteróloga al microorganismo (es decir, un promotor normalmente no presente en, o derivado de una fuente diferente del microorganismo) . Los promotores adecuados pueden incluir promotores que no son el promotor nativo para el gen Zwf seleccionado (es decir, un promotor de gen no de Zwf , que puede ser endógeno al microorganismo heterólogo al microorganismo) . Los promotores adecuados pueden incluir promotores inducibles o promotores constitutivos. Los promotores adecuados pueden ser derivados de promotores de microorganismos que producen ácido succínico. En otras modalidades, la expresión de un gen Zwf puede ser optimizada en el nivel de traducción. Por ejemplo, un gen Zwf heterólogo puede ser modificado para incluir codones que demuestran la frecuencia de utilización preferida en el microorganismo de la cual se deriva el microorganismo recombmante como un hospedero no natural para el gen. En otra modalidad, la expresión de un polmucleótido tal como en gen Zwf puede ser optimizada al proporcionar un número de copias relativamente altos del polinucleótido en el microorganismo recombinante . Por ejemplo, un gen Zwf puede estar presente sobre un elemento epigenetico que es capaz de replicarse para lograr un número de copias relativamente alto en el microorganismo recombinante (por ejemplo, un plásmido) . En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico, tal como Actinoba ci l l us succinogenes o microorganismos relacionados, que se ha transformado a una molécula de DNA que incluye un promotor operacional enlazado a un gen Zwf . El gen Zwf puede ser derivado de un gen Zwf endógeno o heterólogo y puede incluir, por ejemplo, el gen Zwf de A . succinogenes (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) y el gen de Zwf de E . coli (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 & 2) . Otros genes Zwf son conocidos y sus secuencias de polinucleótido se han publicado (ver, por ejemplo, GenBank) . Las secuencias de promotor endógenas o nativas adecuadas de microorganismos que producen ácido succínico pueden incluir, por ejemplo, la secuencia de promotor de fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa . La secuencia de promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquina sa de A. succinogenes esta depositada con GenBank bajo acceso número AY308832, nucleótidos 1-258 (SEQ ID NO: 4) . Un promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquina sa puede ser un promotor heterólogo adecuado para un gen Zwf (es decir, un promotor de gen no de Zwf) . Como es descrito en la presente, un microorganismo recombinante puede incluir una molécula de DNA recombinante como un elemento epigenético y la molécula de DNA recombinante que se puede incorporar en el genoma del microorganismo (por ejemplo, mediante métodos de recombinación apropiados). En ciertas modalidades, la molécula de DNA en un plásmido, un bacteriófago recombinante, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y/o un cromosoma artificial Pl de E . coli (PAC) . La molécula de DNA puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables adecuados pueden incluir marcadores para la resistencia a kanamicina, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, y combinaciones de estos marcadores seleccionables. En una modalidad, el marcador seleccionable es la resistencia a kanamicina . Como es descrito en la presente, una molécula de DNA recombinante puede incluir un promotor adecuado operacionalmente enlazado a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf para expresar el polinucleótido en un microorganismo recombinante (por ejemplo, A . succinogenes ) . El promotor puede ser adecuado para expresar el polipéptido en un microorganismo que produce ácido succínico. En algunas modalidades, la molécula de DNA recombinante incluye un promotor fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa (por ejemplo, un promotor fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes ) operacionalmente enlazado a un gen Zwf o una variante del mismo, (que puede incluir un gen Zwf heterólogo tal como un gen Zwf de E . coli o un gen Zwf de A . succinogenes) . Por ejemplo, la molécula de DNA puede incluir los nucleótidos 1-258 de la secuencia de DNA depositada bajo GenBank acceso numero AY308832 (SEQ ID NO: 4) o una variante de la misma, operacionalmente enlazada al complemento inverso de nucleótidos 1,932,863 a 1,934,338 de la secuencia DNA depositada bajo GenBank acceso número NC_000913 (SEQ ID NO: 1); u operacionalmente enlazada a la secuencia DNA depositada bajo GenBank acceso número M55005 (SEQ ID NO: 2) u operacionalmente enlazada a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el promotor puede incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia al polinucleótido de la SEQ ID NO: 4 y que tienen actividad de promotor en el microorganismo recombinante . Un microorganismo recombinante que comprende la molécula de DNA recombinante puede ser adecuado para producir un ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico o ácido láctico) en un sistema de fermentación. El microorganismo recombinante que comprende la molécula de DNA recombinante puede producir niveles aumentados de un ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico o ácido láctico) en un sistema de fermentación con relación a un microorganismo que no comprende la molécula de DNA recombinante. También se divulga un plásmido de DNA que comprende una o más de las moléculas de DNA recombinante mencionadas en lo anterior. El plásmido de DNA puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables adecuados pueden incluir uno o más de los genes para resistencia a ampicilina, resistencia a estreptomicina, resistencia a kanamicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol y resistencia a sulfonamida, operacionalmente enlazado a un promotor adecuado (por ejemplo, un promotor constitutivo) . En una modalidad, el plásmido de DNA incluye el gen para resistencia a kanamicina. El plásmido de DNA puede incluir secuencias requeridas para mantener y/o replicar el plásmido en una o más células hospederas adecuadas. En una modalidad el plásmido de DNA es capaz de funcionar como un vector de lanzadera entre las células hospederas adecuadas. El plásmido de DNA puede ser capaz de funcionar como un vector de lanzadera entre A . succinogenes y E . coli . También se divulga una célula hospedera que incluye una o más de las moléculas de DNA mencionadas en lo anterior. Por ejemplo, la célula hospedera puede comprender un plásmido de DNA que incluye la molécula del DNA. La célula hospedera puede ser adecuada para producir y aislar un plásmido de DNA que incluye la molécula de DNA. La célula hospedera puede ser adecuada para producir uno o más ácidos orgánicos en un sistema de fermentación. En algunas modalidades, la célula hospedera expresa un gen Zwf (y subsecuentemente una enzima Zwf) en un nivel adecuado para aumentar la producción de uno o más ácidos orgánicos (por ejemplo, ácidos succínico o ácido láctico) en un sistema de fermentación. En algunas modalidades la célula hospedera puede expresar un gen Zwf (y subsecuentemente una enzima Zwf) en un nivel adecuado para aumentar la concentración de los equivalentes de reducción (por ejemplo, NADPH) en la célula hospedera. La célula hospedera puede comprender una cepa recombinante de A . succinogenes que expresa un gen Zwf (y subsecuentemente una enzima Zwf) en un nivel adecuado para aumentar la concentración de los equivalentes de reducción (por ejemplo, NADPH) en la cepa. Tal cepa puede ser adecuada para producir niveles aumentados de ácido succínico de un sistema de fermentación con relación a una cepa que no comprende la molécula de DNA recombinante. En algunas modalidades, la célula hospedera es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de por lo menos aproximadamente 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L, 120 g/L, 140 g/L, y/o 160 g/L (por ejemplo, en un sistema de fermentación). En ciertas modalidades, la célula hospedera es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L. Deseablemente, la célula hospedera no produce ácidos orgánicos seleccionados diferentes al ácido succínico en concentraciones sustanciales. Donde la célula hospedera produce ácidos orgánicos diferentes al ácido succínico (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido pirúvico y mezclas de los mismos), deseablemente los ácidos orgánicos diferentes al ácido succínico se producen en concentraciones de no más de aproximadamente 30 g/L, más deseablemente no más de aproximadamente 20 g/L, más deseablemente no más de aproximadamente 10 g/L, y aun más deseablemente no más de aproximadamente 5 g/L. Los microorganismos recombinantes mencionados en lo anterior se pueden utilizar en métodos que incluyen la fermentación de un medio nutriente para producir uno o más ácidos orgánicos. