ES2899973T3

ES2899973T3 - Malato deshidrogenasas

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Publication number: ES2899973T3
Application number: ES17742208T
Authority: ES
Inventors: Alrik Los; JONG RENé DE; Remko Winter; Dulk Ben Den
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: EP3485004A1; US20200385692A1; CN109689864B; WO2018011161A9; CA3030605A1; WO2018011161A1; EP3919615A1; US20190225947A1; EP3485004B1; CN116286420A; CN109689864A; US10787649B2; DK3485004T3; US11339379B2

Abstract

Una célula hospedadora recombinante que es capaz de producir un ácido dicarboxílico y que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa, en donde el polipéptido mutante comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39, en donde la célula hospedadora recombinante es una célula fúngica, en donde la secuencia nucleica que codifica el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa se expresa en el citosol y el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es activo en el citosol, y en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 53, y en donde la célula hospedadora recombinante produce un aumento de la cantidad de un ácido dicarboxílico en comparación con una célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido de malato deshidrogenasa de SEQ ID NO: 39.

Description

DESCRIPCIÓN

Malato deshidrogenasas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una célula hospedadora recombinante capaz de producir un ácido dicarboxílico, y a un método de producción de un ácido dicarboxílico usando dicha célula hospedadora recombinante.

Antecedentes de la invención

Los ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos el ácido málico, el ácido fumárico y el ácido succínico son posibles precursores de numerosas sustancias químicas. Por ejemplo, el ácido succínico se puede convertir en 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado del ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara uniendo ácido succínico y BDO.

El ácido succínico para uso industrial se produce predominantemente de forma petroquímica a partir de butano mediante hidrogenación catalítica de ácido maleico o anhídrido maleico. Estos procesos se consideran perjudiciales para el entorno y son caros. La producción fermentativa de ácido succínico se considera un proceso atractivo y alternativo para la producción de ácido succínico, en donde se puede usar materia prima renovable como fuente de carbono.

Se han realizado varios estudios sobre la producción fermentativa de ácido dicarboxílico C4 en levadura (recombinante).

El documento de patente EP2495304, por ejemplo, desvela una levadura recombinante adecuada para la producción de ácido succínico, modificada genéticamente con genes que codifican una piruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxicinasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa y un transportador de succinato.

El documento de patente WO2014/018755 propone una hipótesis sobre células de levadura recombinante que tienen una vía reductora de TCA a partir de fosfoenolpiruvato o piruvato en succinato y, en particular, células de levadura recombinante que tienen al menos un gen exógeno dependiente de NADPH en la vía de fosfoenolpiruvato o piruvato a succinato.

El documento de patente WO2009/065778 menciona una célula eucariota recombinante seleccionada del grupo que consiste en una levadura y un hongo filamentoso que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico.

El documento de patente WO2008/144626 describe una levadura modificada que tiene una modificación genética que reduce la actividad del polipéptido de piruvato descarboxilasa (PDC) en comparación con una levadura por lo demás idéntica que carece de la modificación genética y al menos una modificación que aumenta la producción de ácido málico en comparación con una levadura de otro modo idéntica que carece de la modificación.

A pesar de las mejoras que se han hecho en la producción fermentativa de ácido dicarboxílico en células hospedadoras, tales como levadura, sigue existiendo, sin embargo, una necesidad de células hospedadoras mejoradas adicionales para la producción fermentativa de ácidos dicarboxílicos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una célula hospedadora recombinante que es capaz de producir un ácido dicarboxílico y que comprende un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa (MDH). Sorprendentemente, se encontró que la célula hospedadora según la presente invención produce un aumento de la cantidad de un ácido dicarboxílico en comparación con la cantidad de ácido dicarboxílico producida por una célula hospedadora que comprende un polipéptido de MDH de referencia, siendo el polipéptido de MDH de referencia normalmente una malato deshidrogenasa dependiente de NAD(H) (EC 1.1.1.37).

Según la presente invención, así se proporcionó una célula hospedadora recombinante que es capaz de producir un ácido dicarboxílico y que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa, en donde el polipéptido mutante comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación (por ejemplo, una sustitución) de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39,

en donde la célula hospedadora recombinante es una célula fúngica,

en donde la secuencia nucleica que codifica el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa se expresa en el citosol y el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es activo en el citosol, y

en donde el polipéptido muíante que tiene actividad de malato deshidrogenasa tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 53, y

y en donde la célula hospedadora recombinante produce un aumento de la cantidad de un ácido dicarboxílico en comparación con una célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido de malato deshidrogenasa de SEQ ID NO: 39.

Dicho polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede comprender además una o más mutaciones adicionales (por ejemplo, sustituciones). En particular, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede comprender además una o más mutaciones adicionales (por ejemplo, sustituciones) correspondientes a cualquiera de los aminoácidos 35, 36, 37, 38, 39 y/o 40 en SEQ ID NO: 39.

El polipéptido mutante puede tener un aumento en la NADP(H) con respecto a la actividad dependiente de NAD(H) en comparación con la de un polipéptido de MDH de referencia, siendo el polipéptido de MDH de referencia normalmente una malato deshidrogenasa dependiente de NAD(H) (EC 1.1.1.37). Dicho polipéptido mutante puede ser un polipéptido mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación (por ejemplo, una sustitución) de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39.

La célula hospedadora recombinante según la presente invención puede tener una vía reductora activa de ácido tricarboxílico (TCA) de fosfoenol o piruvato a succinato.

La invención también proporciona un método para la producción de un ácido dicarboxílico, en donde el método comprende fermentar la célula hospedadora recombinante de la presente invención en condiciones adecuadas para la producción del ácido dicarboxílico. El ácido dicarboxílico puede ser ácido succínico, ácido málico y/o ácido fumárico. El método puede comprender además recuperar el ácido dicarboxílico del medio de fermentación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 9 a 12. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos 9 a 12 indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El extremo 5' del fragmento 9 y el extremo 3' del fragmento 12 (indicados por las regiones grises en los fragmentos 9 y 12) son homólogos al locus YPRCtau3 en el cromosoma 16. La recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 10 y 11 en el locus YPRCtau3.

La Figura 2 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 1 -8 y del fragmento 113. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos 1-8 y 113 indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El fragmento 1 y el fragmento 113 son homólogos al locus INT59 en el cromosoma XI, la recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 2-8 en el locus INT59.

La Figura 3 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 13, 114, 115, 15 y 16. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos 13, 114, 115, 15 y 16 indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El fragmento 13 y el fragmento 16 son homólogos al locus INT1 en el cromosoma XV, la recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 114, 115 y 15 en el locus INT1.

La Figura 4 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 13, 14, 16 y uno de los fragmentos 17-110. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos 13, 14, 16 y el fragmento 17-110 indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El fragmento 13 y el fragmento 16 son homólogos al locus INT1 en el cromosoma XV, la recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 14 y uno de los fragmentos 17-112 en el locus INT1.

Figura 5A: Títulos promedio de ácido málico medidos en el sobrenadante del medio de producción después del cultivo de transformantes SUC-1112, que expresan fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCKa), piruvato carboxilasa (PYC2), malato deshidrogenasa (MDH3), fumarasa (FUMR y fumB), transportador de ácido dicarboxílico (DCT_02) y se transforman con malato deshidrogenasa de referencia (SEQ ID NO: 39) o malato deshidrogenasa mutante, que contiene mutaciones en comparación con la secuencia de referencia en las posiciones de aminoácidos como se indica en la Tabla 1. El título de ácido málico se midió como se describe en Materiales y métodos generales y representa un valor promedio obtenido de tres clones independientes.

Figura 5B: Actividad de malato deshidrogenasa (MDH) específica de NADH de mutantes de MDH expresados en la cepa SUC-1112 (véase la Tabla 1 para mutaciones específicas). Se muestra la actividad, representada como A A340/min/mg de proteína total. El valor es negativo ya que la oxidación de NADH dependiente de MDH da como resultado una disminución en la absorbancia a 340 nm. Un valor más negativo indica más actividad. La actividad se midió como se describe en el Ejemplo 5.

Figura 5C: Actividad de malato deshidrogenasa (MDH) específica de NADPH de mutantes de MDH expresados en la cepa SUC-1112 (véase la Tabla 1 para mutaciones específicas). Se muestra la actividad, representada como A A340/min/mg de proteína total. El valor es negativo ya que la oxidación de NADPH dependiente de MDH da como resultado una disminución en la absorbancia a 340 nm. Un valor más negativo indica más actividad. La actividad se midió como se describe en el Ejemplo 5.

Figura 5D: Relación de la actividad dependiente de NADPH:NADH de mutantes de MDH expresada en la cepa SUC-1112 (véase la Tabla 1 para mutaciones específicas). Se midió la actividad y se determinó la relación como se describe en el Ejemplo 5. La línea discontinua indica una relación NADPH:NADH de 1,0.

La Figura 6 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 116, 117, 118 y el fragmento 119. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos 116, 117, 118 y el fragmento 119 indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El fragmento 116 y el fragmento 119 son homólogos al locus INT1 en el cromosoma XV, la recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 117 y el fragmento 118 en el locus INT1.

La Figura 7 expone una representación esquemática de la integración de los fragmentos 1 -5, 124 y el fragmento 120, 121, 122 o 123. Las partes sombreadas indicadas en los fragmentos indican las regiones de solapamiento homólogas únicas que conducen a los acontecimientos de recombinación como se indica por las cruces de guiones entre las regiones homólogas. El fragmento 1 y el fragmento 124 son homólogos al locus INT59 en el cromosoma XI, la recombinación homóloga da como resultado la integración del fragmento 2-5 y 120, 121, 122 o 123 en el locus INT59.

Descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 2 (Figura 2), que incluye PEP carboxicinasa del par de codones de Actinobacillus succinogenes optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 3 (Figura 2), que incluye piruvato carboxilasa (PYC2) del par de codones de S. cerevisiae optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de nucleótidos del molde de PCR para el fragmento 4 (Figura 2), que incluye un marcador de selección KanMX funcional en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 4 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 5 (Figura 2), que incluye un supuesto transportador de ácido dicarboxílico del par de codones de Aspergillus niger optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 6 (Figura 2), que incluye malato deshidrogenasa (MDH3) del par de codones de S. cerevisiae optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 6 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 7 (Figura 2), que incluye fumarasa (fumB) del par de codones de Escherichia c o lioptimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 7 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 8 (Figura 2), que incluye fumarato reductasa del par de codones de Trypanosoma brucei (FRDg) optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 8 expone la secuencia de aminoácidos de fumarato reductasa de Trypanosoma brucei (FRDg).

SEQ ID NO: 9 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 1 (Figura 2).

SEQ ID NO: 10 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 1 (Figura 2).

SEQ ID NO: 11 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 2 (Figura 2).

SEQ ID NO: 12 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 2 (Figura 2).

SEQ ID NO: 13 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 3 (Figura 2).

SEQ ID NO: 14 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 3 (Figura 2).

SEQ ID NO: 15 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 4 (Figura 2).

SEQ ID NO: 16 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 4 (Figura 2).

SEQ ID NO: 17 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 5 (Figura 2).

SEQ ID NO: 18 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 5 (Figura 2). SEQ ID NO: 19 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 6 (Figura 2) y los fragmentos 120, 121, 122 y 123 (Figura 7).

SEQ ID NO: 20 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 6 (Figura 2) y los fragmentos 120, 121, 122 y 123 (Figura 7).

SEQ ID NO: 21 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 7 (Figura 2). SEQ ID NO: 22 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 7 (Figura 2). SEQ ID NO: 23 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 8 (Figura 2). SEQ ID NO: 24 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 8 (Figura 2). SEQ ID NO: 25 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 13 (Figura 3). SEQ ID NO: 26 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 13 (Figura 3). SEQ ID NO: 27 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 14 (Figura 4). SEQ ID NO: 28 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 115 (Figura 3) y el fragmento 14 (Figura 4).

SEQ ID NO: 29 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 15 (Figura 3) y el fragmentos 17 a 110 (Figura 4).

SEQ ID NO: 30 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 15 (Figura 3) y el fragmentos 17 a 110 (Figura 4).

SEQ ID NO: 31 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 15 (Figura 3) y el fragmento 120 (Figura 7), que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica el par de codones de SEQ ID NO: 39 optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 32 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 16 (Figura 3). SEQ ID NO: 33 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 16 (Figura 3). SEQ ID NO: 34 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 9 (Figura 1), que incluye fumarasa del par de codones de Rhizopus oryzae optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

SEQ ID NO: 35 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 10 (Figura 1), que incluye la parte 5' de la Crerecombinasa.

SEQ ID NO: 36 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 11 (Figura 1), que incluye la parte 3' de la Crerecombinasa.

SEQ ID NO: 37 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 12 (Figura 1), que incluye una región homóloga al locus YPRCtau3.

SEQ ID NO: 38 expone la secuencia de nucleótidos del molde de PCR para el fragmento 115 (Figura 3), fragmento 14 (Figura 4) y fragmento 117 (Figura 6), que incluye el marcador de selección de nourseotricina. SEQ ID NO: 39 expone la secuencia de aminoácidos de la proteína malato deshidrogenasa (MDH3) de S. cerevisiae, que carece de la secuencia de direccionamiento peroxisomal del extremo 3C.

SEQ ID NO: 40 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 113 (Figura 2). SEQ ID NO: 41 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 113 (Figura 2). SEQ ID NO: 42 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 114 (Figura 3), que incluye el casete de expresión de ZWF1 del par de codones de S. cerevisiae optimizado para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 43 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 114 (Figura 3). SEQ ID NO: 44 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 114 (Figura 3). SEQ ID NO: 45 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 115 (Figura 3). SEQ ID NO: 46 expone la secuencia de aminoácidos de la proteína piruvato carboxilasa de S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 47 expone la secuencia de aminoácidos de fosfoenolpiruvato carboxicinasa de Actinobacillus

succinogenes, con la modificación de EGY a DAF en la posición 120-122.

