EA032726B1 - Рекомбинантная эукариотическая клетка для продукции янтарной кислоты, которая содержит nad(h)-зависимую фумаратредуктазу - Google Patents

Abstract

Изобретение касается улучшенной рекомбинантной эукариотической клетки для продукции янтарной кислоты. Указанную рекомбинантную клетку выбирают из клеток дрожжей и мицелиальных грибов, и она включает последовательность нуклеотидов, кодирующую NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, которая катализирует преобразование фумаровой кислоты в янтарную кислоту, причем указанная NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза активна в цитозоле. Изобретение также касается способа получения янтарной кислоты, в котором используется эукариотическая клетка по изобретению.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной эукариотической клетке, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую фумаратредуктазу, и способ продукции янтарной кислоты, в котором применяют рекомбинантную эукариотическую клетку.

Сведения о предшествующем уровне техники

Янтарная кислота является потенциальным предшественником для многих химических веществ. Например, янтарную кислоту можно превратить в 1,4-бутандиол (BDO), тетрагидрофуран и гаммабутиролактон. Другим продуктом, который получают из янтарной кислоты, является полиэфирный полимер, который изготавливают с помощью присоединения янтарной кислоты и BDO.

Янтарную кислоту преимущественно производят с помощью нефтехимических способов путем гидрирования бутана. Эти способы считают дорогостоящими и губительными для окружающей среды. Ферментативная продукция янтарной кислоты может быть привлекательным альтернативным способом производства янтарной кислоты, в котором в качестве источника углерода можно использовать возобновляемое сырье. Известно много различных бактерий, таких как Escherichia coli, и бактерий рубца Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia или Succinimonas, sp., продуцирующих янтарную кислоту. Проектирование метаболических путей для этих штаммов бактерий улучшает выход янтарной кислоты и/или продуктивность или уменьшает образование побочных продуктов.

WO2007/061590 раскрывает дрожжи, не содержащие пируватдекарбоксилазу, для продукции яблочной кислоты и/или янтарной кислоты, которые трансформированы ферментом пируваткарбоксилазой или фосфоенолпируваткарбоксилазой, ферментом малатдегидрогеназой и белком, транспортирующим яблочную кислоту (МАЕ).

Несмотря на усовершенствования, которые были достигнуты в ферментативной продукции янтарной кислоты, остается необходимость в улучшенных микроорганизмах, используемых для ферментативной продукции янтарной кислоты.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является альтернативный микроорганизм для продукции янтарной кислоты.

Цель достигают в соответствии с изобретением с помощью рекомбинантной эукариотической клетки, выбираемой из группы, состоящей из дрожжей и мицелиальных грибов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, которая катализирует превращение фумаровой кислоты в янтарную кислоту, причем NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза активна в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу.

Неожиданно было обнаружено, что рекомбинантная эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением продуцирует повышенное количество янтарной кислоты по сравнению с количеством янтарной кислоты, продуцируемой эукариотической клеткой дикого типа. Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением продуцирует по меньшей мере в 1,2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше янтарной кислоты, чем эукариотическая клетка дикого типа, которая не включает нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу. Соответственно изобретением также предусмотрен способ получения янтарной кислоты, включающий ферментацию эукариотической клетки по изобретению в подходящей для ферментации среде и извлечение янтарной кислоты.

Используемый в этом документе термин рекомбинантная эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением определяют как клетку, которая содержит или которая трансформирована или генетически модифицирована с помощью нуклеотидной последовательности, или которая содержит полипептид, который не встречается естественным образом в эукариотической клетке, или которая содержит дополнительную копию или копии эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты. Эукариотическую клетку дикого типа в этом документе определяют как родительскую клетку для рекомбинантной клетки.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, которая катализирует превращение фумаровой кислоты в янтарную кислоту, может быть гетерологичной или гомологичной нуклеотидной последовательностью, или последовательностью, которая кодирует гетерологичную или гомологичную NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, и которую можно дополнительно генетически модифицировать с помощью мутации, разрушения или делеции. Методы рекомбинантных ДНК хорошо известны в этой области техники, например, в книге Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Термин гомологичный используют для того, чтобы указать на соответствие между определенной молекулой (рекомбинантной) нуклеиновой кислоты или полипептида и определенным организмом хозяина или клеткой хозяина, этот термин означает, что в природе молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида продуцирует клетка-хозяина или организмы тех же видов, предпочтительно того же самого сорта или штамма.

Термин гетерологичный используют в отношении нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или бел

- 1 032726 ка, который имеет отношение к нуклеиновой кислоте, или белка, который не встречается в естественных условиях как часть организма, клетки, генома или последовательности ДНК или РНК, в которой он находится, или который обнаружен в клетке или месте расположения или местах расположения в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от тех, которые обнаружены в естественных условиях. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными в отношении клетки, в которую они введены, но их получают из другой клетки или синтетическим путем или рекомбинантными способами.

МЛП^Ю-зависимая фумаратредуктаза в соответствии с настоящим изобретением использует NAD(H) в качестве кофактора, тогда как большинство эукариотических клеток включают FADH₂зависимую фумаратредуктазу, в которой кофактором является FADH₂. Считают полезным, если эукариотическая клетка включает нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, так как NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза обеспечивает клетку дополнительными возможностями для окисления NAD(H) в NAD⁺ и оказывает влияние на окислительно-восстановительный баланс в клетке.

Предпочтительно клетка экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который катализирует образование янтарной кислоты, где нуклеотидная последовательность предпочтительно кодирует NЛD(H)-зависимую фумаратредуктазу, включающую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и/или SEQ ID NO: 3, и/или SEQ ID NO: 4, и/или SEQ ID NO: 6. Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует NЛD(H)-зависимую фумаратредуктазу, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или SEQ ID NO: 3, и/или SEQ ID NO: 4, и/или SEQ ID NO: 6.

Идентичность последовательности в этом документе определяют как соответствие между двумя или более аминокислотными последовательностями (полипептида или белка) или двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот (полинуклеотидными последовательностями), которое определено путем сравнения последовательностей. Обычно идентичности последовательностей или сходство сравнивают по всей длине последовательностей, которые сопоставляют. В этой области техники термин идентичность также означает степень родства последовательностей между аминокислотными или нуклеотидными последовательностями в зависимости от ситуации, которую определяют из совпадения между участками таких последовательностей.

Разработаны предпочтительные методы определения идентичности, чтобы определить наибольшее совпадение между анализируемыми последовательностями. Методы для определения идентичности и сходства систематизированы в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные методы с использованием компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают программы BLASTP и BLASTN, которые общедоступны в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Предпочтительными параметрами для сравнения аминокислотных последовательностей с помощью BLASTP являются: gap open 11.0, gap extend 1, матрица Blosum 62.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты, экспрессируемые в клетке настоящего изобретения, также могут быть определены по их способности гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, кодирующими NЛD(H)-зависимую фумаратредуктазу, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 6, в умеренных или в предпочтительно жестких условиях гибридизации. Жесткие условия гибридизации в этом документе определяют как условия, которые обеспечивают возможность последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей по меньшей мере из приблизительно 25, предпочтительно из приблизительно 50 нуклеотидов, 75 или 100 и наиболее предпочтительно из приблизительно 200 или более нуклеотидов, гибридизоваться при температуре около 65°С в растворе, включающем примерно 1 М соль, предпочтительно 6 х SSC (хлорид натрия, цитрат натрия) или любой другой раствор, имеющий сравнимую ионную силу, и которые обеспечивают промывание при 65°С раствором, включающим примерно 0,1 М соль, или менее предпочтительно 0,2 х SSC, или любым другим раствором, имеющим сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию проводят в течение ночи, т.е. в течение по меньшей мере 10 ч, и предпочтительно промывание проводят по меньшей мере в течение 1 ч с помощью по меньшей мере двух смен промывающего раствора. Эти условия обычно обеспечивают специфическую гибридизацию последовательностей, имеющих идентичность последовательностей, которая составляет около 90% или более.

Умеренные условия в этом документе определяют как условия, которые обеспечивают, чтобы последовательности нуклеиновых кислот, состоящие по меньшей мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно из примерно 200 или более нуклеотидов, гибридизовались при температуре около 45°С в растворе, включающем примерно 1 М соль, предпочтительно 6 х SSC или любой другой раствор, имеющий сравнимую ионную силу, и которые обеспечивают промывание при комнатной температуре раствором, включающим примерно 1 М соль, предпочтительно 6 х SSC или любой другой раствор, имеющий срав

- 2 032726 нимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию проводят в течение ночи, т.е. в течение по меньшей мере 10 ч, и предпочтительно промывание проводят по меньшей мере в течение 1 ч с помощью по меньшей мере двух смен промывающего раствора. Эти условия обычно обеспечивают специфическую гибридизацию последовательностей, имеющих идентичность последовательностей, которая составляет до 50%. Специалист в этой области техники сможет модифицировать эти условия гибридизации, чтобы специфически идентифицировать последовательности, различающиеся по идентичности в диапазоне от 50 до 90%.

Для повышения вероятности того, что введенный фермент (ферменты) экспрессируется/экспрессируются в активной форме в эукариотической клетке настоящего изобретения, соответствующую кодирующую нуклеотидную последовательность можно приспособить таким образом, чтобы оптимизировать частоту использования кодона для выбранной эукариотической клетки-хозяина. В этой области техники известны несколько способов оптимизации кодонов. Предпочтительный способ оптимизации частоты использования кодонов нуклеотидных последовательностей для эукариотической клетки представляет собой технологию оптимизации пары кодонов, раскрытую в WO2008/000632. Оптимизация пары кодонов представляет собой метод для продуцирования полипептида в клетке-хозяина, где нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, были модифицированы с учетом частоты использования их кодонов, в частности пар кодонов, которые используют для того, чтобы добиться улучшенной экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и/или усовершенствованной продукции полипептида. Пары кодонов определяют как набор двух расположенных последовательно триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности.

Термин ген, используемый в этом документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей матрицу для полимеразы нуклеиновых кислот, в эукариотах - РНК-полимеразу II. Гены транскрибируются в мРНК, которые затем транслируются в белок.

Термин нуклеиновая кислота, используемый в этом документе, включает отсылку к дезоксирибонуклеотидному или рибонуклеотидному полимеру, например полинуклеотиду как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме, и, за исключением ограниченных случаев, охватывает известные аналоги, обладающие основными свойствами природных нуклеотидов, так как они гибридизуются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами так же, как и встречающиеся в природе нуклеотиды (например, пептид-нуклеиновые кислоты). Полинуклеотид может быть полноразмерным или подпоследовательностью нативного или гетерологичного структурного или регуляторного гена. Если специально не указано, термин включает отсылку к специфической последовательности, а также к последовательности, комплементарной ей.

Термины полипептид, пептид и белок используют в этом документе взаимозаменяемо при отсылке к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков. Термины применяют в отношении аминокислотных полимеров, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также в отношении полимеров, состоящих из встречающихся в природе аминокислот. Обязательным свойством таких аналогов встречающихся в природе аминокислот является то, что если они включены в белок, то белок специфически реагирует с антителами, которые известны для того же белка, но полностью состоящего из встречающихся в природе аминокислот. Термины полипептид, пептид и белок также охватывают модификации, без ограничения включающие гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование.

Термин фермент, используемый в этом документе, определяют как белок, который катализирует (био)химическую реакцию в клетке.

Обычно нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, функционально связана с промотором, который вызывает достаточно хорошую экспрессию соответствующей нуклеотидной последовательности в эукариотической клетке в соответствии с настоящим изобретением, чтобы обеспечивать способность клетки продуцировать янтарную кислоту.

Используемый в этом документе термин функционально связанный относится к присоединению полинуклеотидных элементов (или кодирующих последовательностей или последовательности нуклеиновой кислоты) с целью создания функциональной зависимости. Последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной, если ее помещают в функциональную зависимость от другой последовательности нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер являются функционально связанными с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию кодирующей последовательности.

Используемый в этом документе термин промотор относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для того, чтобы контролировать транскрипцию одного или более генов, фрагмент локализован перед сайтом инициации транскрипции гена в 3'-5'-направлении относительно транскрипции и структурно определяется по присутствию участка связывания ДНК-зависимой РНКполимеразы, участков инициации транскрипции и любых других последовательностей ДНК, известных специалистам в этой области техники. Конститутивный промотор - это промотор, который активен в

- 3 032726 большинстве условий, относящихся к окружающей среде или развитию. Индуцибельный промотор это промотор, который активен в условиях регулирования окружающей среды или развития.

Промотор, который можно было бы использовать для того, чтобы добиться экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, например ПЛП(П)-зависимую фумаратредуктазу или любой другой фермент, введенный в эукариотическую клетку настоящего изобретения, может не быть природным в отношении экспрессируемой нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, т.е. является промотором, гетерологичным в отношении нуклеотидной последовательности (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Предпочтительно промотор является гомологичным, т.е. эндогенным для клетки-хозяина.

Подходящие промоторы в этом контексте включают как конститутивные, так и индуцибельные природные промоторы, а также сконструированные промоторы, которые хорошо известны специалисту в этой области техники. Подходящими промоторами в эукариотических клетках-хозяина могут быть GAL7, GAL10 или GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, РН05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI и ЛОХ1. Другие подходящие промоторы включают PDC, GPD1, PGK1, TEF1 и TDH.

Обычно нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, включает терминатор. Любой терминатор, который является функциональным в эукариотической клетке, может использоваться в настоящем изобретении. Предпочтительные терминаторы получают из природных генов клетки-хозяина. Подходящие терминаторные последовательности хорошо известны в этой области техники. Предпочтительно такие терминаторы используют совместно с мутациями, которые предотвращают нонсенсопосредованное разрушение мРНК в клетке-хозяина в соответствии с изобретением (смотри, например, Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).

В предпочтительном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)зависимую фумаратредуктазу, можно суперэкспрессировать, чтобы достичь достаточно хорошей продукции янтарной кислоты клеткой.

Существуют различные средства, доступные в этой области техники, для суперэкспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты в эукариотической клетке настоящего изобретения. В частности, нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, можно суперэкспрессировать путем увеличения количества копий гена, кодирующего фермент в клетке, например путем введения дополнительных копий гена в геном клетки, путем экспрессирования гена из центромерного вектора, из эписомального мультикопийного экспрессионного вектора или с помощью введения (эписомального) экспрессионного вектора, который включает множественные копии гена. Предпочтительно суперэкспресию фермента в соответствии с изобретением достигают с помощью (сильного) конститутивного промотора.

Изобретение также относится к нуклеотидной конструкции, включающей одну или несколько нуклеотидных последовательностей, выбираемых из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.

Конструкция нуклеиновой кислоты может быть плазмидой, например низкокопийной плазмидой или высококопийной плазмидой. Эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением может включать единственную копию, но предпочтительно включает много копий нуклеотидной последовательности, кодирующей NЛD(П)-зависимую фумаратредуктазу, например, путем использования множественных копий нуклеотидной конструкции.

Конструкция нуклеиновой кислоты может поддерживаться эписомально и, таким образом, включает последовательность для автономной репликации, такую как аутосомная репликационная последовательность. Если эукариотическая клетка происходит из грибов, то в основе подходящей эписомальной конструкции нуклеиновой кислоты могут быть, например, дрожжевые плазмиды 2μ или pKD1 (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975) или плазмиды ЛМЛ (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Альтернативно, каждую конструкцию нуклеиновой кислоты можно ввести в одной или в нескольких копиях в геном эукариотической клетки. Интегрирование в клеточный геном может происходить случайным образом с помощью негомологичной рекомбинации, но предпочтительно конструкцию нуклеиновой кислоты можно вводить в клеточный геном с помощью гомологичной рекомбинации, как хорошо известно в этой области техники.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая NAD(П)-зависимую фумаратредуктазу, может быть гетерологичной или гомологичной нуклеотидной последовательностью. Предпочтительно NADHзависимая фумаратредуктаза является гетерологичным ферментом, который может иметь любое подходящее происхождение, например может происходить из бактерий, грибов, простейших или растений. Предпочтительно клетка в соответствии с изобретением включает гетерологичную NЛD(П)-зависимую фумаратредуктазу, предпочтительно имеющую происхождение из Trypanosoma sp., например из Trypanosoma brucei.

В предпочтительном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая NAD(H)зависимую фумаратредуктазу, экспрессируется в цитозоле. Неожиданно цитозольная активность фермента привела к повышенному продуцированию янтарной кислоты эукариотической клеткой.

В случае если нуклеотидная последовательность, кодирующая NAD(П)-зависимую фумаратредук

- 4 032726 тазу, включает сигнал, направляющий фермент в пероксисомы или митохондрии, может быть необходимым модифицировать или удалить некоторое количество аминокислот (или соответствующие нуклеотидные последовательности в кодирующей нуклеотидной последовательности), чтобы предотвратить направление фермента в пероксисомы или митохондрии. Присутствие сигнала, направляющего фермент в пероксисомы, можно, например, определить с помощью метода, раскрытого в работе Schluter et al, Nucleic acid Research 2007, 35, D815-D822.

Предпочтительно для проявления активности фермента в цитозоле после экспрессии кодирующей нуклеотидной последовательности NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза утрачивает сигнальную последовательность, направляющую ее в пероксисомы или митохондрии.

Предпочтительно клетка экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который катализирует образование янтарной кислоты, где нуклеотидная последовательность предпочтительно кодирует NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, предпочтительно фумаратредуктазу, включающую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 45, 50, 55, 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 6. Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 6.

Эукариотическая клетка, выбираемая из группы, состоящей из дрожжей и мицелиальных грибов, предпочтительно принадлежит одному из родов Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Rhizopus, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Zygosaccharomyces, Pachysolen или Yamadazyma. Наиболее предпочтительной эукариотической клеткой является Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus orizae или Zygosaccharomyces bailii.

Кроме нуклеотидной последовательности, кодирующей NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, которая катализирует превращение фумаровой кислоты в янтарную кислоту, рекомбинантная эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением может включать дополнительные генетические модификации, например мутации, делеции или повреждения, в гомологичных нуклеотидных последовательностях и/или трансформацию нуклеотидными последовательностями, которые кодируют гомологичные или гетерологичные ферменты, которые катализируют реакцию в клетке, приводящую к увеличению потока в направлении янтарной кислоты. Может быть, например, полезным вводить, генетически модифицировать и/или суперэкспрессировать гетерологичные и/или гомологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие i) фермент, который катализирует превращение фосфоенолпирувата или пирувата в оксалоацетат; ii) малатдегидрогеназу, которая катализирует превращение ОАА в яблочную кислоту; или iii) фумаразу, которая катализирует превращение яблочной кислоты в фумаровую кислоту.

Эукариотическую клетку можно трансформировать или генетически модифицировать с помощью любой подходящей нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, катализирующий реакцию превращения молекулы C3 с тремя углеродными атомами в молекулу С4 с четырьмя углеродными атомами, такую как превращение фосфоенолпирувата (PEP, C3) в оксалоацетат (ОАА, С4) и пирувата (C3) в ОАА или яблочную кислоту (С4). Подходящими ферментами являются PEP-карбоксикиназа (ЕС 4.1.1.49, ЕС 4.1.1.38) и PEP-карбоксилаза (ЕС 4.1.1.31), которые катализируют превращение PEP в ОАА; пируваткарбоксилаза (ЕС 6.4.1.1.), которая катализирует реакцию превращения пирувата в ОАА; или маликфермент (ЕС 1.1.1.38), который катализирует реакцию превращения пирувата в яблочную кислоту.

Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением суперэкспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую пируваткарбоксилазу (PYC), предпочтительно пируваткарбоксилазу, которая активна в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей PYC, например PYC, включающей аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 41. Предпочтительно суперэкспрессируют эндогенную или гомологичную пируваткарбоксилазу. Неожиданно было обнаружено, что суперэкспрессия эндогенной пируваткарбоксилазы приводила к повышенному уровню продукции янтарной кислоты эукариотической клеткой в соответствии с настоящим изобретением.

В другом предпочтительном воплощении эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную PEP-карбоксикиназу (ЕС 4.1.1.49), катализирующую реакцию превращения фосфоенолпирувата в оксалоацетат. Неожиданно было обнаружено, что эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением, которая дополнительно включает гетерологичную PEP-карбоксикиназу, продуцировала повышенное количество янтарной кислоты по сравнению с эукариотической клеткой, которая не включает гетерологичную PEP-карбоксикиназу. Предпочтительно PEP-карбоксикиназа происходит из бактерий, более предпочтительно фермент, обладающий PEP-карбоксикиназной активностью, происходит из Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp. или Anaerobiospirillum sp., более предпочтительно из Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes или Anaerobiospirillum succiniciproducens.

- 5 032726

Предпочтительно PEP-карбоксикиназа активна в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей PEP-карбоксикиназу, так как было обнаружено, что это приводит к повышению продукции янтарной кислоты. В одном воплощении PEP-карбоксикиназу Actinobacillus succinogenes (PCKa) модифицировали для того, чтобы заменить EGY в положении 120-122 на аминокислотную последовательность DAF. Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает PEP-карбоксикиназу, которая имеет по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 17, предпочтительно PEP-карбоксикиназу, включающую SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 17. Неожиданно было обнаружено, что сопутствующая (супер)экспрессия PYC и PEP-карбоксикиназы, как было описано в этом документе, приводила по меньшей мере к 1,5-ному увеличению продукции янтарной кислоты.

В другом предпочтительном воплощении клетка в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую малатдегидрогеназу (MDH), которая после экспрессии нуклеотидной последовательности активна в цитозоле. Цитозольная MDH может быть любой подходящей гомологичной или гетерологичной малатдегидрогеназой. MDH может быть MDH3 S. cerevisiae или MDH1 S. cerevisiae. Предпочтительно для локализации фермента в цитозоле MDH не содержит сигнальную последовательность, направляющую ее в пероксисомы или митохондрии.