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir la fermentación de un medio nutriente con un microorganismo recombinante que expresa un gen Zwf (por ejemplo, el gen Zwf de E . col i ) . Los ácidos orgánicos conocidos por el método pueden incluir ácido succínico y ácido láctico. En modalidades adicionales, los métodos son adecuados para producir ácido succínico en concentraciones de por lo menos aproximadamente 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L, 120 g/L, y/o 160 g/L. En particular, los métodos pueden incluir la fermentación de un medio nutriente con una cepa recombinante de A . succinogenes que expresa un gen Zwf (y subsecuentemente una enzima Zwf) en un nivel adecuado para aumentar la producción de un ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico) . El gen Zwf puede incluir un gen Zwf heterólogo. Una cepa recombinante de A . succinogenes que expresa un gen Zwf heterólogo (es decir, el gen Zwf de E . coli ) está depositado bajo ATCC acceso número PTA-6255. En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo tal como Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10 que expresa un gen Zwf (que pueden ser heterólogo) en un nivel adecuado para aumentar la producción de un ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico) . Los microorganismos recombinantes adecuados también incluyen cepas recombinante de E . coli que expresa un gen Zwf (que puede ser heterólogo) en un nivel adecuado para aumentar la producción de un ácido orgánico (por ejemplo, ácido láctico). En el método, puede ser deseable fermentar un medio nutriente con microorganismos recombinantes que producen niveles relativamente altos de ácidos orgánicos seleccionados, tales como ácido succínico y/o ácido láctico. Como tales, los microorganismos recombinantes seleccionados pueden ser resistentes a altos niveles de ácidos orgánicos, tales como ácidos succínico y/o o ácido láctico. Los microorganismos recombinante también se pueden seleccionar para producir niveles relativamente bajos de otros subproductos indeseables. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede producir niveles relativamente bajos de acetato, formiato, piruvato y mezclas de los mismos (por ejemplo, no más de aproximadamente 2.0 g/L, no más de aproximadamente 2.0 g/L de formiato y/o no más de aproximadamente 3.0 g/L de piruvato). Los microorganismos recombinantes descritos en lo anterior que son resistentes a concentraciones de monofluoroacetato de sodio de aproximadamente 1 g/L, 2 g/L, 4 g/L, y/u 8 g/L son adecuados para el método. En el método, el medio nutriente típicamente incluye una fuente de carbono fermentable. Una fuente de carbono fermentable se puede proporcionar mediante una biomasa fermentable. En una modalidad la fuente de carbono fermentable se deriva de material de alimentación, que incluye cultivos de azúcar, cultivos de almidón y/o residuos de cultivo celulósico. Generalmente, la fuente de carbono fermentable es un azúcar, tal como glucosa. La fuente de carbono fermentable también puede incluir alcoholes de azúcar. En modalidades adecuadas, el método da por resultado un rendimiento (g) de ácido succínico de por lo menos aproximadamente 100% con relación a glucosa (g) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Análisis del flujo metabólico de la fermentación del lote FZ45 variante de A . succinogenes usando glucosa . Figura 2: Análisis del flujo metabólico de fermentación del lote FZ45/pJR762.73. de A . succinogenes usando glucosa. Figura 3: Actividades enzimáticas de Zwf en extractos de células de cepas transformadas. Los extractos se prepararon y se analizaron para la actividad de Zwf como es descrito enseguida. Todas las cepas que llevan pJR762.73 mostraron incrementos de los órdenes de magnitud en la actividad de Zwf, que es graficado en una escala logarítmica. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se divulga en la presente un microorganismo recombinante que expresa un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de una enzima utilizada en el ciclo de fosfato de pentosa. Como se utiliza en la presente, "microorganismos" incluye cualquier organismo de célula única adecuado tal como bacterias, hongos y levadura. Como se utiliza en la presente, "microorganismo recombinante" significa un microorganismo que se ha modificado de una manera que da por resultado un microorganismo que no ocurre naturalmente. Un "microorganismo recombinante" puede incluir un microorganismo que se ha transformado con una molécula de DNA (por ejemplo, una molécula de DNA recombinante) . Un microorganismo recombinante puede incluir un microorganismo que se ha transformado con una molécula de DNA que expresa un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf. El ciclo de fosfato de pentosa utiliza varias enzimas que incluyen glucosa-6-fosfato-1- deshidrogenasa, (también llamada Zwischenferment o Zwf); 6-fosfogluconolactonasa; 6-fosfogluconato deshidrogenasa, (también llamada Gnd) ; ribosa-5-fosfato isomerasa A y B; ribulosa fosfato 3-epimerasa; transetolasa I y II; y transaldolasa A y B. De estas enzimas, Zwf y Gnd dan por resultado la producción de dos equivalentes de hidrógeno en la forma de NADPH. El microorganismo recombinante puede expresar cualquier polipéptido adecuado o variante del mismo que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf (por ejemplo, actividad de glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa y actividad de NADP reductasa) . Por ejemplo, una enzima Zwf adecuada es la enzima Zwf de E . coli o una variante de la misma. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede expresar la enzima Zwf en niveles elevados (es decir, "sobreexpresa" la enzima) con relación a los niveles presentes en microorganismos no recombinantes. El microorganismo recombinante puede expresar un polipéptido variante que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido de una enzima Zwf, y más deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia en la secuencia de aminoácidos de una enzima Zwf. En modalidades adecuadas, el microorganismo recombinante puede expresar una variante de una enzima Zwf que tiene por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la enzima Zwf. Deseablemente, el polipéptido variante tiene uno o más actividad bioquímicas de la enzima Zwf. Un polipéptido variante puede incluir un fragmento de la enzima Zwf. Las enzimas Zwf adecuadas incluyen enzimas Zwf de A . succinogenes , enzimas Zwf de E . coli y variantes de las mismas . El microorganismo recombinante puede expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf tal como un gen Zwf o una variante del mismo. Por ejemplo, el microorganismo recombinante que puede expresar un gen Zwf o una variante que comprende una secuencia de DNA que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia al gen Zwf, y más deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia al gen Zwf . En modalidades adecuadas, el microorganismo recombinante puede expresar una variante del gen Zwf que comprende una secuencia de DNA que tiene por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia al gen Zwf . Deseablemente, el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf. Un polinucleótido variante puede incluir un fragmento del gen Zwf . En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede expresar gen Zwf de A . succinogenes como un gen Zwf de E . coli o una variante de los mismos. El microorganismo recombinante puede ser derivado de cualquier microorganismo adecuado. Típicamente, el microorganismo es capa'z de producir un ácido orgánico a un nivel adecuado para la producción comercial. Como se utiliza en la presente, un "ácido orgánico" incluye por lo menos un grupo carboxílico. Por ejemplo, "ácido orgánico" incluye ácido succínico y ácido láctico. Como se utiliza en la presente, ácidos orgánicos puede ser alternativamente designado por el anión de ácido orgánico o una sal del mismo. Por ejemplo, "ácido succínico" puede ser referido como "succinato"; "ácido láctico" puede ser referido como "lactato"; "ácido fórmico" puede ser referido como "formiato"; y "ácido pirúvico" puede ser referido como "piruvato". Los microorganismos adecuados para la preparación de microorganismos recombinantes como es descrito en la presente pueden' incluir, pero no están limitados a, miembros del género Actinobacillus, que incluye A . succinogenes, Bisgaard Taxon 6; Bisgaard Taxon 10; Mannheimia succiniciproducens; E. coli ; Anaerobiospirillu succiniproducens; Ruminobacter amylophilus; Succinivibrio dextrinosolvens; Prevotella rumínicola ; Ralstonia eutropha; y coryneform bacteria (por ejemplo, Corynebacteri um gl utami cum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacteríum flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacteri um divarica tum) ; miembros del género Lactobacillus; levadura (por ejemplo, miembros del género Saccharomyces); y cualquier subconjunto de los mismos. Los microorganismos adecuados para la preparación de microorganismos recombinantes como es descrito en la presente pueden incluir microorganismos que producen ácido succínico. El microorganismo recombinante típicamente expresan un gen Zwf, que puede ser un gen Zwf heterólogo. El gen Zwf puede ser optimizado para la expresión en microorganismo recombinante. Por ejemplo, el gen Zwf puede ser operacionalmente enlazado a un promotor que facilita la sobreexpresión de gen de microorganismo recombinante con relación microorganismo no recombinante. El promotor puede ser endógeno al microorganismo (es decir, nativo al microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante) o heterólogo al microorganismo (es decir, no nativo al microorganismo del cual el microorganismo recombinante se deriva o se obtiene de una fuente diferente del microorganismo) . El promotor puede ser endógeno del gen Zwf o heterólogo al gen Zwf (es decir, un promotor de gen no de Zwf) . El promotor puede facilitar la expresión constitutiva y/o inducible del gen Zwf , y/o promotor puede ser modificado para facilitar la expresión constitutiva y/o inducible del gen Zwf por métodos adecuados.