SEQ ID NO: 48 expone la secuencia de aminoácidos de fumarasa (fumB) de Escherichia coli.

SEQ ID NO: 49 expone la secuencia de aminoácidos de fumarasa de Rhizopus oryzae, que carece de los

primeros 23 aminoácidos del extremo N.

SEQ ID NO: 50 expone la secuencia de aminoácidos de un supuesto transportador de ácido dicarboxílico de

Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 51 expone la secuencia de aminoácidos de isocitrato liasa de Kluyveromyces lactis.

SEQ ID NO: 52 expone la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de malato sintasa

peroxisomal de Saccharomyces cerevisiae (Mls1), que carece de la secuencia de direccionamiento peroxisomal

del extremo 3 C.

SEQ ID NO: 53 expone la secuencia de aminoácidos de la proteína de malato deshidrogenasa (MDH3) de

S. cerevisiae, que incluye la secuencia de direccionamiento peroxisomal SKL.

SEQ ID NO: 54 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 116 (Figura SEQ ID NO: 55 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 116 (Figura SEQ ID NO: 56 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 117 (Figura SEQ ID NO: 57 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 117 (Figura SEQ ID NO: 58 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 119 (Figura SEQ ID NO: 59 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 119 (Figura SEQ ID NO: 60 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 118 (Figura SEQ ID NO: 61 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 118 (Figura SEQ ID NO: 62 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 118 (Figura 6) que incluye la secuencia

codificante para fumarato reductasa del par de codones de Trypanosoma brucei (FRDg) optimizado para la

expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 63 expone la secuencia de nucleótidos del cebador usado para generar el fragmento 124 (Figura 7).

SEQ ID NO: 64 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 121 (Figura 7) que incluye la secuencia

codificante para el par de codones del mutante de MDH3 de S. cerevisiae MUT_014 optimizado para la expresión

en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 65 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 122 (Figura 7) que incluye la secuencia

codificante para el par de codones del mutante de MDH3 de S. cerevisiae MUT_015 optimizado para la expresión

en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 66 expone la secuencia de nucleótidos del fragmento 123 (Figura 7) que incluye la secuencia

codificante para el par de codones del mutante de MDH3 de S. cerevisiae MUT_034 optimizado para la expresión

en S. cerevisiae.

SEQ ID NO: 67 expone la secuencia de aminoácidos de fumarasa de Arabidopsis thaliana.

Descripción detallada de la invención

En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden", "incluyen" y "que

tiene" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" se deben interpretar de forma

inclusiva. Es decir, estas palabras pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no

citados específicamente, donde lo permita el contexto.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o al

menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más

de un elemento.

La vía reductora de TCA es una de las principales vías por las que un microorganismo puede producir ácidos

dicarboxílicos. En los últimos años, ha demostrado ser la mejor opción económica para la producción microbiana de

ácidos dicarboxílicos, por ejemplo, ácido succínico. La vía reductora de TCA vía incluye dos reacciones que requieren

el consumo de potencia reductora; es decir, la reacción de malato deshidrogenasa (reducción de oxaloacetato en malato) y la reacción de fumarato reductasa (reducción de fumarato en succinato).

La malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la conversión reversible de malato en oxaloacetato usando NAD o NADP como cofactor (también denominado conjuntamente NAD(P)). La MDH es una enzima bastante ubicua y desempeña funciones clave en muchas vías metabólicas, que incluyen el ciclo de ácido tricarboxílico, la síntesis de aminoácidos, la gluconeogénesis, el mantenimiento del equilibrio de oxidación/reducción y el estrés metabólico.

Las MDH se pueden dividir en MDH dependientes de NAD(H) (NAD-MDH) (EC 1.1.1.37) y MDH dependientes de NADP(H) (NADP-MDH) (EC 1.1.1.82), según su preferencia por los cofactores. La mayoría de las MDH bacterianas y arqueales son NAD-MDH. Las isoformas de MDH eucariota son todas NAD-MDH, que incluyen MDH mitocondriales, MDH citosólicas, MDH glioxisomales y MDH peroxisomales, excepto NADP-MDH cloroplásicas, que se requieren para la transferencia de equivalentes reductores desde el estroma de los cloroplastos hasta el citosol. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se han identificado tres isoenzimas endógenas de malato deshidrogenasas, concretamente MDH1, MDH2 y MDH3. Se localizaron en las mitocondrias (MDH1), el citosol (MDH2) y el peroxisoma (MDH3), y se caracterizó que todas eran MDH dependientes de NAD(H) (EC 1.1.1.37).

El estudio de los dominios de unión a NAD(P) en la familia de enzimas de malato deshidrogenasa reveló un motivo pB-aC conservado del pliegue de Rossmann. La capacidad de las deshidrogenasas para discriminar a NADP(H) radica en la secuencia de aminoácidos de este motivo de pB-aC, que se ha predicho que es un determinante principal para la especificidad por cofactores. Por ejemplo, en la NAD-MDH peroxisomal de S. cerevisiae (MDH3), el motivo de unión a NAD incluye los restos de aminoácidos 34 a 40 que se encontró que eran importantes para la unión al cofactor y especificidad.

En el contexto de la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que un conjunto de mutaciones específicas en el motivo de unión a NAD conservado de un polipéptido que tiene actividad de MDH confiere un aumento de la producción de un ácido dicarboxílico cuando se expresa (en exceso) en una célula hospedadora recombinante capaz de la producción de dicho ácido dicarboxílico. Es decir, la expresión (en exceso) de dicho polipéptido mutante que tiene actividad de MDH en una célula hospedadora recombinante conduce normalmente al aumento de la producción de un ácido dicarboxílico en comparación con una célula hospedadora recombinante que expresa (en exceso) un polipéptido de MDH de referencia; siendo el "polipéptido de MDH de referencia" normalmente una NAD-MDH (EC 1.1.1.37). Concomitantemente, se ha mostrado que dicho polipéptido mutante que tiene al menos una mutación en el motivo de unión a NAD conservado tiene un aumento en la actividad dependiente de NADP(H) con respecto a dependiente de NAD(H) en comparación con la de dicho polipéptido de MDH de referencia. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han mostrado además que la actividad dependiente de NADP(H) no tiene que ser superior a la actividad dependiente de NAD(H) para obtener un aumento en la producción de ácido dicarboxílico.

Es, por lo tanto, un objeto de la presente invención proporcionar una célula hospedadora recombinante que sea capaz de producir un ácido dicarboxílico y que comprenda un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa (MDH).

En una realización, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39. En otras palabras, dicho polipéptido mutante comprende una mutación de un resto de aminoácido que ocurre en una posición correspondiente a 34 en SEQ ID NO: 39.

En una realización preferida de la invención, la mutación del aminoácido correspondiente al aminoácido 34 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será una sustitución.

Más preferentemente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 34 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Los aminoácidos pequeños adecuados incluyen treonina (T), serina (S), glicina (G), alanina (A) y prolina (P). Los aminoácidos pequeños preferidos son glicina (G) y serina (S).

En el contexto de la presente invención, una "célula hospedadora recombinante" o una "célula hospedadora genéticamente modificada" es una célula hospedadora en la que se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico, una construcción de ácidos nucleicos o un vector que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa.

En el presente documento, un "polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa (MDH)" se puede denominar a "malato deshidrogenasa mutante", "mutante de MDH", "mutante de polipéptido de MDH", "mutante", "polipéptido mutante" o similares.

En el presente documento, la "actividad de malato deshidrogenasa" es la actividad que convierte el ácido oxaloacético en ácido málico:

Ácido málico aceptor <=> ácido oxaloacético aceptor reducido

El término "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de aproximadamente siete restos de aminoácidos. Todas las secuencias de polipéptidos se escriben en el presente documento de derecha a izquierda y en la dirección de extremo amino a extremo carboxi. El código unilítero de aminoácidos usado en el presente documento es comúnmente conocido en la técnica y se puede encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001).

En el contexto de la presente invención, un polipéptido "mutante" se define como un polipéptido que se obtuvo por introducción de una o más mutaciones. Dichas mutaciones se pueden seleccionar del grupo de sustituciones, adiciones y deleciones. El término "sustitución" significa en el presente documento la sustitución de un resto de aminoácido en la secuencia de polipéptidos con otro. Un polipéptido "mutante", un polipéptido "mutado" y un polipéptido "genéticamente manipulado" tienen el mismo significado y se usan indistintamente.

En el presente documento, una "posición correspondiente" se refiere a la columna vertical en un alineamiento de secuencias de aminoácidos entre SEQ ID NO: 39 y secuencias homólogas a SEQ ID NO: 39 correspondientes a una posición específica en SEQ ID NO: 39 y que muestran los aminoácidos que aparecen en esa posición en los otros homólogos alineados.

En el contexto de la invención, una "mutación correspondiente" se refiere a una mutación de un resto de aminoácido que ocurre en una "posición correspondiente" en SEQ ID NO: 39. Por ejemplo, una "sustitución correspondiente" se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido que ocurre en una "posición correspondiente" en SEQ ID NO: 39 con otro resto de aminoácido.

En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede comprender además una o más mutaciones adicionales correspondientes a cualquiera de los aminoácidos 35, 36, 37, 38, 39 y/o 40 en SEQ ID NO: 39. Dichas mutaciones normalmente se seleccionarán del grupo de sustituciones, adiciones y deleciones. Más preferentemente, la uno o más mutaciones adicionales serán una sustitución.

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 35 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Los aminoácidos pequeños adecuados incluyen treonina (T), serina (S), glicina (G), alanina (A) y prolina (P). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 35 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina (I). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 35 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a serina (S) o isoleucina (I).

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 36 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido polar. Los aminoácidos polares adecuados incluyen glutamina (Q), ácido glutámico (E) y serina (S). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 36 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido pequeño, tal como alanina (A) o prolina (P). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 36 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a glutamina (Q), ácido glutámico (E), serina (S), alanina (A) o prolina (P).

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 37 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Los aminoácidos pequeños adecuados incluyen glicina (G), asparagina (N) y alanina (A). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 37 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido polar, tal como arginina (R) o glutamina (Q). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 37 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a glicina (G), asparagina (N), alanina (A), arginina (R) o glutamina (Q).

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 38 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Los aminoácidos pequeños adecuados incluyen valina (V), treonina (T), serina (S), glicina (G), alanina (A) y prolina (P). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 38 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a alanina (A), valina (V), treonina (T) o serina (S).

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 39 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Un aminoácido pequeño adecuado incluye prolina (P). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 39 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido hidrófobo, tal como lisina (K), fenilalanina (F) o leucina (L). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 39 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido polar, tal como ácido glutámico (E). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 39 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a ácido glutámico (E), lisina (K), fenilalanina (F), leucina (L) o prolina (P).

La sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 40 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será normalmente a un aminoácido pequeño. Los aminoácidos pequeños adecuados incluyen glicina (G). Alternativamente, la sustitución del aminoácido correspondiente al aminoácido 40 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a un aminoácido polar, tal como glutamina (Q). Una sustitución preferida del aminoácido correspondiente al aminoácido 40 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) será a glicina (G) o glutamina (Q).

Los diversos tipos de aminoácidos anteriores se clasifican con referencia a, por ejemplo, Betts y Russell, en Bioinformatics for Geneticists, Barnes and Gray eds, Wiley 2003.

Con más detalle, en el contexto de la invención, un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa comprenderá G o S en la posición 34 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39;

y, opcionalmente

I o S en la posición 35 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

Q, A, E, P o S en la posición 36 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

A, N, G, R o Q en la posición 37 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

A, V, T o S en la posición 38 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

E, K, P, F o L en la posición 39 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

G o Q en la posición 40 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39.

En una realización específica, un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa comprenderá un aminoácido pequeño en la posición 34 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39) y un aminoácido pequeño o polar en la posición 36 (como se define con referencia a SEQ ID NO: 39). En dicha realización, un aminoácido pequeño preferido en la posición 34 se puede seleccionar de G o S. En dicha realización, un aminoácido pequeño o polar preferido en la posición 36 se puede seleccionar de Q, A, E, P o S. Opcionalmente, en dicha realización, el polipéptido mutante comprenderá

I o S en la posición 35 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39; y/o

G o Q en la posición 40 como se define con referencia a SEQ ID NO: 39.

El polipéptido mutante que tiene actividad de MDH puede comprender además mutaciones adicionales distintas de las siete posiciones definidas anteriormente, por ejemplo, unas o más sustituciones, adiciones o deleciones adicionales.

El polipéptido mutante que tiene actividad de MDH puede comprender una combinación de diferentes tipos de modificación de este tipo. El polipéptido mutante que tiene actividad de MDH puede comprender una, dos, tres, cuatro, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o más de dichas modificaciones (que pueden ser todas del mismo tipo o pueden ser diferentes tipos de modificación). Normalmente, las modificaciones adicionales pueden ser sustituciones.

En aún otras realizaciones, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es como se define con referencia a la Tabla 1 (Ejemplo 4) y en donde el resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 se selecciona de glicina (G) o serina (S). Es decir, el polipéptido mutante puede comprender cualquier combinación de sustituciones que se exponen en la Tabla 1 en comparación con una secuencia de referencia adecuada tal como que se expone en SEQ ID NO: 39, y en donde el resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 se selecciona de glicina (G) o serina (S).

Normalmente, entonces el polipéptido mutante puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 39 con una sustitución en la posición 34, y opcionalmente una o más sustituciones en 35, 36, 37, 38, 39 y/o 40. Es decir, el polipéptido mutante tendrá un aminoácido distinto de aspartato en la posición 34 y opcionalmente un aminoácido distinto de isoleucina en la posición 35 y/o un aminoácido distinto de arginina en la posición 36 y/o un aminoácido distinto de alanina en la posición 37, y/o un aminoácido distinto de alanina en la posición 38, y/o un aminoácido distinto de glutamato en la posición 39, y/o un aminoácido distinto de glicina en la posición 40.