Альтернативно, MDH является MDH2 S. cerevisiae, которую модифицировали таким образом, чтобы она не инактивировалась в присутствии глюкозы и была активна в цитозоле. Известно, что после добавления глюкозы к клеткам, истощенным по глюкозе, транскрипция MDH2 подавляется и Mdh2p разрушается. Mdh2p, у которой удалены первые 12 N-концевых аминокислотных остатков, менее восприимчива к распаду, индуцированному глюкозой (Minard and McAlister-Henn, J. Biol Chem. 1992? Aug 25; 267(24):17458-64). Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает нуклеотидную последовательность, кодирующую малатдегидрогеназу, которая имеет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21. Предпочтительно малатдегидрогеназа включает SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21. Предпочтительно активность малатдегидрогеназы повышается путем суперэкспрессии кодирующей нуклеотидной последовательности с помощью методов, известных в этой области техники.

Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который катализирует превращение яблочной кислоты в фумаровую кислоту, который может быть гетерологичным или гомологичным ферментом, например фумаразой (FUM). Нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный фермент, который катализирует превращение яблочной кислоты в фумаровую кислоту, может быть любого подходящего происхождения, предпочтительно он может происходить из микроорганизмов, предпочтительно из дрожжей, например из Saccharomyces cerevisiae, или мицелиальных грибов, например Rhizopus oryzae. Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает нуклеотидную последовательность, кодирующую фумаразу, которая имеет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23. Предпочтительно фумараза включает SEQ ID NO: 23. Предпочтительно фермент, обладающий фумаразной активностью, после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий фумаразной активностью, активен в цитозоле. Неожиданно было обнаружено, что эукариотическая клетка, дополнительно включающая фермент, обладающий фумаразной активностью, как было описано в этом документе, продуцировала повышенное количество янтарной кислоты.

В другом воплощении эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты, предпочтительно белок, транспортирующий яблочную кислоту (МАЕ). Белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты, может быть гомологичным или гетерологичным белком. Предпочтительно белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты, является гетерологичным белком. Белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты, может происходить из любого подходящего организма, предпочтительно из Schizosaccharomyces pombe. Предпочтительно белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты, является белком, транспортирующим яблочную кислоту (МАЕ), который имеет по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 36. Предпочтительно МАЕ включает SEQ ID NO: 36. Неожиданно было обнаружено, что эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно включающая транспортер дикарбоновых кислот, например транспортер яблочной кислоты, как было описано в этом документе, продуцировала повышенное количество янтарной кислоты по сравнению с эукариотической клеткой, не включающей белок, транспортирующий дикарбоновые кислоты.

Настоящее изобретение также относится к применению транспортера дикарбоновых кислот, предпочтительно белка, транспортирующего яблочную кислоту, в эукариотической клетке для повышения продукции янтарной кислоты. Предпочтительно транспортер яблочной кислоты происходит из Schizosaccharomyces pombe.

- 6 032726

В предпочтительном воплощении эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением представляет собой клетку дрожжей, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие МЛПда-зависимую фумаратредуктазу, малатдегидрогеназу, гетерологичную фумаразу, гетерологичную PEP-карбоксикиназу и гетерологичный транспортер дикарбоновых кислот, и суперэкспрессирует пируваткарбоксилазу (PYC), как было описано, в том числе в предпочтительных воплощениях, указанных выше. Неожиданно было обнаружено, что дрожжи настоящего изобретения, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты, описанные в этом документе, продуцировали повышенное количество янтарной кислоты по сравнению с дрожжами, включающими лишь какую-либо одну из нуклеотидных последовательностей.

В другом предпочтительном воплощении эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает ферменты, которые превращают NAD(H) в NAD', с активностью, сниженной по сравнению с активностями этих ферментов в клетке дикого типа.

Предпочтительно клетка в соответствии с настоящим изобретением представляет собой клетку, в которой по меньшей мере один ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу, не является функциональным. Термин ген алкогольдегидрогеназы, который не является функциональным в этом документе применяют для описания эукариотической клетки, которая включает алкогольдегидрогеназу с активностью, сниженной по сравнению с клеткой, в которой все гены, кодирующие алкогольдегидрогеназу, являются функциональными. Ген может становиться нефункциональным при помощи методов, известных в этой области техники, например с помощью мутации, разрушения или делеции, например с помощью метода, раскрытого в работе Gueldener et. al. 2002, Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 6, e23. Предпочтительно эукариотическая клетка представляет собой клетку дрожжей, например Saccharomyces cerevisiae, в которой один или несколько генов adhl и/или adh2, кодирующих алкогольдегидрогеназу, инактивированы.

Предпочтительно клетка в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает по меньшей мере один ген, кодирующий глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, который не является функциональным. Термин ген глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, который не является функциональным, в этом документе применяют для описания эукариотической клетки, которая включает глицерол-3фосфатдегидрогеназу с активностью, сниженной, например, с помощью мутации, разрушения или делеции гена, кодирующего глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, в результате чего уменьшается образование глицерина по сравнению с клеткой дикого типа. Неожиданно было обнаружено, что эукариотическая клетка, включающая алкогольдегидрогеназу и/или глицерол-3-фосфатдегидрогеназу со сниженной активностью и NЛD(H)-зависимую фумаразу, обеспечивала повышенную продукцию янтарной кислоты по сравнению с клеткой, в которой один или несколько генов, кодирующих алкогольдегидрогеназу и/или глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, не являются инактивированными.

Настоящее изобретение также относится к способу продукции янтарной кислоты, включающему ферментацию в эукариотической клетке, включающей по меньшей мере один ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу, который не является функциональным, и/или по меньшей мере один ген, кодирующий глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, который не является функциональным.

В другом предпочтительном воплощении рекомбинантная эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере один ген, кодирующий сукцинатдегидрогеназу, которая не является функциональной. Термин сукцинатдегидрогеназа, которая не является функциональной, в этом документе применяют для описания эукариотической клетки, которая включает сукцинатдегидрогеназу с активностью, сниженной с помощью мутации, разрушения или делеции по меньшей мере одного гена, кодирующего сукцинатдегидрогеназу, в результате чего увеличивается продукция янтарной кислоты по сравнению с клеткой дикого типа. Эукариотическая клетка, включающая ген, кодирующий сукцинатдегидрогеназу, которая не является функциональной, может быть клеткой Aspergillus niger, предпочтительно клеткой Aspergillus niger, в которой один или несколько генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу, таких как sdhA и sdhB, не являются функциональными, например, в результате делеции этих генов.

Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с изобретением является клеткой дрожжей, предпочтительно клеткой Saccharomyces cerevisiae, предпочтительно клеткой Saccharomyces cerevisiae, включающей одну или несколько нуклеотидных последовательностей, выбираемых из SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением также может быть клеткой мицелиальных грибов, предпочтительно клеткой A. niger, предпочтительно клеткой А. niger, включающей одну или несколько нуклеотидных последовательностей, выбираемых из SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

Предпочтительно эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением, включающая любую одну из генетических модификаций, описанных в этом документе, способна к продуцированию по меньшей мере 0,3, 0,5, 0,7 г/л янтарной кислоты, предпочтительно по меньшей мере 1 г/л янтарной кислоты, предпочтительно по меньшей мере 1,5, предпочтительно по меньшей мере 2 или 2,5, 4,5, предпочтительно по меньшей мере 8, 10, 15 или 20 г/л янтарной кислоты, но обычно меньше 200 или меньше 150 г/л.

Предпочтительная эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением может быть

- 7 032726 способной к росту на любом подходящем источнике углерода, известным в этой области техники, и способной превращать его в янтарную кислоту. Эукариотическая клетка может быть способной непосредственно превращать растительную биомассу, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектины, рамнозу, галактозу, фукозу, мальтозу, мальтодекстрины, рибозу, рибулозу или крахмал, производные крахмала, сахарозу, лактозу и глицерин. Вследствие этого, предпочтительный организм хозяина экспрессирует ферменты, такие как целлюлаза (эндоцеллюлаза и экзоцеллюлаза) и гемицеллюлаза (например, эндо- и экзоксиланазы, арабиназы), необходимые для превращения целлюлозы в мономеры глюкозы и гемицеллюлозы в мономеры ксилозы и арабинозы, пектиназы, способные превращать пектины в глюкуроновую кислоту и галактуроновую кислоту, или амилазы, чтобы превращать крахмал в мономеры глюкозы.

Предпочтительно клетка способна превращать источник углерода, выбираемый из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, арабинозы, сахарозы, раффинозы, лактозы и глицерина.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения янтарной кислоты, включающему ферментацию эукариотической клетки в соответствии с настоящим изобретением, в которой получают янтарную кислоту.

Было установлено полезным применять эукариотическую клетку в соответствии с изобретением в способе продукции янтарной кислоты, так как большинство эукариотических клеток не нуждаются в стерильных условиях для того, чтобы размножаться, и нечувствительны к бактериофаговым инфекциям.

Предпочтительно янтарную кислоту, которую получают с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, затем превращают в требуемый продукт. Требуемый продукт, например, может быть полимером, таким как полибутиленоянтарная кислота (PBS), противогололедное средство или поверхностно-активное средство.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться в аэробных и анаэробных условиях. Предпочтительно способ осуществляют в анаэробных условиях или в микроаэрофильных условиях или в условиях с ограниченным содержанием кислорода. Способ анаэробной ферментации в этом документе определяют как способ ферментации, осуществляемый в отсутствие кислорода или в котором, по существу, не потребляется кислород, т.е. потребляется предпочтительно менее чем 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, и где органические молекулы служат как донорами электронов, так и акцепторами электронов.

Способ ферментации при пониженном содержании кислорода представляет собой способ, в котором потребление кислорода ограничено транспортом кислорода из газовой фазы в жидкость. Степень ограничения поступления кислорода определяется количеством и композицией поступающего потока газа, а также фактическими характеристиками используемого оборудования для ферментации для смешивания/переноса массы. Предпочтительно в способе в условиях пониженного содержания кислорода скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.

Способ продукции янтарной кислоты в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять при любом подходящем значении рН в диапазоне от 1 до 9. Предпочтительно рН питательной среды для ферментации составляет диапазон от 2 до 7, предпочтительно диапазон от 3 до 5. Было установлено полезным обеспечивать выполнение способа в соответствии с настоящим изобретением при низких значениях рН, так как это предотвращает бактериальное загрязнение. Кроме того, так как при продуцировании янтарной кислоты снижается рН среды, для поддержания рН на требуемом уровне может понадобиться небольшое количество раствора для титрования.

Подходящая температура, при которой осуществляют способ в соответствии с настоящим изобретением, составляет диапазон от 5 до 60°С, предпочтительно диапазон от 10 до 50°С, более предпочтительно диапазон от 15 до 35°С, более предпочтительно диапазон от 18 до 30°С. Специалисту в этой области техники известно, какие оптимальные температуры являются подходящими для ферментации в эукариотической клетке.

Предпочтительно янтарную кислоту извлекают из питательной среды для ферментации с помощью подходящего метода, известного в этой области техники, например с помощью кристаллизации и осаждения солями аммония.

Предпочтительно янтарную кислоту, которую получают с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, затем превращают в фармацевтический, косметический, пищевой, кормовой или химический продукт. Янтарную кислоту можно затем превратить в полимер, такой как полибутиленсукцинат (PBS), или другие подходящие полимеры, полученные из него.

Настоящее изобретение также относится к питательной среде для ферментации, включающей янтарную кислоту, получаемую с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение относится к способу продукции янтарной кислоты с помощью дрожжей или мицелиальных грибов в качестве продуцентов янтарной кислоты, в соответствии с чем для увеличения продукции янтарной кислоты используют фумаратредуктазу Trypanosoma, где предпочтительно фумаратредуктаза активна в цитозоле.

Г енетические модификации.

Стандартные генетические методы, такие как суперэкспрессия ферментов в клетках-хозяина, гене

- 8 032726 тическая модификация клеток-хозяина или методы гибридизации, известны в этой области техники и описаны, например, в работах Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, или F. Ausubel et al, eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Методы трансформации, генетическая модификация и т.п. для клеток грибов известны, например, из ЕР-А-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 и WO 00/37671, WO90/14423, ЕР-А-0481008, ЕР-А-0635 574 и US 6,265,186.

Приведенные ниже примеры предназначены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - карта вектора pGBTOP-11, используемого для экспрессии фумаратредуктазы в A. niger.

Фиг. 2 - карта плазмиды pGBS414SUS-07, кодирующей митохондриальную фумаратредуктазу m1(FRDm1) Trypanosoma brucei, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 3 - карта плазмиды of pGBS414SUS-08, кодирующей гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg) Trypanosoma brucei, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 4 - карта плазмиды pDEL-SDHA.

Фиг. 5 - карта плазмиды pGBTOPAn1 для суперэкспрессии FRDm1 в A. niger.

Фиг. 6 - схема замен в sdhA.

Фиг. 7 - карта плазмиды pGBS416FRD-1, кодирующей митохондриальную фумаратредуктазу m1 (FRDm1) Trypanosoma brucei, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 8 - карта плазмиды pGBS416FRE-1, кодирующей гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg) Trypanosoma brucei, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 9 - карта плазмиды pGBS414PPK-1, содержащей PEP-карбоксикиназу Actinobacillus succinogenes (PCKa) для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетическую генную конструкцию (промотор TDH1-PCKa-терминатор TDH1) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 10 - карта плазмиды pGBS414PPK-2, содержащей PEP-карбоксикиназу Actinobacillus succinogenes (PCKa) и митохондриальную фумаратредуктазу m1 Trypanosoma brucei (FRDm1), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-PCKa-терминатор TDH1) и (промотор TDH3-FRDm1-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 11 - карта плазмиды pGBS414PPK-3, содержащей PEP-карбоксикиназу Actinobacillus succinogenes (PCKa) и гликосомальную фумаратредуктазу Trypanosoma brucei (FRDg), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-PCKa-терминатор TDH1) и (промотор TDH3-FRDg-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 12 - карта плазмиды pGBS414PEK-1, содержащей PEP-карбоксикиназу Mannheimia succiniciproducens (PCKm), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетическую генную конструкцию (промотор TDHLPCKm-терминатор TDH1) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 13 - карта плазмиды pGBS414PEK-2, содержащей PEP-карбоксикиназу Mannheimia succiniciproducens (PCKm) и митохондриальную фумаратредуктазу m1 Trypanosoma brucei (FRDm1), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-PCKmтерминатор TDH1) и (промотор TDH3-FRDm1-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 14 - карта плазмиды pGBS414PEK-3, содержащей PEP-карбоксикиназу Mannheimia succiniciproducens (PCKm) и гликосомальную фумаратредуктазу Trypanosoma brucei (FRDg), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-PCKm-терминатор TDH1) и (промотор TDH3-FRDg-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS414. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 15 - карта плазмиды pGBS415FUM-2, содержащей фумаразу Rhizopus oryzae (FUMR) и цитоплазматическую малатдегидрогеназу Saccharomyces cerevisiae, укороченную на первые 12 аминокислот (дельта12N MDH2), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-FUMR-терминатор TDH1) и (промотор TDH3-MDH3-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS415. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 16 - карта плазмиды pGBS415FUM-3, содержащей фумаразу Rhizopus oryzae (FUMR) и пероксисомальную малатдегидрогеназу Saccharomyces cerevisiae (MDH3), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетические генные конструкции (промотор TDH1-FUMR-терминатор TDH1) и (промотор

- 9 032726

ТПНЗ-МПНЗ-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS415. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 17 - уровни янтарной кислоты в штаммах SUC-101 (О, контроль с пустым вектором), SUC148 (, суперэкспрессия PCKa, MDH3, FUMR, FRDm1), SUC-149 (□, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC150 (♦, PCKm, MDH3, FUMR, FRDm1), SUC-151 (O, PCKm, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-152 (·, PCKa, MDH3, FUMR), SUC-154 (X, PCKm, MDH3, FUMR) и SUC-169 (A, PCKm, дельта12NMDH2, FUMR, FRDm1). Все суперэкспрессированные гены были оптимизированы по кодоновым парам для экспрессии в S. cerevisiae. Все данные представлены в виде средних значений для 3 независимых экспериментов по выращиванию SUC-148, 149, 150, 151, 152, 154 и SUC-169 и в виде средних значений для 6 независимых экспериментов по выращиванию SUC-101.

Фиг. 18 - карта плазмиды pRS416MAE-1, содержащей малатпермеазу Schizosaccharomyces pombe (SpMAE1), для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетическую генную конструкцию (промотор Eno1-МАЕ1-терминатор Eno1) клонировали в экспрессионный вектор pRS416. CPO означает оптимизированную кодоновую пару.

Фиг. 19 - уровни янтарной кислоты в штаммах SUC-101 (О, контроль с пустым вектором), SUC169 (A, PCKm, дельта12NMDH2, FUMR, FRDm1) и SUC-194 PCKm, дельта12NMDH2, FUMR, FRDm1, SpMAE1). Все суперэкспрессированные гены были оптимизированы по кодоновым парам для экспрессии в S. cerevisiae. Все данные представлены в виде средних значений для 3 независимых экспериментов по выращиванию SUC-169 и SUC-194 и в виде средних значений для 6 независимых экспериментов по выращиванию SUC-101.

Фиг. 20 - уровни янтарной кислоты в штаммах SUC-103 (О, делеционный мутант adh1/2 и gpd1; контроль с пустым вектором), SUC-201 (□, делеционный мутант adh1/2 и gpd1; PCKa, MDH3, FUMR, FRDg) и SUC-200 (, делеционный мутант adh1/2 и gpd1; PCKa, MDH3, FUMR, FRDg, SpMAE1). Все суперэкспрессированные гены были оптимизированы по кодоновым парам для экспрессии в S. cerevisiae.

Фиг. 21 - карта плазмиды pGBS426PYC-2, содержащей пируваткарбоксилазу Saccharomyces cerevisiae, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Нуклеотидную последовательность, кодирующую PYC2, получали методом ПЦР, используя геномную ДНК штамма CEN.PK113-5D в качестве матрицы, и продукт ПЦР клонировали в экспрессионный вектор p426GPD.

Фиг. 22 - карта плазмиды pGBS414FRE-1, кодирующей гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg) Trypanosoma brucei, для экспрессии в Saccharomyces cerevisiae. Синтетическую генную конструкцию (промотор TDH3-FRDg-терминатор TDH3) клонировали в экспрессионный вектор pRS414.

Фиг. 23 - уровни янтарной кислоты в штаммах SUC-226 (□, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-227 (A, PYC2, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-228 (, PYC2, MDH3, FUMR, FRDg) и SUC-230 (O, MDH3, FUMR, FRDg). Данные представлены в виде средних значений для 3 независимых экспериментов по выращиванию.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Примеры.

Пример 1. Клонирование фумаратредуктаз Trypanosoma brucei в Aspergillus niger.

1.1. Экспрессионные конструкции.

Митохондриальную фумаратредуктазу m1 (FRDm1) [E.C. 1.3.1.6] Trypanosoma brucei, номер доступа в GenBank 60460035, анализировали на присутствие сигнальной последовательности с помощью программы SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. et al. (2004) Mol. Biol., 340:783795 и TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. В N-концевой половине белка была идентифицирована предполагаемая последовательность, направляющая в митохондрии, включающая возможный участок расщепления между положениями 25 и 26 (D-S).

Было показано, что рекомбинантный белок FRDm1, лишенный 68 N-концевых остатков, был релокализован в цитозоле проциклических трипаносом (Coustou et al., J Biol Chem. 2005 Apr 29; 280(17): 16559-70). Эти результаты указывают на то, что предполагаемый N-концевой сигнальный мотив FRDm1 необходим для направления белка в митохондрии. Из SEQ ID NO: 1 удаляли первые 68 аминокислот (соответствует нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2) и вставляли новую аминокислоту метионин, что приводило к получению SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, раскрытого в WO2008/000632 для A. niger. Полученную последовательность SEQ ID NO: 7 помещали позади конститутивной промоторной последовательности GPDA SEQ ID NO: 11, в которой последовательности из 10 последних нуклеотидов заменяли на оптимальную последовательность Козака CACCGTAAA. Добавляли подходящие сайты рестрикции. Стоп-кодон ТАА в SEQ: ID NO: 7 заменяли на ТААА. Полученную последовательность синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany). Фрагмент клонировали по сайтам рестрикции SnaBI и SfiI в вектор pGBTOP11 для экспрессии в A. niger (фиг. 1), используя подходящие сайты рестрикции. Полученную плазмиду, включающую FRDm1, назвали pGBTOPAn1 (фиг. 5).

Аналогичным образом гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg) [E.C. 1.3.1.6] Trypanosoma brucei, код доступа в GenBank 23928422, анализировали на присутствие последовательности, направляющей

- 10 032726 белок в пероксисомы у мицелиальных грибов, с помощью PTSl-предиктора http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp с предсказывающей функцией, специфичной для грибов. Из белка с последовательностью SEQ ID NO: 4 удаляли С-концевые аминокислоты в положениях 1140-1142 (SKI) (соответствует нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5), в результате получали SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 6 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, раскрытого в РСТ/ЕР2007/05594 для A. niger. Стоп-кодон ТАА в SEQ ID NO: 8 заменяли на ТААА. Полученную последовательность SEQ ID NO: 8 помещали позади конститутивной промоторной последовательности GPDA SEQ ID NO: 11 и вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную последовательность синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany). Фрагмент клонировали по сайтам рестрикции SnaBI и SfiI в вектор pGBTOP11 для экспрессии в A. niger (фиг. 1), используя подходящие сайты рестрикции.

1.2. Трансформация A. niger.

A. niger WT-1.

Этот штамм A. niger CBS513.88 включает делеции генов, кодирующих глюкоамилазу (glaA), амилазу грибов и кислую амилазу. A. niger WT 1 был сконструирован с помощью метода MARKER-GENE FREE, описанного в ЕР 0635574 В1.

Экспрессионные конструкции были ко-трансформированы в штамм A. niger WT-1 в соответствии с методом, описанным Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205-221 и Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 со следующими модификациями.