El gen Zwf puede ser modificado para facilitar la traducción del mRNA correspondiente. Por ejemplo, el gen Zwf puede ser modificado para incluir codones que no están presentes en el gen endógeno o nativo. Estos codones no endógenos pueden ser seleccionados para reflejar la frecuencia de utilización de codón en el microorganismo recombinante. Las tablas de utilización de codones se han desarrollado para muchos microorganismos y son conocidas en la técnica. El gen Zwf puede ser modificado para reflejar la frecuencia de utilización de codón para A. succinogenes como es proporcionado enseguida: Utilización de la Frecuencia de Codón Ejemplar para Actinobacillus succinogenes . Fuente: GenBank Reléase 144.0 [12 de noviembre del 2004] Triplete [frecuencia por mil] UUU [20.4] UCU [1.9] UAU [13.0] UGU [7.4] UUC [29.7] UCC [14.8] UAC [16.7] UGC [3.7] UUA [35.3] UCA [13.0] UAA [1.9] UGA [0.0] UUG [20.4] UCG [5.6] UAG [0.0] UGG [16.7] CUU [13.0] CCU [5.6] CAU [5.6] CGU [20.4] CUC [1.9] CCC [0.0] CAC [7.4] CGC [9.3] CUA [0.0] CCA [3.7] CAÁ [18.6] CGA [1.9] CUG [5.6] CCG [35.3] CAG [3.7] CGG [0.0] AUU [27.8] ACU [18.6] AAU [13.0] AGU [7.4] AUC [22.3] ACC [31.5] AAC [39.0] AGC [3.7] AUA [0.0] ACÁ [5.6] AAA [76.1] AGA [1.9] AUG [20.4] ACG [18.6] AAG [1.9] AGG [0.0] GUU [26.0] GCU [13.0] GAU [33.4] GGU [61.2] GUC [7.4] GCC [13.0] GAC [29.7] GGC [24.1] GUA [11.1] GCA [22.3] GAA [64.9] GGA [0.0] GUG [27.8] GCG [35.3] GAG [5.6] GGG [5.6] El microorganismo recombinante puede incluir una cepa recombinante de A . succinogenes que expresa un gen Zwf (por ejemplo, un gen Zwf endógeno y/o un gen Zwf heterólogo tal como el gen Zwf de E . coli ) . Otros microorganismos adecuados para producir microorganismos recombinantes incluyen Bisgaard Taxon 6 (depositado con la Colección de Cultivos, University of Goteborg, Sweden (CCUG) bajo el acceso número 15568) ; Bisgaard Taxon 10 (depositado bajo CCUG acceso número 15572); y cualquier cepa adecuada de E . coli para las cuales muchas cepas son conocidas en la técnica. El microorganismo recombinante puede ser derivado de una cepa que produce altos niveles de uno o más ácidos orgánicos tales como ácido succíníco y ácido láctico, y/o el microorganismo recombinante puede ser seleccionado y/o diseñado para producir altos o incrementados niveles de uno o más ácidos orgánicos tales como ácido succínico y ácido láctico con relación a un microorganismo no recombinante. El microorganismo recombinante puede ser derivado de cepas que son resistentes a niveles relativamente altos de subproductos deseables y/o cepas de microorganismos que producen niveles relativamente bajo de subproductos indeseables. Los subproductos indeseables pueden incluir formiato (o ácido fórmico) , acetato (o ácido acético) , y/o piruvato (o ácido pirúvico) . Los métodos para seleccionar cepas que producen bajos niveles de acetato son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, U.S. 5,521,075 y U.S. 5,573,931, que son incorporadas en la presente por referencia. Por ejemplo, las cepas de microorganismos que producen niveles relativamente bajos de acetato se pueden seleccionar al cultivar los microorganismos en la presencia de un derivado de acetato tóxico, tal como monofluoroacetato de sodio a una concentración de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 8.0 g/L. Las cepas seleccionadas pueden producir niveles relativamente bajos de acetatos (por ejemplo, menos de aproximadamente 2.0 g/L), formiato (por ejemplo, menos de aproximadamente 2.0 g/L), y/o piruvato (por ejemplo, menos de aproximadamente 3.0 g/L) en una fermentación de glucosa. Una cepa resistente a monofluoroacetato adecuada para producir microorganismo recombinante es una cepa de A . succinogenes llamada FZ45, que es un derivado de A . succinogenes depositado bajo ATCC acceso número 55618. Ver U.S. 5,573,931, que describe métodos adecuados para preparar cepas microbianas que son resistentes a monofluoroacetato . El microorganismo recombinante puede ser seleccionado y/o diseñado par ser resistente de niveles relativamente altos de subproductos indeseables y/o para producir niveles relativamente bajos de subproductos indeseables. Por ejemplo, después de la transformación, una población de microorganismos recombinantes puede ser cultivada en la presencia de monofluoroacetato de sodio para seleccionar cepas que son resistentes a niveles relativamente altos de acetato y/o cepas que producen niveles relativamente bajos de acetato. Una secuencia de DNA que codifica un polipéptido con una o más actividades bioquímicas de la enzima Zwf se puede obtener al emplear métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, amplificación con PCR de un gen Zwf con cebadores adecuados y la clonación en un vector de DNA adecuados) . Las secuencias de polinucleótido de genes Zwf adecuados se han divulgado (ver por ejemplo, GenBank). Por ejemplo, la secuencia de polinucleótido del gen Zwf de A . succinogenes se ha publicado (SEQ ID NO: 5 & 6). (Ver el sitio de la red Joint Genome Institute, Department of Energy) . El gen Zwf de E . coli está depositado con GenBank (por ej emplo, bajo GenBank Acceso Número NC_000913 (SEQ ID N0:1) y el GenBank Acceso Número M55005 (SEQ ID N0:2)). El gen Zwf o variantes del mismo se puede obtener mediante la amplificación de PCR del DNA genómico de un microorganismo con cebadores apropiados. El vector DNA puede ser cualquier vector adecuado para expresar el gen en un microorganismo recombinante. Vectores adecuados incluyen plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales bacterianos) y/o bacteriófagos modificados (por ejemplo, fagémidos) . El vector se puede diseñar para existir como un elemento epigenético y/o el vector se pueden diseñar para recombinarse con el genoma del microorganismo. La molécula de DNA típicamente incluye un promotor operacionalmente enlazado a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf . El promotor puede ser endógeno o nativo al microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante, o heterólogo al microorganismo ( es decir, derivado de una fuente diferente del microorganismo recombinante). Además, el promotor puede ser el promotor nativo para un gen Zwf seleccionado o puede ser un promotor diferente del promotor nativo para un gen Zwf seleccionado (es decir, un promotor no de gen Zwf ) . Donde el microorganismo recombinante es una cepa de A . succinogenes, un promotor endógeno o nativo adecuado es decir el promotor el promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes (SEQ ID N0:4), depositado bajo GenBank Acceso Número AY308832, que incluye los nucleótidos 1-258, o una variante del mismo. El promotor puede ser operacionalmente enlazado al gen Zwf utilizando métodos de clonación que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el promotor y el gen Zwf pueden ser amplificados mediante PCR utilizando cebadores que incluyen los sitios de reconocimiento de enzima de restricción compatibles. El promotor amplificado y el gen luego se pueden digerir con la enzima y clonar en un vector apropiado que incluye un sitio de clonación múltiple adecuado . Además, la molécula de DNA puede incluir un marcador seleccionable. El marcador seleccionable puede impartir resistencia a uno o más agentes antibióticos. Por ejemplo, los marcadores seleccionables pueden incluir genes para resistencia a ampicilina, resistencia a estreptomicina, resistencia a canamicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloranfenicol, resistencia a sulfonamida o combinaciones de estos marcadores. Típicamente, el marcador seleccionable es operacionalmente enlazado a un promotor que facilita la expresión del marcador. Los plásmidos y otros vectores de clonación que incluyen marcadores seleccionables son conocidos en la técnica. La molécula de DNA típicamente se utiliza para transformar una célula hospedera. Las células hospederas adecuadas incluyen cualquier célula que es útil para almacenar y/o producir la molécula de DNA. Las células hospederas adecuadas pueden incluir células que expresan cualquier gen presente sobre la molécula de DNA. Las células hospederas adecuadas también pueden incluir células que son capaces de producir un ácido orgánico en un proceso de fermentación, tal como ácido succínico a una concentración adecuada para la producción comercial (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20 g/L, más adecuadamente por lo menos aproximadamente 50 g/L y más adecuadamente por lo menos aproximadamente 100 g/L) . Los métodos para producir un ácido orgánico típicamente incluyen la fermentación de un medio de nutriente con un microorganismo recombinante que expresa un gen Zwf . Por ejemplo, el método puede incluir la fermentación de un medio nutriente con un A . succinogenes recombinante que expresa un gen Zwf (por ejemplo, un gen Zwf heterólogo tal como el gen Zwf de E . coli ) . Los ácidos orgánicos producidos en la fermentación pueden incluir ácido succínico. Un microorganismo recombinante adecuado para los métodos es una cepa recombinante de A . succinogenes que expresa el gen Zwf de E . coli , depositado bajo ATTC Acceso Número PTA-6255. Los métodos también pueden incluir la fermentación de un medio nutriente con una cepa recombinante de Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10 que expresa un gen Zwf (por ejemplo, un gen Zwf heterólogo tal como el gen Zwf de E . col i ) para producir ácido succínico. Los métodos también pueden incluir la fermentación de un medio . nutriente con una cepa recombinante de E . coli que expresa un gen Zwf (o sobreexpresa un gen Zwf ) para producir uno o más ácidos orgánicos tal como ácido láctico . Los métodos pueden emplear microorganismos recombinantes que son resistentes a niveles relativamente altos del ácido orgánico que es producido (por ej emplo, ácido succínico) . Los métodos también pueden emplear cepas de microorganismos que son resistentes a niveles relativamente altos de subproductos indeseables y/o cepas de microorganismos que producen niveles relativamente bajos de subproductos indeseables. El medio nutriente típicamente incluye una fuente de carbono fermentable. La fuente de carbono fermentable se puede proporcionar mediante una biomasa fermentable. Una biomasa fermentable se puede derivar de una variedad de cultivos y/o materiales de alimentación que incluyen: cultivos de azúcar (por ej emplo, azúcar, remolachas, sorgo dulce, caña de azúcar, remolacha de forraje); cultivos de almidón (por ejemplo, granos tales como maíz, trigo, sorgo, cebada y tubérculos tales como papas y camotes); cultivos celulósicos (por ejemplo, forraje de maíz, fibra de maíz, paja de trigo y forrajes tal como el forraje de hierba del Sudán y sorgo) . La biomasa se puede tratar para facilitar la liberación de la fuente de carbono fermentable (por ejemplo, azúcares) . Por ejemplo, la biomasa se puede tratar con enzimas tales como celulasa y/o xilanasa, para liberar azúcares