Por tanto, normalmente, el polipéptido mutante puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 39 con una sustitución en la posición 34, una sustitución en la posición 36, y opcionalmente una o más sustituciones en 35, 37, 38, 39 y/o 40. Es decir, el polipéptido mutante tendrá un aminoácido distinto de aspartato en la posición 34, un aminoácido distinto de arginina en la posición 36, y opcionalmente un aminoácido distinto de isoleucina en la posición 35 y/o un aminoácido distinto de alanina en la posición 37, y/o un aminoácido distinto de alanina en la posición 38, y/o un aminoácido distinto de glutamato en la posición 39, y/o un aminoácido distinto de glicina en la posición 40.

El polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede tener un aumento en la actividad dependiente de NADP(H) con respecto a dependiente de NAD(H) en comparación con la de un polipéptido de MDH de referencia. En dicha realización, dicho polipéptido muíante puede ser un polipéptido muíante que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación (por ejemplo una sustitución) de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39. Realizaciones adicionales con respecto a la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido mutante son como se describen en el presente documento anteriormente.

En el contexto de la invención, un polipéptido de referencia que tiene actividad de malato deshidrogenasa, también denominado un "polipéptido de MDH de referencia", puede ser NAD-MDH (EC 1.1.1.37). Un polipéptido de referencia que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede ser una malato deshidrogenasa de una fuente microbiana, tal como una levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae). Una malato deshidrogenasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 39 puede ser un polipéptido de referencia adecuado que tiene actividad de MDH.

La expresión "aumento en la actividad dependiente de NADP(H) con respecto a dependiente de NAD(H)" en el presente documento normalmente se refiere a la propiedad de un polipéptido mutante de mostrar un aumento en la actividad dependiente de NADP(H) con respecto a dependiente de NAD(H) en comparación con la de un polipéptido de MDH de referencia, por ejemplo en comparación con SEQ ID NO: 39. Es decir un polipéptido mutante puede mostrar un aumento en la relación entre la actividad dependiente de NADP(H) y de NAD(H) en comparación con la de un polipéptido de referencia. En el Ejemplo 5, la relación también se denomina "relación de especificidad NADPH:NADH".

En el contexto de la presente invención, los términos "actividad dependiente de NADP(H)" y "actividad específica de NADP(H)" tienen el mismo significado en el presente documento y se usan indistintamente. Lo mismo se aplica para los términos "actividad dependiente de NAD(H)" y "actividad específica de NAD(H)".

El término "actividad dependiente de NADP(H)" en el presente documento se refiere a la propiedad de una enzima para usar NADP(H) como el cofactor de rédox. La actividad dependiente de NADP(H) de la enzima se puede determinar por un ensayo de actividad enzimática, tal como se describe en el Ejemplo 5.

El término "actividad dependiente de NAD(H)" en el presente documento se refiere a la propiedad de una enzima para usar NAD(H) como el cofactor de rédox. La actividad dependiente de NAD(H) de la enzima se puede determinar por un ensayo de actividad enzimática, tal como se describe en el Ejemplo 5.

Un aumento del valor de la relación de especificidad promedio NADPH:NADH puede indicar, por ejemplo, una reducida actividad dependiente de NAD(H), un aumento de la actividad dependiente de NADP(H) o una combinación de los dos. En algunos casos, un aumento del valor de dicha relación se puede obtener con un mutante de MDH que tiene una actividad dependiente de NAD(H) similar o elevada en comparación con una MDH de referencia. En los últimos casos, puede ser que el mutante de MDH muestre tanto elevadas actividades dependientes de NAD(H) como de NADP(H).

El polipéptido de MDH mutante tendrá normalmente actividad de MDH modificada en términos de dependencia de cofactor modificado. Esta actividad dependiente de NAD(H) o de NADP(H) se puede modificar independientemente entre sí, por ejemplo disminuir, en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 %. Alternativamente, la propiedad se puede aumentar en al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 %, al menos, 200 %, al menos 500 %, al menos 700 %, al menos 1000 %, al menos 3000 %, al menos 5000 %, o al menos 6000 %.

En una realización específica, las actividades dependientes de NAD(H) y de NADP(H) del polipéptido de MDH mutante son ambas elevadas. La actividad dependiente de NAD(H) de dicho polipéptido de MDH mutante aumenta en al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 %, al menos, 200 %, o al menos 300 %. La actividad dependiente de NADP(H) de dicho polipéptido de MDH mutante aumenta en al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 %, al menos, 200 %, al menos 500 %, al menos 700 %, al menos 1000 %, al menos 3000 %, al menos 5000 %, o al menos 6000 %.

En otra realización, la actividad dependiente de NAD(H) del polipéptido de MDH mutante es aproximadamente la misma o se reduce en como máximo 5 %, como máximo 10 %, como máximo 20 %, como máximo 30 %, como máximo 40 %, como máximo 50 %, como máximo 60 %, como máximo 70 %, como máximo 80 % y la actividad dependiente de NADP(H) de dicho polipéptido de MDH mutante aumenta en al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 %, al menos, 200 %, al menos 500 %, al menos 700 %, al menos 1000 %, al menos 3000 %, al menos 5000 %, o al menos 6000 %.

En otra realización, la relación de especificidad de NADPH:NADH del polipéptido de MDH mutante aumenta en al menos 10 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos, 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 3000 %, al menos 5000 %, al menos 7000 %, o al menos 8000 %.

El porcentaje de disminución o aumento en este contexto representa el porcentaje de disminución o aumento en comparación con el polipéptido de MDH de referencia, por ejemplo el de SEQ ID NO: 39. El experto conoce bien cómo se pueden medir dichos cambios de porcentaje - es una comparación de la actividad, por ejemplo actividad dependiente de NAD(H) o de NADP(H), de la m Dh de referencia y la MDH mutante medida como se expone en los ejemplos.

En el contexto de la presente invención, el polipéptido mutante de MDH como se describe en el presente documento anteriormente puede ser una NAD(P)-malato deshidrogenasa mutante, tal como un NAD-MDH mitocondrial mutante, una NAD-MDH citosólica mutante, una NAD-MDH glioxisomal mutante, una NAD-MDH peroxisomal mutante, o una NADP-MDH cloroplásica mutante. Es decir, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa se puede obtener por introducción de una o más mutaciones en una NAD(P)-malato deshidrogenasa, tal como una NAD-MDH mitocondrial, NAD-MDH citosólica, NAD-MDH glioxisomal, n A d -MDH peroxisomal, o una NADP-MDH cloroplásica (denominándose la última los polipéptidos de MDH de molde para introducir dicha una o más mutaciones). Preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una NAD(H)-malato deshidrogenasa mutante (EC 1.1.1.37). Más preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una NAD(H)-malato deshidrogenasa peroxisomal mutante. Incluso más preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una NAD(H)-malato deshidrogenasa mutante de una levadura o un hongo. Incluso más preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una NAD(H)-malato deshidrogenasa mutante de una levadura u hongo, tal como S. cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii, Naumovozyma castellii, Naumovozyma dairenensis, Lachancea lanzarotensis, Zygosaccharomyces rouxii, Kazachstania africana, Candida tropicalis, Kluyveromyces marxianus, Scheffersomyces stipites, Talaromyces marneffei, Rasamsonia emersonii, Aspergillus n igero Trametes versicolor. Los siguientes códigos de la base de datos UniProt se refieren a polipéptidos de MDH molde de levadura y fúngicos adecuados (http://www.uniprot.org): E7NGH7, G8ZXS3, G0V668, W0VU18, G0WB63, A0A0W0D4X6, A0A0C7MME9, C5DQ42, C5DI45, H2AWW6, A0A090C493, J7R0C8, Q6CJP3, Q759M4, 12H037, C5M546, A7TL95, A0A0L0P3G3, Q6BM17, S8AW17, V5FMV2, A3LW84, A0A109UZS1, G8BVW8, G8BJ12, M3HPK4, A0A093UW53, B8MTP0, A0A0F4YPR0, C8V0H6, W6QNU3, A5DZ33, U1GAT6, G3B7S5, C4JPI7, A0A0F8UZY9, Q4WDM0, A0A093UPX3, B8ND04, A0A0M9VRI4, G7XZ98, Q5A5S6, M7S9E4, E4UYX5, A5DE02, A0A0J7BIJ5, A0A017SK11, G8Y7A1, A0A0G2EFQ2, R7S165, I1RFM4, R1EVC8, U4L6K9, A0A0L0P507, W7HM94, A5DGY9, F2QY33, A0A0G2JA24, UPI000462180C, C7Z9W6, E5AAQ2, B2VVR8, A0A0H2RCV1, A8Q524, A0A0E9N879, N1JA02, A0A0D1ZEE3, J5T1X5, W6MY07, C4Y826, G3AJA2, G9N6G5, A0A0K8L6L9, A3GH28, A8P7W6, K5W0T4, G1XT67, A0A0B7K175, B8MTP5, A0A0D1ZAS7, A0A0C3BQC4, K5Y2Q9, A0A0C3DSW4, A0A068S518, W2RPL2, A0A0H5C453, A0A074WKG5, G8JRX4, A0A0U1M134, H6C0V9, A0A0H5BZ30, M2UXR7, A0A0C9YJV6, A0A0C3S6T1, W1QK02, A0A0C2YFC4, A0A061AJ54, A0A086T183, W2RVT1, UPI0004623914, A0A0C9X7U1, UPI0001F26169, G7E054, A0A0C2S9T3, A0A067NIX1, L8FPM0, G3ALW4, A0A0D0AYX2, G0VJG3, A0A0D2NGY0, C1GLB8, W9X415, A0A0D0CDE8, S7Q8G0, A0A0C9TB51, R7YP89, A0A0C2W4H8, UPI000455FA04, A0A067NL73, A0A067STP4, W9WWP5, A0A0D7A9T7, A0A0D6R2E1, M2YLX9, G0W7D4, N1QJ61, G4TRY5, F0XJ10, A0A063BQQ6, A0A061HBX5, A0A0A1 PCT2, M1WIC4, A8QAQ2, A0A0C3N631, F2QTL7, A0A060S7U3, A0A0L0HTQ9, Q0CKY1, A0A0C2ZJ90, K5W527, I4Y5C3, R7YXZ2, F9XI12, A0A061J968, F9XL74, A0A0D0BEW9, A0A0C9WB72, F7WA21, A8NJ67, M2P8M6, W4KHW3, A0A0L1I2T4, UPI0004449A9D, P83778, C4Y9Q7, A0A0D7BHV7, A0A068RWX9, M2YWQ3, A0A137QV51, A0A0D0B6C2, I1BQQ7, S3DA07, Q4DXL5, G8Y022, A0A0C9W9B3, A0A0L6WJ49, A0A0L9SL52, D5GA85, A0A0N1J4Z6, J7S1G2, A0A0F4X5C6, Q6CIK3, A0A067QNN0, Q0UGT7, F8ND69, U5HIM0, J3NKC7, A0A061ATZ7, A5DSY0, Q9Y750, UPI0004F4119A, A0A086TL69, A0A0J0XSS4, UP10003F496E1, UP1000455F0EA, S7RXX1, A0A067NAG9, A0A0B7N3M5, E6ZKH0, C8V1V3, A7UFI6, T5AEM1, A0A072PGA9, A0A094EKH6, S8ADX4, G8C073, Q6BXI8, G2R916 y U9TUL6. Incluso más preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una NAD-MDH peroxisomal mutante de S. cerevisiae (MDH3).

Además, en la célula hospedadora recombinante de la invención, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede ser un mutante de una NAD(P)-malato deshidrogenasa homóloga o heteróloga. En una realización preferida, el mutante de MDH es un mutante de una NAD(P)-malato deshidrogenasa homóloga. Más preferentemente, el mutante de MDH es un mutante de una NAD(H)-malato deshidrogenasa homóloga (EC 1.1.1.37). Más preferentemente, el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es un mutante de una NAD(H)-malato deshidrogenasa peroxisomal homóloga.

En este contexto, el término "homólogo" o "endógeno", cuando se usa para indicar la relación entre una molécula (recombinante) del ácido nucleico o del polipéptido dada y un organismo hospedador o célula hospedadora dada, se entiende que significa que en la naturaleza la molécula del ácido nucleico o del polipéptido se produce por una célula hospedadora u organismo de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa.

El término "heterólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia del ácido nucleico o de aminoácidos que no existe de forma natural en una célula hospedadora. En otras palabras, la secuencia del ácido nucleico o de aminoácidos no es idéntica a la encontrada naturalmente en la célula hospedadora.

En una célula hospedadora recombinante de la presente invención, la secuencia nucleica que codifica dicho polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa se expresa en el citosol y el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es activo en el citosol. En algunos casos, la expresión citosólica se puede obtener por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal o mitocondrial. La presencia de una señal de direccionamiento peroxisomal o mitocondrial se puede determinar, por ejemplo, por el método desvelado por Schlüter et al., Nucleic Acid Research 2007, 35, D815-D822. Cuando el mutante de MDH es una NAD-MDH peroxisomal muíante de S. cerevisiae (por ejemplo, una MDH3 muíante), su SKL del extremo C se deleciona preferentemente de forma que sea activo en el citosol.

El polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa puede tener al menos 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido de MDH de referencia de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 39, por ejemplo al menos 85 % de identidad de secuencia con dicho polipéptido de MDH de referencia, tal como al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia con dicho polipéptido de MDH de referencia, al menos 95 % de identidad de secuencia con dicho polipéptido de MDH de referencia, al menos 98 % de identidad de secuencia con dicho polipéptido de MDH de referencia o al menos 99 % de identidad de secuencia con dicho polipéptido de MDH de referencia.

Se ha encontrado sorprendentemente que dicho polipéptido de MDH mutante como se describe en el presente documento anteriormente confiere un aumento en la producción de un ácido dicarboxílico en una célula hospedadora recombinante cuando dicho mutante se expresa (en exceso) en dicha célula hospedadora recombinante en comparación con el nivel de producción de una célula hospedadora recombinante equivalente que expresa (en exceso) una malato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 39.