Споры проращивали и культивировали в течение 16 ч при 30°С во встряхиваемой колбе, помещенной в ротационный шейкер при 300 об/мин, в минимальной среде для Aspergillus (100 мл). Минимальная среда для Aspergillus в 1 л содержит: 6 г NaNO₃, 0,52 г KCl, 1,52 г KH₂PO₄, 1,12 мл 4 М KOH, 0,52 г MgSO₄-7H₂O, 10 г глюкозы, 1 г казаминовых кислот, 22 мг ZnSO₄-7H₂O, 11 мг Н₃ВО₃, 5 мг FeSO₄-7H₂O, 1,7 мг CoC₁₂-6H₂O, 1,6 мг CuSO₄-5H₂O, 5 мг MnCl₂-2H₂O, 1,5 мг Na₂MoO₄-2H₂O, 50 мг EDTA, 2 мг рибофлавина, 2 мг тиамина-HCl, 2 мг никотинамида, 1 мг пиридоксина-HCl, 0,2 мг пантотеновой кислоты, 4 г биотина, 10 мл раствора пенициллина (5000 МЕд/мл) и стрептомицина (5000 мкг/мл) (Gibco).

Для получения протопластов вместо хеликазы применяли Novozym 234™ (Novo Industries).

После образования протопластов (60-90 мин) добавляют KC-буфер (0,8 М KCl, 9,5 мМ лимонная кислота, рН 6,2) до конечного объема 45 мл, суспензию протопластов центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин при 4°С в бакет-роторе. Протопласты вновь суспендируют в 20 мл KC-буфера и последовательно добавляют 25 мл STC-буфера (1,2 М сорбит, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ CaCl₂). Суспензию протопластов центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин при 4°С в бакет-роторе, промывают в STC-буфере и ресуспендируют в STC-буфере в концентрации 10 протопластов/мл.

К 200 мкл суспензии протопластов добавляют фрагмент ДНК, растворенный в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ EDTA) и 100 мкл раствора PEG (20% PEG 4000 (Merck), 0,8 М сорбит, 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ CaCl₂).

После инкубации суспензии ДНК-протопластов в течение 10 мин при комнатной температуре медленно добавляют 1,5 мл раствора PEG (60% PEG 4000 (Merck), 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ CaCl₂) при повторяющемся перемешивании пробирок. После инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре суспензию разводят 5 мл 1,2 М сорбита, перемешивают, переворачивая пробирки, и центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об/мин при комнатной температуре. Протопласты аккуратно ресуспендируют в 1 мл 1,2 М сорбита и высевают на твердую селективную среду для регенерации, состоящей из минимальной среды для Aspergillus, не содержащей рибофлавина, тиамина-HCl, никотинамида, пиридоксина, пантотеновой кислоты, биотина, казаминовых кислот и глюкозы. В случае ацетамидной селекции среда содержит 10 мМ ацетамида в качестве единственного источника азота и 1 М сахарозу в качестве вещества, обеспечивающего осмотичность среды, и в качестве источника углерода. Альтернативно, протопласты высевают на PDA (картофельно-декстрозный агар, Oxoid), дополненный 1-50 мкг/мл флеомицина и 1 М сахарозой в качестве вещества, обеспечивающего осмотичность среды. Содержимое чашек для регенерации делают твердым с помощью 2%-ного агара (агар № 1, Oxoid L11). После инкубации в течение 6-10 дней при 30°С конидиоспоры трансформантов переносят в чашки, содержащие селективную среду для Aspergillus (минимальная среда, содержащая ацетамид в качестве единственного источника азота в случае ацетамидной селекции или PDA, дополненную 1-50 мкг/мл флеомицина в случае флеомициновой селекции) с 2%-ной глюкозой и 1,5%-ной агарозой (Invitrogen), и инкубируют в течение 5-10 дней при 30°С. Выделяют отдельные трансформанты и эту стадию селективной очистки повторяют еще раз, после чего сохраняют очищенные трансформанты.

1.3. Выращивание A. niger в колбах на качалке.

В общей сложности для каждой конструкции отбирают 10 трансформантов и наличие конструкции подтверждают с помощью ПЦР, используя праймеры, специфичные для конструкций. Затем споры инокулируют в 100 мл минимальной обогащенной среды для Aspergillus, включающей 100 г/л глюкозы. Штаммы выращивают в термостате при 250 об/мин в течение 4 дней при 34°С. Супернатант культуральной среды анализируют на образование щавелевой кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты и

- 11 032726 янтарной кислоты с помощью ВЭЖХ и сравнивают с нетрансформированным штаммом.

1.4 Анализ ВЭЖХ.

Для определения органических кислот и сахаров в различных типах образцов проводят ВЭЖХ. Принцип разделения на колонке Phenomenex Rezex-RHM-Monosaccharide основан на механизмах гельфильтрации, ионообменной хроматографии и ионного обмена с использованием обращенной фазы. Обнаружение проводят с помощью дифференциального индекса рефракции и ультрафиолетовых детекторов.

Пример 2А. Клонирование фумаратредуктаз Trypanosoma brucei в Saccharomyces cerevisiae.

2A. 1. Экспрессионные конструкции.

Митохондриальную фумаратредуктазу m1 (FRDm1) [E.C. 1.3.1.6] Trypanosoma brucei, код доступа в GenBank 60460035, анализировали на присутствие сигнальной последовательности и проводили оптимизацию кодонов, как описано в разделе 1.1 для экспрессии в S. cerevisiae. Полученную последовательность SEQ ID NO: 9 помещали позади последовательности конститутивного промотора TDH3 SEQ ID NO: 12 и перед последовательностью терминатора TDH3 SEQ ID NO: 13 и вводили подходящие сайты рестрикции. Стоп-кодон TGA в SEQ ID NO: 9 заменяли на TAAG. Полученную последовательность синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany). Экспрессионную конструкцию pGBS414SUS-07 получали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS414 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической конструкции гена фумаратредуктазы (фиг. 2). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli DH10B (Invitrogen), что приводило к получению конструкции pGBS414SUS-07 для экспрессии в дрожжах (фиг. 2).

Аналогичным образом гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg) [E.C. 1.3.1.6] Trypanosoma brucei, код доступа в GenBank 23928422, анализировали на присутствие последовательности, направляющей белок в пероксисомы, и проводили оптимизацию кодонов, как было описано в разделе 1.1 для экспрессии в S. cerevisiae. Полученную последовательность SEQ ID NO: 10 помещали позади последовательности конститутивного промотора TDH3 SEQ ID NO: 12 и перед последовательностью терминатора TDH3 SEQ ID NO: 13 и вводили подходящие сайты рестрикции. Стоп-кодон TGA в SEQ ID NO: 10 заменяли на TAAG. Полученную последовательность синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany). Экспрессионную конструкцию pGBS414SUS-08 создавали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS414 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической конструкции гена фумаратредуктазы (фиг. 3). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli DH10B (Invitrogen), что приводило к получению конструкции pGBS414SUS-08 для экспрессии в дрожжах (фиг. 3).

Конструкции pGBS414SUS-07 и pGBS414SUS-08 независимо трансформировали в штаммы S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), RWB066 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox) и RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox). Трансформированные смеси высевали на дрожжевой минимальной азотистой среде (YNB) без АК (Difco) + 2% глюкозы, дополненной подходящими аминокислотами. Трансформанты инокулировали в среду Verduyn, включающую глюкозу, дополненную подходящими аминокислотами (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul;8(7):501-17), и выращивали в колбах на качалке в аэробных, анаэробных условиях и условиях с ограниченным содержанием кислорода. Среду для анаэробного выращивания дополняли 0,01 г/л эргостерола и 0,42 г/л Tween 80, растворенных в этаноле (Andreasen and Stier, 1953, J. cell. Physiol, 41, 23-36; Andreasen and Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281). Все культуры дрожжей выращивали при 30°С на термостатируемой качалке при 250-280 об/мин. В различные моменты времени инкубирования отбирали аликвоты культур, центрифугировали и среду анализировали с помощью ВЭЖХ на образование щавелевой кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты и янтарной кислоты, как было описано в разделе 1.4.

Пример 2В. Клонирование фумаратредуктаз Trypanosoma brucei в Saccharomyces cerevisiae.

2В.1. Экспрессионные конструкции.

Так же, как было описано в примере 2А.1, митохондриальную фумаратредуктазу Trypanosoma brucei (FRDm, SEQ ID NO: 9) лигировали в вектор pRS416 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27). Лигированную смесь использовали для трансформации клеток Е. coli TOP10 (Invitrogen), что приводило к получению конструкций для экспрессии в дрожжах и pGBS416FRD-1 (фиг. 7).

Аналогичным образом гликосомальную фумаратредуктазу (FRDg, SEQ ID NO: 10) Trypanosoma brucei лигировали в вектор pRS416 для экспрессии в S. cerevisiae. Лигированную смесь использовали для трансформации клеток Е. coli TOP10 (Invitrogen), что приводило к получению конструкции pGBS416FRE-1 для экспрессии в дрожжах (фиг. 8).

- 12 032726

2В.2. Трансформация и эксперименты по выращиванию в микротитровальных планшетах (MTP's).

Конструкции pGBS416FRD-1 и pGBS416FRE-1 независимо трансформировали в штамм S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATA ura3-52). В качестве отрицательного контроля штамм CEN.PK 113-5D трансформировали пустым вектором pRS416. Трансформированные смеси высевали на дрожжевой минимальной азотистой среде (YNB) без АК (Difco) + 2% глюкозы. Отдельные трансформанты в приведенном ниже количестве инокулировали в двойных повторах в 250 мкл среды Verduyn, включающей 2% глюкозы, в MTP's с 96 глубокими лунками и предварительно культивировали при 30°С, 550 об/мин и влажности 80% на термостатируемой качалке для планшетов Infors: 12 трансформантов pGBS416FRD-1 (FRDm1), 12 трансформантов pGBS416FRE-1 (FRDg) и 24 контрольных трансформантов с пустым вектором pRS416. Через 3 дня 25 мк прекультуры, находящейся в лунках планшетов МТР, переносили в новые планшеты МТР с 96 глубокими лунками, содержащими среду Verduyn, содержащую глюкозу и CaCO₃ (конечные концентрации: 10% глюкозы, 1% мас./об. CaCO₃, в конечном объеме 250 мкл). Через 3 и 7 дней роста при 30°С, 550 об/мин и влажности 80% на термостатируемой качалке для планшетов Infors планшеты МТР центрифугировали в течение 2 мин при 2000 об/мин с помощью Multimek 96 (Beckman) и собирали 200 мкл супернатанта. Супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ, как было описано в примере 1.4, на присутствие янтарной кислоты. Результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Эффект введения митохондриальной (FRDm1) и гликосомальной фумаратредуктазы (FRDg) T. brucei в S. cerevisiae на уровень продукции янтарной кислоты через 3 и 7 дней инкубации

S. cerevisiae, включающие плазмиду:	Янтарная кислота (мг/л) через 3 дня	Янтарная кислота (мг/л) через 7 дней
«Пустой» вектор pRS416	138±18(п=48)	203±48 (п=48)
pGBS416FRD-l (FRDml)	340±65 (п=24)	399±72 (п=24)
pGBS416FRE-l (FRDg)	489±30 (п=24)	516±57 (п=24)

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что введение и суперэкспрессия митохондриальной фумаратредуктазы (FRDm1) T. brucei приводили к увеличению уровня продукции янтарной кислоты (в 2,47 раза, р=6,96Е-14, критерий Стьюдента, через 3 дня инкубации; и в 1,97 раза, р=8,63Е-14, критерий Стьюдента через 7 дней инкубации).

Аналогичным образом, введение и суперэкспрессия гликосомальной фумаратредуктазы (FRDg) T. brucei приводили к увеличению уровня продукции янтарной кислоты (в 3,55 раза, р=5,08Е-32, критерий Стьюдента, через 3 дня инкубации; и повышение в 2,55 раза, р=8,63Е-25, критерий Стьюдента через 7 дней инкубации).

Пример 2С. Экспрессия PEP-карбоксикиназы Actinobacillus succinogenes или Mannheimia succiniciproducens и малатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae и фумаразы Rhizopus oryzae и фумаратредуктазы Trypanosoma brucei в Saccharomyces cerevisiae.

2C.1. Последовательности генов.

Фосфоенолпируваткарбоксикиназа.

Фосфоенолпируваткарбоксикиназу [Е.С. 4.1.1.49] Actinobacillus succinogenes, код доступа в GenBank 152977907, анализировали на присутствие сигнальной последовательности с помощью программы SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. et al. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 и TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. Анализ, описанный в работе Schluter et al., (2007) NAR, 35, D815-D822, выявил предполагаемую сигнальную последовательность PTS2 в положениях 115-123. Последовательность A. succinogenes модифицировали, чтобы иметь сходство с белковой последовательностью Mannheimia succiniciproducens, с помощью замены аминокислот EGY в положении 120-122 на DAF, что приводило к получению аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 15). SEQ ID NO: 14 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, как было описано в WO2008/000632 для S. cerevisiae. Стоп-кодон ТАА в полученной последовательности SEQ ID NO: 16 заменяли на TAAG. Эту последовательность SEQ ID NO: 16, содержащую стоп-кодон TAAG, помещали позади конститутивной последовательности промотора TDH1 SEQ ID NO: 25 и перед последовательностью терминатора TDH1 SEQ ID NO: 26, и вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную последовательность SEQ ID NO: 29 синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

Аналогичным образом, фосфоенолпируваткарбоксикиназу [Е.С. 4.1.1.49] Mannheimia succiniciproducens, код доступа в GenBank 52426348, анализировали на присутствие сигнальной последовательности, как было описано в работе Schluter et al., (2007) NAR, 35, D815-D822. Последовательность, как видно из SEQ ID NO: 17, не требовала модификаций. SEQ ID NO: 17 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, как было описано в WO2008/000632 для S. cerevisiae. Стоп-кодон ТАА в полученной последовательности SEQ ID NO: 18 заменяли на TAAG. SEQ ID NO: 18, содержащую стопкодон TAAG, помещали позади конститутивной последовательности промотора TDH1 SEQ ID NO: 25 и перед последовательностью терминатора TDH1 SEQ ID NO: 26. Вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную синтетическую конструкцию (SEQ ID NO: 30) синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

- 13 032726

Малатдегидрогеназа.

Цитоплазматическая малатдегидрогеназа (Mdh2p) [E.C. 1.1.1.37], код доступа в GenBank 171915, регулируется с помощью катаболитной репрессии углеродом: после добавления глюкозы к клеткам, дефицитным по глюкозе, транскрипция MDH2 репрессируется и Mdh2p разрушается. Mdh2p с делецией 12 N-концевых аминокислот менее чувствительна к деградации, индуцируемой глюкозой (Minard and McAlister-Henn, J Biol Chem. 1992 Aug 25; 267(24):17458-64). Чтобы предотвратить деградацию Mdh2, индуцируемую глюкозой, удаляли нуклеотиды, кодирующие первые 12 аминокислот, и вводили новую аминокислоту метионин (SEQ ID NO: 19) для суперэкспрессии Mdh2 в S. cerevisiae. SEQ ID NO: 19 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, как было описано в WO2008/000632 для S. cerevisiae. Стоп-кодон ТАА в полученной SEQ ID NO: 20 заменяли на TAAG. SEQ ID NO: 20, содержащую модифицированный стоп-кодон TAAG, кодирующую дельта12NMDH2, помещали позади конститутивной последовательности промотора TDH3 SEQ ID NO: 12 и перед последовательностью терминатора TDH3 SEQ ID NO: 13, и вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную синтетическую конструкцию (SEQ ID NO: 31) синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

Пероксисомальную малатдегидрогеназу (Mdh3p) [E.C. 1.1.1.37], код доступа в GenBank 1431095, анализировали на присутствие сигнальной последовательности, направляющей белок в мицелиальных грибах в пероксисомы, с помощью PTS1-предиктора http://mendel.imp.ac.at/mendeIjsp/sat/pts1/PTS1predictor.Jsp с предсказывающей функцией, специфичной для грибов. Из белка MDH3 удаляли С-концевые аминокислоты в положениях 341-343 (SKL), в результате получали SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 21 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, раскрытого в РСТ/ЕР2007/05594 для A. niger. Стоп-кодон TGA в полученной последовательности SEQ ID NO: 22 заменяли на TAAG. Полученную последовательность SEQ ID NO: 22, содержащую TAAG в качестве стоп-кодона, синтезировали позади конститутивной последовательности промотора TDH3 SEQ ID NO: 27 (600 пар оснований против хода транскрипции относительно инициирующего кодона) и перед последовательностью терминатора TDH3 SEQ ID NO: 28 (300 пар оснований по ходу транскрипции относительно стоп-кодона), и вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную последовательность SEQ ID NO: 32 синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

Фумараза.

Фумаразу [Е.С. 4.2.1.2] Rhizopus oryzae (FumR), код доступа в GenBank 469103, анализировали на присутствие сигнальной последовательности с помощью программы SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. et al. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 и TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. Предполагаемую последовательность, направляющую белок в митохондрии, идентифицировали в первых 23 аминокислотах белка. Чтобы предотвратить потенциальное направление белка в митохондрии в S. cerevisiae, из FumR удаляли первые 23 аминокислоты и вновь вводили аминокислоту метионин, что приводило к получению SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 23 подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, как было описано в WO2008/000632 для S. cerevisiae, что приводило к получению SEQ ID NO: 24. Стоп-кодон ТАА в SEQ ID NO: 24 заменяли на TAAG. SEQ ID NO: 24, содержащую TAAG в качестве стоп-кодона, синтезировали позади конститутивной последовательности промотора TDH1 SEQ ID NO: 25 и перед последовательностью терминатора TDH1 SEQ ID NO: 26 и вводили подходящие сайты рестрикции. Полученную синтетическую конструкцию SEQ ID NO: 33 синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

Фумаратредуктаза.

Последовательности генов митохондриальной фумаратредуктазы (FRDm1) и гликосомальной фумаратредуктазы (FRDg) T. brucei конструировали и синтезировали, как описано в разделе 2A.1.

2C.2. Создание экспрессионных конструкций.

Экспрессионные конструкции pGBS414PPK-1 (фиг. 9), pGBS414PPK-2 (фиг. 10) и pGBS414PPK-3 (фиг. 11) были получены после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS414 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической конструкции гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы (происходящей из Actinobacillus succinogenes) (SEQ ID NO: 29). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), что приводило к получению конструкции pGBS414PPK-1 для экспрессии в дрожжах. Затем pGBK414PPK-1 расщепляли рестриктазами AscI и NotI. Для получения pGBS414PPK-2 рестрикционный фрагмент AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции митохондриальной фумаратредуктазы Т. brucei (FRDm1) (SEQ ID NO: 34), лигировали в расщепленный рестриктазами вектор pGBS414PPK-1. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS414PPK-2 для экспрессии в дрожжах (фиг. 10). Для получения pGBS414PPK-3 рестрикционный фрагмент AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции гликосомальной фумаратредуктазы Т. brucei (FRDg) (SEQ ID NO: 35), лигировали в расщепленный рестриктазами вектор pGBS414PPK-1. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS414PPK3 для экспрессии в дрожжах (фиг. 11).

- 14 032726

Экспрессионные конструкции pGBS414PEK-1 (фиг. 12), pGBS414PEK-2 (фиг. 13) и pGBS414PEK-3 (фиг. 14) получали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS414 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической генной конструкции фосфоенолпируваткарбоксикиназы (происходящей из Mannheimia succiniciproducens) (SEQ ID NO: 30). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS414PEK-1 для экспрессии в дрожжах. Затем pGBK414PEK-1 расщепляли рестриктазами AscI и NotI. Для получения pGBS414PEK-2 фрагмент рестрикции AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции митохондриальной фумаратредуктазы Т. brucei (FRDm1) (SEQ ID NO: 34), лигировали в вектор pGBS414PEK-1, расщепленный рестриктазами. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS414PEK-2 для экспрессии в дрожжах (фиг. 13). Для получения pGBS414PEK-3 фрагмент рестрикции AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции гликосомальной фумаратредуктазы Т. brucei (FRDg) (SEQ ID NO: 35), лигировали в вектор pGBS414PEK-1, расщепленный рестриктазами. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen) приводящей к получению конструкции pGBS414PEK3 для экспрессии в дрожжах (фиг. 14).

Экспрессионные конструкции pGBS415FUM-2 (фиг. 15) и pGBS415FUM-3 (фиг. 16) получали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS415 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической генной конструкции фумаразы (происходящей из Rhizopus oryzae) (SEQ ID NO: 33). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS415FUM-1 для экспрессии в дрожжах. Затем pGBK415FUM-1 расщепляли рестриктазами AscI и NotI. Для получения pGBS415FUM-2 фрагмент рестрикции AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции цитоплазматической малатдегидрогеназы S. cerevisiae (дельта12NMDH2) (SEQ ID NO: 31), лигировали в вектор pGBS415FUM-1, расщепленный рестриктазами. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS415FUM-2 для экспрессии в дрожжах (фиг. 15). Для получения pGBS415FUM-3 фрагмент рестрикции AscI/NotI, состоящий из синтетической генной конструкции пероксисомальной малатдегидрогеназы S. cerevisiae (MDH3) (SEQ ID NO: 32), лигировали в вектор pGBS415FUM-1, расщепленный рестриктазами. Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS415FUM-3 для экспрессии в дрожжах (фиг. 16).

2C.3. Штаммы S. cerevisiae.

Различные комбинации плазмид pGBS414PPK-1, pGBS414 PPK-2, pGBS414PPK-3, pGBS414PEK-1, pGBS414PEK-2, pGBS414PEK-3, pGBS415FUM-2, pGBS415-FUM-3 были трансформированы в штамм S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), что приводило к получению дрожжевых штаммов, указанных в табл. 2. Кроме указанных плазмид для получения прототрофных штаммов дрожжей был трансформирован pRS416 (пустой вектор). Экспрессионные векторы были трансформированы в дрожжи с помощью электропорации. Трансформированные смеси высевали на чашки с минимальной азотистой средой (YNB) без АК (Difco) + 2% глюкозы.