simples. La fuente de carbono fermentable puede incluir azúcares simples y alcoholes de azúcar tales como glucosa, maltosa, mañosa, manitol, sorbitol, galactosa, xilosa, arabinosa y mezclas de los mismos. Los métodos típicamente dan por resultado un rendimiento relativamente alto de ácido succínico con relación a una entrada de fuente de carbono tal como glucosa. Por ejemplo, los métodos pueden tener un rendimiento (g) de ácido succínico de por lo menos aproximadamente 90% con relación a la entrada de glucosa (g) . Alternativamente, el rendimiento se puede calcular como tanto % de rendimiento de ácido succínico (mol) /entrada de glucosa (mol) . Como tales, los métodos pueden tener un rendimiento de ácido succínico (mol) de por lo menos aproximadamente 140% con relación a la entrada de glucosa (mol). Deseablemente, los métodos pueden tener un rendimiento de ácido succínico (mol) de por lo menos aproximadamente 130% o de por lo menos aproximadamente 170% con relación a la entrada de glucosa (mol) . Los métodos también típicamente dan por resultado una concentración relativamente alta de producción de ácido succínico (por ejemplo, con relación a un método que utiliza un microorganismo no recombinante en una fermentación) . Por ejemplo, una fermentación puede alcanzar una concentración de por lo menos aproximadamente 50 g/L de ácido succínico. Deseablemente, una fermentación puede alcanzar una concentración de por lo menos aproximadamente 90 g/L de ácido succínico o más deseablemente, una concentración de por lo menos aproximadamente 130 g/L de ácido succínico. En algunas modalidades, la fermentación típicamente no produce niveles sustanciales de subproductos indeseables tales como acetato, formiato, piruvato y mezclas de los mismos (por ejemplo, no más de aproximadamente 2.0 g/L de acetato, no más de aproximadamente 2.0 g/L de formiato y/o no más de aproximadamente 3.0 g/L de piruvato) . Los métodos se pueden utilizar para producir concentración relativamente alta de ácido láctico (por ejemplo, con relación a un método que utiliza un microorganismo no recombinante en una fermentación) . Por ejemplo, los microorganismos recombinantes se pueden utilizar en una fermentación para producir ácido láctico en una concentración de por lo menos aproximadamente 25 g/L. En una modalidad, los rendimientos de fermentación pueden producir aproximadamente 0.5 g de ácido láctico por gramo de glucosa. Los métodos para producir ácido láctico pueden incluir la fermentación de una fuente de carbono adecuada con E . coli recombinante que expresa (o sobreexpresa) un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas del gen Zwf . Por ejemplo, el método puede incluir la fermentación de una fuente de carbono adecuada con E . coli recombinante que expresa el gen Zwf de E . coli a partir de un elemento epigenético tal como un plásmido. Modalidades Ilustradas En una modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de Actinoba ci ll us succinogenes que expresa un gen Zwf heterólogo. El gen Zwf heterólogo puede ser optimizado para la expresión en Actinoba cil l us succinogenes . El gen Zwf heterólogo puede codificar una enzima Zwf de E . coli . La cepa recombinante puede incluir Actinoba cill us succinogenes recombinante depositada bajo ATCC Acceso Número PTA-6255. La cepa recombinante puede ser capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L (por ejemplo, un sistema de fermentación que utiliza una fuente de carbono adecuada) . La cepa recombinante puede ser resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de por lo menos aproximadamente 1 g/L. En algunas modalidades, la cepa recombinante es una cepa recombinante de microorganismo que pertenece a Bisgaard Taxon o Bisgaard Taxon 10 que expresa un gen Zwf heterólogo. El gen Zwf heterólogo puede codificar la enzima Zwf de E . coli . En otra modalidad, la cepa recombinante es una cepa recombinante de Actinoba cill us succinogenes , que incluye una molécula de DNA que comprende un promotor de transcripción para Actinoba cill us succinogenes operacionalmente enlazado a un gen Zwf heterólogo. El promotor de transcripción puede incluir el promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes o una variante del mismo (por ejemplo, un polinucleótido de la SEQ ID NO: 4 o un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 4, donde el polinucleótido tiene actividad del promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes . El gen Zwf heterólogo puede codificar la enzima Zwischenf ermen t de E . coli o una variante de la misma (por ejemplo, un polinucleótido de la SEQ ID N0:1 o un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1, donde el polinucleótido tiene actividad de enzima Zwischenf ermen t de E . col i ) . El gen Zwf heterólogo puede incluir el gen Zwf de E. coli . Opcionalmente, el gen Zwf puede ser optimizado para la expresión en Actinoba cill us succinogenes . La molécula de DNA puede ser epigenética (por ej emplo, presente sobre un plásmido) . La molécula de DNA puede incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a canamicina, resistencia a ampicilina, resistencia a estreptomicina, resistencia a sulfamida, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloranfenicol o una combinación de las mismas). En otra modalidad, la cepa recombinante es una cepa recombinante de Actinoba cill us succinogenes que comprende una enzima Zwf heteróloga. La enzima Zwf heteróloga puede ser expresada de un gen Zwf que se ha optimizado para la expresión en Actinoba cill us succinogenes . La enzima Zwf heteróloga puede incluir la enzima Zwischenf ermen t de E . coli . La cepa recombinante puede incluir A . succinogenes recombinante depositado bajo ATCC Acceso Número PTA-6255. La cepa recombinante puede ser capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L. Opcionalmente, la cepa recombinante es resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de por lo menos aproximadamente 1 g/L. En una modalidad, el método para producir ácido succínico incluye la fermentación de un medio nutriente con un microorganismo recombinante que expresa un gen Zwf heterólogo. El microorganismo recombinante puede incluir una cepa recombinante de Actinoba ci ll us succinogenes (por ej emplo, la cepa recombinante de A . succinogenes depositada bajo ATCC Acceso Número PTA-6255). El microorganismo recombinante puede incluir una cepa recombinante de Bisgaard Taxon 6 o una cepa recombinante de Bisgaard Txon 10. El gen Zwf heterólogo puede incluir el gen Zwf de E . coli .

Opcionalmente, la cepa recombinante es resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de por lo menos aproximadamente 1 g/L. Opcionalmente, la cepa recombinante es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L. El medio nutriente puede incluir un azúcar fermentable (por ejemplo, glucosa) . Típicamente, el método da por resultado un rendimiento (g) de ácido succínico de por lo menos aproximadamente 100% con relación a la glucosa (g) . En una modalidad, la molécula de DNA recombinante incluye un promotor de transcripción para A . succinogenes operacionalmente enlazado a un Zwf heterólogo. Por ejemplo, el promotor de transcripción puede incluir el promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes o una variante del mismo, (por ejemplo, un polinucleótido de la SEQ ID NO: 4 o un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 4, donde el polinucleótido tiene actividad de promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de Actinobacillus succinogenes . En una modalidad, la molécula de DNA recombinante está presente en un plásmido de DNA. Típicamente, el plásmido de DNA incluye un marcador seleccionable (por ej emplo, un gen seleccionado del grupo que consiste de resistencia a ampicilina, resistencia a canamicina, resistencia a estreptomicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloranfenicol, resistencia a sulfamida y combinaciones de las mismas) . La molécula de DNA, que puede estar presente en un plásmido de DNA, se puede presentar en una célula hospedera. La célula hospedera puede ser capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L en un sistema de fermentación. En una modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con una molécula de DNA que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima de Zwf .

La molécula de DNA puede incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf, que puede incluir la actividad de NADP reductasa. La molécula de DNA puede incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia (o deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia) a la secuencia de aminoácidos de una enzima Zwf (por ej emplo, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 6), donde el polipéptido tiene actividad de enzima Zwf (por ejemplo, actividad de NADP reductasa) . La molécula de DNA puede incluir una secuencia de polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia (o deseablemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia) a una secuencia de polinucleótido de un gen Zwf (por ej emplo, SEQ ID N0:1; SEQ ID NO: 2; o SEQ ID N0:5), donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf . En algunas modalidades, la cepa recombinante puede ser derivada de un microorganismo cuyo rRNA de 16S tiene por «lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de rRNA de 16S de Actinobacill us succinogenes . Por ejemplo, la cepa recombinante puede ser derivada de una cepa de Actinoba cil l us succinogenes , Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con un gen Zwf heterólogo. El gen Zwf heterólogo puede ser optimizado para la expresión en el microorganismo. En algunas modalidades, el gen Zwf heterólogo puede codificar la enzima Zwf de E . coli . En algunas modalidades, el gen Zwf puede incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia en la SEQ ID N0:1, donde el polinucleótido tiene actividad de enzima Zwf . En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con una molécula de DNA que incluye un promotor de transcripción para fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa operacionalmente enlazado a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf . El promotor de transcripción puede incluir el promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de Actinobacil l us succinogenes . En algunas modalidades, el promotor puede incluir un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 4, donde el polinucleótido tiene actividad del promotor. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante transformada con una molécula de DNA que e's epigenética. La molécula de DNA puede estar presente sobre un plásmido. En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante que es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L. La cepa recombinante puede ser resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de por lo menos aproximadamente 1 g/L. En algunas modalidades, la cepa recombinante es Actinoba cill us succinogenes recombinante depositado bajo ATCC Acceso Número PTA-6255. En otra modalidad, el microorganismo recombinante se utiliza para producir ácido succínico en un método que incluye la fermentación de un medio nutriente con el microorganismo recombinante. El medio nutriente típicamente incluye azúcar fermentable tal como glucosa. El método puede dar por resultado un rendimiento (g) de ácido succínico de por lo menos aproximadamente 100% con relación a la glucosa (g) • En algunas modalidades, la molécula de DNA que comprende un promotor de transcripción para un microorganismo que produce ácido succínico operacionalmente enlazado a un gen Zwf heterólogo. El promotor de transcripción puede incluir un promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa . En algunas modalidades, el promotor incluye un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 4, donde el polinucleótido tiene actividad del promotor. La molécula de DNA puede estar presente dentro de un plásmido. La molécula de DNA puede estar presente en una célula hospedera (por ejemplo, una célula hospedera capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L) . EJEMPLOS Cepas de Microorganismos y Plásmidos La cepa FZ45 de A . succinogenes es una variante bacteriana estable de 130Z de Actinoba ci ll us succinogenes, que es resistente a monofluoroacetato de sodio. Ver Guettler y colaboradores, INT'L J. SYST. BACT . (1999) 49:207-216; y la Patente Norteamericana No. 5,573,931. El vector de lanzadera pLS88 de E . coli - A . succinogenes (depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo como ATCC Acceso No. 86980) se obtuvo del Dr . Leslie Slaney, Universidad de Manitoba, Canadá. El plásmido pLS88 es descrito como que se ha aislado de Haemophilus ducreyi y puede conferir resistencia a sulfamidas, estreptomicina y canamicina. Manipulaciones Genéticas Las manipulaciones de DNA recombinante generalmente siguieron métodos descritos en la técnica. El DNA de plásmido se preparó mediante el método de lisis alcalina. Los volúmenes de resuspensión típicos para plásmidos multicopia extraídos de cultivos de 1.5 ml fueron 50 µl . La preparación de DNA más grande utilizó el equipo Qiagen Plasmid Purification Midi and Maxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las Endonucleasas de Restricción, Estándares de Peso Molecular, y los marcadores pre-manchados adquirieron de New England Biolabs and Invitrogen y las digestiones se realizaron como es recomendado por los fabricantes, excepto que se utilizó aproximadamente cinco veces de exceso de enzima. El DNA se analizó sobre geles de Tris-acetato-agarosa en la presencia de bromuro de etidio. El DNA se extrajo de los geles de agarosa y purificó utilizando el equipo de extracción de gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA se desfosforiló utilizando fosfatasa alcalina de camarón (Roche) en combinación con digestiones de restricción. La fosfatasa se inactivo con calor a 70°C durante 15 min. Las ligaciones se realizaron utilizando un exceso molar de 3 a cinco veces de inserto a DNA de vector en un volumen de reacción de 20 µl y 1 µl de T4 de DNA ligasa (New England Biolabs) durante 1 hora a 25°C. La transformación de E . col i se realizó al utilizar "células competentes de eficacia de librerías" adquiridas de Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las transformaciones usando mezclas de ligación se colocaron sin diluciones sobre placas LB estándares que contienen el antibiótico apropiado. Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el manual de Perkin Elmer como una guía. Los diseños de cebadores se basaron sobre las secuencias publicadas (como es proporcionado en la base de datos del Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI)) . Los cebadores incluyeron sitios de reconocimiento de enzimas de restricción diseñados. Los cebadores se analizaron para la formación de dímero y de horquilla y la temperatura de fusión utilizando el programa Vector NTI. Todos los cebadores se ordenaron del Michigan State Macromolecular Structure Facility. Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo en un Ciclador Eppendorf Grandient Master, o en un Termociclador Perkin Elmer. Las temperaturas de templado de partida se determinaron utilizando el programa Vector NTI para cada par de cebadores. Las enzimas de restricción para digerir los productos amplificados se adquirieron de Invitrogen o New England Biolabs. Plásmido pJR762.55 La secuencia de promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de A . succinogenes (ppepck, de la SEQ ID NO: 4, GenBank Acceso Número AY308832, que incluye los nucleótidos 1-258) se amplificó del DNA genómico de FZ45 de A . succinogenes utilizando los siguientes cebadores: Delantero, 5' -AAAGAATTCTTAATTTCTTTAATCGGGAC (SEQ ID N0:7); y Trasero, 5' -GCGTCGACATACTTCACCTCATTGAT (SEQ ID NO: 8). Las secuencias de restricción Eco.RI y Salí (nucleótidos subrayados) se incluyeron para facilitar la clonación, y el fragmento ppepck de 0.27-kb resultantes se insertó como un fragmento EcoRI / Sal í en pLS88 para producir el plásmido pJR762.55. Plásmido pJR762.73 El gen Zwf de E . col i se amplificó del DNA genómico de la cepa BL21(DE3) (ATCC Acceso Número NC_000913), utilizando los siguientes cebadores: Delantero, 5'-CCGCTCGAGGGCGGTAACGCAAACAGC (SEQ ID NO: 9); y Trasero, 5' -CCGCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGG (SEQ ID NO: 10) . Las secuencias de restricción de Xhol (nucleótidos subrayados) se incluyeron para facilitar la clonación y el fragmento Zwf de 1.5kb consecuente se insertó en el sitio Salí de pJR762.55 para producir el plásmido pJR762.73. Transformación de A . succinogenes Células competentes de A . succinogenes para la electroporación se prepararon al cultivar células en el medio de caldo de soya tríptico (TSB) a una OD600 de -0.6. Las células se giraron hacia abajo, se lavaron con agua estéril, dos veces con glicerol al 10% v/v y se resuspendieron en O.Olx del volumen de cultivo original con glicerol al 10%. Las células se congelaron instantáneamente y se almacenaron a menos 80°C. Aproximadamente 40 µl de células descongeladas se utilizaron para la electroporación, en probetas de 0.1 cm con un BioRad GenePulser en ajustes de 400 , 25 mF y 1.8 kV. Después de la electroporación, 1 ml de medio TSB a temperatura ambiente se adicionó inmediatamente y las células se incubaron a 37°C durante 1 h. La solución de células se colocó sobre placas de agar TSB que contienen Kanamicina (100 µg/ml) . Determinación de la densidad óptica de A . succinogenes Muestras de fermentaciones neutralizadas con magnesio se giraron en 420 x g durante 2 minutos para precipitar el MgC03 y se diluyeron con HCL 0.5N para solubilizar cualquier precipitado restante antes de la lectura en OD66o- Fermentaciones del lote de A . succinogenes Las fermentaciones de A . succinogenes se realizaron en 51 termentadores que contienen el siguiente medio a menos que se especifique de otra manera: 80 g/L de glucosa, 85 g/L de jarabe de alimentación líquido (LFS), 0.2 mg/L de biotina, fosfato 5 mM, 3g/L de extracto de levadura, Sensient AG900. El pH se mantuvo a 7.0 con Mg(0H)2- La agitación se ajustó a 250 rpm, temperatura a 38°C, y bióxido de carbono se dispersó en una proporción de 0.025 v.v.m. Los termentadores se inocularon con un inoculo de semilla de 1.25%, cultivado en frasquitos de suero que contienen el medio descrito en lo anterior. El medio de fermentación para las cepas recombinantes de A . succinogenes contuvieron 100 µg/ml de canamicina . Clarificación del LFS Para las fermentaciones que requirieron una medición de crecimiento a través de mediciones de densidad óptica se utilizó un extracto de agua fría de LFS. Los sólidos suspendidos y algunos aceites se removieron a través de la centrifugación de LFS en un rotor Sorvall GSA, en 9.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se dejó asentar en un embudo de separación durante 3 horas a temperatura ambiente. La fase de agua inferior típicamente representó 57% (p/v) del LFS en bruto. Ensayos Bioquímicos para Verificar la Expresión de Zwf Los ensayos de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se realizaron como es descrito por Choi y colaboradores, 2003. (Ver Choi, Jae-Chulk, Shin, Hyun-Dong, Lee, Yong-Hyun (2003) Enzyme and Mi crobial Technology 32, páginas 178-185; "Modula tion of 3-hydroxyvalera te molar fra ction on pol (3- hydroxybutyra te-3-hydroxyvalera te) using Ralstonia eutropha transf orman t co-amplifying phbC and NADPH genera tion-rela ted Zwf genes" ) . La proporción de formación de D-6-fosfo-glucono-d-lactona se midió mediante el incremento en NADPH, que se cuantificó al medir la absorbencia en 340 nm. Cada ensayo se realizó en 1 ml que contiene 50 µl de Tris-HCl [1M], pH 7.5, 200 µl de mgCl2 [50 mM] , 100 µl de NADP [10 mM] , 100 µl de glucosa-6-fosfato [10 mM] , 450 µl de H20, y 100 µl de extracto de células. La actividad específica se calculó como: Actividad específica = dA/dt/0.623 x (concentración de proteína), µmol/min mg"1. La actividad de Zwf incrementada se observó en todas las cepas recombinantes que incluyen el plásmido pJR762.73, que expresa el gen Zwf de E . coli del promotor PEPCK de A . succinogenes . La actividad incrementada se observó en la cepa de Actinoba ci l l us transformada (FZ45) y en cepas transformadas de Bisgaard Taxon 6 (BT6) y Bisgaard Taxon 10 (BT10), que llevaron el plásmido pJR762.