Por consiguiente, así se proporciona una célula hospedadora recombinante que es capaz de producir o produce un ácido dicarboxílico y que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa como se describe en el presente documento anteriormente.

Una célula hospedadora recombinante de la invención es capaz de producir o produce un ácido dicarboxílico, tal como ácido málico, ácido fumárico y/o ácido succínico.

Los términos "ácido dicarboxílico" y "dicarboxilato", tales como "ácido succínico" y "succinato", tienen el mismo significado en el presente documento y se usan indistintamente, siendo el primero la forma hidrogenada del último.

La célula hospedadora recombinante de la invención producirá un aumento de la cantidad de un ácido dicarboxílico en comparación con una célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido de MDH de referencia de SEQ ID NO: 39. La producción de un ácido dicarboxílico se puede aumentar en al menos 5 %, 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 % al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % o más. El nivel de producción se puede expresar en términos de g/L, por lo que un aumento en el nivel de producción de un ácido dicarboxílico será evidente por un mayor nivel de producción en términos de g/L.

La célula hospedadora recombinante de la invención o un progenitor de dicha célula hospedadora puede ser cualquier tipo de célula hospedadora. Por consiguiente, están incluidas tanto células procariotas como eucariotas. Las células hospedadoras también pueden incluir, pero no se limitan a, estirpes celulares de mamífero, tales como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y estirpes celulares del plexo coroideo.

Una célula hospedadora adecuada de la invención puede ser una célula procariota. Preferentemente, la célula procariota es una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye tanto microorganismos Gram-negativos como Gram-positivos.

Las bacterias adecuadas se pueden seleccionar de, por ejemplo, Escherichia, Actinobacillus, Anabaena, Caulobactert, Gluconobacter, Mannheimia, Basfia, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus o Actinomycetes, tales como especies de Streptomyces y de Actinoplanes. Preferentemente, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, Actinobacillus succinogenes, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Mannheimia succinoproducens, Basfia succinoproducens, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Streptomyces clavuligerus, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

Una célula hospedadora según la invención puede ser una célula hospedadora eucariota. Preferentemente, la célula eucariota es una célula de mamífero, insecto, planta, fúngica o de alga. Más preferentemente, la célula eucariota es una célula fúngica. Una célula fúngica adecuada puede pertenecer, por ejemplo, a los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Pichia, Issatchenkia, Kloeckera, Schwanniomyces, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Rhizopus, Zygosaccharomyces, Pachysolen o Yamadazyma. Una célula fúngica puede pertenecer, por ejemplo,a una especie de Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus S. pastorianus, S. carlsbergensis, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Pichia stipidis, P. pastoris, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis, C. kruisei, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Issatchenkia orientalis, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus oryzae o Zygosaccharomyces bailii. En una realización, una célula fúngica de la presente invención es una levadura, por ejemplo que pertenece a una Saccharomyces sp , tal como una Saccharomyces cerevisiae.

Los ejemplos de células hospedadoras de levadura específicas incluyen C. sonorensis, K. marxianus, K. thermotolerans, C. methanesorbosa, Saccharomyces bulderi (S. bulderi), P. kudriavzevii, I. orientalis, C. lambica, C. sorboxylosa, C. zemplinina, C. geochares, P. membranifaciens, Z. kombuchaensis, C. sorbosivorans, C. vanderwaltii, C. sorbophila, Z. bisporus, Z. lentus, Saccharomyces bayanus (S. bayanus), D. castellii, C, boidinii, C. etchellsii, K. lactis, P. jadinii, P. anomala, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149 (designación NRRL), Candida ethanolica, P. deserticola, P. membranifaciens, P. fermentans y Saccharomycopsis crataegensis (S. crataegensis). Las cepas adecuadas de K. marxianus y C. sonorensis incluyen las descritas en los documentos de patente WO 00/71738 A1, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152 A2 y WO 03/102201A2. Las cepas adecuadas de I. orientalis son la cepa de ATCC 32196 y la cepa de ATCC PTA-6648. En la invención, la célula hospedadora puede ser una Crabtree negativa como una cepa no mutante. El efecto Crabtree se define como la aparición de metabolismo fermentativo en condiciones aerobias debido a la inhibición del consumo de oxígeno por un microorganismo cuando se cultiva a altas tasas de crecimiento específicas (efecto a largo plazo) o en presencia de altas concentraciones de glucosa (efecto a corto plazo). Los fenotipos de Crabtree negativo no presentan este efecto, y así son capaces de consumir oxígeno incluso en presencia de altas concentraciones de glucosa o a altas tasas de crecimiento.

La célula eucariota puede ser una célula fúngica filamentosa. Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, GB). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento de hifas y el catabolismo del carbono es aerobio estricto. Las cepas fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a, cepas de Acremonium, Aspergillus, Agaricus, Aureobasidium, Cryptococcus, Corynascus, Chrysosporium, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Monascus, Mucor, Myceliophthora, Mortierella, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete Podospora, Pycnoporus, Rhizopus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Rasamsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes y Trichoderma. Las cepas fúngicas filamentosas preferidas que pueden servir de células hospedadoras pertenecen a la especie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Rasamsonia emersonii (conocida antiguamente como Talaromyces emersonii), Aspergillus sojae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophtora thermophyla. Las células hospedadoras de referencia para la comparación de características de fermentación de células transformadas y sin transformar incluyen, por ejemplo, Aspergillus niger CBS120.49, CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC16868, ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, Aspergillus fumigatus AF293 (CBS101355), P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Thielavia terrestris NRRL8126, Talaromyces emersonii CBS 124.902, Rasamsonia emersonii CBS393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225, ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921, ATCC 56765, ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 y derivados de todas estas cepas.

Una célula hospedadora más preferida pertenece al género Aspergillus, más preferentemente la célula hospedadora pertenece a la especie Aspergillus niger. Cuando la célula hospedadora según la invención es una célula hospedadora de Aspergillus niger, la célula hospedadora es preferentemente CBS 513.88, CBS124.903 o un derivado de las mismas.

En una realización preferida, una célula hospedadora según la invención es una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste en cepas de Candida, Hansenula, Issatchenkia, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, o una célula fúngica filamentosa seleccionada del grupo que consiste en células fúngicas filamentosas pertenece a una especie de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora, Penicillium, Talaromyces, Rasamsonia, Thielavia, Fusarium o Trichoderma.

Una célula hospedadora de la invención puede ser cualquier cepa no mutante que produzca un ácido dicarboxílico. Además, una célula hospedadora adecuada puede ser una célula que ha sido obtenida y/o mejorada sometiendo una célula parental o no mutante de interés a un tratamiento mutagénico clásico o a transformación recombinante de ácidos nucleicos. Así, una célula hospedadora adecuada ya puede ser capaz de producir el ácido dicarboxílico. Sin embargo, la célula también se puede proporcionar con una construcción de expresión homóloga o heteróloga que codifica uno o más polipéptidos implicados en la producción del ácido dicarboxílico.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, una célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender un polipéptido mutante de MDH y una vía reductora activa de ácido tricarboxílico (TCA) de fosfoenolpiruvato o piruvato en succinato.

Por consiguiente, además de un ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante de MDH, una célula hospedadora de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que codifica uno o más de una piruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxicinasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una isocitrato liasa, una malato sintasa, una fumarato reductasa y/o un transportador de ácido dicarboxílico. Preferentemente, una o más de dichas enzimas se expresan (en exceso) y son activas en el citosol.

Así, una célula hospedadora recombinante de la invención puede expresar en exceso una secuencia de nucleótidos homologa o heterólogo adecuada que codifica una enzima endógena y/o heteróloga que cataliza una reacción en la célula que da como resultado un aumento del flujo hacia un ácido dicarboxílico, tal como ácido málico, ácido fumárico y/o ácido succínico.

Una célula hospedadora recombinante de la invención puede expresar en exceso una secuencia del ácido nucleico endógena o heteróloga como se describe en el presente documento a continuación.

Una célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender una modificación genética con una piruvato carboxilasa (PYC), que cataliza la reacción de piruvato en oxaloacetato (EC 6.4.1.1). La piruvato carboxilasa puede ser activa, por ejemplo, en el citosol tras la expresión del gen. Por ejemplo, la célula hospedadora expresa en exceso una piruvato carboxilasa, por ejemplo, se expresa en exceso una piruvato carboxilasa endógena u homóloga. La célula hospedadora fúngica recombinante según la presente invención puede ser genéticamente modificada con una piruvato carboxilasa que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 46.

Preferentemente, la célula hospedadora recombinante expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato (PEP) carboxicinasa en el citosol. Preferentemente, una secuencia de nucleótidos que codifica una PEP carboxicinasa se expresa en exceso. La PEP carboxicinasa (EC 4.1.1.49) es preferentemente una enzima heteróloga, preferentemente derivada de bacterias, más preferentemente la enzima que tiene actividad de PEP carboxicinasa deriva de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., o Anaerobiospirillum sp., más preferentemente Mannheimia succiniciproducens. Un gen que codifica una PEP carboxicinasa se puede expresar en exceso y ser activo en el citosol de una célula fúngica. Preferentemente, una célula fúngica recombinante según la presente invención se modifica genéticamente con una PEP carboxicinasa que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.

Preferentemente, la célula hospedadora recombinante expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilasa en el citosol. Preferentemente, una secuencia de nucleótidos que codifica una PEP carboxilasa se expresa en exceso. La PEP carboxilasa (EC 4.1.1.31) es preferentemente una enzima heteróloga, preferentemente derivada de bacterias.

En una realización, la célula hospedadora recombinante se modifica además genéticamente con un gen que codifica una malato deshidrogenasa (MDH) activa en el citosol tras la expresión del gen. La expresión citosólica se puede obtener por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal. La malato deshidrogenasa se puede expresar en exceso. Una MDH citosólica puede ser cualquier malato deshidrogenasa homóloga o heteróloga adecuada, que cataliza la reacción de oxaloacetato en malato (EC 1.1.1.37), por ejemplo, derivada de S. cerevisiae.

Preferentemente, la MDH es MDH3 de S. cerevisiae, más preferentemente una que tiene una deleción de SKL del extremo C de forma que es activa en el citosol. Preferentemente, la célula fúngica recombinante según la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.

En otra realización, la célula hospedadora recombinante de la presente divulgación se modifica además genéticamente con un gen que codifica una fumarasa, que cataliza la reacción de ácido málico en ácido fumárico (EC 4.2.1.2). Un gen que codifica fumarasa puede derivar de cualquier origen adecuado, preferentemente de origen microbiano, por ejemplo una levadura tal como Saccharomyces o un hongo filamentoso, tal como Rhizopus oryzae, o una bacteria tal como una Escherichia coli. La célula hospedadora de la presente divulgación puede expresar en exceso una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarasa. La fumarasa puede ser activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal. Se encontró que la actividad citosólica de una fumarasa produjo una alta productividad de un ácido dicarboxílico por una célula fúngica.

Preferentemente, la célula hospedadora recombinante de la presente invención expresa en exceso una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarasa que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 67.

En otra realización, la célula hospedadora recombinante se modifica genéticamente con cualquier gen heterólogo u homólogo adecuado que codifique una fumarato reductasa dependiente de NAD(H), catalizando la reacción de fumarato en succinato (EC 1.3.1.6). La fumarato reductasa dependiente de NAD(H) puede ser una enzima heteróloga, que puede derivar de cualquier origen adecuado, por ejemplo bacterias, hongos, protozoos o plantas. Una célula fúngica de la presente divulgación comprende una fumarato reductasa heteróloga dependiente de NAD(H), preferentemente derivada de una Trypanosoma sp., por ejemplo una Trypanosoma brucei. En una realización, la fumarato reductasa dependiente de NAD(H) se expresa y es activa en el citosol, por ejemplo por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal. La célula hospedadora puede expresar en exceso un gen que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD(H).

Preferentemente, la célula hospedadora recombinante según la presente invención se modifica genéticamente con una fumarato reductasa dependiente de NAD(H), que tiene al menos al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También preferentemente, la célula hospedadora según la presente invención se modifica genéticamente con un polipéptido de variante que tiene actividad de fumarato reductasa como se desvela en el documento de patente WO2015/086839.

En otra realización, la célula hospedadora recombinante de la invención expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora de ácido dicarboxílico. Preferentemente, la proteína transportadora de ácido dicarboxílico se expresa en exceso. Una proteína transportadora de ácido dicarboxílico puede ser cualquier proteína homóloga o heteróloga adecuada. Preferentemente, la proteína transportadora de ácido dicarboxílico es una proteína heteróloga. Una proteína transportadora de ácido dicarboxílico puede derivar de cualquier organismo adecuado, preferentemente de levadura u hongos tales como Schizosaccharomyces pom beo Aspergillus niger. Preferentemente, una proteína transportadora de ácido dicarboxílico es una proteína transportadora de ácido dicarboxílico/ácido málico, por ejemplo, de Aspergillus niger que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

La célula hospedadora recombinante puede comprender además una modificación genética con un gen que codifica una isocitrato liasa (EC 4.1.3.1), que puede ser cualquier enzima heteróloga u homóloga adecuada. La isocitrato liasa se puede obtener, por ejemplo, de Kluyveromyces lactis o Escherichia coli. La célula hospedadora recombinante, modificada genéticamente con una isocitrato liasa, puede tener al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 51.

La célula hospedadora recombinante puede comprender además una modificación genética con una malato sintasa (EC 2.3.3.9). La malato sintasa se puede expresar en exceso y/o es activa en el citosol, por ejemplo, por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal. En el caso de que la malato sintasa sea una malato sintasa de S. cerevisiae, por ejemplo, la malato sintasa nativa se altera por la deleción de la secuencia de SKL carboxiterminal. La célula hospedadora recombinante, modificada genéticamente con una malato sintasa, puede tener al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 52.