Таблица 2

Штаммы дрожжей, сконструированные для примера 2С

Название	Основа	Плазмиды	Гены
SUC-148	CEN.PK113-6B	pGBS414PPK-2 pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	РСКа, FRDml FUMR, MDH3
SUC-149	CEN.PK113-6B	pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	РСКа, FRDg FUMR, MDH3
SUC-150	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-2 pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	PCKm, FRDml FUMR, MDH3
SUC-151	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-3 pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	PCKm, FRDg FUMR, MDH3
SUC-152	CEN.PK113-6B	pGBS414PPK-l pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	PCKa FUMR, MDH3
SUC-154	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-l pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	PCKm FUMR, MDH3
SUC-169	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-2	PCKm, FRDml
		pGBS415FUM-2 pRS416 («пустой» вектор)	FUMR, A12NMDH2
SUC-101	CEN.PK113-6B	pRS414 («пустой» вектор) pRS415 («пустой» вектор) pRS415 («пустой» вектор)

- 15 032726

2С.4. Эксперименты по выращиванию и продукции янтарной кислоты.

Трансформанты инокулировали в 20 мл среды для предварительного культивирования, состоящей из среды Verduyn (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul; 8(7):501-17), включающей 2% галактозу (мас./об.), и выращивали в аэробных условиях в колбах объемом 100 мл на термостатируемой качалке при 30°С при 250 об/мин. Через 72 ч культуру центрифугировали в течение 5 мин при 4750 об/мин. Для измерения уровня янтарной кислоты с помощью ВЭЖХ использовали 1 мл суспензии, как было описано в разделе 1.4. Оставшийся супернатант декантировали и осадок (клетки) ресуспендировали в 1 мл среды для продуцирования. Среда для продуцирования состоит из среды Verduyn с 10% галактозы (мас./об.) и 1% CaCO₃ (мас./об.). Ресуспендированные клетки инокулировали в 50 мл среды для продуцирования в колбах объемом 100 мл и выращивали на термостатируемой качалке при 30°С при 100 об/мин. В различные временные точки из культуры отбирали образец объемом 1 мл и с помощью ВЭЖХ измеряли уровень янтарной кислоты, как было описано в разделе 1.4 (фиг. 17).

Штаммы, трансформированные пустыми векторами (контрольный штамм), продуцировали до 0,3 г/л янтарной кислоты. Суперэкспрессия PEP-карбоксикиназы М. succiniciproducens (PCKm), пероксисомальной малатдегидрогеназы (MDH3) S. cerevisiae и фумаразы R. oryzae (FUMR) приводила к продукции 0,9 г/л янтарной кислоты. Суперэкспрессия PEP-карбоксикиназы A. succinogenes (PCKa), MDH3 и FUMR приводила к небольшому увеличению продукции янтарной кислоты до 1,0 г/л.

Эти результаты показывают, что S. cerevisiae, как было описано выше, увеличивают продукцию янтарной кислоты примерно в 3 раза.

Дополнительная суперэкспрессия митохондриальной фумаратредуктазы (FRDm1) Т. brucei также повышает уровень продукции янтарной кислоты; суперэкспрессия PCKa, MDH3, FUMR, FRDm1 приводила к продукции 2,6 г/л янтарной кислоты, а суперэкспрессия PCKm, MDH3, FUMR и FRDm1 приводила к продукции 2,7 г/л янтарной кислоты. Суперэкспрессия дельта12NMDH2 в комбинации с PCKm, FUMR и FRDm1 приводила к продукции 2,7 г/л янтарной кислоты, что указывает на то, что сходные уровни янтарной кислоты продуцировались при использовании и укороченной MDH2, и MDH3. Дополнительная суперэкспрессия гликосомальной фумаратредуктазы (FRDg) Т. brucei приводила к еще более сильному увеличению уровня продукции янтарной кислоты; суперэкспрессия PCKa, MDH3, FUMR и FRDg приводила к продукции 3,9 г/л янтарной кислоты, тогда как суперэкспрессия PCKm, MDH3, FUMR и FRDg приводила к небольшому снижению продукции до 3,6 г/л янтарной кислоты.

Результаты демонстрируют, что добавление NAD(H)-зависимой фумаратредуктазы, как раскрыто в этом документе, в S. cerevisiae, включающее генетическую модификацию PCKa/m, MDH3 и FUMR, значительно повышало уровень продукции янтарной кислоты.

Суперэкспрессия FRDg оказывала более позитивный эффект на уровень продукции янтарной кислоты в S. cerevisiae по сравнению с суперэкспрессией FRDm1 в S. cerevisiae.

Пример 2D. Влияние суперэкспрессии транспортера дикарбоновых кислот на продукцию янтарной кислоты в клетках S. cerevisiae, продуцирующих янтарную кислоту.

2D.1. Последовательности генов.

Малатпермеазу Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 36), код доступа в GenBank 119368831, подвергали обработке с помощью метода оптимизации пар кодонов, как было описано в WO2008/000632 для S. cerevisiae, что приводило к получению SEQ ID NO: 37. Стоп-кодон ТАА в SEQ ID NO: 37 заменяли на TAAG. SEQ ID NO: 37, содержащую TAAG в качестве стоп-кодона, помещали позади конститутивной последовательности промотора ENO1 SEQ ID NO: 38 и перед последовательностью терминатора ENO1 SEQ ID NO: 39, и вводили подходящие сайты рестрикции. В промоторе ENO1 Т в положении 596 (-5) заменяли на А, чтобы получить оптимальную последовательность Козака. Полученную последовательность SEQ ID NO: 40 синтезировали в Sloning (Puchheim, Germany).

2D.2. Создание экспрессионных конструкций.

Экспрессионные конструкции pGBS416MAE-1 (фиг. 18) получали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS416 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической генной конструкции малатного транспортера Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 40). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS416MAE-1 для экспрессии в дрожжах.

2D.3. Штаммы S. cerevisiae.

Плазмиды pGBS414PEK-2, pGBS415FUM-2 и pGBS416MAE-1 (описанные в разделе 2С.2.) были трансформированы в штамм S. cerevisiae CEN.PK113-6В (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) для получения штамма SUC-194, суперэкспрессирующего PCKm, дельта12NMDH2, FUMR, FRDm1 и SpMAE1. Все гены были оптимизированы по парам кодонов для экспрессии в S. cerevisiae.

Экспрессионные векторы были трансформированы в дрожжи с помощью электропорации. Трансформированные смеси высевали на чашки с минимальной азотистой средой (YNB) без АК (Difco) + 2% глюкозы. Штамм SUC-101 описан в табл. 2.

- 16 032726

Таблица 3

Штаммы дрожжей, сконструированные для примера 2D.

Название	Основа	Плазмиды	Гены
SUC-132	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-2 pGBS415FUM-2 pRS416 («пустой» вектор)	PCKm, FRDml FUMR, A12NMDH2
SUC-194	CEN.PK113-6B	pGBS414PEK-2 PGBS415FUM-2 PRS416MAE-1	PCKm, FRDml FUMR, A12NMDH2 SpMAEl

2D.4. Эксперименты по выращиванию и продукция янтарной кислоты в штаммах CEN.PK дикого типа.

Параметры роста и анализ образцов проводили, как было описано в примере 2С.4 со следующими модификациями: предварительное культивирование проводили с использованием 2% глюкозы (мас./об.) в качестве источника углерода. В среде для продуцирования в качестве источника углерода использовали 10% глюкозы (мас./об.).

Штаммы, трансформированные пустыми векторами (контрольный штамм), продуцировали до 0,3 г/л янтарной кислоты. Дополнительная суперэкспрессия SpMAE1 в штамме SUC-194, суперэкспрессирующем PCKm, дельта12NMDH2, FUMR и FRDm1, приводила к увеличению уровня продукции янтарной кислоты до 4,6 г/л, тогда как штамм SUC-132, суперэкспрессирующий PCKm, дельта12NMDH2, FUMR и FRDm1, в результате продуцировал 2,7 г/л янтарной кислоты.

Результаты показывают, что введение малатного транспортера в S. cerevisiae, включающее генетические модификации, описанные в этом документе, дополнительно повышало продукцию янтарной кислоты по меньшей мере в 1,5 раза.

Пример 2Е. Влияние транспортера дикарбоновых кислот в S. cerevisiae, включающих делецию генов алкогольдегидрогеназы 1 и 2 (adh1, adh2) и гена глицерол-3-фосфатдегидрогеназы 1 (gpd1), на уровень продукции янтарной кислоты.

2Е.1. Последовательности генов.

Описано в разделе 2D.1.

2Е.2. Создание экспрессионных конструкций.

Описано в разделе 2D.2.

2Е.З. Штаммы S. cerevisiae.

Плазмиды pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 и pGBS416MAE-1 (описанные в разделе 2С.2.) были трансформированы в штамм S. cerevisiae RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox) для получения штамма SUC-201, суперэкспрессирующего PCKa, MDH3, FUMR, FRDg и SpMAE1. Все гены были оптимизированы по парам кодонов для экспрессии в S. cerevisiae.

Таблица 4

Штаммы дрожжей, сконструированные для примера 2Е

Название	Основа	Плазмиды	Гены
SUC-200	CEN.PK113-6B adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanlox	pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 pGBS416MAE-l	PCKa, FRDg FUMR, MDH3 SpMAEl
SUC-201	CEN.PK113-6B adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanlox	pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 pRS416 («пустой» вектор)	PCKa, FRDg FUMR, MDH3
SUC-103	CEN.PK113-6B adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanlox	pRS414 («пустой» вектор) pRS415 («пустой» вектор) pRS415 («пустой» вектор)

2Е.4. Эксперименты по выращиванию и продукции янтарной кислоты в штаммах CEN.PK, делетированных по генам алкогольдегидрогеназы 1 и 2 (adh1, adh.2), и гену глицерол-3-фосфатдегидрогеназы 1 (gpd1).

Параметры роста и анализ образцов проводили, как описано в примере 2С.4, со следующими модификациями: предварительное культивирование проводили, используя 2% галактозы (мас./об.) в качестве источника углерода. В среду для продуцирования во временных точках t=0, 3 и 7 дней добавляли 5% галактозы (мас./об.).

Штамм SUC-103, трансформированный пустыми векторами (контрольный штамм), продуцировал 0,9 г/л янтарной кислоты после выращивания в течение 10 дней на среде для продуцирования (фиг. 20). Суперэкспрессия PCKa, MDH3, FUMR и FRDg в штамме RWB064 приводила к увеличению уровня продукции янтарной кислоты до 2,5 г/л (штамм SUC-201, фиг. 20). Дополнительная суперэкспрессия SpMAE1 помимо PCKa, MDH3, FUMR и FRDg в штамме RWB064 приводила к дальнейшему повышению уровня продукции янтарной кислоты до 11,9 г/л (штамм SUC-200, фиг. 20).

Результаты демонстрируют, что суперэкспрессия малатного транспортера в S. cerevisiae, включаю

- 17 032726 щих делецию генов алкогольдегидрогеназы и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, приводила к значительному увеличению уровня продукции янтарной кислоты. Кроме того, было показано, что делеция генов adh1, adh2 и gpd1 (SUC 103) приводила к увеличению уровня продукции янтарной кислоты по сравнению со штаммом дикого типа (SUC 101, табл. 2).

Пример 2F. Клонирование фосфоенолпируваткарбоксикиназы Actinobacillus succinogenes, пируваткарбоксилазы Saccharomyces cerevisiae, малатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae, фумаразы Rhizopus oryzae в Saccharomyces cerevisiae и фумаратредуктазы Trypanosoma brucei.

2F.1. Последовательности генов.

Последовательности генов PEP-карбоксикиназы A. succinogenes, малатдегидрогеназы S. cerevisiae, фумаразы R. oryzae и фумаратредуктазы Т. brucei были описаны в разделе 2F.1. Цитоплазматическая пируваткарбоксилаза Saccharomyces cerevisiae (Рус2р) [Е.С. 6.4.1.1.] SEQ ID NO: 41, код доступа в GenBank 1041734, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 42. Геномную ДНК штамма S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATA ura3-52) применяли в качестве матрицы для амплификации последовательности (SEQ ID NO: 42), кодирующей PYC2, используя праймеры P1 (SEQ ID NO: 43) и Р2 (SEQ ID NO: 44) и набор Phusion DNA polymerase (Finnzymes, Finland) в соответствии с инструкциями фирмыпроизводителя. В праймеры были введены подходящие сайты рестрикции в целях дальнейшего клонирования.

2F.2. Создание экспрессионных конструкций.

Экспрессионную конструкцию pGBS426PYC-2 (фиг. 21) получали после рестрикции SpeI/XhoI вектора p426GPD для экспрессии в S. cerevisiae (Mumberg et al., Gene. 1995 Apr 14; 156(1):119-22) и последующего лигирования в этот вектор рестрикционного фрагмента SpeI/XhoI, состоящего из амплифицированной нуклеотидной последовательности PYC2 (SEQ ID NO: 42). Лигированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS426PYC-2 для экспрессии в дрожжах (фиг. 21). Конструирование экспрессионных векторов pGBS414PPK-3 и pGBS415FUM-3 описано в разделе 2С.2. Экспрессионную конструкцию pGBS414FRE-1 создавали после рестрикции BamHI/NotI вектора pRS414 для экспрессии в S. cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) и последующего лигирования в этот вектор фрагмента рестрикции BamHI/NotI, состоящего из синтетической генной конструкции гликосомальной фумаратредуктазы (происходившей из Trypanosoma brucei) (SEQ ID NO: 35). Дотированную смесь использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen), приводящей к получению конструкции pGBS414FRE-1 для экспрессии в дрожжах (фиг. 22).

2F.3. Штаммы S. cerevisiae.

Штаммы SUC-226, SUC-227, SUC-228 и SUC-230 получали с помощью трансформации различных комбинаций плазмид pGBS414FRE-1, pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-1, pGBS426PYC-2 и p426GPD в штамм CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), как указано в табл. 5.

Таблица 5

Штаммы дрожжей, сконструированные для примера 2F

Название	Основа	Плазмиды	Гены
SUC-226	CEN.PK113-6B	pGBS414PPK-3 PGBS415FUM-3 p426GPD («пустой» вектор)	РСКа, FRDg FUMR, MDH3
SUC-227	CEN.PK113-6B	pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 PGBS426PYC-2	РСКа, FRDg FUMR, MDH3 PYC2
SUC-228	CEN.PK113-6B	pGBS414FRE-l pGBS415FUM-3 PGBS426PYC-2	FRDg FUMR, MDH3 PYC2
SUC-230	CEN.PK113-6B	pGBS414FRE-l PGBS415FUM-3 p426GPD («пустой» вектор)	FRDg FUMR, MDH3

2F.4. Эксперименты по выращиванию и продукции янтарной кислоты.

Параметры роста и анализ образцов проводили, как было описано в примере 2С.4 со следующими модификациями: предварительное культивирование проводили, используя 2% глюкозы (мас./об.) в качестве источника углерода. В среде продуцирования в качестве источника углерода использовали 10% глюкозы (мас./об.).

Как показано на фиг. 23, штамм SUC-230, суперэкспрессирующий MDH3, FUMR и FRDg, продуцировал до 3,0 г/л янтарной кислоты. Дополнительная суперэкспрессия PCKa повышала продукцию янтарной кислоты до 3,4 г/л (штамм SUC-226), а дополнительная суперэкспрессия PYC2 повышала продукцию янтарной кислоты до 3,7 г/л (штамм SUC-228). Неожиданно было обнаружено, что совместная суперэкспрессия и PCKa и PYC2 (SUC-227) приводила к повышению уровня продукции янтарной кислоты в 1,5 раза до 5,0 г/л по сравнению с эффектами суперэкспрессии только PCK или только PYC. Эти результаты демонстрируют синергический эффект совместной суперэкспрессии как PEP-карбоксикиназы A. succino

- 18 032726 genes (PCKa), так и пируваткарбоксилазы S. cerevisiae (PYC2) на уровень продукции янтарной кислоты в S. cerevisiae.

Пример 3. Инактивация генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу в Aspergillus niger.

3.1. Идентификация.

Геномная ДНК Aspergillus niger, штамм CBS513.88, была секвенирована и проанализирована. Были идентифицированы два гена с транслируемыми белками, аннотируемыми как гомологи белков сукцинатдегидрогеназы, которые были названы sdhA и sdhB соответственно. Локусы последовательностей sdhA (An16g07150) и sdhB (An02g12770) доступны в базе данных Genbank с кодами доступа 145253004 и 145234071 соответственно. Векторы для замены генов sdhA и sdhB были спроектированы в соответствии с известными принципами и сконструированы в соответствии с обычными процедурами клонирования (смотри фиг. 6). Векторы включают приблизительно 1000 п.н., фланкирующих участки sdh ORFs для гомологичной рекомбинации в предопределенном геномном локусе. Кроме того, они содержат бинаправленный селективный маркер amdS A. nidulans, управляемый промотором gpd, между прямыми повторами. Основная схема этих делеционных векторов ранее была описана в ЕР635574В и WO 98/46772.

3.2. Инактивация гена sdhA в Aspergillus niger.

Получали линейную ДНК делеционного вектора pDEL-SDHA (фиг. 4) и использовали ее для трансформации Aspergillus niger CBS513.88, как описано в книге Biotechnology of Filamentous fungi: Technology and Products. (1992) Reed Publishing (USA); Chapter 6: Transformation, p. 113-156. Эту линейную ДНК можно интегрировать в геном в локусе sdhA, заменяя, таким образом, ген sdhA на ген amdS, как показано на фиг. 6. Селекцию трансформантов проводили на ацетамидной среде и колонии очищали в соответствии со стандартными методами, как было описано в ЕР635574В. Споры высевали на чашках с фторацетамидной средой для селекции штаммов, которые утратили маркер amdS. В растущих колониях с помощью ПЦР выявляли интеграцию в локусе sdhA и подходящие штаммы анализировали с помощью блоттинга по Саузерну на наличие делеции гена sdhA. Делецию гена sdhA определяли по уменьшению размера фрагментов ДНК примерно на 2,2 т.п.н. (4,6 т.п.н. во фрагменте дикого типа по сравнению с 2,4 т.п.н. при успешной делеции SDHA), охватывая локус целиком, и гибридизовали с соответствующими зондами. Приблизительно у 9 штаммов из примерно 96 исходных трансформантов было обнаружено удаление геномного гена sdhA.

В качестве типичного штамма с инактивированным геном sdhA отбирали штамм dSDHA. Продукцию янтарной кислоты штаммом dSDHA определяли в микротитровальных планшетах, как описано в примере 4.

Пример 4. Клонирование FRDm Trypanosoma brucei в Aspergillus niger dSDHA.

A. niger, штамм dSDHA, описанный в примере 3.2., был трансформирован с помощью экспрессионной конструкции pGBTOPAn1 (фиг. 5), включающей усеченную митохондриальную фумаратредуктазу m1 (FRDm1, SEQ ID NO:7), как было описано в примере 1.1. ДНК Е. coli удаляли с помощью расщепления рестриктазой NotI. Трансформанты A. niger отбирали с помощью Qpix и переносили в микротитровальные планшеты МТР, содержащие селективную среду для Aspergillus. Через 7 дней инкубации при 30°С биомассу переносили в микротитровальные планшеты (МТР), содержащие PDA, вручную или с помощью устройства для сбора колоний. Через 7 дней инкубации при 30°С биомасса образовывала споры. Эти споры ресуспендировали с помощью Multimek 96 (Beckman) в 100 мкл минимальной обогащенной среды для Aspergillus, содержащей 10% глюкозы. Затем 2 МТР со 170 мкл минимальной обогащенной среды для Aspergillus, содержащей 10% глюкозы и 1% CaCO₃ инокулировали 30 мкл суспензии спор. Аналогичным образом штаммы A. niger dSDHA и CBS513.88 инокулировали в МТР. Такие МТР инкубировали в течение 5 дней при 34°С и 80% влажности. Через 5 дней с помощью Multimek 96 (Beckman) собирали 160 мкл среды и с помощью ВЭЖХ определяли янтарную кислоту, как описано в примере 1.4. Результаты приведены в табл. 6.

Таблица 6

Влияние делеции сукцинатдегидрогеназы (SDHA) и вставки митохондриальной фумаратредуктазы (FRDm1) T. brucei в A. niger на уровень продукции янтарной кислоты

Штамм A. niger	Янтарная кислота, мг/л
CBS513.88	38
dSDHA	50
dSDHA, + gGBTOPAnl (FRDml)	583

Табл. 6 ясно демонстрирует повышенную продукцию янтарной кислоты А. niger, включающую митохондриальную фумаратредуктазу Т. brucei.

- 19 032726

Перечень последовательностей <110> ДСМ АЙПи АССЕТС Б.В.