-73. Estos resultados se ilustran en la Figura 3. Fermentaciones de E. coli Las cepas de E . col i DH5a/pJR762.73 (Zwf), DH5a/pJR762.17 (Zwf) y DH5a/pLS88 se cultivaron en termentadores Bioflo III de 5 litros NBS utilizando cuatro litros del siguiente medio: Extracto de levadura 900AG 15 g; licor intenso de maíz 15 g; Na2HP04 1.16 g; NaH2P04-H20, 0.84 g: (NH4)2S04 3g; MgS04.7H20, 0.61; CaCl2.2H20, 0.25 g y glucosa, 45g por litro. El pH se controló en 6.7 a través de la adición automática de K2C03 (3.3N) . Las fermentaciones cada una se iniciaron con un inoculo al 1.25%. Las condiciones fueron inicialmente hechas aeróbicas lo cual favoreció el crecimiento rápido de las células de E . coli ; la agitación fue de 500 rpm y el medio se dispersó con aire en 0.5 litros/litro-min. Las condiciones del termentador se hicieron anaeróbicas para favorecer la producción de ácido orgánico cuando la densidad de células alcanzó un mínimo de 6.2 unidades de OD660; luego el medio se dispersó con 0.2 litros/litro-min de una mezcla de C02 y H2 (95:5), y la agitación se redujo a 250 rpm, las muestras se tomaron periódicamente y los productos de ácido orgánico y las concentraciones de glucosa residual se determinaron a través de HPLC. Análisis de los Caldos de Fermentación Las concentraciones de ácido succínico, glucosa, ácido láctico, piruvato, etanol y ácido fórmico se determinaron mediante la cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC) utilizando una bomba Isocrática Walters 1515 con un automoestreador Walters 717 y un equipo detector de índice de refracción Walters 2414 a 35°C. El sistema HPLC se controló, los datos se recolectaron y se procesaron utilizando el software Walters Breeze (versión 3.3) . Una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) se utilizó con una columna de protección del catión H mantenida a 55°C. La fase móvil fue ácido sulfúrico 0.021 N que corre en 0.5 ml/min. Las muestras se filtraron a través de un filtro de 0.45 µm, y 5.0 µl fue inyectado sobre la columna. El tiempo de corrida fue de treinta minutos. Mediciones de C02 Un controlador de flujo de masa (Brooks modelo 58501) se utilizó para monitorear y suministrar C02 al sistema de dispersión del termentador en 100 ml/min. Un medidor de flujo de masa (Brooks modelo 58601) se utilizó para medir el C02 que sale del termentador por medio del sistema de condensador de escape. Los dos medidores de flujo de C02 se conectaron en una computadora por la vía de una Interfaz Bio-Command de 4-20 ma . El software BioCommand Plus Bioprocessing registró la entrada y salida del flujo de C02 cada 60 segundos. El gasto de consumo de C02 (ml/min) se expresó como la diferencia entre los gastos de entrada y de salida durante cualquier minuto dado (C02uso = C02entrada -C02salida) . El volumen de C02 consumido durante cualquier intervalo de fermentación dado es la suma de gastos cada minuto del intervalo. Los moles de C02 consumidos se calcularon utilizando la ley de gas ideal, (litros consumidos -í-22.4 litros/mol = moles consumidos). Los medidores de flujo de masa se calibraron por el fabricante para C02 y su precisión fue 1% de la escala completa de 2 ml/m. El ajuste de fermentación se monitoreó para las fugas de gas al mezclar 5% de hidrógeno en el C02. Las fugas de hidrógeno se detectaron utilizando un analizador de CO Tif8800/Gas Combustible. Análisis del flujo metabólico de las fermentaciones de A . succinogenes Las distribuciones de flujo metabólicos (MFA) durante la producción de ácido succínico anaeróbica en Actinoba ci l l us succinogenes se analizaron utilizando la paquete de software FluxAnalyzer. El paquete FluxAnalyzer se obtuvo del Profesor Steffen Klamt (Max Planck Institute, Magdeburg, Alemania) y se operó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual. El paquete FluxAnalyzer facilita el análisis de los flujos metabólicos al proporcionar una interfaz de usuario gráfica para el programa MATLAB, que realiza los cálculos matemáticos reales. El software MATLAB se adquirió de MathWork Inc., al medir los cambios en las concentraciones extracelulares de los componentes conocidos y esperados de la ruta metabólica completa, los flujos intracelulares para los metabolitos intracelulares mayores se calcularon utilizando el modelo de red metabólico descrito enseguida. La red específica (marcada A_succinogenes ) se construyó utilizando los 20 metabolitos conocidos y 27 reacciones mostradas enseguida (sin consideraciones de la composición de la biomasa y la proporción de crecimiento) : Modelo de Red Metabólico de A succinogenes Glucosa (entrada) ? Glucosa (Rl) Glucosa ? Glucosa-6P (R2) Glucosa-6P + 2 NAD ? 2 PEP + 2 NADH (R3) PEP ? Piruvato (R4) PEP + C02 ? OAA (R5) Piruvato ? Piruvato (salida) (R6) Piruvato + NAD ? Acetil-coA + NADH + C02 (R7) Piruvato + NADH + C02 ? Ácido málico (R8) Acetil-coA ? Acetato (R9) Acetato ? Acetato (salida) (RIO) Acetato + OAA ? Citrato (Rll) Citrato + NAD ? C02 + NADH + a-KG (R12) OAA + NADH ? Ácido málico + NAD (R13) Ácido málico ? Fumarato (R14) Fumarato + NADH ? Ácido succínico + NAD (R15) Ácido succínico ? Ácido succínico (salida) (R16) C02 (entrada) ? C02 ( 17) Glicerol (entrada) ? Glicerol (R18) Glicerol + 2 NAD ? PEP + 2 NADH (R19) Sorbitol (entrada) ? Sorbitol (R20) Sorbitol + NAD ? Glucosa -6P + NADH (R21) Xilosa (entrada) ? Xilosa (R22) Xilosa ? R5P (R23) R5P + 5/3 NAD ? 5/3 PEP + 5/3 NADH (R24) Glucosa-6P + 2 NADP ? R5P + C02 + 2 NADPH (R25) Acetil-coA + 2 NADH ? Etanol + 2 NAD (R26) Etanol ? Etanol (salida) (R27) Las muestras de fermentación se analizaron a través del curso de tiempo de las fermentaciones utilizando los métodos analíticos previamente descritos. Las concentraciones de glucosa, glicerol, arabinosa, xilosa, sorbitol, ácido succínico, ácido acético, etanol, piruvato, ácido láctico y los volúmenes de fermentación se determinaron en cada tiempo de muestreo. La cantidad de metabolito se calculó de acuerdo con la fórmula: (metabolito, g) = V (termentador, 1) *C (metabolito, g/l) . La proporción de consumo de metabolito o la proporción de producción de metabolito durante el período de tiempo de t0-t? se calculó utilizando la fórmula: Proporción de consumo de metabolito (mol/h, t0 y ti) = [Cantidad (metabolito, g, to) - [Cantidad (metabolito, g, ti) ] / [ (ti-to) * peso molecular del metabolito]. Para comparación del flujo metabólico para todos los períodos de tiempo, la proporción de consumo o proporción de producción de metabolito en el mapa de flujo se ajustó, asumiendo una proporción de consumo de glucosa en el mapa de flujo de 100. La proporción de consumo o producción de metabolito en el mapa "MCP" se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula: MCP = (proporción de consumo/o producción metabólico) x 100/ (proporción de consumo de glucosa). Las proporciones de consumo o producción de los diversos metabolitos se introdujeron en el modelo de red metabólico en el paquete de FluxAnalyzer de acuerdo con las instrucciones de operación. La función "Proporciones de Calculo/Balance" se utilizó para calcular todas las proporciones calculables. Si el sistema fue no redundante, un procedimiento de optimización se inició, donde una función objetiva lineal se minimizó. Si el sistema fue redundante, uno o más de los tres métodos (mínimos cuadrados simple, varianzas - mínimos cuadrados ponderados I y varianzas mínimos cuadrados ponderados II) se aplicaron para calcular las proporciones. El gasto de flujo se mostró directamente sobre el mapa de flujo. El mapa de flujo final se copió en archivos de Microsoft Excel para propósitos de almacenamiento . Análisis del Flujo Metabólico de las Rutas Bioquímicas en FZ45 de A . succinogenes El análisis de flujo metabólico se utilizó para evaluar el efecto de diferentes fuentes de de carbono sobre la producción de ácido succínico en fermentaciones de lotes con FZ45 de A . succinogenes . Los análisis establecieron que la ruta mayor para producción de ácido succínico en FZ45 de A . succinogenes fluye en la siguiente manera: fosfoenolpiruvato (PEP) -> oxaloacetato (OAA) -> malato -> fumarato -> ácido succínico. La derivación de glioxilato y el sistema de transporte de PEP (PTS) no se presentan que sean sustancialmente utilizados en el organismo. Las fermentaciones de glucosa alcanzan una concentración de 61.7 g/L de ácido succínico con un rendimiento de aproximadamente 94% (ácido succínico (g) /glucosa (g) ) . Las fermentaciones realizadas utilizando una fuente de carbono más reducida, tal como sorbitol, produjo cantidades más altas de ácido succínico (77.3 g/L) con un rendimiento más alto (108% de ácido succínico (g) /glucosa (g) ) , indicando que el poder de reducción puede llegar a ser un factor limitativo durante la fermentación de glucosa. Producción de Ácido Succínico Aumentada a partir de la Glucosa mediante la Sobre-Expresión de Zwf Las cepas FZ45, FZ45/pLS88 y FZ45/pJR762.73 se cultivaron bajo condiciones de producción estándares con la excepción de que 100 µl/ml de canamicina se adicionaron al medio de fermentación para las cepas transformadas. FZ45/pLS88 sirvió como un segundo control, y se transforma con el vector de clonación, que no lleva el promotor PEP carboxiquinasa del gen Zwf . La fuente de carbono utilizada fue glucosa. La cepa FZ45/pJR762.73 mostró un incremento en la producción de ácido succínico sobre las cepas de control FZ45 y FZ45/pLS88, con un incremento correspondiente en la concentración final de ácido succíñico. La cantidad total de ácido succínico producida de la glucosa se incrementó de 284 g a 302 g, el rendimiento molar de ácido succínico producido se incrementó de 144% a 155% (moles de ácido succínico/100 moles de glucosa), el rendimiento en peso se incrementó de 94.7% a 101.9%, y la concentración final de ácido succínico en el caldo de fermentación se incrementó de 62 g/L a 65 g/L. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Todos los derivados FZ45 transformados exhiben crecimiento más lento comparado con el FZ45 no transformado, que puede ser causado por la replicación del DNA de plásmido extracromosómico adicional . Tabla 1 Producción de Ácido Succínico de la Glucosa Mediante las Cepas FZ45, FZ45/pLS88 y Además, la cepa FZ45/pJR762.73 también produjo menos de los dos metabolitos ácido acético y ácido pirúvico, como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2 Producción de Otros Metabolitos mediante las Cepas FZ45 y FZ45/pJR762 . 73 Análisis del flujo metabólico sobre ambas cepas FZ45 y FZ45/pJR762.73 mostró que FZ45/pJR762.73 canalizó más carbono en la ruta de fosfato de pentosa que la FZ45 no transformada (ver la Figura 1 y la Figura 2) . Así, la sobre-expresión de la proteína Zwf fue suficiente parea aumentar los rendimientos de ácido succínico y para reducir la producción de otros metabolitos cuando se utilizó glucosa como fuente de carbono. Fermentación con Z45/pJR762.73 de A . succinogenes utilizando una Fuente de Carbono Reducida Las fermentaciones con FZ45/pJR 762. 13 de A . succinogenes utilizando manitol como una fuente de carbono también se realizaron. El manitol es un alcohol de azúcar de 6 carbonos que es más reducido que la glucosa. La expresión de Zwf también aumentó la producción de ácido succínico utilizando manitol (ver la Tabla 3). Sin embargo, las fermentaciones utilizando este alcohol de azúcar también mostraron rendimientos incrementados aun con la cepa no transformada FZ45. Esto indica que el incremento de la cantidad de los equivalentes de reducción metabólicos aumentará la producción de ácido succínico. Tabla 3 Producción de Ácido Succínico Utilizando Manitol como Fuente de Carbono Efecto de la Expresión Zwf en Bisgaard Taxon 6 y Bisgaard Taxon 10 Recombinantes El efecto de la expresión Zwf en otras especies también se probó utilizando los organismos Bisgaard Taxon 6 (BT6) y Bisgaard Taxon 10 (BT10) . Ambos organismos pertenecen a la familia Pasteurellaceae, y están relacionados con A . succinogenes . También, ambos organismos se conocen que producen ácido succínico. Utilizando los métodos descritos en lo anterior y el mismo plásmido, pJR762.73 (que lleva el gen Zwf bajo el promotor PEPCK de A . succinogenes ) , Bisgaard taxa se transformaron. Ambas de estas cepas transformadas mostraron un incremento en la producción de ácido succínico utilizando glucosa como la fuente de carbono. Estos resultados se muestran en la Tabla 4 enseguida.