En otra realización, la célula hospedadora recombinante de la invención desvelada en el presente documento comprende una alteración de un gen a piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1), que cataliza la reacción de piruvato en acetaldehído.

En otra realización, la célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender una alteración de un gen que codifica una enzima de la vía de fermentación de etanol. Un gen que codifica una enzima de una vía de fermentación de etanol puede ser piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1), que cataliza la reacción de piruvato en acetaldehído, o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), que cataliza la reacción de acetaldehído en etanol. Preferentemente, una célula hospedadora de la invención comprende una alteración de uno, dos o más genes que codifican una alcohol deshidrogenasa. En el caso de que la célula fúngica sea una levadura, por ejemplo S. cerevisiae, la levadura comprende preferentemente una alteración de uno o más genes de alcohol deshidrogenasa (adh1 adh2, adh3, adh4, adh5, adh6).

Alternativamente o además, la célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender al menos un gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que no es funcional. Se usa un gen de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que no es funcional en el presente documento para describir una célula eucariota, que comprende una actividad reducida de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, por ejemplo por mutación, alteración o deleción del gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, dando como resultado una reducción de la formación de glicerol en comparación con una célula natural. En el caso de que la célula fúngica sea una levadura, por ejemplo S. cerevisiae, la levadura comprende preferentemente una alteración de uno o más genes de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (gpd1, gpd2, gut2).

Alternativamente o además de lo anterior, la célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender al menos un gen que codifica una NADH deshidrogenasa externa mitocondrial que no es funcional. Se usa un gen de NADH deshidrogenasa externo mitocondrial que no es funcional en el presente documento para describir una célula eucariota, que comprende una actividad de NADH deshidrogenasa reducida, por ejemplo por mutación, alteración o deleción del gen que codifica la NADH deshidrogenasa externa mitocondrial. En el caso de que la célula fúngica sea una levadura, por ejemplo S. cerevisiae, la levadura comprende preferentemente una alteración de uno o más genes de NADH deshidrogenasa externa mitocondrial (nde1, nde2).

Alternativamente o además de lo anterior, la célula hospedadora recombinante de la invención puede comprender al menos un gen que codifica una aldehído deshidrogenasa que no es funcional. Un gen de aldehído deshidrogenasa que no es funcional se usa en el presente documento para describir una célula eucariota, que comprende una actividad de aldehído deshidrogenasa reducida, por ejemplo por mutación, alteración o deleción del gen que codifica la aldehído deshidrogenasa. En el caso de que la célula fúngica sea una levadura, por ejemplo S. cerevisiae, la levadura comprende preferentemente una alteración de uno o más genes de aldehído deshidrogenasa (ald2, ald3, ald4, ald5, ald6).

Preferentemente, la célula hospedadora recombinante de la presente invención es una célula fúngica recombinante. Más preferentemente, la célula hospedadora de la presente invención es una célula de levadura recombinante. Las realizaciones preferidas de la célula fúngica recombinante o célula de levadura recombinante son como se describen en el presente documento anteriormente para la célula hospedadora recombinante.

En algunas realizaciones de la invención, la célula hospedadora recombinante es una célula de levadura recombinante que es capaz de producir un ácido dicarboxílico como se describe en el presente documento anteriormente y que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa como se detalló en el presente documento anteriormente. Dicho mutante de MDH puede ser un mutante de un polipéptido de MDH natural homólogo o heterólogo. En una realización preferida, dicho mutante de MDH es un mutante de un polipéptido de MDH homólogo. En una realización incluso más preferida, la célula de levadura recombinante es un Saccharomyces recombinante, por ejemplo S. cerevisiae, y el mutante de MDH es un mutante de una MDH homóloga, por ejemplo MDH2 o MDH3. En una realización más específica, dicha célula de levadura recombinante comprende una secuencia nucleica que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa como se define en la Tabla 1 y en donde el resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 se selecciona de glicina (G) o serina (S).

Las técnicas genéticas estándar, tales como expresión en exceso de enzimas en las células hospedadoras, modificación genética de células hospedadoras, o técnicas de hibridación, son métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001) o Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, NY, 1987). Los métodos de transformación, modificación genética de células hospedadoras fúngicas se conocen de, por ejemplo, los documentos de patente EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 y WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186.

Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato). Dichos oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades alteradas de apareamiento de bases o elevada resistencia a nucleasas.

El término "construcción de ácidos nucleicos" se refiere en el presente documento a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, que se aísla de un gen que existe de forma natural o, más normalmente, que se ha modificado para contener segmentos de ácido nucleico que se combinan y yuxtaponen de un modo que no existiría de otro modo en la naturaleza. El término construcción de ácidos nucleicos es sinónimo con el término "casete de expresión" cuando la construcción de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora, en donde dichas secuencias de control están operativamente unidas a dicha secuencia codificante.

Como se usa en el presente documento, el término "operativamente unido" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótidos (o secuencias codificantes o secuencia del ácido nucleico) en una relación funcional. Una secuencia del ácido nucleico está "operativamente unida" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona controlando la transcripción de uno o más genes, situados aguas arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción del gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN conocida por un experto en la técnica. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación medioambiental o de desarrollo.

Un promotor que se podría usar para lograr la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima, tal como una malato deshidrogenasa o cualquier otra enzima introducida en la célula hospedadora de la invención, puede ser no nativa para una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima a expresar, es decir, un promotor que es heterólogo para la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) con la que está operativamente unida. Preferentemente, el promotor es homólogo, es decir, endógeno para la célula hospedadora.

Los promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, así como promotores manipulados, que son bien conocidos por el experto en la técnica. Los promotores adecuados en las células hospedadoras eucariotas pueden ser GAL7, GAL10, o GAL 1, CYC1, HIS3, a Dh 1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, t Pi y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC, GPD1, PGK1, TEF1 y TDH.

Normalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima comprende un ''terminador''. Se puede usar en la presente invención cualquier terminador, que sea funcional en la célula eucariota. Los terminadores preferidos se obtienen de genes naturales de la célula hospedadora. Las secuencias terminadoras adecuadas se conocen bien en la técnica. Preferentemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que previenen la descomposición de ARNm mediada por no sentido en la célula hospedadora de la invención (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).

La construcción de ácidos nucleicos se puede incorporar en un "vector", tal como un vector de expresión y/o en una célula hospedadora para efectuar la expresión del polipéptido a expresar.

El vector de expresión puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus), que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de malato deshidrogenasa. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que el vector se va a introducir. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Si está previsto para su uso en una célula hospedadora de origen fúngico, una construcción episómica adecuada de ácidos nucleicos se puede basar, por ejemplo, en la levadura 2g o plásmidos pKD1 (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9:968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489).

Alternativamente, el vector de expresión puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en el que se ha integrado. El vector de clonación integrante se puede integrar en un locus aleatorio o en un locus diana predeterminado en los cromosomas de la célula hospedadora. En una realización preferida de la invención, el vector de clonación integrante comprende un fragmento de ADN, que es homólogo a una secuencia de ADN en un locus diana predeterminado en el genoma de la célula hospedadora para el direccionamiento de la integración del vector de clonación hacia su locus predeterminado. Para promover la integración dirigida, el vector de clonación se linealiza preferentemente antes de la transformación de la célula. La linealización se realiza preferentemente de forma que al menos un extremo del vector de clonación, pero preferentemente cualquiera, esté flanqueado por secuencias homólogas al locus diana. La longitud de las secuencias homólogas que flanquean el locus diana tiene preferentemente al menos 20 pb, al menos 30 pb, al menos 50 pb, al menos 0,1 kb, al menos 0,2 kb, al menos 0,5 kb, al menos 1 kb, al menos 2 kb o más. La eficiencia de la integración dirigida en el genoma de la célula hospedadora, es decir, la integración en un locus diana predeterminado, aumenta por capacidades de recombinación homóloga aumentada de la célula hospedadora.

Las secuencias de ADN flanqueantes homólogas en el vector de clonación, que son homólogas al locus diana, derivan de un locus altamente expresado que significa que derivan de un gen, que es capaz de un alto nivel de expresión en la célula hospedadora. Un gen capaz de un alto nivel de expresión, es decir, un gen altamente expresado, se define en el presente documento como un gen cuyo ARNm puede constituir al menos 0,5 % (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo en condiciones inducidas, o alternativamente, un gen cuyo producto génico puede constituir al menos 1 % (p/p) de la proteína celular total, o, en caso de un producto génico secretado, se puede secretar hasta un nivel de al menos 0,1 g/L.

Una construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión se puede ensamblar in vivo en una célula hospedadora de la invención y, opcionalmente, integrar en el genoma de la célula en una única etapa (véase, por ejemplo, el documento de patente WO2013/076280)

Más de una copia de una construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión de la invención se puede insertar en la célula hospedadora para aumentar la producción del polipéptido que tiene actividad de malato deshidrogenasa (expresión en exceso) codificada por la secuencia del ácido nucleico comprendida dentro de la construcción de ácidos nucleicos. Esto se puede hacer, preferentemente integrando en su genoma dos o más copias del ácido nucleico, más preferentemente dirigiendo la integración del ácido nucleico en un locus altamente expresado definido como se ha definido anteriormente.

Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc.

Una construcción de ácidos nucleicos y/o vector de expresión de la invención se puede introducir en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o de transfección. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora bien conocida por los expertos en la técnica. Los métodos adecuados de transformación o transfección de células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001), Davis et al. (Basic Methods in Molecular Biology, ia edición, Elsevier, 1986) y otros manuales de laboratorio.

La expresión citosólica de las enzimas descritas anteriormente se puede obtener por deleción de una señal de direccionamiento peroxisomal o mitocondrial. La presencia de una señal de direccionamiento peroxisomal o mitocondrial se puede determinar, por ejemplo, por el método desvelado por Schlüter et al. (Schlüter et al., 2007, Nucleic Acid Research 35: D815-D822).

Se puede realizar una comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. El experto conocerá el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la identidad entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y de Wunsch para el alineamiento de dos secuencias (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos se pueden alinear por el algoritmo. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Con el fin de la presente invención, se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para la secuencia de nucleótidos, se usa EDNAFULL. Los parámetros opcionales usados son una penalización por hueco abierto de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan algoritmos diferentes.

Después del alineamiento por el programa NEEDLE como se ha descrito anteriormente, el porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia problema y una secuencia de la invención se calcula del siguiente modo: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico o nucleótido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento después de la resta del número total de huecos en el alineamiento. La identidad definida como en el presente documento se puede obtener a partir de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se etiqueta en la salida del programa como "identidad más larga".

Las secuencias del ácido nucleico y de proteínas de la presente invención se pueden usar además como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda por comparación con bases de datos públicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de familias o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando los programas blastn y blastx (versión 2.2.31 o superiores) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden realizar con el programa blastn, puntuación = 100, tamaño de palabra = 11 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas con BLAST se pueden realizar con el programa blastx, puntuación = 50, tamaño de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, blastx y blastn). Véase la página de inicio del Centro Nacional para Información Biotecnológica en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Según la presente invención, también se proporciona un proceso para la producción de un ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico, proceso que comprende fermentar la célula hospedadora recombinante de la invención como se describe en el presente documento anteriormente, en condiciones adecuadas para la producción del ácido dicarboxílico, y opcionalmente, recuperar el ácido dicarboxílico del medio de fermentación.

En el proceso, la célula hospedadora recombinante de la invención se fermenta en un recipiente que comprende un medio de fermentación adecuado. El término fermentar, fermentación o fermentado y similares, como se usa en el presente documento, se refiere a la producción microbiana de compuestos, aquí ácidos dicarboxílicos a partir de hidratos de carbono.

Preferentemente, el producto de fermentación es un ácido dicarboxílico, preferentemente ácido málico, ácido fumárico y/o ácido succínico, preferentemente ácido succínico.

Una fermentación discontinua se define en el presente documento como una fermentación en donde todos los nutrientes se añaden al comienzo de una fermentación.

Una fermentación de lotes alimentados es una fermentación discontinua en donde los nutrientes se añaden durante la fermentación. Los productos en una fermentación discontinua y de lotes alimentados se pueden recoger en un momento adecuado, por ejemplo cuando se agotan uno o más nutrientes.

Una fermentación continua es una fermentación en donde los nutrientes se añaden continuamente a la fermentación y en donde los productos se retiran continuamente de la fermentación.

En una realización, la fermentación de la célula hospedadora en el proceso de la invención se lleva a cabo en condiciones limitantes de hidratos de carbono. Como se usa en el presente documento, las condiciones limitantes de hidratos de carbono se definen como el mantenimiento de la concentración de hidratos de carbono por debajo de 10 g/L, por ejemplo, aproximadamente 5 g/L.

El proceso para la producción de ácido dicarboxílico según la presente invención se puede llevar a cabo en cualquier volumen y escala adecuada, preferentemente en una escala industrial. La escala industrial se define en el presente documento como un volumen de al menos 10, o 100 litros, preferentemente al menos 1 metro cúbico, preferentemente al menos 10, o 100 metros cúbicos, preferentemente al menos 1000 metros cúbicos, normalmente inferior a 10.000 metros cúbicos.

La fermentación de la célula hospedadora recombinante en el proceso de la invención se puede llevar a cabo en cualquier medio de fermentación adecuado que comprende una fuente de nitrógeno adecuada, hidrato de carbono y otros nutrientes requeridos para el crecimiento y la producción de un ácido dicarboxílico en el proceso de la invención. Un hidrato de carbono adecuado en el proceso de fermentación según la invención puede ser glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa o maltosa.

En una realización, el proceso de fermentación se lleva a cabo bajo una presión parcial de CO²de entre 5 % y 60 %, preferentemente aproximadamente 50 %.