ВУ, Лиан

ДАМВЕЛЬД, Роббертус, Антониус

ВЕРВАЛ, Рене

САГТ, Корнелис, Мария, Якобус <120> Рекомбинантная эукариотическая клетка для продукции янтарной кислоты, которая содержит NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу <130> 26345W0 <140> 26345WO <141> 2008-11-14 <160>44 <170> Patentin version 3.2 <210> 1 <211>1232 <212> белок <213> Trypanosoma brucei <400>1

Met

Leu

Ser

Thr

Lys

Gln

Leu

Leu

Leu

Arg

Ala

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

1

5

10

15

Ala

Gly

Ser

Ser

Gly

Val

Ala

Arg

Asp

Ser

Pro

Ser

Leu

Val

Gly

Asp

20

25

30

Pro

Cys

Asp

Ser

Val

Ser

Pro

Thr

Arg

Val

Val

Trp

Gly

Arg

Phe

Phe

35

40

45

Lys

Ser

Leu

Ala

Pro

Pro

Ala

Pro

Ser

Val

Val

Ser

cys

Gln

Lys

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ser

His

Gly

Ala

Asp

Gly

Ile

Ser

Ser

Ala

Ser

Ile

Val

Val

65

70

75

80

Thr

Asp

Pro

Glu

Ala

Ala

Ala

Lys

Lys

Arg

Asp

Arg

Met

Ala

Arg

Glu

85

90

95

Leu

Leu

Ser

Ser

Asn

Ser

Gly

Leu

cys

Gln

Glu

Asp

Glu

Pro

Thr

Ile

- 20 032726

100

105

110

lie

Asn

Leu

Lys

Gly

Leu

Glu

His

Thr

He

Pro

Tyr

Arg

Leu

Ala

Vai

115

120

125

Vai

Leu

cys

Asn

Ser

Arg

Ser

Thr

Gly

Glu

Phe

Glu

Ala

Lys

Ala

Ala

130

135

140

Glu

lie

Leu

Arg

Lys

Ala

Phe

His

Met

Vai

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn

cys

145

150

155

160

Phe

Asn

Pro

Glu

Ser

Glu

Leu

Ser

Arg

Vai

Asn

Ser

Leu

Pro

Vai

Gly

165

170

175

Glu

Lys

His

Gin

Met

Ser

Glu

Asp

Leu

Arg

His

Vai

Met

Glu

Cys

Thr

180

185

190

lie

Ser

Vai

His

His

Ser

Ser

Gly

Met

Gly

Phe

Asp

Pro

Ala

Ala

Gly

195

200

205

Pro

lie

He

Ser

Arg

Leu

Arg Gly

Ala

Met

Arg Asp

His

Asn

Asp

Met

210

215

220

Ser

Asp

lie

Ser

Vai

Thr

Glu

Ala

Glu

Vai

Glu

Leu

Phe

Ser

Leu

Ala

225

230

235

240

Gin

Ser

Phe

Asp

Vai

Asp

Leu

Glu

Glu

Gly

Thr

He

Ala

Arg

Lys

His

245

250

255

Ser

Glu

Ala

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly Gly

Vai

Asn

Lys

Gly

Tyr

Thr

Vai

260

265

270

Asp

Tyr

Vai

Vai

Asp

His

Leu

Arg

Ala

Ala

Gly

Met

Pro

Asn

Vai

Leu

275

280

285

Phe

Glu

Trp

Gly Gly

Asp

He

Arg

Ala

Ser

Gly Arg

Asn

He

Lys

Gly

290

295

300

Asn

Leu

Trp

Ala

Vai

Ala

He

Lys

Arg

Pro

Pro

Ser

Vai

Glu

Glu

Vai

- 21 032726

305

310

315

320

Не

Arg Arg

Ala

Lys

Gly

Lys

Met

Leu

Lys

Met

Gly

Glu

Glu

Glu

Gln

325

330

335

Glu

Glu

Lys

Asp

Asp

Asp

Ser

Pro

Ser

Leu

Leu

His

Val

Val

Glu

Leu

340

345

350

Asp

Asp

Glu

Ala

Leu

cys

Thr

Ser

Gly Asp

Tyr

Glu

Asn

Val

Leu

Tyr

355

360

365

His

Pro

Lys

His

Gly

Val

Ala

Gly

Ser

He

Phe

Asp

Trp

Gln

Arg

Arg

370

375

380

Gly

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Glu

Gly

Ala

Leu

Ala

Gln

Val

Ser

Val

Lys

385

390

395

400

cys

Tyr

Ser

Ala

Met

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Val

cys

Leu

Val

405

410

415

Lys

Arg Asp

Ala

Val

Arg

He

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Gly

Trp

Arg

Tyr

420

425

430

Val

Arg

Ser

Arg

Val

Thr

Asn

Tyr

Phe

Ala

Tyr

Thr

Arg

Gln

Gly

Glu

435

440

445

Arg

Leu

Ala

His

Met

His

Glu

He

Ala

Gln

Glu

Thr

Arg

Glu

Leu

Arg

450

455

460

Glu

lie

Arg

He

Ala

Gly

Ser

Leu

Pro

Ser

Arg

He

Val

He

Val

Gly

465

470

475

480

Gly Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala

He

Glu

Ala

Ala

Ser

cys

Gly

485

490

495

Ala

Gln

Val

He

Leu

Met

Glu

Lys

Glu

Gly Arg

He

Gly Gly

Asn

Ser

500

505

510

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Gly

He

Asn

Gly Trp Gly

Thr

Arg Thr

Gln

Ala

- 22 032726

515

520

525

Lys

Ser

Asp

lie

Leu Asp

Gly Gly

Lys

Tyr

Phe

Glu

Arg

Asp

Thr

Phe

530

535

540

Leu

Ser

Gly

Val

Gly Gly

Thr

Thr

Asp

Pro

Ala

Leu

Val

Lys

Val

Leu

545

550

555

560

Ser

Val

Lys

Ser

Gly

Asp

Ala

He

Gly

Trp

Leu

Thr

Ser

Leu

Gly

Val

565

570

575

Pro

Leu

Ser

Val

Leu

Ser

Gin

Leu

Gly Gly

His

Ser

Phe

Lys

Arg

Thr

580

585

590

His

Arg

Ala

Pro

Asp

Lys

Thr

Asp

Gly

Thr

Pro

Leu

Pro

He

Gly

His

595

600

605

Thr

He

Met

Arg

Thr

Leu

Glu

Asp

His

He

Arg

Asn

Asn

Leu

Ser

Glu

610

615

620

Arg

Val

Thr

He

Met

Thr

His

Val

Ser

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

His

Glu

625

630

635

640

Thr

Asp

Thr

Thr

Pro

Asp

Gly

Ala

Ser

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Gly

Val

645

650

655

Arg

Tyr

Arg

Asp

Leu

Ser

Asp

Val

Asp

Gly

Gin

Pro

Ser

Lys

Leu

Leu

660

665

670

Ala

Asp

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Thr

Gly Gly

Phe

Ser

Asn

Asp

Arg

Glu

675

680

685

Glu

Asn

Ser

Leu

Leu

Cys

Lys

Tyr

Ala

Pro

His

Leu

Ala

Ser

Phe

Pro

690

695

700

Thr

Thr

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Thr

Gly Asp

Gly

Val

Lys

Leu

Ala

Thr

705

710

715

720

Ser

Val

Gly

Ala

Lys

Leu

Val

Asp

Met Asp

Lys

Val

Gin

Leu

His

Pro

- 23 032726

725

730

735

Thr

Gly

Leu

Ile

Asp

Pro

Lys

Asp

Pro

Ala

Asn

Thr

Thr

Lys

lie

Leu

740

745

750

Gly

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Ser

Gly

Gly

Ile

Leu

Leu

Asn

Lys

Gln

755

760

765

Gly

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Val

Val

Ser

Lys

770

775

780

Ala

lie

Asn

Thr

Gln

Gly

Asn

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gly

Gly

cys

Tyr

785

790

795

800

Phe

Ala

Tyr

Cys

Val

Leu

Asn

Glu

Asp

Ala

Thr

Asn

Leu

Phe

cys

Gly

805

810

815

Gly

Ala

Leu

Gly

Phe

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Gly

Leu

Phe

Gln

Arg

Ala

820

825

830

Glu

Thr

Val

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Leu

Ile

Gly

cys

Asp

Glu

Gly

Glu

835

840

845

Leu

Arg

Asp

Thr

Leu

Glu

Lys

Tyr

Glu

Thr

cys

Ser

Lys

Ala

Lys

Val

850

855

860

Ala

cys

Pro

Val

Thr

Gly

Lys

Val

Val

Phe

Pro

cys

Val

Val

Gly

Thr

865

870

875

880

Arg

Gly

Pro

Tyr

Asn

Val

Ala

Phe

Val

Thr

Pro

Ser

Ile

His

Tyr

Thr

885

890

895

Met

Gly

Gly

cys

Leu

Ile

Ser

Pro

Ala

Ala

Glu

Val

Leu

Gln

Glu

Tyr

900

905

910

Lys

Gly

Leu

Asn

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Arg

Pro

Ile

Arg

cys

Leu

Phe

915

920

925

Gly

Ala

Gly

Glu

Val

Thr

Gly

Gly

Val

His

Gly

Gly

Asn

Arg

Leu

Gly

- 24 032726

930 935 940

Gly

Asn

Ser

Leu

Leu

Glu

Cys

Val

Val

Phe

Gly

Lys

He

Ala

Gly

Asp

945

950

955

960

Arg

Ala

Ala

Thr

He

Leu

Gin

Lys

Arg

Glu

lie

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

965

970

975

Ser

Trp

Thr

Ser

Val

Val

Val

Arg

Glu

Ser

Arg

Ser

Gly

Glu

Gin

Phe

980 985 990

Gly Thr Gly Ser Arg Val Leu Arg Phe Asn Leu Pro Gly Ala Leu Gin

995 1000 1005

Arg Thr 1010

Gly

Leu

Asn

Leu Gly 1015

Glu Phe Val Ala He 1020

Arg Gly Glu

Trp

Asp 1025

Gly

Gin

Gin

Leu

Val 1030

Gly

Tyr

Phe

Ser

Pro 1035

He Thr

Leu

Pro

Glu 1040

Asp

Leu

Gly

Thr

He 1045

Ser

Leu

Leu

Val

Arg 1050

Ala Asp

Lys

Gly

Thr 1055

Leu

Lys

Glu

Trp

He 1060

Cys

Ala

Leu

Arg

Pro 1065

Gly Asp

Ser

Val

Glu 1070

He

Lys

Ala

Cys

Gly 1075

Gly

Leu

Arg

He

Asp 1080

Gin Asp

Pro

Val

Lys 1085

Lys

Cys

Leu

Leu

Phe 1090

Arg

Asn

Arg

Pro

He 1095

Thr Arg

Phe

Ala

Leu 1100

Val

Ala

Ala

Gly

Thr 1105

Gly

Val

Ala

Pro

Met 1110

Leu Gin

Val

He

Arg 1115

Ala

Ala

Leu

Lys

Lys 1120

Pro

Tyr

Val

Asp

Thr 1125

Leu Glu

Ser

He

Arg

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Glu

Glu

Tyr Asp

Thr

Leu Thr

Tyr

- 25 032726

1130

1135

1140

Arg

Ser

lie

Leu

Gln

Arg

Phe

Ala

Glu

Glu

Phe

Pro

Asp

Lys

Phe

1145

1150

1155

Val

Cys

Asn

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

Pro

Pro

Glu

Gly

Trp

Thr

Gly

1160

1165

1170

Gly

Val

Gly

Phe

Val

Asn

Lys

Lys

Ser

Leu

Gln

Lys

Val

Leu

Gln

1175

1180

1185

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Pro

Leu

lie

Val

Val

Cys

Gly

Pro

Pro

Val

1190

1195

1200

Met

Gln

Arg Asp

Val

Lys

Asn

Glu

Leu

Leu

Ser

Met

Gly Tyr Asp

1205

1210

1215

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Val

Asp

Gly

Glu

Ser

Gly

Thr

Leu

1220

1225

1230

<210> 2
<211> 3698 <212> ДНК <213> Trypanosoma brucei
<400> 2 atgctctcaa	cgaagcaact	tctccttcga	gccacatctg	cattagtggc	gggaagctct	60
ggagttgcgc	gagacagccc	ttcgcttgtc	ggcgaccctt	gcgactcggt	ttcaccaacg	120
cgggtcgtat	gggggcgctt	cttcaaatcc	ctagcgccac	ccgctccctc	ggttgtttca	180
tgtcaaaagc	gttttacgtc	ccatggcgcc	gatggtattt	cctcggcttc	gattgttgtc	240
actgacccgg	aggcggcagc	aaagaagcgt	gaccgcatgg	cgcgcgagtt	gctctcaagt	300
aatagtggtc	tttgtcaaga	agatgaaccc	actatcatta	acttaaaggg	gttggagcac	360
acgattccgt	acaggctcgc	cgtggttctt	tgtaactcgc	gctctacagg	tgaattcgaa	420
gcaaaggcag	ctgagatttt	gcgaaaggca	tttcacatgg tggactactc	cctcaattgt	480
ttcaatcctg	aaagcgagtt	gtcgcgtgtc	aactctctgc cggtgggtga	gaagcatcaa	540
atgtcggagg	atctccggca	cgtgatggag tgcaccatca gtgtacatca	ctccagcgga	600

- 26 032726

atgggcttcg acccggcggc aggtccaatt atcagccgac ttcggggggc aatgagggac	660
cacaacgaca tgtccgacat ttccgtaacg gaagccgagg tagagctctt ctccttagcg	720
caaagttttg acgtggacct cgaggaggga acaatagctc gcaagcactc tgaagcgagg	780
cttgatcttg gtggtgtgaa caaaggctac acagttgatt atgtagtgga tcatcttcgt	840
gcggccggta tgccaaacgt gctctttgag tggggcgggg atattcgagc gtcgggtagg	900
aacatcaaag gaaacctatg ggcagttgct atcaaacgac cgccatctgt ggaggaggtg	960
attcggcgcg ccaaagggaa aatgttaaaa atgggggagg aggagcagga agagaaggac	1020
gatgattctc catccctgct tcatgtggtg gagcttgatg atgaagccct ttgcaccagt	1080
ggtgactacg aaaacgtttt gtatcatcca aagcatggag tggcggggag catttttgac	1140
tggcagcgaa gggggctact atctcctgag gaaggggcac tcgctcaagt gtctgtgaaa	1200
tgttatagcg caatgtacgc tgatgctctg gcaacagtgt gccttgtgaa gcgtgatgct	1260
gtgaggattc gctacttatt agagggctgg cgttacgttc gaagtcgtgt gacgaattac	1320
tttgcctata cccgtcaggg cgagcggtta gcacatatgc acgagatagc gcaagaaaca	1380
cgggagctac gtgaaatacg gattgccggg agtttgccct ccagaattgt tattgtgggt	1440
ggaggtctag cgggcctttc agcggccatc gaagccgcaa gttgtggtgc acaagtcata	1500
ctcatggaaa aggaaggaag aatcgggggg aacagcgcaa aggctacatc aggtattaat	1560
gggtggggga cgcgtacgca ggcaaagtca gatattctcg acggtggaaa gtattttgag	1620
cgtgacactt ttctctctgg cgttggcggt actaccgatc ctgccctcgt caaagtgctc	1680
tcagttaaga gtggggacgc aattggttgg cttacttctc ttggtgtgcc actcagtgtc	1740
ctctcgcaac ttggtggcca cagtttcaag cgaacccacc gtgccccgga caaaacggac	1800
gggacacccc taccaattgg tcatacgatc atgagaaccc tcgaggatca catccgtaac	1860
aacctctctg agcgagtaac gattatgaca catgtgtccg tgaccgagtt attgcacgaa	1920
accgatacaa cacctgatgg cgcctccgaa gtgcgtgtta cgggtgtaag atacagggac	1980
ctctccgatg tggatggcca gccatcaaaa ttgcttgcgg atgccgtcgt tcttgcaact	2040
ggtggtttct ccaatgaccg tgaagaaaat tcactgctct gcaagtatgc gcctcacctg	2100
gccagttttc caacgacaaa tggcccctgg gcgaccggtg acggggttaa actcgcaaca	2160

- 27 032726

tcggttggtg caaagcttgt ggatatggat aaggttcagc tacaccccac agggcttatc	2220
gatccaaagg atcccgcgaa cacaacgaag attctcggcc cggaggcact ccgaggttca	2280
ggtgggatat tactcaacaa gcaaggaaag cgcttcgtga atgaacttga cctccgctct	2340
gttgtatcca aggcaattaa tacgcagggt aatgaatacc ctggatccgg tggatgttac	2400
tttgcgtact gcgtgctcaa cgaagatgca acaaacctct tctgtggcgg tgcactgggg	2460
ttctacggaa agaagcttgg tttgttccag cgtgctgaga ctgtggaaga gttggccaaa	2520
ctgattggct gtgacgaagg tgaattacgg gatacgcttg aaaagtatga aacttgcagc	2580
aaggccaaag ttgcgtgccc tgtgacgggg aaggtagtat tcccttgtgt ggtgggtaca	2640
agggggccgt acaatgttgc ttttgtcacg ccttccattc attacacaat gggtggctgc	2700
ctcatttcac cggctgctga agttcttcag gagtacaaag gtttaaatat tctggaaaac	2760
catagaccga ttcgatgctt gtttggtgcc ggtgaagtga cgggtggtgt gcacggtggt	2820
aaccgccttg gtggtaattc gctcttggaa tgtgtggtat tcgggaaaat tgcgggtgac	2880
cgtgccgcaa caatacttca aaaacgtgag atagccctct ccaagacgag ttggacttcc	2940
gttgttgtac gtgagtcccg ctccggcgaa cagttcggga ccggctctcg tgttcttcgt	3000
tttaacctac ctggggcgct gcagcgcaca ggtctcaatc tgggcgaatt tgtggccatc	3060
cgtggcgagt gggacggcca acaacttgtt ggttacttca gtccaattac actaccagag	3120
gaccttggca ctatctccct tctggttcgt gccgacaagg gcacattgaa ggaatggatc	3180
tgcgccttgc gaccgggcga ctccgtcgaa atcaaagcgt gtggaggtct tcgtattgat	3240
caagacccgg taaagaagtg tctgctgttt cgtaaccggc ctattacgcg gtttgctctt	3300
gtcgcggcag ggactggtgt cgcgcccatg ttgcaggtta ttcgtgcggc actcaagaag	3360
ccttacgtgg acacgttgga aagcatccgt cttatatacg ccgcagaaga gtacgacaca	3420
ttgacgtatc gctcaatttt gcagcggttt gcggaagagt tccccgacaa gttcgtctgc	3480
aacttcgttc ttaacaaccc acccgaaggg tggacaggtg gagtggggtt tgtcaacaaa	3540
aaatccctgc agaaggtgct gcaaccgcca tcgagtgagc cgctgattgt tgtgtgtgga	3600
ccgcccgtga tgcagcgcga cgtgaagaat gagttactga gcatgggtta tgacaaagag ctcgttcata cggttgacgg cgagtcggga acgctgta	3660 3698

- 28 032726 <210> 3 <211> 1164 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDm Trypanosoma без 68 aa нацеливающего сигнала <400> 3

Met

Ala

Asp

Gly

lie

Ser

Ser

Ala

Ser

lie

Val

Val

Thr

Asp

Pro

Glu

1

5

10

15

Ala

Ala

Ala

Lys

Lys

Arg

Asp

Arg

Met

Ala

Arg

Glu

Leu

Leu

Ser

Ser

20

25

30

Asn

Ser

Gly

Leu

Cys

Gin

Glu

Asp

Glu

Pro

Thr

He

He

Asn

Leu

Lys

35

40

45

Gly

Leu

Glu

His

Thr

He

Pro

Tyr

Arg

Leu

Ala

Val

Val

Leu

cys

Asn

50

55

60

Ser

Arg

Ser

Thr

Gly

Glu

Phe

Glu

Ala

Lys

Ala

Ala

Glu

He

Leu

Arg

65

70

75

80

Lys

Ala

Phe

His

Met

Val

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn

cys

Phe

Asn

Pro

Glu

85

90

95

Ser

Glu

Leu

Ser

Arg

Val

Asn

Ser

Leu

Pro

Val

Gly

Glu

Lys

His

Gin

100

105

110

Met

Ser

Glu

Asp

Leu

Arg

His

Val

Met

Glu

Cys

Thr

He

Ser

Val

His

115

120

125

His

Ser

Ser

Gly

Met

Gly

Phe

Asp

Pro

Ala

Ala

Gly

Pro

He

He

Ser

130

135

140

Arg

Leu

Arg

Gly

Ala

Met

Arg

Asp

His

Asn

Asp

Met

Ser

Asp

He

Ser

145

150

155

160

- 29 032726

Val

Thr

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

Leu

Phe

Ser

Leu

Ala

Gln

Ser

Phe

Asp

165

170

175

Val

Asp

Leu

Glu

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Arg

Lys

His

Ser

Glu

Ala

Arg

180

185

190

Leu

Asp

Leu

Gly

Gly

Val

Asn

Lys

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Tyr

Val

Val

195

200

205

Asp

His

Leu

Arg

Ala

Ala

Gly

Met

Pro

Asn

Val

Leu

Phe

Glu

Trp

Gly

210

215

220

Gly

Asp

Ile

Arg

Ala

Ser

Gly

Arg

Asn

Ile

Lys

Gly

Asn

Leu

Trp

Ala

225

230

235

240

Val

Ala

Ile

Lys

Arg

Pro

Pro

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Ile

Arg

Arg

Ala

245

250

255

Lys

Gly

Lys

Met

Leu

Lys

Met

Gly

Glu

Glu

Glu

Gln

Glu

Glu

Lys

Asp

260

265

270

Asp

Asp

Ser

Pro

Ser

Leu

Leu

His

Val

Val

Glu

Leu

Asp

Asp

Glu

Ala

275

280

285

Leu

cys

Thr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Glu

Asn

Val

Leu

Tyr

His

Pro

Lys

His

290

295

300

Gly

Val

Ala

Gly

Ser

Ile

Phe

Asp

Trp

Gln

Arg

Arg

Gly

Leu

Leu

Ser

305

310

315

320

Pro

G1U

Glu

Gly

Ala

Leu

Ala

Gln

Val

Ser

Val

Lys

Cys

Tyr

Ser

Ala

325

330

335

Met

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Val

Lys

Arg

Asp

Ala

340

345

350

Val

Arg

Ile

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Gly

Trp

Arg

Tyr

Val

Arg

Ser

Arg

355

360

365

- 30 032726

Val	Thr 370	Asn	Tyr	Phe	Ala	Tyr 375	Thr
Met 385	His	Glu	Ile	Ala	Gln 390	Glu	Thr
Ala	Gly	Ser	Leu	Pro 405	Ser	Arg	Ile
Gly	Leu	Ser	Ala 420	Ala	Ile	Glu	Ala
Leu	Met	Glu 435	Lys	Glu	Gly	Arg	Ile 440
Ser	Gly 450	Ile	Asn	Gly	Trp	Gly 455	Thr
Leu 465	Asp	Gly Gly	Lys	Tyr 470	Phe	Glu
Gly Gly	Thr	Thr	Asp 485	Pro	Ala	Leu
Gly	Asp	Ala	Ile 500	Gly	Trp	Leu	Thr
Leu	Ser	Gln 515	Leu	Gly Gly	His	Ser 520
Asp	Lys 530	Thr	Asp	Gly	Thr	Pro 535	Leu
Thr 545	Leu	Glu	Asp	His	Ile 550	Arg	Asn
Met	Thr	His	Val	Ser 565	Val	Thr	Glu