Tabla 4 Producción de Ácido Succínico a partir de Glucosa mediante las Cepas BT6/pJR762.73 y BT10/pJR762.73 El análisis de flujo de estas fermentaciones con las cepas Bisgaard Taxa indicó que el uso de la ruta de fosfato de pentosa fue en realidad incrementado en las cepas que llevan el plásmido. BT6/pJR762.73 digirió más carbono a través de la ruta de fosfato de pentosa que el control (33% en mol vs . 20% en mol) . De manera similar, BT10/pJR762.73 dirigió 35% en mol de carbono a través de la ruta de fosfato de pentosa, comparado con solamente 5% en mol en el control. Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que sustituciones y modificaciones variantes se pueden hacer a la invención divulgada en la presente sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. La invención ilustrativamente descrita en la presente adecuadamente puede ser practicada en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no son específicamente divulgadas en la presente. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquiera de los equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención. Así, se debe entender que aunque la presente invención se ha ilustrado por modalidades específicas y características opcionales, la modificación y/o variación de los conceptos divulgados en la presente puede ser recurrida por aquellos expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones se consideran que están dentro del alcance de esta invención. Además, donde las características o aspectos de la invención se describen en términos de los grupos Markush u otro agrupamiento de alternativas, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención también es descrita de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush u otro grupo. También, a menos que se indique lo contrario, donde varios valores numéricos se proporcionan para modalidades, modalidades adicionales se describen al tomar cualquiera de 2 valores diferentes como los puntos de extremo de un intervalo. Tales intervalos también están dentro del alcance de la invención descrita.

Todas las referencias, patentes y/o solicitudes citadas en la especificación se incorporan por referencia en sus totalidades, incluyendo cualquiera de las tablas y figuras, al mismo grado como si cada referencia se ha incorporado por referencia en su totalidad individualmente.

Tabla 5 Listado de Secuencias SEQ ID NO : 1 - atggcggt aacgcaaaca gcccaggcct gtgacctggt cattttcggc gcgaaaggcg accttgcgcg tcgtaaattg ctgccttccc tgtatcaact ggaaaaagcc ggtcagctca acccggacac ccggattatc ggcgtagggc gtgctgactg ggataaagcg gcatatacca aagttgtccg cgaggcgctc gaaactttca tgaaagaaac cattgatgaa ggtttatggg acaccctgag tgcacgtctg gatttttgta atctcgatgt caatgacact gctgcattca gccgtctcgg cgcgatgctg gatcaaaaaa atcgtatcac cattaactac tttgccatgc cgcccagcac ttttggcgca atttgcaaag ggcttggcga ggcaaaactg aatgctaaac cggcacgcgt agtcatggag aaaccgctgg ggacgtcgct ggcgacctcg caggaaatca atgatcaggt tggcgaatac ttcgaggagt gccaggttta ccgtatcgac cactatcttg gtaaagaaac ggtgctgaac ctgttggcgc tgcgttttgc taactccctg tttgtgaata actgggacaa tcgcaccatt gatcatgttg agattaccgt ggcagaagaa gtggggatcg aagggcgctg gggctatttt gataaagccg gtcagatgcg cgacatgatc cagaaccacc tgctgcaaat tctttgcatg attgcgatgt ctccgccgtc tgacctgagc gcagacagca tccgcgatga aaaagtgaaa gtactgaagt ctctgcgccg catcgaccgc tccaacgtac gcgaaaaaac cgtacgcggg caatatactg cgggcttcgc ccagggcaaa aaagtgccgg gatatctgga agaagagggc gcgaacaaga gcagcaatac agaaactttc gtggcgatcc gcgtcgacat tgataactgg cgctgggccg gtgtgccatt ctacctgcgt actggtaaac gtctgccgac caaatgttct gaagtcgtgg tctatttcaa aacacctgaa ctgaatctgt ttaaagaatc gtggcaggat ctgccgcaga ataaactgac tatccgtctg caacctgatg aaggcgtgga tatccaggta ctgaataaag ttcctggcct tgaccacaaa cataacctgc aaatcascaa gctggatctg agctattcag aaacctttaa tcagacgcat ctggcggatg cctatgaacg tttgctgctg gaaaccatgc gtggtattca ggcactgttt gtacgtcgcg acgaagtgga agaagcctgg aaatgggtag actccattac tgaggcgtgg gcgatggaca atgatgcgcc gaaaccgtat caggccggaa cctggggacc cgttgcctcg gtggcgatga ttacccgtga tggtcgttcc tggaatgagt ttgagtaa SEQ ID NO: 2 - atg gcggtaacgc aaacagccca ggcctgtgac ctggtcattt tcggcgcgaa aggcgacctt gcgcgtcgta aattgctgcc ttccctgtat caactggaaa aagccggtca gctcaacccg gacacccgga tt'atcggcgt agggcgtgct gactgggata aagcggcata taccaaagtt gtccgcgagg cgctcgaaac tttcatgaaa gaaaccattg atgaaggttt atgggacacc ctgagtgcac gtctggattt ttgtaatctc gatgtcaatg acactgctgc attcagccgt ctcggcgcga tgctggatca aaaaaatcgt atcaccatta actactttgc catgccgccc agcacttttg gcgcaatttg caaagggctt ggcgaggcaa aactgaatgc taaaccggca cgcgtagtca tggagaaacc gctggggacg tcgctggcga cctcgcagga aatcaatgat caggttggcg aatacttcga ggagtgccag gtttaccgta tcgaccacta tcttggtaaa gaaacggtgc tgaacctgtt ggcgctgcgt tttgctaact ccctgtttgt gaataactgg gacaatcgca ccattgatca tgttgagatt accgtggcag aagaagtggg gatcgaaggg cgctggggct attttgataa agccggtcag atgcgcgaca tgatccagaa ccacctgctg caaattcttt gcatgattgc gatgtctccg ccgtctgacc tgagcgcaga cagcatccgc gatgaaaaag tgaaagtacc tgaagtctcg tcgccgcatc gaccgctcca acgtacgcga aaaaaccgta cgcgggcaat atactgcgtt ccccagggca aaaaagtgcc gggatatctg gaagaagagg gcgcgaacaa gagcagcaat acagaaactt tcgtggcgat ccgcgtcgac attgataact ggcgctgggc cggtgtgcca ttctacctgc gtactggtaa acgtctgccg accaaatgtt ctgaagtcgt ggtctatttc aaaacacctg aactgaatct gtttaaagaa tcgtggcagg atctgccgca gaataaactg actatccgtc tgcaacctga tgaaggcgtg gatatccagg tactgaataa agttcctggc cttgaccaca aacataacct gcaaatcacc aagctggatc tgagctattc agaaaccttt aatcagacgc atctggcgga tgcctatgaa cgtttgctgc tggaaaccat gcgtggtatt caggcactgt ttgtacgtcg cgacgaagtg gaagaagcct ggaaatgggt agactccatt actgaggcgt gggcgatgga caatgatgcg ccgaaaccgt atcaggccgg aacctgggga cccgttgcct cggtggcgat gattacccgt gatggtcgtt cctggaatga gtttgagtaa SEQ ID NO:3 - MAVTQTAQACDLVIFGAKGDIARRKLLPSLYQ EKAGQ NPDTR IIGVG ADWDKAAYTKWREA ETFMKETIDEGIJWDT SARIÍDFCN DVNDTAAFSRL GAMLDQKN ITINYPAMPPSTFGAICKGI.GEAKIiNAKPARWMEKPIjsTSIiATSQEIN DQVGEYFEECQ\nnIDHYI/3KETV NL AIiRFANSLFVNNVÍDNRTIDHVBITVAEEVG IEGRWGYFDKAGQMRDMÍQNHLIiQI C IAMSPPSD SADSIRDEKVKVLKSIiRRIDR SNVREKTVRGQYTAGFAQGKKVPGYLEEEGANKSSNTETFVAIRVDIDNWRWAGVPFY RTGKRLPTKCSEWVYFKTPE NLFKESWQDLPQNKLTIR QPDEGVDIQV NKVPG DHKHNLQITKIiDLSYSETFIíQTHliADAYERLLLETMRGIQALFVRRDEVEEAWK VD SITEAWAMDNDAPKPYQAGTWGPVASVAMITRDGRSWNEFE SEQ ID NO: 4 - ttaatttctt taatcgggac gctatcgata aattgaaaat gcagcaatag aggaaacacg gtttgtttga gtgaaaacag ccgtgttttt tcatttaccg ccataaaaat ttgaaacgga tcacaaatca tgaaaaaaat acgttcaaat tagaactaat tatcgaaaat ttgatctagt taacattttt taggtataaa tagttttaaa atagatctag tttggatttt taattttaaa ttatcaatga ggtgaagt SEQ ID NO : 5 - TTACGCT TT TTCTTCATGG AGCCCGAAGG TCTGCGCCAT ACGCGTCCTT CACGGGCGAT AAGTTTATCC GCTTCCACCG GTCCCCAGGT GCCGGCTTCA TATTCGTAAA CGCGACCTTG GTTTTCCTTG TAATCCAAAA