El pH durante el proceso para la producción de ácido dicarboxílico normalmente se reduce durante la producción del ácido dicarboxílico. Preferentemente, el pH en el proceso para la producción de ácido dicarboxílico varía entre 1 y 5, preferentemente entre 1,5 y 4,5, más preferentemente entre 2 y 4.

En otra realización preferida, el proceso según la presente invención comprende una etapa de precultivar la célula hospedadora en condiciones aerobias en presencia de un hidrato de carbono. Preferentemente, la fermentación de la célula hospedadora durante el precultivo se lleva a cabo a un pH de entre 4 y 6. Preferentemente, el hidrato de carbono durante el precultivo es un hidrato de carbono no represor, preferentemente galactosa. Se ha encontrado ventajoso precultivar las células hospedadoras en un hidrato de carbono no represor, puesto que esto previene que ocurra la represión de la glucosa, que puede influir negativamente en la cantidad de biomasa producida. Además, se ha encontrado que una etapa de precultivar células hospedadoras en condiciones aerobias da como resultado un mayor rendimiento de la biomasa y un crecimiento más rápido. Preferentemente, el precultivo se lleva a cabo en modo discontinuo.

Se lleva a cabo normalmente una etapa de propagación para producir una elevada biomasa, preferentemente en condiciones limitantes de hidratos de carbono.

El proceso de producción de un ácido dicarboxílico se puede llevar a cabo a cualquier temperatura adecuada. Una temperatura adecuada puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 grados Celsius, por ejemplo entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 grados Celsius.

En una realización, el proceso de la invención se lleva a cabo de tal forma que al menos una porción de las células hospedadoras se reutilice, es decir, se recircula. Las células se pueden recircular de nuevo al recipiente original o a un segundo recipiente. Preferentemente, el medio en el que las células hospedadoras recirculadas se introducen se complementa con una vitamina y/o un oligoelemento.

En una realización preferida, el medio de fermentación comprende una cantidad de ácido succínico de entre 1 y 150 g/L, preferentemente entre 5 y 100 g/L, más preferentemente entre 10 y 80 g/L o entre 15 y 60 g/L de ácido succínico. En cualquier caso, la célula hospedadora recombinante de la invención será normalmente capaz de acumular más ácido succínico en el medio de fermentación en comparación con una célula hospedadora que ha sido modificada con un polipéptido de MDH de referencia, por ejemplo el de SEQ ID NO: 39.

El proceso para la producción de un ácido dicarboxílico puede comprender además recuperar el ácido dicarboxílico. La recuperación del ácido dicarboxílico se puede llevar a cabo por cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo por cristalización, precipitación de amonio, tecnología de intercambio iónico, centrifugación o filtración, o cualquier combinación adecuada de estos métodos.

En una realización preferida, la recuperación del ácido dicarboxílico comprende cristalizar el ácido dicarboxílico y formar cristales de ácido dicarboxílico. Preferentemente, la cristalización del ácido dicarboxílico comprende retirar parte del medio de fermentación, preferentemente por evaporación, para obtener un medio concentrado.

El ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico, se puede recuperar cristalizando el ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico, de una disolución acuosa que tiene un pH de entre 1 y 5 y que comprende ácido succínico, que comprende evaporar parte de la disolución acuosa para obtener una disolución concentrada, reducir la temperatura de la disolución concentrada hasta un valor de entre 5 y 35 grados Celsius, en donde se forman los cristales de ácido succínico. Preferentemente, la cristalización comprende llevar la temperatura del medio concentrado hasta una temperatura de entre 10 y 30 grados Celsius, preferentemente entre 15 y 25 grados Celsius. Preferentemente, el medio de fermentación tiene un pH de entre 1,5 y 4,5, preferentemente entre 2 y 4.

Se ha encontrado que la cristalización del ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico, a temperaturas más altas, tales como entre 10 y 30 grados Celsius, da como resultado cristales de un ácido dicarboxílico, tales como ácido succínico, con una menor cantidad de impurezas, tales como ácido orgánico, proteína, color y/u olor, que los cristales de un ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico, que se cristalizaron a una temperatura más baja inferior a 10 grados.

Otra ventaja de la cristalización del ácido succínico a una temperatura más alta es que requiere una menor cantidad de energía para enfriar la disolución acuosa en comparación con un proceso en donde la cristalización del ácido dicarboxílico se lleva a cabo por debajo de 10 o 5 grados Celsius, dando como resultado una proceso más económico y sostenible.

Preferentemente, la cristalización del ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico, comprende una etapa de lavar los cristales de ácido dicarboxílico. El ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico, se puede cristalizar directamente en el medio de fermentación que tiene un pH de entre 1 y 5 hasta una pureza de al menos 90 % p/p, preferentemente al menos 95, 96, 97, o al menos 98 %, o 99 a 100 % p/p.

En una realización preferida, el proceso para la producción de un ácido dicarboxílico comprende además usar el ácido dicarboxílico en un proceso industrial.

Preferentemente, el ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico, que se prepara en el proceso según la presente invención, se convierte además en un producto deseable. Un producto deseable puede ser, por ejemplo, un polímero, tal como ácido polibutilensuccínico (PBS), un anticongelante, un aditivo alimentario, un aditivo cosmético o un tensioactivo. Es decir, la invención proporciona un método para la producción de un producto, por ejemplo, un polímero, tal como ácido polibutilensuccínico (PBS), un anticongelante, un aditivo alimentario, un aditivo cosmético o un tensioactivo, método que comprende: producir un ácido dicarboxílico como se describe en el presente documento; y usar dicho ácido dicarboxílico en la producción de dicho producto.

Una referencia en el presente documento a un documento de patente u otra materia que se proporciona como estado de la técnica no debe ser considerada como una admisión de que ese documento o materia fuera conocido o que la información que contiene fuera parte del conocimiento general común como en la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos:

EJEMPLOS

Materiales y métodos generales

Procedimientos de ADN

Se llevaron a cabo procedimientos de ADN convencionales como se describe en cualquier parte (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), a menos que se estableciera de otro modo. Se amplificó ADN usando la enzima de corrección la polimerasa Phusion (New England Biolabs, EE. UU.) según instrucciones del fabricante. Las enzimas de restricción fueron de Invitrogen o New England Biolabs.

Fermentación en placas de microtitulación (MTP) de cepas de producción de ácido dicarboxílico

Para determinar la producción de ácido dicarboxílico, se cultivaron por triplicado cepas en placas de microvaloración en agitadores de humedad (Infors) durante 3 días a 30 grados a 550 rpm y 80 % de humedad. El medio se basó en medio Verduyn (Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, 1992 Jul;8(7):501-517), pero las modificaciones en la fuente de carbono y de nitrógeno se hicieron como se describe en el presente documento a continuación.

Composición del medio de precultivo para MTP

a Disolución de oligoelementos

b Disolución de vitaminas

Se usaron 80 microlitros de precultivo para inocular 2,5 mL de medio con 1,5 % de galactosa como fuente de carbono en placas de 24 pocillos. Los cultivos se cultivaron durante 72 horas en humedad (Infors) a 30 °C, 550 rpm, 80 % de humedad. Después de generar biomasa, se inició un experimento de producción resuspendiendo células en 2,5 mL de medio mineral con glucosa como fuente de carbono. Los principales cultivos se incubaron en agitadores de humedad (Infors) a 30 grados a 550 rpm y 80 % de humedad y se tomaron muestras después de 48 horas de cultivo.

Análisis de metabolitos de muestras de MTP por RMN

Para el análisis de metabolitos de muestras de MTP, se mezclan 90 microlitros de sobrenadante de muestras de fermentación con 10 microlitros de patrón de RMN (20 g/L de ácido maleico) y 100 microlitros de 10 % de disolución de D²O. Las muestras se liofilizan y posteriormente se disuelven en 1 mL de D²O.

Se registran los espectros de RMN 1H 1D en un espectrómetro BEST Bruker Avance III, que funciona a una frecuencia protónica de 500 MHz, equipado con una criosonda enfriada con He, usando un programa de impulsos sin supresión de agua (ZG) a una temperatura de 300 K, con un impulso de excitación de 90 grados, tiempo de adquisición de 2,0 segundos y un retraso en la relajación de 40 segundos. El número de barridos se estableció en 8.

La concentración de ácido málico [en g/L] se calcula basándose en las siguientes señales (5 con respecto a ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico):

Ácido málico: Dependiendo del pH y el solapamiento de las señales de a-CH2 y CH(OH) con otros compuestos, se elige una de las tres señales de ácido málico para la cuantificación, a-CH(A) (2,92 ppm, n=1 H, doblete doble o dd), a-CH(X) (2,85 ppm, n=1 H, dd) o CH(OH) (4,6 ppm, n=1 H, dd).

La concentración de ácido succínico [en g/L] se calcula basándose en las siguientes señales (5 con respecto a ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico):

Ácido succínico: señal de ácido succínico a 2,67 ppm (s, 4 H)

La señal usada para el patrón: pico de ácido maleico aproximadamente 6,3 ppm (s, 2 H).

La cuantificación por RMN se describe por Bharti et al., 2012, TrAC Trends in Analytical Chemistry 35:5-26.

Ejemplo 1: Construcción de la cepa SUC-1029

Se usó la cepa CEN.PK 113-7D (MATa HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) como punto de partida para construir la cepa SUC-1029. Se transformó un gen de fumarasa de Rhyzopus oryzae (FUMR) en la cepa CEN.PK113-7D como se describe a continuación.

Generación de fragmentos de PCR

Se obtuvo el fragmento de PCR 9 por amplificación por PCR de SEQ ID NO: 34 usando cebadores que amplifican toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 34. SEQ ID NO: 34 describe un polinucleótido sintético que contiene la secuencia de nucleótidos de fumarasa (FUMR) de Rhyzopus oryzae como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065779. La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. La expresión del gen FUMR está controlada por el promotor TDH1 (600 pb directamente antes del codón de iniciación del gen TDH1) y el terminador TDH1 (300 pb directamente después del codón de terminación del gen TDH1). El promotor TDH1 y las secuencias terminadoras de TDH1 que controlan la expresión de FUMR son secuencias nativas derivadas de Saccharomyces cerevisiae S288C. La región de 599 pb en el extremo 5' de SEQ ID NO: 34, en la dirección 5' del promotor TDH1, es una región homóloga al locus YPRCtau3.

Se obtuvo el fragmento de PCR 10 por amplificación por PCR de SEQ ID NO: 35 usando cebadores que amplifican toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 35 describe un polinucleótido sintético que contiene parte de la secuencia del plásmido pSUC227, descrita en el documento de patente PCT/EP2013/055047. El extremo 5' de SEQ ID NO: 35 contiene el solapamiento con el extremo 3' de SEQ ID NO: 34. El extremo 3' de SEQ ID NO: 35 contiene el solapamiento con el extremo 5' de SEQ ID NO: 36.

Se obtuvo el fragmento de PCR 11 por amplificación por PCR de SEQ ID NO: 36 usando cebadores que amplifican toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 36. SEQ ID NO: 36 describe un polinucleótido sintético que contiene parte de la secuencia del plásmido pSUC225, descrita en el documento de patente PCT/EP2013/055047. El extremo 3' de SEQ ID NO: 36 contiene el solapamiento con el extremo 5' de SEQ ID NO: 37.

Se obtuvo el fragmento de PCR 12 por amplificación por PCR de SEQ ID NO: 37 usando cebadores que amplifican toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37. SEQ ID NO: 37 describe un polinucleótido sintético homólogo al locus YPRCtau3.

Se purificaron los fragmentos de PCR 9 a 12 usando el kit DNA Clean & Concentrator™-25 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Transformación en CEN.PK113-7D para construir la cepa SUC-1029

Se hizo la transformación de levadura por un método conocido por los expertos en la técnica. Se transformó la cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-7D con los fragmentos de PCR 9 a 12 purificados y los fragmentos de PCR 10 y 11 contuvieron solapamientos en sus extremos 5' y 3' y los fragmentos de PCR 9 y 12 en sus extremos 3' y 5', respectivamente, de forma que esto permitiera la recombinación homologa de los cuatro fragmentos de PCR (Figura 1). El extremo 5' del fragmento de PCR 9 y el extremo 3' del fragmento de PCR 12 fueron homólogos al locus YPRCtau3 y permitieron la integración de los cuatro fragmentos de PCR en el locus YPRCtau3 (Figura 1). Esto produjo un fragmento lineal que consistía en los fragmentos de PCR 9 a 12 integrados en el locus YPRCtau3, que se localiza en el cromosoma XVI.

Se sembraron mezclas de transformación en YEPhD-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de PhytonePeptone, 20 gramos de glucosa, 20 gramos de agar) que contenían 200 pg de G418 (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) por mL. Después de tres días de crecimiento a 30 °C, se volvieron a cultivar en línea transformantes individuales sobre placas de YEPh - agar que contenían 20 gramos de glucosa por litro y 200 pg de G418 por mL.

Posteriormente, el casete marcador y el gen Cre-recombinasa presentes en los fragmentos de PCR 10 y 11 integrados se retiraron por recombinación entre los sitios lox66 y lox71 que flanquean el marcador KanMX y el gen CRE que codifica la CRE recombinasa por CRE recombinasa, usando el método descrito en el documento de patente PCT/EP2013/055047, dando como resultado la retirada del marcador KanMX y el gen CRE y dejando un sitio lox72 como resultado de la recombinación entre los sitios lox66 y lox71. La cepa libre de marcador resultante se denominó SUC-1029.

La presencia del gen FUMR introducido se confirmó usando PCR usando secuencias de cebador que se pueden hibridar con las secuencias codificantes de los ORF codificados por SEQ ID NO: 34. La correcta integración y retirada del marcador KanMX se confirmó por PCR usando los cebadores 5' y 3' del locus YPRCtau3, que no se hibridan en regiones homólogas de YPRCtau3 presentes en los fragmentos de PCR 9 y 12.