Arg Gln Gly Glu Arg Leu Ala His

380
Arg	Glu	Leu 395	Arg Glu	Ile	Arg	Ile 400
Val	Ile 410	Val	Gly Gly Gly	Leu 415	Ala
Ala 425	Ser	cys	Gly	Ala	Gln 430	Val	Ile
Gly Gly	Asn	Ser	Ala 445	Lys	Ala	Thr
Arg	Thr	Gln	Ala 460	Lys	Ser	Asp	Ile
Arg	Asp	Thr 475	Phe	Leu	Ser	Gly	Val 480
Val	Lys 490	Val	Leu	Ser	Val	Lys 495	Ser
Ser 505	Leu	Gly	Val	Pro	Leu 510	Ser	Val
Phe	Lys	Arg	Thr	His 525	Arg	Ala	Pro
Pro	Ile	Gly	His 540	Thr	Ile	Met	Arg
Asn	Leu	Ser 555	Glu	Arg	Val	Thr	lie 560
Leu	Leu 570	His	Glu	Thr	Asp	Thr 575	Thr

- 31 032726

Pro

Asp

Gly Ala 580

Ser Glu Val Arg Val Thr Gly Val Arg Tyr Arg Asp

585

590

Leu

Ser

Asp

Val

Asp Gly

Gin

Pro

Ser

Lys

Leu

Leu

Ala

Asp

Ala

Val

595

600

605

Val

Leu

Ala

Thr

Gly Gly

Phe

Ser

Asn

Asp

Arg

Glu

Glu

Asn

Ser

Leu

610

615

620

Leu

Cys

Lys

Tyr

Ala

Pro

His

Leu

Ala

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Asn

Gly

625

630

635

640

Pro

Trp

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Val

Lys

Leu

Ala

Thr

Ser

Val

Gly

Ala

645

650

655

Lys

Leu

Val

Asp

Met

Asp

Lys

Val

Gin

Leu

His

Pro

Thr

Gly

Leu

Ile

660

665

670

Asp

Pro

Lys

Asp

Pro

Ala

Asn

Thr

Thr

Lys

Ile

Leu

Gly

Pro

Glu

Ala

675

680

685

Leu

Arg Gly

Ser

Gly Gly

Ile

Leu

Leu

Asn

Lys

Gin

Gly

Lys

Arg

Phe

690

695

700

Val

Asn

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Val

Val

Ser

Lys

Ala

Ile

Asn

Thr

705

710

715

720

Gin

Gly

Asn

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gly Gly

cys

Tyr

Phe

Ala

Tyr

cys

725

730

735

Val

Leu

Asn

Glu

Asp

Ala

Thr

Asn

Leu

Phe

cys

Gly Gly

Ala

Leu

Gly

740

745

750

Phe

Tyr Gly

Lys

Lys

Leu

Gly

Leu

Phe

Gin

Arg

Ala

Glu

Thr

Val

Glu

755

760

765

Glu

Leu

Ala

Lys

Leu

Ile

Gly Cys

Asp

Glu

Gly

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

770

775

780

- 32 032726

Leu

Glu

Lys

Tyr

Glu

Thr

cys

Ser

Lys

Ala

Lys

Vai

Ala

cys

Pro

Vai

785

790

795

800

Thr

Gly

Lys

Vai

Vai

Phe

Pro

cys

Vai

Vai

Gly

Thr

Arg

Gly

Pro

Tyr

805

810

815

Asn

Vai

Ala

Phe

Vai

Thr

Pro

Ser

He

HiS

Tyr

Thr

Met

Gly

Gly

cys

820

825

830

Leu

He

Ser

Pro

Ala

Ala

Glu

Vai

Leu

Gin

Glu

Tyr

Lys

Gly

Leu

Asn

835

840

845

He

Leu

Glu

Asn

His

Arg

Pro

He

Arg

cys

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Glu

850

855

860

Vai

Thr

Gly

Gly

Vai

His

Gly

Gly

Asn

Arg

Leu

Gly

Gly

Asn

Ser

Leu

865

870

875

880

Leu

Glu

Cys

Vai

Vai

Phe

Gly

Lys

He

Ala

Gly

Asp

Arg

Ala

Ala

Thr

885

890

895

lie

Leu

Gin

Lys

Arg

Glu

He

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

Ser

Trp

Thr

Ser

900

905

910

Vai

Vai

Vai

Arg

Glu

Ser

Arg

Ser

Gly

Glu

Gin

Phe

Gly

Thr

Gly

Ser

915

920

925

Arg

Vai

Leu

Arg

Phe

Asn

Leu

Pro

Gly

Ala

Leu

Gin

Arg

Thr

Gly

Leu

930

935

940

Asn

Leu

Gly

Glu

Phe

Vai

Ala

He

Arg

Gly

Glu

Trp

Asp

Gly

Gin

Gin

945

950

955

960

Leu

Vai

Gly

Tyr

Phe

Ser

Pro

He

Thr

Leu

Pro

Glu

Asp

Leu

Gly

Thr

965

970

975

He

Ser

Leu

Leu

Vai

Arg

Ala

Asp

Lys

Gly

Thr

Leu

Lys

Glu

Trp

He

980

985

990

- 33 032726

Cys Ala Leu Arg Pro Gly Asp Ser Val Glu lie Lys Ala Cys Gly Gly

995 10001005

Leu

Arg 1010

lie Asp Gln

Asp

Pro 1015

Val

Lys Lys Cys

Leu 1020

Leu

Phe Arg

Asn

Arg

Pro

He

Thr

Arg

Phe

Ala

Leu

Val

Ala

Ala

Gly

Thr

Gly

1025

1030

1035

Val

Ala

Pro

Met

Leu

Gln

Val

He

Arg

Ala

Ala

Leu

Lys

Lys

Pro

1040

1045

1050

Tyr

Val

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

He

Arg

Leu

He

Tyr

Ala

Ala

Glu

1055

1060

1065

Glu

Tyr

Asp

Thr

Leu

Thr

Tyr

Arg

Ser

He

Leu

Gln

Arg

Phe

Ala

1070

1075

1080

Glu

Glu

Phe

Pro

Asp

Lys

Phe

Val

cys

Asn

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

1085

1090

1095

Pro

Pro

Glu

Gly

Trp

Thr

Gly

Gly

Val

Gly

Phe

Val

Asn

Lys

Lys

1100

1105

1110

Ser

Leu

Gln

Lys

Val

Leu

Gln

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Pro

Leu

He

1115

1120

1125

Val

Val

cys

Gly

Pro

Pro

Val

Met

Gln

Arg

Asp

Val

Lys

Asn

Glu

1130

1135

1140

Leu

Leu

Ser

Met

Gly

Tyr

Asp

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Val

Asp

1145

1150

1155

Gly

Glu

Ser

Gly

Thr

Leu

1160 <210>4 <211>1142 <212> белок <213> Trypanosoma brucei

- 34 032726 <400> 4

Met

Val

Asp

Gly

Arg

Ser

Ser

Ala

Ser

He

Val

Ala

Val

Asp

РГО

Glu

1

5

10

15

Arg

Ala

Ala

Arg

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Leu

Gin

Asp

20

25

30

Ser

Pro

Leu

His

Thr

Thr

Met

Gin

Tyr

Ala

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Leu

35

40

45

Thr

Val

Pro

Tyr

Ala

Leu

Lys

Val

Val

Ala

Ser

Ala

Asp

Thr

Phe

Asp

50

55

60

Arg

Ala

Lys

Glu

Val

Ala

Asp

Glu

Val

Leu

Arg

Cys

Ala

Trp

Gin

Leu

65

70

75

80

Ala

Asp

Thr

Val

Leu

Asn

Ser

Phe

Asn

Pro

Asn

Ser

Glu

Val

Ser

Leu

85

90

95

Val

Gly

Arg

Leu

Pro

Val

Gly

Gin

Lys

His

Gin

Met

Ser

Ala

Pro

Leu

100

105

110

Lys

Arg

Val

Met

Ala

Cys

cys

Gin

Arg

Val

Tyr

Asn

Ser

Ser

Ala

Gly

115

120

125

cys

Phe

Asp

Pro

Ser

Thr

Ala

Pro

Val

Ala

Lys

Ala

Leu

Arg

Glu

He

130

135

140

Ala

Leu

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Asn

Ala

cys

Leu

Glu

Ala

Leu

Thr

Gin

145

150

155

160

Ala

cys

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Phe

Val

He

Asp

Phe

Glu

Ala

Gly

Thr

165

170

175

lie

Ser

Arg

Lys

His

Glu

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Gly

Val

Ser

180

185

190

Lys

Gly

Tyr

He

Val

Asp

Tyr

Val

He

Asp

Asn

He

Asn

Ala

Ala

Gly

- 35 032726

195

200

205

Phe

Gin

Asn

Vai

Phe

Phe

Asp

Trp

Gly

Gly

Asp

cys

Arg

Ala

Ser

Gly

210

215

220

Met

Asn

Ala

Arg

Asn

Thr

Pro

Trp

Vai

Vai

Gly

He

Thr

Arg

Pro

Pro

225

230

235

240

Ser

Leu

Asp

Met

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

Glu

Ala

Ser

Tyr

He

Ser

245

250

255

Vai

He

Ser

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Glu

260

265

270

Asn

Leu

He

Tyr

Thr

Ala

Asp

Asp

Lys

Pro

Leu

Thr

cys

Thr

Tyr

Asp

275

280

285

Trp

Lys

Gly

Lys

Glu

Leu

Met

Lys

Pro

Ser

Gin

Ser

Asn

He

Ala

Gin

290

295

300

Vai

Ser

Vai

Lys

Cys

Tyr

Ser

Ala

Met

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

305

310

315

320

Ala

Cys

Phe

He

Lys

Arg

Asp

Pro

Ala

Lys

Vai

Arg

Gin

Leu

Leu

Asp

325

330

335

Gly

Trp

Arg

Tyr

Vai

Arg

Asp

Thr

Vai

Arg

Asp

Tyr

Arg

Vai

Tyr

Vai

340

345

350

Arg

Glu

Asn

Glu

Arg

Vai

Ala

Lys

Met

Phe

Glu

He

Ala

Thr

Glu

Asp

355

360

365

Ala

Glu

Met

Arg

Lys

Arg

Arg

He

Ser

Asn

Thr

Leu

Pro

Ala

Arg

Vai

370

375

380

lie

Vai

Vai

Gly

Gly

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala

He

Glu

Ala

385

390

395

400

Ala

Gly

Cys

Gly

Ala

Gin

Vai

Vai

Leu

Met

Glu

Lys

Glu

Ala

Lys

Leu

- 36 032726

405

410

415

Gly

Gly

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Gly

Ile

Asn

Gly

Trp

Gly

Thr

420

425

430

Arg

Ala

Gln

Ala

Lys

Ala

Ser

Ile

Val

Asp

Gly

Gly

Lys

Tyr

Phe

Glu

435

440

445

Arg

Asp

Thr

Tyr

Lys

Ser

Gly

Ile

Gly

Gly

Asn

Thr

Asp

Pro

Ala

Leu

450

455

460

Val

Lys

Thr

Leu

Ser

Met

Lys

Ser

Ala

Asp

Ala

Ile

Gly

Trp

Leu

Thr

465

470

475

480

Ser

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

Thr

Val

Leu

Ser

Gln

Leu

Gly

Gly

His

Ser

485

490

495

Arg

Lys

Arg

Thr

His

Arg

Ala

Pro

Asp

Lys

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Leu

5Θ0

505

510

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

Ile

Met

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp

His

Val

Arg

Gly

515

520

525

Asn

Leu

Ser

Gly

Arg

Ile

Thr

lie

Met

Glu

Asn

Cys

Ser

Val

Thr

Ser

530

535

540

Leu

Leu

Ser

Glu

Thr

Lys

Glu

Arg

Pro

Asp

Gly

Thr

Lys

Gln

Ile

Arg

545

550

555

560

Val

Thr

Gly

Val

Glu

Phe

Thr

Gln

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Thr

Thr

Ile

565

570

575

Leu

Ala

Asp

Ala

Val

Ile

Leu

Ala

Thr

Gly

Gly

Phe

Ser

Asn

Asp

Lys

580

585

590

Thr

Ala

Asp

Ser

Leu

Leu

Arg

Glu

His

Ala

Pro

His

Leu

Val

Asn

Phe

595

600

605

Pro

Thr

Thr

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Val

Lys

Leu

Ala

- 37 032726

610

615

620

Gln

Arg

Leu

Gly

Ala

Gln

Leu

Vai

Asp

Met

Asp

Lys

Vai

Gln

Leu

His

625

630

635

640

Pro

Thr

Gly

Leu

He

Asn

Pro

Lys

Asp

Pro

Ala

Asn

Pro

Thr

Lys

Phe

645

650

655

Leu

Gly

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Ser

Gly

Gly

Vai

Leu

Leu

Asn

Lys

660

665

670

Gln

Gly

Lys

Arg

Phe

Vai

Asn

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Vai

Vai

Ser

675

680

685

Lys

Ala

lie

Met

Glu

Gln

Gly

Ala

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

690

695

700

Met

Phe

Ala

Tyr

cys

Vai

Leu

Asn

Ala

Ala

Ala

Gln

Lys

Leu

Phe

Gly

705

710

715

720

Vai

Ser

Ser

His

Glu

Phe

Tyr

Trp

Lys

Lys

Met

Gly

Leu

Phe

Vai

Lys

725

730

735

Ala

Asp

Thr

Met

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Leu

He

Gly

Cys

Pro

Vai

Glu

740

745

750

Ser

Vai

Gln

Gln

Thr

Leu

Glu

Glu

Tyr

Glu

Arg

Leu

Ser

He

Ser

Gln

755

760

765

Arg

Ser

Cys

Pro

lie

Thr

Arg

Lys

Ser

Vai

Tyr

Pro

cys

Vai

Leu

Gly

770

775

780

Thr

Lys

Gly

Pro

Tyr

Tyr

Vai

Ala

Phe

Vai

Thr

Pro

Ser

He

His

Tyr

785

790

795

800

Thr

Met

Gly

Gly

cys

Leu

He

Ser

Pro

Ser

Ala

Glu

He

Gln

Met

Lys

805

810

815

Asn

Thr

Ser

Ser

Arg

Ala

Pro

Leu

Ser

His

Ser

Asn

Pro

He

Leu

Gly

820

825

830

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Glu

Val

Thr

Gly

Gly

Val

His

Gly

Gly

Asn

Arg

835

840

845

Leu

Gly

Gly

Asn

Ser

Leu

Leu

Glu

cys

Val

Val

Phe

Gly

Arg

He

Ala

850

855

860

Gly

Asp

Arg

Ala

Ser

Thr

He

Leu

Gln

Arg

Lys

Ser

Ser

Ala

Leu

Ser

865

870

875

880

Phe

Lys

Val

Trp

Thr

Thr

Val

Val

Leu

Arg

Glu

Val

Arg

Glu

Gly

Gly

885

890

895

Val

Tyr

Gly

Ala

Gly

Ser

Arg

Val

Leu

Arg

Phe

Asn

Leu

Pro

Gly

Ala

900

905

910

Leu

Gln

Arg

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Gly

Gln

Phe

He

Ala

He

Arg

Gly

915

920

925

Asp

Trp

Asp

Gly

Gln

Gln

Leu

He

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Pro

He

Thr

Leu

930

935

940

Pro

Asp

Asp

Leu

Gly

Met

He

Asp

He

Leu

Ala

Arg

Ser

Asp

Lys

Gly

945

950

955

960

Thr

Leu

Arg

Glu

Trp

He

Ser

Ala

Leu

Glu

Pro

Gly

Asp

Ala

Val

Glu

965

970

975

Met

Lys

Ala

cys

Gly

Gly

Leu

Val

He

Glu

Arg

Arg

Leu

Ser

Asp

Lys

980

985

990

His

Phe

Val

Phe

Met

Gly

His

He

He Asn Lys Leu Cys Leu He A)

995

1000

1005

Gly Gly Thr Gly Val Ala Pro Met Leu Gln He lie Lys Ala Ala 1010 1015 1020

Phe Met Lys Pro Phe He Asp Thr Leu Glu Ser Val His Leu lie

- 39 032726

1025 10301035

Туг

Ala

Ala Glu Asp

Val

Thr

Glu

Leu

Thr

Tyr Arg

Glu

Val

Leu

1040

1045

1050

Glu

Glu

Arg Arg Arg

Glu

Ser

Arg Gly

Lys

Phe

Lys

Lys

Thr

Phe

1055

1060

1065

Val

Leu

Asn Arg

Pro

Pro

Pro

Leu

Trp

Thr

Asp

Gly

Val

Gly

Phe

1070

1075

1080

Ile

Asp

Arg Gly

Ile

Leu

Thr

Asn

His

Val

Gln

Pro

Pro

Ser

Asp

1085

1090

1095

Asn

Leu

Leu Val

Ala

Ile

Cys

Gly

Pro

Pro

Val

Met

Gln

Arg

Ile

1100

1105

1110

Val

Lys

Ala Thr

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly

Tyr

Asn

Met

Asn

Leu

Val

1115

1120

1125

Arg

Thr

Val Asp

Glu

Thr

Glu

Pro

Ser

Gly

Ser

Ser

Lys

Ile

1130

1135

1140

<210>5 <211>3429 <212> ДНК <213> Trypanosoma brucei <400> 5

atggtagacg ggcgatcttc	tgcatcaatt	gttgccgttg	atcccgaaag ggctgcgcgt	60
gagcgcgacg	cagcagcgcg	tgcccttctt	caagacagtc	cgctacacac	gaccatgcaa	120
tatgcaacgt	ctggtcttga	gcttaccgtt	ccctatgcac	ttaaggtggt	tgccagtgct	180
gacaccttcg	atcgcgctaa	ggaggttgcc	gatgaggtgc	tacgctgcgc	atggcaactc	240
gccgacaccg	tgttgaacag tttcaacccg	aacagtgagg tttcactcgt	gggtcgcctg	300
cctgtggggc	agaagcacca	aatgtctgct	ccactcaagc	gtgtgatggc	atgctgccag	360
cgtgtgtata	actcatcggc	tggatgtttt	gatccctcca	cagcacccgt	cgcaaaggcg	420
ctgcgtgaga	ttgcactggg	gaaggagcgg	aacaatgctt	gtctggaggc	acttactcaa	480

- 40 032726

gcgtgtacgc	ttcccaacag	ttttgtgatc	gatttcgaag	ctggaactat cagccgtaag	540
cacgagcatg	cgtctctgga	cctaggtggg	gttagcaaag	gttatatcgt tgattatgtc	600
attgataata	tcaatgctgc	tggatttcaa	aacgtttttt	ttgactgggg tggagactgc	660
cgtgcgagtg	gtatgaatgc	gcgcaatacc	ccgtgggttg	ttggtataac	tcgccctccg	720
tcccttgata	tgctccctaa	cccgccaaag	gaggcgtcgt	atatcagcgt	tatctctctc	780
gacaacgagg	cccttgccac	gagtggcgat	tatgaaaact	taatatacac	cgctgatgat	840
aaacccctta	cctgcactta	tgactggaag	gggaaggaac	tgatgaaacc	ttctcagtcc	900
aatatcgcgc	aggtatcggt	taaatgttat	agcgccatgt	acgctgacgc	gcttgcgact	960
gcgtgtttca	taaagcggga	tcccgcgaag gttcgacagc	tgctggacgg	ttggcgttac	1020
gtgcgtgata	cagtgagaga	ttacagggtc	tacgttcgtg	aaaatgagcg	agtagcgaag	1080
atgtttgaga	tcgccacaga	ggatgcggaa	atgaggaaga	ggcggatcag	caacacactt	1140
cccgctcgtg	tcattgtggt	gggcggtggt	cttgcgggtt	tgtccgcggc	catcgaagct	1200
gcaggatgcg	gtgctcaggt	tgtgcttatg	gagaaggagg	cgaagctcgg	aggcaacagc	1260
gccaaggcga	catctggtat	caacggatgg	ggcacacgtg	ctcaggcgaa	ggcaagcatt	1320
gtggatggtg	ggaaatactt	cgagcgtgac	acatacaagt	ctggtatcgg	gggtaacacc	1380
gatcctgccc	ttgtgaagac	actttctatg	aaaagtgctg	acgctattgg	gtggctgacc	1440
tcgttgggtg	taccgctgac	ggtattgtca	cagcttgggg	gtcacagccg	caagcgcaca	1500
catcgggcac	cggataagaa	agatggtaca	cctctaccta	tcggatttac	aatcatgaaa	1560
accctcgagg	atcacgtgcg tggtaacctt	tctggccgca	tcaccataat	ggaaaactgc	1620
agtgtaacgt	cgttgctcag tgagacgaag	gaacggccag	atggcactaa	acagatacga	1680
gttactggtg tggagttcac	gcaggctggc	agtgggaaga	cgaccatact	tgcagatgct	1740
gtcatccttg	ccactggtgg	attttctaac	gacaaaactg	cagactccct	gcttcgtgag	1800
cacgccccgc	acttggtcaa	cttccctacg acgaatggcc	cgtgggcgac	aggtgatggc	1860
gtgaaacttg	cacagcgact	tggcgctcaa	ctggtggata	tggacaaggt	ccagttgcat	1920
ccgacaggcc	tcatcaaccc	gaaggatcca	gcgaacccta	caaagttcct	tggacctgag	1980
gcgctacgtg	gatccggtgg	cgttttgttg	aacaagcaag	gcaagcgctt	cgttaatgaa	2040