TCGGCTGCAC GAATTTCCAG CAGGCGTGAA CGGCOTCGGT ACGGGCGAAT AATGTGGCGT CGCCTTTCAT GGCGTCAAGC AGTAAACGTT CGTAGGCGGT TAATAAATTA GCGGAAGAAC TGATATCCGC ATAACGGAAA TCCATGGATA CTTCTTTAGC CTCGAAGCCG GCTCCCGGTT TTTTCAAACC GAAGAACATG GAAATGCCTT CGTCCGGTTG GATACGGATG ATTAATTTGT TATCCGGCGC ATTTTGGCTG AATACCGGGT GCGGCGTGGT TTTGAAATGA ATGACGATTT CCGTCACCCG GGTCGGCAGG CGTTTACCGG TGCGCACGTA AAACGGCACG CCGGCCCAGC GCCAGTTATC GATTTGGCAG CGCAACGCCA TGTAGGTTTC GGTGCCGGAA TCGGACGGCA CGCCCGCTTC CTCCAGATAA CCCTTCACCG GTTTATCGTC AACGGTGGAG GCCGTGTATT GCCCTAATAC CAGATTGTGT TTGAGATCTT CCGTGGTCAA CGGATGCAGA CAATAGAGCA CTTTGGCGGT TTCGTCACGC ATGGAATCGG CGTTAATAAT CGCCGGCGGT TCCATGGCAA CCATTGCCAA TACTTGCAAT AAGTGGTTTT GGAACATATC CCGCATTGCA CCGGAACCGT CATAATAGCC GCCCCGTTGT TCTACGCCGA TCTCTTCCGC GCCGGTGATT TCTACGTAAT CGATGAAGTT ACGGTTCCAA AGCGGTTCGA ACAGGCCGTT GGAGAATCGC AGCACCAACA GATTTTGCAC GGTTTCTTTG CCCAAATAAT GGTCGATACG GTAAATCTGG TGTTCCTCGA AGAAACGGTG AATCTGAATA TCCAGTGCTT TGGCGGTTTT AATATCGTAA CCGAACGGTT TTTCCACGAT AATCCGTTTC CAGCCGAATT CTTCCGTATT TAAGCCGTGA GCCGCCAGGC ATTCCGGAAT AACGCCGTAC AGGCTCGGCG GAGTGGATAG ATAATAAAGC GTATTGCCGC AGGTTTGGTA TTTGTCGTGT AATTCATCCA AACGAGGCAG TAACTTTACG TAATCCGCCG AATCGGAGGT GTTTACCGCC TGGTAATACA GATGAGAACA GAATTTATCC AGCGTTTCGC CTTCGGCATT TTCTTGGGTA ATCAGGGCGG TTCGCATTTT TTCACGGAAA ATGTCATCCG TCATTTCTGT GCGGGCCACT CCCAGCACGG AGAAGTTTTC TTCCAACCGT CCGATTTTGT AAAGATTATA GAGTGCGGGA ATTAATTTAC GGTGCGTCAG ATCCCCTGAT GCGCCGAAAA TCACGATACA ATTATTTTCT GCTTTCAT SEQ ID NO : 6 - MKAENNCIVIFGASGD TH KLIPAIiYNLYKIGRLEENFSVLGVARTEMT DDIFREK KTALITQENAEGETLDKFCSHLYYQAVNTSDSADYVKL.LPRIiDE HD YQTCGNTL YYLSTPPSLYGVIPECLAAHGLNTEEFGWKRIIVEKPFGYDIKTAKAIiDIQIHRFFEEHQIYRI DHYLGKETVQNLr.VLRFSNGLFEPLWNRNFIDYVEITGAEEIGVEQRGGYYDGSGAMRDMFQNH LLQVIiAMVAMEPPAIINADSMRDETAKVLYCLHPLTrEDI.KHNLVLGQYTASTVDDKPVKGYI.E EAGVPSDSGTETYMAIiRCQIDNWRWAGTOFYVRTGKRLPTRVTEIVIHFKTTPHPVFSQNAPDN KLIIRIQPDEGISMFFGLKKPGAGFEAKKVSMDFRYADISSSANIíLTAYER LIjDAMKGDAT F ARTDAVHACWKFVQPILDYKE^QGR?TfEYEAGTWGPVEADK IAREGRV RRPSGSMKKKA SEQ ID NO : 7 - AAAGAATTCTTAATTTCTTTAATCGGGAC SEQ ID NO : 8 - GCGTCGACATACTTCACCTCATTGAT SEQ ID NO : 9 - CCGCTCGAGGGCGGTAACGCAAACAGC SEQ ID NO : 10 - CCGCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGG

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES 1. Una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico, caracterizada porque se ha transformado con una molécula de DNA que expresa un polipéptido que tiene actividad de enzima Zwf.
2. 2. • La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el microorganismo es un microorganismo cuyo rRNA de 16S tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia al rRNA de 16S de Actinobacillus succinogenes .
3. 3. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el microorganismo es un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Actinoba cill us succinogenes, Bisgaard Taxon 6 y Bisgaard Taxon 10.
4. 4. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la actividad de enzima Zwf incluye actividad de NADP reductasa.
5. 5. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el microorganismo se transforma con un gen Zwf heterólogo.
6. 6. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el gen Zwf heterólogo se optimiza para la expresión en el microorganismo.
7. 7. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el gen Zwf heterólogo codifica la enzima Zwf de E . coli .
8. 8. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el gen Zwf comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1.
9. 9. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 3.
10. 10. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de DNA comprende un -promotor de transcripción para fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa operacionalmente enlazado al polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima ZwF.
11. 11. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el promotor de transcripción comprende el promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa de Actinobacill us succinogenes .
12. 12. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el promotor comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 4 y el polinucleótido tiene actividad de promotor.
13. 13. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de DNA es epigenética .
14. 14. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la molécula de DNA está presente sobre un plásmido.
15. 15. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa recombinante es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L.
16. 16. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa recombinante es resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de por lo menos aproximadamente 1 g/L.
17. 17. La cepa recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa recombinante es Actinoba cil l us succinogenes recombinante depositada bajo ATCC Acceso Número PTA-6255.
18. 18. Una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico, caracterizada porque se ha transformado con una molécula de DNA que expresa un polipéptido que tiene actividad de NADP reductasa y el polipéptido tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 3.
19. 19. Un método para producir ácido succínico, caracterizado porque comprende fermentar un medio nutriente con el microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el medio nutriente comprende glucosa .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el método da por resultado un rendimiento (g) de ácido succínico de por lo menos aproximadamente 100% con relación a la glucosa (g) .
22. 22. Una molécula de DNA, caracterizada porque comprende un promotor de transcripción para un microorganismo que produce ácido succínico operacionalmente enlazado a un gen Zwf heterólogo.
23. 23. La molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el microorganismo que produce ácido succínico es Actinoba ci ll us succinogenes .
24. 24. La molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el promotor de transcripción comprende un promotor fosfoenolpiruva to (PEP) carboxiquinasa .
25. 25. La molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el promotor comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 4 y el polinucleótido tiene actividad de promotor.
26. 26. Un plásmido de DNA, caracterizado porque comprende la molécula de DNA de cualquiera de las reivindicaciones 22-25.
27. 27. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el plásmido de DNA de la reivindicación 26.
28. 28. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula hospedera es capaz de producir ácido succínico en concentraciones de aproximadamente 50 g/L a aproximadamente 130 g/L.