Ejemplo 2: Construcción de la cepa SUC-1112

Generación de fragmentos de PCR

Se usaron las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para generar el fragmento de PCR 1 que consiste en el sitio de integración 5' INT59, usando ADN genómico de la cepa de Saccharomyces cerevisiae la cepa CEN.PK 113-7D (MATa HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) como molde.

Se generó el fragmento de PCR 2 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, usando SEQ ID NO: 1 como molde. SEQ ID NO: 1 codifica fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCKa) de Actinobacillus succinogenes, como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065780. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TPI1 controla la expresión del gen PCKa. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador GND2.

Se generó el fragmento de PCR 3 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, usando SEQ ID NO: 2 como molde. SEQ ID NO: 2 codifica piruvato carboxilasa (PYC2) de Saccharomyces cerevisiae, como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065780. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor PGK1 controla la expresión del gen PYC2. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador ADH1.

Se generó el fragmento de PCR 4 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, usando SEQ ID NO: 3 como molde. SEQ ID NO: 3 codifica un marcador de selección KanMX funcional en Saccharomyces cerevisiae que se amplificó de plásmido pUG7-EcoRV. pUG7-EcoRV es una variante del plásmido pUG6 descrito por Gueldener et al., (Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1 ;24(13):2519-24), en la que los sitios loxP presentes en pUG6 se cambiaron en los sitios lox66 y lox71 (Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35. Epub 2006 Dec 1.)

Se generó el fragmento de PCR 5 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, usando SEQ ID NO: 4 como molde. SEQ ID NO: 4 codifica un supuesto transportador de ácido dicarboxílico de Aspergillus niger, como se desvela en el documento de patente EP2495304. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor ENO1 controla la expresión del gen DCT_02. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TEF2.

Se generó el fragmento de PCR 6 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, usando SEQ ID NO: 5 como molde. SEQ ID NO: 5 codifica malato deshidrogenasa (MDH3) de Saccharomyces cerevisiae, como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065778. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por d Na 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de Kluyveromyces lactis, es decir, el promotor de ORF KLLA0_F20031G (número de acceso de UniProt Q6CJA9) controla la expresión del gen MDH3. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador GPM1.

Se generó el fragmento de PCR 7 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, usando SEQ ID NO: 6 como molde. SEQ ID NO: 6 codifica fumarasa (fumB) de Escherichia c o li(E.C. 4.2.1.2, número de acceso de UniProt P14407). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. La secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 controla la expresión de los controles la expresión del gen fumB. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TDH1.

Se generó el fragmento de PCR 8 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, usando SEQ ID NO: 7 como molde. SEQ ID NO: 7 codifica fumarato reductasa (FRDg) de Trypanosoma brucei, como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065778. La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. La secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TEF1 controla la expresión del gen fumB. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TAL1.

Se usaron las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 para generar el fragmento de PCR 113 que consiste en el sitio de integración 3' INT59, usando ADN genómico de la cepa CEN.PK 113-7D como molde.

Los fragmentos de PCR 1 a 8 y el fragmento de PCR 113 se purificaron usando el kit DNA Clean & Concentrator™-25 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Transformación en SUC-1029 para construir la cepa SUC-1112

Se hizo la transformación en levadura por un método conocido por los expertos en la técnica. Se transformó la cepa de S. cerevisiae SUC-1029 con los fragmentos de PCR 1 a 8 y el fragmento de PCR 113 purificados. Los fragmentos de PCR 2 a 8 contuvieron solapamientos en sus extremos 5' y 3' y los fragmentos de PCR 1 y 113 en sus extremos 3' y 5', respectivamente, de forma que esto permitió la recombinación homóloga de los ocho fragmentos de PCR. El extremo 5' del fragmento de PCR 1 y el extremo 3' del fragmento de PCR 113 fueron homólogos al locus INT59 y permitieron la integración de los nueve fragmentos de PCR en el locus INT59 (véase la Figura 2). Esto produjo un fragmento lineal que consistía en los fragmentos de PCR 2 a 8 integrados en el locus INT59. Este método de integración se describe en la solicitud de patente WO2013076280. El locus INT59 se localiza en el cromosoma XI, 923 pb en la dirección 3’ de YKR092C y 922 pb en la dirección 5' de YKR093W.

Se sembraron mezclas de transformación en YEPh-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de PhytonePeptone, 20 gramos de agar) que contenía 20 gramos de galactosa por litro y 200 gg de G418 (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) por mL. Después de tres días de crecimiento a 30 °C, se volvieron a cultivar en línea transformantes individuales sobre placas de YEPh - agar que contenían 20 gramos de galactosa por litro y 200 gg de G418 por mL. La presencia de todos los genes introducidos se confirmó usando PCR usando secuencias de cebadores que se pueden hibridar con las secuencias codificantes de los ORF codificados por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7. La cepa resultante se denominó SUC-1112. El marcador de KanMX, presente en la cepa SUC-1112, se pueden retirar si se requiere.

Ejemplo 3: Transformación de un gen malato deshidrogenasa en la cepa SUC-1112 y producción de ácido mélico en transformantes resultantes

Generación de fragmentos de PCR

Se usaron las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para generar el fragmento de PCR 13 que consiste en el sitio de integración 5' INT1, usando ADN genómico de la cepa CEN.PK 113-7D como molde.

Se generó el fragmento de PCR 114 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, usando SEQ ID NO: 42 como molde. SEQ ID NO: 42 contiene el gen ZWF1, que codifica glucosasfosfato deshidrogenasa (G6PD). Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de Kluyveromyces lactis, es decir, el promotor de ORF KLLA0C05566G (número de acceso de UniProt Q6CUE2) controla la expresión del gen ZWF1. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TEF1.

Se generó el fragmento de PCR 115 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 28, usando SEQ ID NO: 38 como molde. SEQ ID NO: 38 codifica un marcador de selección de nourseotricina funcional en Saccharomyces cerevisiae que se amplificó de una versión modificada del plásmido pUG7-Nat. pUG7-Nat es una variante de plásmido pUG6 descrito por Gueldener et al., (Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1 ;24(13):2519-24), en la que los sitios loxP presentes en pUG6 se cambiaron en los sitios lox66 y lox71 (Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35. Epub 2006 Dec 1) y en la que el marcador KanMX se sustituyó por un marcador de nourseotricina (Goldstein y McCusker, Yeast. 1999 Oct;15(14):1541 -53).

Se generó el fragmento de PCR 15 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, usando SEQ ID NO: 31 como molde. SEQ ID NO: 31 codifica malato deshidrogenasa (MDH3) de S. cerevisiae. MDH3 está alterada por la deleción de la secuencia carboxiterminal de SKL como se desvela en la solicitud de patente WO2013/004670 A1. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-genterminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetizó por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 controla la expresión del gen MDH3. La apropiada terminación está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador GPM1.

Se usaron las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 para generar el fragmento de PCR 16 que consiste en el sitio de integración 3' INT1, usando ADN genómico de la cepa CEN.PK 113-7D como molde.

Se purificaron los fragmentos de PCR 13 a 16 usando el kit DNA Clean & Concentrator™-25 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

T ransformación en SUC-1112

Se hizo la transformación en levadura por un método conocido por los expertos en la técnica. Se transformó la cepa de S. cerevisiae SUC-1112 con los fragmentos de PCR 13, 114, 115, 15 y 16 purificados. Los fragmentos de PCR 114 y 115 y 15 contuvieron solapamientos en sus extremos 5' y 3’ y los fragmentos de PCR 13 y 16 contuvieron solapamientos en sus extremos 3' y 5', respectivamente, de forma que esto permitió la recombinación homóloga de los cinco fragmentos de PCR. El extremo 5' del fragmento de PCR 13 y el extremo 3' del fragmento de PCR 16 fueron homólogos al locus INT1 y permitieron la integración de los cuatro fragmentos de PCR en el locus INT1 (véase la Figura 3). Esto produjo un fragmento lineal que consistía en los fragmentos de PCR 13 a 16 integrados en el locus INT1. Este método de integración se describe en la solicitud de patente WO2013/076280. El locus INT1 se localiza en el cromosoma XV, 659 pb en la dirección 3' de YOR071c y 998 pb en la dirección 5' de YOR070c. Este enfoque produjo la expresión de la proteína malato deshidrogenasa de 340 aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 39 que carece del aminoácido SKL del extremo C en comparación con la secuencia nativa de S. cerevisiae.

Se sembraron mezclas de transformación en YEPh-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de PhytonePeptone, 20 gramos de agar) que contenía 20 gramos de galactosa por litro y 200 gg de nourseotricina (Jena Bioscience, Alemania) por mL. Después de tres días de crecimiento a 30 °C, se volvieron a cultivar en línea transformantes individuales sobre placas de YEPh - agar que contenían 20 gramos de galactosa por litro y 200 gg de nourseotricina por mL. La presencia de todos los genes introducidos se confirmó usando PCR usando secuencias de cebadores que se pueden hibridar con las secuencias codificantes de los ORF codificados presentes en el fragmento de PCR 114, 115 y 15. Para confirmar la integración de fragmentos de PCR 13, 114, 115, 15 y 16 en el locus correcto, la hibridación de cebadores con la región 5' y 3' del locus INT1, que no se unen con las regiones INT1 en fragmentos de PCR 13 y 16, se usaron en combinación con cebadores que se hibridaron con los ORF en los fragmentos de PCR 114 y 15 de forma que solo el producto de PCR se pudiera formar si los fragmentos de PCR 114 y 15 se integraran en el locus INT1. Tres colonias individuales resultantes SUC-1112+MDH3#1, SUC-1112+MDH3#2, SUC-1112+MDH3#3. Los marcadores KanMX y nourseotricina, presentes en las cepas SUC-1112+MDH3#1, SUC-1112+MDH3#2, SUC-1112+MDH3# se pueden retirar si se requiere.

Producción de ácido dicarboxílico

Para determinar la producción de ácido dicarboxílico, se realizaron fermentaciones MTP y mediciones de RMN como se describe en Materiales y métodos generales. En el sobrenadante de las cepas SUC-1112+MDH3, SUC-1112+MDH3#1, SUC-1112+Md H3#2, SUC-1112+MDH3#3, que contienen una copia adicional del gen MDH3, presente en el fragmento de PCR 15, se midió un título promedio de 8,7 g/L de ácido málico. Los niveles de ácido succínico fueron inferiores a los esperados; pareció que las cepas habían perdido el gen FRDg, dando como resultado una conversión limitada de malato en succinato.

Ejemplo 4: Transformación de genes que codifican mutantes de malato deshidrogenasa en la cepa SUC-1112 y producción de ácido mélico en transformantes resultantes

Generación de fragmentos de PCR

Se generaron los fragmentos de PCR 13 y 16 como se describe en el Ejemplo 3.

Se generó el fragmento de PCR 14 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, usando SEQ ID NO: 38 como molde. SEQ ID NO: 38 codifica un marcador de selección de nourseotricina funcional en Saccharomyces cerevisiae que se amplificó de una versión modificada de plásmido pUG7-Nat. pUG7-Nat es una variante del plásmido pUG6 descrito por Gueldener et al., (Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1 ;24(13):2519-24), en el que los sitios loxP presentes en pUG6 se cambiaron en sitios lox66 y lox71 (Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35. Epub 2006 Dec 1) y en el que el marcador KanMX se sustituyó por un marcador de nourseotricina (Goldstein y McCusker, Yeast. 1999 Oct;15(14):1541-53).

Se sintetizaron secuencias sintéticas de nucleótidos que codifican diferentes mutantes de proteína de la secuencia de malato deshidrogenasa de referencia que se describe en SEQ ID NO: 39 por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). Las secuencias sintéticas de nucleótidos codifican una secuencia de aminoácidos mutante en las posiciones 34 a 40 con respecto a la secuencia de MDH3 de referencia (SEQ ID NO: 39) como se indica en la Tabla 1. Aparte de codificar los aminoácidos mutantes indicados en la Tabla 1, los mutantes de secuencia de nucleótidos sintéticos son idénticos a SEQ ID NO: 31. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 controla la expresión del gen MDH mutante. La apropiada terminación está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador GPM1.

Las secuencias sintéticas de genes que contienen, entre otros, un promotor TDH3 - MDH mutante - terminador GPM1 y se amplificaron por PCR usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, para generar fragmentos de PCR 17 a 108 (véase la Tabla 1).

Se purificaron los fragmentos de PCR 13, 14, 16 y 17 a 108 usando el kit DNA Clean & Concentrator™-25 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Transformación en SUC-1112

Se transformó la cepa SUC-1112 con fragmentos de PCR 13, 14 y 16 purificados en combinación con los fragmentos de PCR 17 a 108 individualmente. El fragmento de PCR 14 y los fragmentos de PCR 17 a 108 contuvieron solapamientos en sus extremos 5' y 3' y los fragmentos de PCR 13 y 16 contuvieron solapamientos en sus extremos 3' y extremo 5', respectivamente, de forma que esto permitió la recombinación homóloga de los cuatro fragmentos de PCR. El extremo 5' del fragmento de PCR 13 y el extremo 3' del fragmento de PCR 16 fueron homólogos al locus INT1 y permitieron la integración de los cuatro fragmentos de PCR en el locus INT1 (Figura 4). La transformación y la selección de transformantes se describen en el Ejemplo 2.

Producción de ácidos dicarboxílicos

Para determinar la producción de ácidos dicarboxílicos, se cultivaron cuatro transformantes de SUC-1112 independientes que expresan las secuencias mutantes de malato deshidrogenasa en placas de microvaloración como se describe en Materiales y métodos generales. Se produjeron bajas cantidades de ácido succínico debido a la pérdida de FRDg (véase el Ejemplo 3), pero todavía se pudo determinar la actividad de MDH3 midiendo los niveles de malato. Los títulos promedio de ácido málico se representan en la Tabla 1. La producción promedio de ácido málico de varios transformantes de SUC-1112 que expresan secuencias mutantes de malato deshidrogenasa superó los 10 g/L de ácido málico. Es interesante señalar que mutantes con una sustitución de ácido aspártico por un resto glicina o serina en la posición 34 muestran una elevada producción de malato. Esto es significativamente superior al título promedio de ácido málico de SUC-1112 transformado con la secuencia de MDH3 de referencia descrita en el Ejemplo 3. Por significativamente más se indica que los intervalos de confianza del 95 % de los títulos de málico para las cepas con referencia y las secuencias mutantes de malato deshidrogenasa no se solapan. El límite superior del intervalo de confianza del 95 % para el título de ácido málico de SUC-1112 transformado con la secuencia de MDH3 de referencia se encuentra por debajo de 10 g/L.