- 41 032726

cttgacctcc gttctgtggt atcgaaagcc atcatggaac agggtgcgga atatcctgga	2100
tcgggtggta gcatgttcgc ctactgtgtg ttgaatgctg cggcgcagaa gctctttggt	2160
gtcagctcac acgagttcta ctggaagaag atgggtctct tcgtgaaggc tgacaccatg	2220
agggacctcg ctgcactcat tgggtgccca gtggaatctg tgcagcagac gctggaggag	2280
tacgagcggc tctccatatc acagcgttcc tgccccatca cgcgcaaaag cgtctatccg	2340
tgcgtgctcg gcactaaggg cccctactac gtcgccttcg tgacaccttc gattcactac	2400
acaatgggtg gatgtctcat ctcgccttct gctgaaatac aaatgaagaa cacatcatca	2460
cgcgctccac tgagtcacag caacccaatc ctcgggttat ttggtgccgg tgaggtaacg	2520
ggtggtgtgc acggtgggaa ccggttgggc ggcaattcgc tgcttgagtg cgtcgtgttt	2580
gggagaattg cgggtgatcg ggcctcgacc atccttcaga ggaagtcctc agcactttcc	2640
ttcaaggtgt ggacgaccgt ggtgctgcgt gaagtacgcg aaggtggtgt gtacggtgct	2700
gggtcccgcg tgcttcgctt taatttaccc ggggcgctgc aacggtctgg tctgagcctc	2760
ggccaattta tcgcaattcg tggtgattgg gacggtcagc agttgatcgg ttattacagt	2820
cccatcacgc tgccagatga tcttggcatg atcgatatac tcgcccgcag tgataagggg	2880
acgctgaggg agtggatttc cgctctggag ccgggtgacg ctgtggagat gaaggcatgc	2940
ggtggtctgg tgattgagcg ccgcttaagc gataagcact ttgtgttcat gggacacatt	3000
atcaacaagc tttgtctaat tgctggtgga acgggtgtgg caccgatgct gcaaataatc	3060
aaagcagcct ttatgaaacc cttcattgac acattggaga gcgttcatct catctatgcc	3120
gcggaggacg tgacggagtt gacgtatcgc gaggtgctgg aggagcgccg tcgtgagtca	3180
cgtggaaagt tcaagaaaac gtttgtcctc aaccggcccc cgcccctatg gactgatggt	3240
gttggcttca tcgaccgggg catcctcaca aatcatgtgc agccgccatc tgacaacctg	3300
ctggtggcca tatgcggacc accggtaatg cagcgcattg taaaggcgac cctgaagact	3360
ttgggctaca acatgaacct tgtgaggact gtggatgaaa cggagccgag cggctcatcc	3420
aaaatttga	3429

<210> б <211> 1139

- 42 032726 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDg без 3 аа С-концевого нацеливающего сигнала <400> б

Met

Vai

Asp

Gly

Arg

Ser

Ser

Ala

Ser

Ile

Vai

Ala

Vai

Asp

Pro

Glu

1

5

10

15

Arg

Ala

Ala

Arg

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Leu

Gin

Asp

20

25

30

Ser

Pro

Leu

His

Thr

Thr

Met

Gin

Tyr

Ala

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Leu

35

40

45

Thr

Vai

Pro

Tyr

Ala

Leu

Lys

Vai

Vai

Ala

Ser

Ala

Asp

Thr

Phe

Asp

50

55

60

Arg

Ala

Lys

Glu

Vai

Ala

Asp

Glu

Vai

Leu

Arg

cys

Ala

Trp

Gin

Leu

65

70

75

80

Ala

Asp

Thr

Vai

Leu

Asn

Ser

Phe

Asn

Pro

Asn

Ser

Glu

Vai

Ser

Leu

85

90

95

Vai

Gly

Arg

Leu

Pro

Vai

Gly

Gin

Lys

His

Gin

Met

Ser

Ala

Pro

Leu

100

105

110

Lys

Arg

Vai

Met

Ala

cys

cys

Gin

Arg

Vai

Tyr

Asn

Ser

Ser

Ala

Gly

115

120

125

Cys

Phe

Asp

Pro

Ser

Thr

Ala

Pro

Vai

Ala

Lys

Ala

Leu

Arg

Glu

Ile

130

135

140

Ala

Leu

Gly

Lys

Glu

Arg

Asn

Asn

Ala

cys

Leu

Glu

Ala

Leu

Thr

Gin

145

150

155

160

Ala

cys

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Phe

Vai

Ile

Asp

Phe

Glu

Ala

Gly

Thr

165

170

175

- 43 032726

lie

Ser

Arg

Lys

His

Glu

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Gly

Vai

Ser

180

185

190

Lys

Gly

Tyr

lie

Vai

Asp

Tyr

Vai

Ile

Asp

Asn

Ile

Asn

Ala

Ala

Gly

195

200

205

Phe

Gin

Asn

Vai

Phe

Phe

Asp

Trp

Gly

Gly

Asp

cys

Arg

Ala

Ser

Gly

210

215

220

Met

Asn

Ala

Arg

Asn

Thr

Pro

Trp

Vai

Vai

Gly

Ile

Thr

Arg

Pro

Pro

225

230

235

240

Ser

Leu

Asp

Met

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

G1U

Ala

Ser

Tyr

Ile

Ser

245

250

255

Vai

Ile

Ser

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Glu

260

265

270

Asn

Leu

Ile

Tyr

Thr

Ala

Asp

Asp

Lys

Pro

Leu

Thr

cys

Thr

Tyr

Asp

275

280

285

Trp

Lys

Gly

Lys

Glu

Leu

Met

Lys

Pro

Ser

Gin

Ser

Asn

Ile

Ala

Gin

290

295

300

Vai

Ser

Vai

Lys

cys

Tyr

Ser

Ala

Met

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

305

310

315

320

Ala

Cys

Phe

Ile

Lys

Arg

Asp

Pro

Ala

Lys

Vai

Arg

Gin

Leu

Leu

Asp

325

330

335

Gly

Trp

Arg

Tyr

Vai

Arg

Asp

Thr

Vai

Arg

Asp

Tyr

Arg

Vai

Tyr

Vai

340

345

350

Arg

Glu

Asn

Glu

Arg

Vai

Ala

Lys

Met

Phe

Glu

Ile

Ala

Thr

Glu

Asp

355

360

365

Ala

Glu

Met

Arg

Lys

Arg

Arg

lie

Ser

Asn

Thr

Leu

Pro

Ala

Arg

Vai

370 375 380

- 44 032726

Ile

Val

Val

Gly

Gly

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala

Ile

Glu

Ala

385

390

395

400

Ala

Gly

cys

Gly

Ala

Gin

Val

Val

Leu

Met

Glu

Lys

Glu

Ala

Lys

Leu

405

410

415

Gly

Gly

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Gly

lie

Asn

Gly

Trp

Gly

Thr

420

425

430

Arg

Ala

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Ile

Val

Asp

Gly

Gly

Lys

Tyr

Phe

Glu

435

440

445

Arg

Asp

Thr

Tyr

Lys

Ser

Gly

Ile

Gly

Gly

Asn

Thr

Asp

Pro

Ala

Leu

450

455

460

Val

Lys

Thr

Leu

Ser

Met

Lys

Ser

Ala

Asp

Ala

lie

Gly

Trp

Leu

Thr

465

470

475

480

Ser

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

Thr

Val

Leu

Ser

Gin

Leu

Gly

Gly

His

Ser

485

490

495

Arg

Lys

Arg

Thr

His

Arg

Ala

Pro

Asp

Lys

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Leu

500

505

510

Pro

Ile

Gly

Phe

Thr

lie

Met

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp

His

Val

Arg

Gly

515

520

525

Asn

Leu

Ser

Gly

Arg

Ile

Thr

lie

Met

Glu

Asn

Cys

Ser

Val

Thr

Ser

530

535

540

Leu

Leu

Ser

Glu

Thr

Lys

Glu

Arg

Pro

Asp

Gly

Thr

Lys

Gin

Ile

Arg

545

550

555

560

Val

Thr

Gly

Val

Glu

Phe

Thr

Gin

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Thr

Thr

Ile

565

570

575

Leu

Ala

Asp

Ala

Val

Ile

Leu

Ala

Thr

Gly

Gly

Phe

Ser

Asn

Asp

Lys

580

585

590

- 45 032726

Thr Ala

Asp 595

Ser

Leu Leu Arg

Glu His Ala Pro His Leu Val Asn Phe

600

605

Pro

Thr

Thr

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Val

Lys

Leu

Ala

610

615

620

Gin

Arg

Leu

Gly

Ala

Gin

Leu

Val

Asp

Met

Asp

Lys

Val

Gin

Leu

His

625

630

635

640

Pro

Thr

Gly

Leu

He

Asn

Pro

Lys

Asp

Pro

Ala

Asn

Pro

Thr

Lys

Phe

645

650

655

Leu

Gly

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Ser

Gly

Gly

Val

Leu

Leu

Asn

Lys

660

665

670

Gin

Gly

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Val

Val

Ser

675

680

685

Lys

Ala

lie

Met

Glu

Gin

Gly

Ala

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gly Gly

Ser

690

695

700

Met

Phe

Ala

Tyr

cys

Val

Leu

Asn

Ala

Ala

Ala

Gin

Lys

Leu

Phe

Gly

705

710

715

720

Val

Ser

Ser

His

Glu

Phe

Tyr

Trp

Lys

Lys

Met

Gly

Leu

Phe

Val

Lys

725

730

735

Ala

Asp

Thr

Met

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Leu

He

Gly

Cys

Pro

Val

Glu

740

745

750

Ser

Val

Gin

Gin

Thr

Leu

Glu

Glu

Tyr

Glu

Arg

Leu

Ser

He

Ser

Gin

755

760

765

Arg

Ser

cys

Pro

He

Thr

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Pro

cys

Val

Leu

Gly

770

775

780

Thr

Lys

Gly

Pro

Tyr

Tyr

Val

Ala

Phe

Val

Thr

Pro

Ser

He

His

Tyr

785

790

795

800

- 46 032726

Thr

Met

Gly

Gly

cys

Leu

Ile

Ser

Pro

Ser

Ala

Glu

Ile

Gin

Met

Lys

805

810

815

Asn

Thr

Ser

Ser

Arg

Ala

Pro

Leu

Ser

His

Ser

Asn

Pro

Ile

Leu

Gly

820

825

830

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Glu

Val

Thr

Gly

Gly

Val

His

Gly

Gly

Asn

Arg

835

840

845

Leu

Gly

Gly

Asn

Ser

Leu

Leu

Glu

cys

Val

Val

Phe

Gly

Arg

Ile

Ala

850

855

860

Gly

Asp

Arg

Ala

Ser

Thr

lie

Leu

Gin

Arg

Lys

Ser

Ser

Ala

Leu

Ser

865

870

875

880

Phe

Lys

Val

Trp

Thr

Thr

Val

val

Leu

Arg

Glu

Val

Arg

Glu

Gly

Gly

885

890

895

Val

Tyr

Gly

Ala

Gly

Ser

Arg

Val

Leu

Arg

Phe

Asn

Leu

Pro

Gly

Ala

900

905

910

Leu

Gin

Arg

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Phe

Ile

Ala

Ile

Arg

Gly

915

920

925

Asp

Trp

Asp

Gly

Gin

Gin

Leu

He

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Pro

Ile

Thr

Leu

930

935

940

Pro

Asp

Asp

Leu

Gly

Met

Ile

Asp

Ile

Leu

Ala

Arg

Ser

Asp

Lys

Gly

945

950

955

960

Thr

Leu

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Ala

Leu

Glu

Pro

Gly

Asp

Ala

Val

Glu

965

970

975

Met

Lys

Ala

cys

Gly

Gly

Leu

Val

Ile

Glu

Arg

Arg

Leu

Ser

Asp

Lys

980

985

990

His

Phe

Val

Phe

Met

Gly

His

Ile

Ile Asn Lys Leu Cys Leu Ile Ala

995

1000

1005

- 47 032726

Gly Gly

Thr

Gly

Vai

Ala

Pro

Met

Leu

Gln

He He

Lys

Ala

Ala

1010

1015

1020

Phe

Met

Lys

Pro

Phe

He

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser Vai

His

Leu

He

1025

1030

1035

Tyr

Ala

Ala

Glu

Asp

Vai

Thr

Glu

Leu

Thr

Tyr Arg

Glu

Vai

Leu

1040

1045

1050

Glu

Glu

Arg

Arg

Arg

Glu

Ser

Arg

Gly

Lys

Phe Lys

Lys

Thr

Phe

1055

1060

1065

Vai

Leu

Asn

Arg

Pro

Pro

Pro

Leu

Trp

Thr

Asp Gly

Vai

Gly

Phe

1070

1075

1080

He

Asp

Arg Gly

lie

Leu

Thr

Asn

His

Vai

Gln Pro

Pro

Ser

Asp

1085

1090

1095

Asn

Leu

Leu

Vai

Ala

He

Cys

Gly

Pro

Pro

Vai Met

Gln

Arg

lie

1100

1105

1110

Vai

Lys

Ala

Thr

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly Tyr

Asn Met

Asn

Leu

Vai

1115

1120

1125

Arg

Thr

Vai

Asp

Glu

Thr

Glu

Pro

Ser Gly

Ser

1130 1135 <210> 7 <211> 3498 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDml оптимизированный по кодонам для A. niger <400>7 atgggtgccg atggtatctc ctctgcctcc attgtcgtca ccgaccccga ggctgctgcc60 aagaagcgtg accgcatggc ccgtgagctc ctctcctcca actccggtct ttgccaggag120 gatgagccca ccatcatcaa cctgaagggt ctggaacaca ccatccccta ccgtcttgct180 gttgtccttt gcaactctcg cagcactggt gaattcgagg ccaaggctgc tgagatcctc240

- 48 032726

cgcaaggctt	tccacatggt	tgactactct	ctgaactgct	tcaaccccga	gtccgagctc	300
tcccgtgtca	acagcttgcc	tgtcggtgag	aagcaccaga	tgagcgaaga	tctgcgccac	360
gtcatggagt	gcaccatctc	cgtccaccac	tcctctggca	tgggtttcga	ccctgctgct	420
ggtcccatca	tctcccgtct	gcgtggtgcc	atgcgcgacc	acaacgacat	gtccgacatc	480
tccgtcaccg	aggctgaggt	tgagctgttc	tcgctagcgc	agtcgttcga	tgttgacctc	540
gaggagggca	ccattgctcg	caagcactcc	gaggctcgcc	tcgaccttgg tggtgtcaac	600
aagggctaca	ctgttgacta	cgtggtggac	cacctccgcg	ctgctggcat	gcccaacgtc	660
ctgttcgaat	ggggtggtga	catccgtgcc	tccggccgca	acatcaaggg	caacctctgg	720
gctgttgcca	tcaagcgccc	tccctccgtt	gaggaggtca	tccgccgtgc	caagggcaag	780
atgctcaaga	tgggtgaaga	agaacaggag	gagaaggatg	atgactctcc	cagccttctg	840
cacgttgttg	agctcgatga	tgaggccctc	tgcacctccg gtgactacga	gaacgtcctc	900
taccacccca	agcacggtgt	tgctggcagc	atcttcgact	ggcagcgccg	tggtctgctg	960
tctcctgagg	agggtgctct	tgctcaggtt	tccgtcaagt	gctactctgc	catgtacgcc	1020
gatgcccttg	ccaccgtctg	cctggtcaag	cgtgatgccg	tccgtatccg	ctacctcctg	1080
gaaggctggc	gctacgtgcg	ctctcgtgtc	accaactact	tcgcctacac	ccgccagggt	1140
gagcgtcttg	ctcacatgca	cgaaattgcc	caggagactc	gtgagctccg tgagatccgc	1200
attgctggct	ccctcccctc	ccgtatcgtc	atcgtcggtg	gtggtctggc	cggtctgtct	1260
gctgccattg aggctgcctc	ctgcggtgct	caggtcatcc	tgatggagaa	ggagggtcgt	1320
attggtggca	actctgccaa	ggccacctcc	ggtatcaacg gctggggtac	tcgcactcag	1380
gccaagtccg	acatcctgga	tggcggcaag tacttcgagc	gtgacacctt	cctgagcggt	1440
gttggtggta	ccactgaccc	tgctctggtc	aaggtcctct	ccgtcaagtc	cggtgatgcc	1500
attggctggt	tgaccagcct	tggtgttcct	ctttctgttc	tctcccagct	gggtggtcac	1560
tctttcaagc	gtacccaccg tgctcctgac	aagactgatg gcactcctct	ccccatcggt	1620
cacaccatca	tgcgcaccct	cgaggaccac	atccgcaaca	acctgagcga	acgtgtcacc	1680
atcatgaccc	acgtttccgt	cactgagctc	ctccacgaga	ctgacaccac	tcccgatggt	1740
gcctccgagg	tccgtgtcac	cggtgtccgc	taccgtgacc	tctccgatgt	tgacggccag	1800

- 49 032726

cccagcaagc	tccttgccga	tgccgttgtc	cttgccactg gtggtttctc	caacgaccgc	1860
gaggagaaca	gcttgctttg	caagtacgcc	ccccacctgg	cctccttccc	caccaccaac	1920
ggcccttggg	ccactggtga	tggtgtcaag	ctggccacct	ccgtcggtgc	caagctcgtc	1980
gacatggaca	aggtccagct	gcaccccact	ggcttgattg	accccaagga	ccccgccaac	2040
accaccaaga	tcctgggccc	cgaggctctc	cgtggcagcg	gtggtatcct	gctcaacaag	2100
cagggcaagc	gcttcgtcaa	cgagcttgac	ctccgcagcg ttgtctccaa	ggccatcaac	2160
actcagggca	acgaataccc	cggcagcggt	ggctgctact	tcgcctactg	cgtgttgaac	2220
gaagatgcca	ccaacctgtt	ctgcggtggt	gctcttggat	tctacggcaa	gaagcttggt	2280
ctgttccagc	gtgctgagac	tgttgaggag	cttgccaagt	tgattggctg	cgatgagggc	2340
gagctccgtg	acaccctcga	gaagtacgag	acttgctcga	aggccaaggt	tgcctgcccc	2400
gtgaccggca	aggtcgtgtt	cccctgcgtt	gttggtaccc	gtggtcccta	caacgtcgct	2460
ttcgtcaccc	cctccatcca	ctacaccatg	ggtggctgct	tgatttctcc	tgctgctgag	2520
gtcctccagg	aatacaaggg tctgaacatc	ctggagaacc	accgtcccat	tcgctgcttg	2580
ttcggtgctg	gtgaagtcac	cggtggtgtc	cacggtggca	accgcctggg tggcaactcc	2640
ctcctcgagt	gcgttgtgtt	cggcaagatc	gctggtgacc	gtgctgccac	cattctccag	2700
aagcgcgaaa	ttgccctctc	caagaccagc	tggacctccg tcgtcgtccg	cgagtcccgc	2760
tctggcgagc	agttcggtac	cggctctcgt	gtcctccgct	tcaacctgcc	cggtgctctc	2820
cagcgcactg	gtctgaacct	gggtgagttc	gtcgccatcc	gtggtgaatg ggatggccag	2880
cagctggtcg	gctacttctc	ccccatcacc	ctccccgaag	atcttggtac	catctccctc	2940
ctggtccgtg	ccgacaaggg	caccctcaag gaatggatat	gtgccctccg	ccccggtgac	3000
agcgttgaga	tcaaggcctg	cggtggtctg	cgtatcgacc	aggaccctgt	caagaagtgc	3060
ttgctattcc	gcaaccgccc	catcacccgc	ttcgctcttg ttgctgctgg tactggtgtt	3120
gctcccatgc	tccaggtcat	ccgtgctgct	ctcaagaagc	cctacgtgga	tacattggag	3180
tccatccgtc	tgatctacgc	tgctgaagaa	tacgacaccc	tgacctaccg	ctccatcctc	3240
cagcgcttcg	ctgaggagtt	ccccgacaag	ttcgtctgca	acttcgtcct	caacaaccct	3300
cctgaaggct	ggactggtgg	tgttggtttc	gtcaacaaga	agtccctcca	gaaggtcctc	3360

- 50 032726 cagcctccta gctctgagcc tctgattgtc gtctgcggtc ctcctgtcat gcagcgtgat 3420 gtcaagaacg agctcctcag catgggctac gacaaggagc ttgtccacac cgttgacggc 3480 gagtctggca ccctataa 3498 <210> 8 <211> 3420 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDg оптимизированный ген для A. niger <400> 8

atggtcgatg	gccgctcctc	cgcctccatt	gttgctgttg	accccgagcg	tgctgctcgt	60
gagcgtgatg	ctgctgctcg	tgccctcctc	caggactctc	ccttgcacac	caccatgcag	120
tacgccacct	ccggtctgga	attgactgtt	ccctacgccc	tcaaggttgt	tgcctccgcc	180
gacaccttcg	accgtgccaa	ggaggttgcc	gatgaggtcc	tccgctgcgc	ctggcagctg	240
gccgacaccg	tcctcaactc	tttcaacccc	aacagcgaag	tctctctggt	cggccgcctc	300
cccgtcggtc	agaagcacca	gatgagcgct	cctctcaagc	gtgtcatggc	ctgctgccag	360
cgtgtctaca	acagctctgc	tggctgcttc	gaccccagca	ctgctcctgt	tgccaaggcc	420
ctccgtgaga	tcgctcttgg	caaggagcgc	aacaacgcct	gcttggaggc	tcttactcag	480
gcctgcaccc	tccccaactc	gttcgtcatt	gacttcgagg	ctggcaccat	ctcccgcaag	540
cacgaacacg	cctccctcga	tcttggtggt	gtcagcaagg	gctacatcgt	cgactacgtc	600
attgacaaca	tcaacgctgc	tggtttccag	aacgttttct	tcgactgggg tggtgactgc	660
cgtgcctccg	gcatgaacgc	ccgcaacacc	ccctgggttg ttggtatcac	ccgccccccg	720
tcattggaca	tgcttcccaa	ccctcccaag gaggccagct	acatctccgt	catctccctc	780
gacaacgagg	ctcttgccac	cagcggtgac	tacgagaacc	tgatctacac	tgccgatgac	840
aagcctctga	cctgcaccta	cgactggaag	ggcaaggagc	tcatgaagcc	cagccagtcc	900
aacattgccc	aggtcagcgt	caagtgctac	tctgccatgt	acgccgatgc	ccttgccact	960
gcttgcttca	tcaagcgtga	ccccgccaag	gtccgccagc	tgttggatgg	ctggcgctac	1020
gtgcgcgaca	ccgtccgtga	ctaccgtgtc	tacgtgcgcg	agaacgagcg	tgttgccaag	1080