Tabla 1: Títulos promedio de ácido málico medidos en el sobrenadante del medio de producción después de 4 días de cultivo de transformantes de la cepa SUC-1112, que expresa fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCKa), piruvato carboxilasa (PYC2), malato deshidrogenasa (MDH3), fumarasa (FUMR y fumB), transportador de ácido dicarboxílico (DCT 02) y transformada con la secuencia de nucleótidos que codifica la malato deshidrogenasa de referencia (SEQ ID NO: 39) o un mutante de malato deshidrogenasa (MUT 001 - MUT 94), que contiene mutaciones en comparación con la secuencia de referencia en las posiciones de aminoácidos indicadas a continuación.

Ejemplo 5: Medición de la actividad específica de NADH y NADPH de mutantes de malato deshidrogenasa

Se seleccionó un total de 19 mutantes de la Tabla 1 y se volvieron a cultivar como se describe en Materiales y métodos generales. La biomasa se recogió por centrifugación (4000 rpm, 10 min, 4 °C) y se lavó dos veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato, Sigma Aldrich) después de que los sedimentos de células se congelaran a -20 °C. Se logró la alteración celular en placas de microvaloración (MTP) de 96 pocillos profundos de pocillos cuadrados usando perlas de vidrio de 0,5 mm lavadas con ácido en combinación con el TissueLyser II de Qiagen (3000 rpm durante 2x 10 s, enfriar sobre hielo durante 1 min entre ciclos). Las perlas de vidrio que absorben un volumen de 600 gL se añadieron al sedimento de células antes de la adición de 1 mL de medio de ensayo de tipo in vivo (descrito en van Eunen et al. FEBS Journal 277: 749-760 adaptado para contener DTT 0,5 mM (ditiotreitol, Sigma-Aldrich) y PMSF 0,1 mM (fluoruro de fenilmetanosulfonilo, Amresco). Se añadieron perlas de vidrio por inversión de la MTP de pocillos profundos que contenían los sedimentos congelados sobre una MTP convencional donde cada pocillo se llena completamente con perlas de vidrio (=un volumen de 300 gL) y luego invirtiendo ambas placas, de manera que las perlas de vidrio caigan sobre los sedimentos de células. Este proceso se repitió para obtener 600 gL de perlas de vidrio en los sedimentos de células. A continuación, se añadió 1 mL de medio de ensayo de tipo in vivo descrito anteriormente. Después de la rotura de las células, se sedimentó el residuo celular por centrifugación (4000 rpm, 30 min, 4 °C). El sobrenadante (extractos de células solubles) se recogió y se almacenó sobre hielo. La concentración de proteína de los extractos se determinó por Bradford, usando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.

Se ensayó por espectrofotometría la actividad de malato deshidrogenasa (MDH) siguiendo la disminución en la absorbancia 340 nm provocada por la oxidación de NADH o NADPH en NAD+ o NADP+, respectivamente. Los ensayos contuvieron NADH 400 gM o NADPH 400 gM, ácido oxaloacético 2 mM (Sigma Aldrich) y aproximadamente 0,0625 mg de proteína ml-1 de extractos solubles de células en medio de ensayo de tipo in vivo. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 200 gL. Se añadió un volumen igual de extractos solubles de células en tanto los ensayos dependientes de NADH como de NADPH. Las reacciones empezaron con la adición de 100 gL de disolución madre de ácido oxaloacético (4 mM) y fueron seguidas durante 9 minutos a 30 grados Celsius y la pendiente se usó como una medida de la actividad de MDH dependiente de NADH o NADPH. La pendiente (en A A340/min) se determinó con la función 'pendiente' en Microsoft Excel donde los valores de absorbancia se tomaron como valores 'y' y el tiempo en minutos como valores 'x'. La función 'RSQ' en Microsoft Excel se usó para comprobar la calidad del ajuste de la pendiente (criterio > 0,9). La pendiente se corrigió para la pendiente de la reacción del blanco que contiene medio de ensayo de tipo in vivo en lugar de sustrato. La absorbancia se midió usando un lector de placas Tecan Infinite M1000. La actividad dependiente de NADH de cada mutante se comparó con la actividad de NADPH. La relación de actividad dependiente de NADPH:NADH, o relación de especificidad de NADPH:NADH, se determinó:

1) Determinando la pendiente (en A A340/min) de la actividad de MDH dependiente de NADPH

2) Determinando la pendiente (en A A340/min) de la actividad de MDH dependiente de NADH

3) Dividiendo la pendiente de la actividad de MDH dependiente de NADPH entre la pendiente de la actividad de MDH dependiente de NADH.

Para determinar la relación, se usaron pendientes sin normalización para la cantidad de proteína total como volúmenes iguales de cada mutante en los ensayos de actividad de MDH dependiente de NADH y NADPH,

La relación se calculó para 19 mutantes (Figura 5D). Un aumento del valor para la relación en comparación con la referencia indicó que la especificidad del cofactor ha sido cambiada.

Se analizaron los sobrenadantes de los 19 mutantes cultivados y la cepa de referencia para los títulos de ácido málico como se describe en Materiales y métodos generales. Se midieron las actividades específicas de NADPH y específicas de NADH como se ha descrito anteriormente y se normalizaron para proteína total dividiendo entre la concentración de proteína total en el ensayo. Los resultados se muestran en las Figuras 5B - 5C. Claramente, los 19 mutantes seleccionados tienen una potenciada actividad de malato deshidrogenasa específica de NADPH. Para la mayoría de los 19 mutantes, la actividad de malato deshidrogenasa específica de NADH disminuye en comparación con la referencia (Fig. 5B). Es interesante señalar que en 6 mutantes la actividad específica de NADH es elevada (Fig. 5B), que indica que en estos mutantes tanto la actividad específica de NADH como la actividad específica de NADPH es reducida. En todos los mutantes, aumentó la relación de especificidad NADPH:NADH (Figura 5D).

Sorprendentemente, una sustitución de ácido aspártico por un resto de glicina o serina en la posición 34 tiene un efecto positivo sobre el título de ácido málico de las cepas SUC-1112 transformadas con estos mutantes de malato deshidrogenasa (Fig. 5A).

Ejemplo 6: Construcción de la cepa REV-0001

Generación de fragmentos de PCR

Se usan las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55 para generar el fragmento de PCR 116 que consiste en el sitio de integración 5' INT1, usando ADN genómico de la cepa CEN.PK 113-7D como molde.

Se genera el fragmento de PCR 117 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, usando SEQ ID NO: 38 como molde. SEQ ID NO: 38 codifica un marcador de selección de nourseotricina funcional en Saccharomyces cerevisiaeque se amplificó de una versión modificada del plásmido pUG7-Nat. pUG7-Nat es una variante del plásmido pUG6 descrito por Gueldener et al., (Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1 ;24(13):2519-24), en la que los sitios IoxP presentes en pUG6 se cambiaron en los sitios lox66 y lox71 (Lambert et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35. Epub 2006 Dec 1) y en la que el marcador KanMX se sustituyó por un marcador de nourseotricina (Goldstein y McCusker, Yeast. 1999 Oct;15(14):1541-53).

Se genera el fragmento de PCR 118 usando las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61, usando SEQ ID NO: 62 como molde. SEQ ID NO: 62 codifica fumarato reductasa (FRDg) de Trypanosoma brucei, como se desvela en la solicitud de patente WO2009/065778. Esta secuencia sintética, que incluye la secuencia de promotor-gen-terminador, que incluye sitios de restricción apropiados, se sintetiza por DNA 2.0 (Menlo Park, California, EE. UU.). La secuencia del gen estuvo optimizada en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae como se desvela en la solicitud de patente WO2008/000632. El gen sintético está bajo el control de (o unido operativamente con) un promotor de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 controla la expresión del gen FRDg. La terminación apropiada está controlada por una secuencia terminadora de S. cerevisiae, es decir, el terminador TAL1.

Las secuencias de cebadores descritas en SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59 se usan para generar el fragmento de PCR 119 que consiste en el sitio de integración 3' INT1, usando ADN genómico de la cepa CEN.PK 113-7D como molde.

Se purifican los fragmentos de PCR 116 a 119 usando el kit DNA Clean & Concentrator™-25 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) según instrucciones del fabricante.

Transformación de SUC-1029

Se realiza la transformación en levadura por un método conocido por los expertos en la técnica. Se transforma la cepa de S. cerevisiae SUC-1029 (Ejemplo 1) con los fragmentos de PCR 116 a 119 purificados. Los fragmentos de PCR 117 y 118 contienen solapamientos en sus extremos 5' y 3' y los fragmentos de PCR 116 y 119 contienen solapamientos en sus extremos 3' y 5', respectivamente, de forma que esto permite la recombinación homóloga de los cuatro fragmentos de PCR. El extremo 5' del fragmento de PCR 116 y el extremo 3' del fragmento de PCR 119 son homólogos al locus INT1 y permite la integración de los cuatro fragmentos de PCR en el locus INT1 (véase la Figura 6). Esto da como resultado un fragmento lineal que consiste en los fragmentos de PCR 116 a 119 integrados en el locus INT1. Este método de integración se describe en la solicitud de patente WO2013076280. El locus INT1 se localiza en el cromosoma XV, 659 pb en la dirección 3' de YOR071c y 998 pb en la dirección 5' de YOR070c. Este enfoque da como resultado la expresión de la proteína fumarato reductasa de 1139 aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 8, que carece del aminoácido SKI del extremo C en comparación con la secuencia nativa de T. brucei.

Se siembran mezclas de transformación en YEPh-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de PhytonePeptone, 20 gramos de galactosa, 20 gramos de agar)) que contiene 100 gg de nourseotricina (Jena Bioscience, Alemania) por mL. Después de tres días de crecimiento a 30 °C, se vuelven a cultivar en línea transformantes individuales sobre placas de YEPh-agar que contienen 20 gramos de galactosa por litro y 100 gg de nourseotricina por mL. La presencia de los genes introducidos se confirma usando PCR usando secuencias de cebadores que se pueden hibridar con las secuencias codificantes de los ORF codificados por SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 62.

Ejemplo 7: Transformación de genes que codifican mutantes de malato deshidrogenasa en la cepa REV-0001 y producción de ácido succínico en transformantes resultantes

Para determinar si los niveles de succinato son elevados en cepas que expresan mutantes de MDH, se introducen mutantes de MDH en la cepa REV-0001 en la que FRDg se expresa (Ejemplo 6). Basándose en los resultados de producción de ácido málico (Ejemplo 4) y los resultados del ensayo de actividad in vitro (Ejemplo 5), se seleccionan 3 mutantes de MDH: MUT_014, MUT_015 y MUT_034.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora recombinante que es capaz de producir un ácido dicarboxílico y que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa, en donde el polipéptido mutante comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la malato deshidrogenasa que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39, comprende una mutación de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39,

en donde la célula hospedadora recombinante es una célula fúngica,

en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 53, y

en donde la célula hospedadora recombinante produce un aumento de la cantidad de un ácido dicarboxílico en comparación con una célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido de malato deshidrogenasa de SEQ ID NO: 39.

2. Una célula hospedadora recombinante según la reivindicación 1, en donde la mutación del resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 es una sustitución a un aminoácido pequeño seleccionado de treonina (T), serina (S), glicina (G), alanina (A) o prolina (P).

3. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la mutación del resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 es una sustitución a un aminoácido pequeño seleccionado de serina (S) o glicina (G).

4. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa comprende además una mutación de un resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 36 en SEQ ID NO: 39.

5. Una célula hospedadora recombinante según la reivindicación 4, en donde la mutación del resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 36 en SEQ ID NO: 39 es una sustitución a un aminoácido seleccionado de glutamina (Q), alanina (A), ácido glutámico (E), prolina (P) o serina (S).

6. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula hospedadora recombinante comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa como se define en la Tabla 1 y en donde el resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 34 en SEQ ID NO: 39 se selecciona de glicina (G) o serina (S).

7. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una malato deshidrogenasa dependiente de NAD(H) mutante (Ec 1.1.1.37).

8. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una malato deshidrogenasa dependiente de NAD(H) peroxisomal mutante.

9. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es un mutante de un polipéptido homólogo que tiene actividad de malato deshidrogenasa.

10. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el polipéptido mutante que tiene actividad de malato deshidrogenasa es una malato deshidrogenasa dependiente de NAD(H) mutante de una levadura.

11. Una célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la célula hospedadora recombinante es una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste en cepas de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Issatchenkia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, o una célula fúngica filamentosa seleccionada del grupo que consiste en células fúngicas filamentosas que pertenecen a un género de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora, Penicillium, Talaromyces, Rasamsonia, Thielavia, Fusarium o Trichoderma.

12. Una célula hospedadora recombinante según la reivindicación 11, en donde la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

13. Una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la célula hospedadora recombinante comprende además una o más copias de un ácido nucleico que codifica una o más de una fosfoenolpiruvato carboxicinasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una piruvato carboxilasa, una fumarasa, una fumarato reductasa y/o un transportador de succinato.

14. Un método para la producción de un ácido dicarboxílico, en donde el método comprende fermentar la célula hospedadora recombinante según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en condiciones adecuadas para la producción del ácido dicarboxílico.

15. Un método según la reivindicación 14, que comprende además recuperar el ácido dicarboxílico del medio de fermentación.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde el ácido dicarboxílico es ácido succínico, ácido málico y/o ácido fumárico.