- 51 032726

atgttcgaaa ttgccactga ggatgccgag atgcgcaagc gccgtatctc caacaccctc	1140
cctgctcgtg tcattgttgt tggtggtggt ctggctggtc tttctgctgc cattgaggct	1200
gctggctgcg gtgctcaggt tgtcctgatg gagaaggagg ccaagctcgg tggcaactcc	1260
gccaaggcca cctccggtat caacggctgg ggtactcgtg ctcaggccaa ggcctccatc	1320
gtcgatggcg gcaagtactt cgagcgtgac acctacaagt ccggtatcgg tggcaacacc	1380
gaccctgctc tggtcaagac cctgagcatg aagtccgccg atgccattgg ctggttgacc	1440
agccttggtg ttcctcttac tgtcctttct cagctgggtg gccactctcg caagcgcacc	1500
caccgtgctc ctgacaagaa ggacggcacc cccctcccca tcggtttcac catcatgaaa	1560
actctcgagg accacgtccg tggcaacctg tctggccgta tcaccatcat ggagaactgc	1620
tcggtgacct cgctactctc cgagactaag gagcgccccg atggcaccaa gcagatccgt	1680
gtcaccggtg ttgagttcac ccaggctggc tctggcaaga ccaccatcct ggccgatgcc	1740
gtcatcctgg ccactggtgg tttctccaac gacaagactg ccgactcgct actccgcgaa	1800
cacgctcccc acctggtcaa cttccccacc accaacggcc cctgggcgac tggtgatggt	1860
gtcaagctgg cccagcgtct gggtgctcag ctcgtcgaca tggacaaggt ccagctccac	1920
cccactggtc tgatcaaccc caaggaccct gccaacccca ccaagttcct tggacctgag	1980
gctctccgtg gctccggtgg tgtccttctg aacaagcagg gcaagcgctt cgtcaacgag	2040
ctcgatctcc gcagcgttgt ctccaaggcc atcatggagc agggtgctga ataccccggc	2100
agcggtggca gcatgttcgc ctactgcgtt ctcaacgctg ctgctcagaa gctgttcggt	2160
gtctcctccc acgaattcta ctggaagaag atgggtctgt tcgtcaaggc cgacaccatg	2220
cgtgatcttg ctgctctgat cggttgcccc gttgagagcg tgcagcagac cctggaagaa	2280
tacgagcgcc tctccatctc ccagcgctct tgccccatca cccgcaagtc ggtgtaccct	2340
tgcgtgcttg gcaccaaggg tccctactac gtggctttcg tcaccccctc catccactac	2400
accatgggtg gctgcttgat ctctccttct gctgagatcc agatgaagaa cacctcctcc	2460
cgtgctcctc tctcccactc caaccccatc ctcggtctgt tcggtgctgg tgaagtcact	2520
ggtggtgtcc acggtggcaa ccgtcttggt ggcaactccc tcctcgagtg cgttgtgttc	2580
ggccgtatcg ctggtgaccg tgccagcacc atcctccagc gcaagagctc tgctctctcc	2640

- 52 032726 ttcaaggtct ggaccactgt tgtcctccgc gaagtccgcg agggtggtgt ctacggtgct2700 ggctctcgtg tcctccgctt caacctcccc ggtgctctcc agcgctccgg tctgtctctt2760 ggccagttca ttgccatccg tggtgactgg gatggccagc agctcattgg ctactactct2820 cccatcaccc tccccgatga tcttggaatg atcgacatcc tggctcgctc cgacaagggt2880 accctccgcg aatggatctc cgctctggag cccggtgatg ccgttgagat gaaggcctgc2940 ggtggtctgg tcattgagcg tcgtctgtcc gacaagcact tcgtgttcat gggtcacatc3000 atcaacaagc tctgcttgat tgccggtggt actggtgttg ctcccatgct tcagatcatc3060 aaggctgctt tcatgaagcc cttcattgac accctcgagt ccgtccacct gatctacgct3120 gctgaggatg tcactgagct gacctaccgt gaggtccttg aggagcgccg ccgcgagtcc3180 cgtggcaagt tcaagaaaac cttcgtcctg aaccgccctc ctcctctctg gactgatggt3240 gttggtttca ttgaccgtgg tatcctgacc aaccacgtcc agcctccctc cgacaaccta3300 ttagtggcca tctgcggtcc tcctgtcatg cagcgcattg tcaaggccac tctcaagacc3360 ctaggataca acatgaacct ggtccgcact gttgatgaga ctgagccctc cggatcataa3420 <210>9 <211>3498 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDml оптимизированный ген для S. cerevisiae <400>9 atgggtgctg atggtatttc ttctgcttcc attgttgtta ctgacccaga agctgctgcc60 aagaagcgtg acagaatggc cagagaattg ttgtcctcca actctggtct atgtcaagaa120 gatgaaccaa ccatcatcaa cttaaagggt ttggaacaca ccattccata cagattggcc180 gttgttttgt gtaactccag atccactggt gaattcgaag ccaaggctgc tgaaatcttg240 agaaaggctt tccacatggt tgactactct ttgaattgtt tcaacccaga atctgaattg300 tcccgtgtca actctttacc agtcggtgaa aagcaccaaa tgtccgaaga tctaagacat360 gtcatggaat gtaccatttc tgtccaccac tcctctggta tgggtttcga cccagctgct420 ggtccaatca tctccagatt gagaggtgcc atgagagatc acaacgacat gtccgatatc480

- 53 032726 tccgtcactg aagctgaagt tgaattattc tctttggctc aatctttcga tgtcgacttg 540 gaagaaggta ctattgccag aaagcactct gaagccagat tggatttggg tggtgtcaac 600 aagggttaca ctgttgacta cgttgttgac catttgagag ctgctggtat gccaaacgtc 660 ttgttcgaat ggggtggtga tatcagagct tctggtagaa acatcaaggg taacttgtgg 720 gctgttgcca tcaagcgtcc accatctgtt gaagaagtta tccgtcgtgc caagggtaag 780 atgttaaaga tgggtgaaga agaacaagaa gaaaaggacg atgactctcc atctttgttg 840 cacgttgttg aattggatga cgaagctttg tgtacctctg gtgactacga aaacgtctta 900 taccatccaa agcacggtgt tgctggttcc attttcgact ggcaacgtcg tggtttattg 960 tctccagaag aaggtgcttt agctcaagtt tccgtcaaat gttactctgc catgtacgct 1020 gatgctttgg ccactgtttg tttggtcaag agagatgctg tcagaatcag atacttgttg 1080 gaaggttgga gatacgtcag atctcgtgtc accaactact tcgcttacac cagacaaggt 1140 gaaagattgg ctcacatgca cgaaattgct caagaaacca gagaattaag agaaatcaga 1200 attgctggtt ctttgccatc cagaattgtt atcgtcggtg gtggtttggc tggtctatcc 1260 gctgccattg aagctgcttc ttgtggtgct caagtcattt tgatggaaaa ggaaggtaga 1320 attggtggta actctgccaa ggctacctct ggtatcaacg gttggggtac cagaacccaa 1380 gccaagtctg atatcttgga tggtggtaag tactttgaaa gagacacttt cttgtccggt 1440 gtcggtggta ccactgaccc agctttggtc aaggtcttgt ccgtcaaatc tggtgacgct 1500 atcggttggt taacttcttt gggtgtccca ttgtccgttt tgtctcaatt gggtggtcac 1560 tctttcaaga gaactcacag agctccagac aagactgatg gtactccatt accaattggt 1620 cacaccatca tgagaacttt ggaagatcat atcagaaaca acttgtctga aagagttacc 1680 atcatgaccc acgtttctgt tactgaattg ttgcacgaaa ctgacaccac tccagatggt 1740 gcttctgaag ttcgtgtcac cggtgtccgt tacagagact tgtctgatgt cgatggtcaa 1800 ccttccaaac tattggctga cgctgttgtt ttggccactg gtggtttctc caacgacaga I860 gaagaaaact ctttgttgtg taaatacgct cctcatttgg cttctttccc aactaccaac 1920 ggtccatggg ctactggtga cggtgtcaaa ttggccacct ccgttggtgc caagttggtt 1980 gacatggaca aggttcaatt gcacccaact ggtttgattg acccaaagga cccagctaac 2040

- 54 032726

accactaaga	tcttgggtcc	agaagctttg	agaggttctg gtggtatttt gttgaacaag	2100
caaggtaaga	gattcgtcaa	cgaattggac	ttgagatccg ttgtttccaa ggccattaac	2160
actcaaggta	acgaataccc	aggttctggt	ggttgttact	ttgcttactg tgtcttaaac	2220
gaagatgcta	ccaacttatt	ctgtggtggt	gctttgggtt	tctacggtaa gaaattaggt	2280
ttgttccaaa	gagctgaaac	tgttgaagaa	ttggccaaat	tgattggttg tgacgaaggt	2340
gaattgagag	acactttgga	aaaatacgaa	acctgttcca	aggccaaggt	tgcttgtcca	2400
gtcactggta	aggttgtttt	cccatgtgtt	gtcggtacca	gaggtccata	caatgttgct	2460
ttcgtcactc	catccatcca	ctacaccatg	ggtggttgtt	tgatctctcc	agctgctgaa	2520
gtcttgcaag	aatacaaggg	tttgaatatc	ttggaaaacc	acagaccaat	cagatgtttg	2580
ttcggtgctg	gtgaagtcac	tggtggtgtc	cacggtggta	acagattagg tggtaactct	2640
ctattggaat	gtgttgtctt	tggtaagatt	gctggtgaca	gagctgccac	tatcttgcaa	2700
aagagagaaa	ttgctttgtc	caagacctcc	tggacctctg	ttgttgtcag	agaatccaga	2760
tctggtgaac	aattcggtac	cggttccaga	gttttgagat	tcaacttgcc	aggtgcttta	2820
caaagaaccg	gtttgaactt	gggtgaattc	gttgccatca	gaggtgaatg	ggatggtcaa	2880
caattagtcg	gttacttctc	tccaatcact	ttgccagaag	atttgggtac	catctctttg	2940
ttggtcagag	ctgacaaggg tactttgaag gaatggatct	gtgctttgcg	tccaggtgac	3000
tccgttgaaa	tcaaggcttg tggtggtcta	agaattgacc	aagatccagt	caagaaatgt	3060
ttgttgttca	gaaacagacc	aattaccaga	tttgctttgg ttgctgctgg taccggtgtt	3120
gctccaatgt	tgcaagttat	cagagctgct	ttgaagaagc	catacgtcga	cactttggaa	3180
tccatcagat	tgatctacgc	tgctgaagaa	tatgacactt	taacctacag	atctatcttg	3240
caaagatttg	ctgaagaatt	cccagacaaa	ttcgtttgta	acttcgtctt	aaacaaccct	3300
ccagaaggtt	ggaccggtgg tgttggtttc	gtcaacaaga	aatctttgca	aaaggttttg	3360
caaccacctt	cttctgaacc attgattgtt	gtttgtggtc	cacctgttat	gcaaagagat	3420
gtcaaaaatg	aattgttgtc catgggttac	gacaaggaat	tggttcacac	tgtcgatggt	3480
gaatctggta	ccttgtaa					3498

- 55 032726 <210> 10 <211> 3420 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FRDg оптимизированный ген для S. cerevisiae <400> 10

atggttgatg gtagatcttc	tgcttccatt	gttgccgttg	acccagaaag	agctgccaga	60
gaaagagatg	ctgctgccag	agctttgttg	caagactctc	cattgcacac	caccatgcaa	120
tacgctacct	ctggtttgga	attgactgtt	ccatacgctt	tgaaggttgt	tgcttctgct	180
gacactttcg	acagagccaa	ggaagttgct	gatgaagtct	tgagatgtgc	ctggcaattg	240
gctgacaccg ttttgaactc	tttcaaccca	aactctgaag tctctttagt	cggtagatta	300
ccagtcggtc	aaaagcatca	aatgtctgct	ccattgaaac	gtgtcatggc	ttgttgtcaa	360
agagtctaca	actcctctgc	tggttgtttc	gacccatcca	ctgctccagt	tgccaaggct	420
ttgagagaaa	ttgctttggg	taaggaaaga	aacaatgctt	gtttggaagc	tttgactcaa	480
gcttgtacct	tgccaaactc	tttcgtcatt	gatttcgaag	ctggtactat	ctccagaaag	540
cacgaacacg	cttctttgga	tttgggtggt	gtttccaagg	gttacatcgt	cgattacgtc	600
attgacaaca	tcaatgctgc	tggtttccaa	aacgttttct	ttgactgggg tggtgactgt	660
cgtgcctccg	gtatgaacgc	cagaaacact	ccatgggttg	tcggtatcac	tagacctcct	720
tccttggaca	tgttgccaaa	ccctccaaag	gaagcttctt	acatctccgt	catctctttg	780
gacaatgaag	ctttggctac	ctctggtgat	tacgaaaact	tgatctacac	tgctgacgat	840
aaaccattga	cctgtaccta	cgattggaaa	ggtaaggaat	tgatgaagcc	atctcaatcc	900
aatatcgctc	aagtttccgt	caagtgttac	tctgccatgt	acgctgacgc	tttggctacc	960
gcttgtttca	tcaagcgtga	cccagccaag	gtcagacaat	tgttggatgg ttggagatac	1020
gttagagaca	ccgtcagaga	ttaccgtgtc	tacgtcagag	aaaacgaaag	agttgccaag	1080
atgttcgaaa	ttgccactga	agatgctgaa	atgagaaaga	gaagaatttc	caacacttta	1140
ccagctcgtg tcattgttgt	tggtggtggt	ttggctggtt	tgtccgctgc	cattgaagct	1200
gctggttgtg gtgctcaagt	tgttttgatg	gaaaaggaag	ccaagttggg tggtaactct	1260
gccaaggcta cctctggtat	caacggttgg	ggtactagag	ctcaagctaa ggcttccatt	1320

- 56 032726

gtcgatggtg gtaagtactt	cgaaagagat	acctacaagt	ctggtatcgg tggtaacacc	1380
gatccagctt tggttaagac	tttgtccatg	aaatctgctg	acgctatcgg ttggttgact	1440
tctctaggtg ttccattgac	tgttttgtcc	caattaggtg	gtcactccag	aaagagaact	1500
cacagagctc	cagacaagaa	ggatggtact	ccattgccaa	ttggtttcac	catcatgaaa	1560
actttagaag	atcatgttag	aggtaacttg tccggtagaa	tcaccatcat	ggaaaactgt	1620
tccgttacct	ctttgttgtc	tgaaaccaag	gaaagaccag	acggtaccaa	gcaaatcaga	1680
gttaccggtg tcgaattcac	tcaagctggt	tctggtaaga	ccaccatttt	ggctgatgct	1740
gttatcttgg	ccaccggtgg	tttctccaac	gacaagactg	ctgattcttt	gttgagagaa	1800
catgccccac	acttggttaa	cttcccaacc	accaacggtc	catgggctac	tggtgatggt	1860
gtcaagttgg	ctcaaagatt	aggtgctcaa	ttggtcgata	tggacaaggt	tcaattgcac	1920
ccaactggtt	tgatcaaccc	aaaggaccca	gccaacccaa	ccaaattctt	gggtccagaa	1980
gctctaagag gttctggtgg tgttttgttg	aacaaacaag	gtaagagatt	tgtcaacgaa	2040
ttggatttga	gatctgttgt	ttccaaggcc	atcatggaac	aaggtgctga	atacccaggt	2100
tctggtggtt	ccatgtttgc	ttactgtgtc	ttgaacgctg	ctgctcaaaa	attgtttggt	2160
gtttcctctc	acgaattcta	ctggaagaag	atgggtttgt	tcgtcaaggc	tgacaccatg	2220
agagacttgg	ctgctttgat	tggttgtcca	gttgaatccg	ttcaacaaac	tttagaagaa	2280
tacgaaagat	tatccatctc	tcaaagatct	tgtccaatta	ccagaaaatc	tgtttaccca	2340
tgtgttttgg	gtaccaaagg	tccatactat	gtcgcctttg	tcactccatc	tatccactac	2400
accatgggtg	gttgtttgat	ttctccatct	gctgaaatcc	aaatgaagaa	cacttcttcc	2460
agagctccat	tgtcccactc	caacccaatc	ttgggtttat	tcggtgctgg tgaagtcacc	2520
ggtggtgtcc	acggtggtaa	cagattaggt	ggtaactctt	tgttggaatg	tgttgttttc	2580
ggtagaattg	ccggtgacag	agcttctacc	attttgcaaa	gaaagtcctc	tgctttgtct	2640
ttcaaggtct	ggaccactgt	tgttttgaga	gaagtcagag	aaggtggtgt	ctacggtgct	2700
ggttcccgtg tcttgagatt	caacttacca	ggtgctctac	aaagatctgg tctatccttg	2760
ggtcaattca ttgccatcag	aggtgactgg gacggtcaac	aattgattgg ttactactct	2820
ccaatcactt tgccagacga	tttgggtatg attgacattt	tggccagatc tgacaagggt	2880

- 57 032726 actttacgtg aatggatctc tgctttggaa ccaggtgacg ctgtcgaaat gaaggcttgt 2940 ggtggtttgg tcatcgaaag aagattatct gacaagcact tcgttttcat gggtcacatt 3000 atcaacaagc tatgtttgat tgctggtggt accggtgttg ctccaatgtt gcaaatcatc 3060 aaggccgctt tcatgaagcc attcatcgac actttggaat ccgtccactt gatctacgct 3120 gctgaagatg tcactgaatt gacttacaga gaagttttgg aagaacgtcg tcgtgaatcc 3180 agaggtaaat tcaagaaaac tttcgttttg aacagacctc ctccattatg gactgacggt 3240 gtcggtttca tcgaccgtgg tatcttgacc aaccacgttc aaccaccatc tgacaactta 3300 ttggttgcca tctgtggtcc accagttatg caaagaattg tcaaggccac tttaaagact 3360 ttaggttaca acatgaactt ggtcagaacc gttgacgaaa ctgaaccatc tggaagttaa 3420

<210> <211> <212> <213>

11 898 ДНК Искусственная последовательность

<220>

<223> GPDA промотор <400> 11

tcagcgtcca	attcgagctc	tgtacagtga	ccggtgactc	tttctggcat	gcggagacac	60
ggacggtcgc	agagaggagg	gctgagtaat	aagcgcactc	atgtcagctc	tggcgctctg	120
aggtgcagtg	gatgattatt	aatccgggac	cggccgcccc	tccgccccga	agtggaaagg	180
ctggtgtgcc	cctcgttgac	caagaatcta	ttgcatcatc	ggagaatatg gagcttcatc	240
gaatcaccgg	cagtaagcga	aggagaatgt	gaagccaggg	gtgtatagcc	gtcggcgaaa	300
tagcatgcca	ttaacctagg tacagaagtc	caattgcttc	cgatctggta	aaagattcac	360
gagatagtac	cttctccgaa	gtaggtagag	cgagtacccg	gcgcgtaagc	tccctaattg	420
gcccatccgg	catctgtagg	gcgtccaaat	atcgtgcctc	tcctgctttg	cccggtgtat	480
gaaaccggaa	aggccgctca	ggagctggcc	agcggcgcag	accgggaaca	caagctggca	540
gtcgacccat	ccggtgctct	gcactcgacc	tgctgaggtc	cctcagtccc	tggtaggcag	600
ctttgccccg tctgtccgcc	cggtgtgtcg	gcggggttga	caaggtcgtt	gcgtcagtcc	660
aacatttgtt gccatatttt	cctgctctcc	ccaccagctg	ctcttttctt	ttctctttct	720

- 58 032726

tttcccatct	tcagtatatt	catcttccca	tccaagaacc	tttatttccc	ctaagtaagt	780
actttgctac	atccatactc	catccttccc	atcccttatt	cctttgaacc	tttcagttcg	840
agctttccca	cttcatcgca	gcttgactaa	cagctacccc	gcttgagcca	ccgtcaaa	898
<210> 12 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> TDH3 промотор
<400> 12 ctattttcga	ggaccttgtc	accttgagcc	caagagagcc	aagatttaaa	ttttcctatg	60
acttgatgca	aattcccaaa	gctaataaca	tgcaagacac	gtacggtcaa	gaagacatat	120
ttgacctctt	aacaggttca	gacgcgactg	cctcatcagt	aagacccgtt gaaaagaact	180
tacctgaaaa	aaacgaatat	atactagcgt	tgaatgttag	cgtcaacaac	aagaagttta	240
atgacgcgga	ggccaaggca	aaaagattcc	ttgattacgt	aagggagtta	gaatcatttt	300
gaataaaaaa	cacgcttttt	cagttcgagt	ttatcattat	caatactgcc	atttcaaaga	360
atacgtaaat	aattaatagt	agtgattttc	ctaactttat	ttagtcaaaa	aattagcctt	420
ttaattctgc	tgtaacccgt	acatgcccaa	aatagggggc	gggttacaca	gaatatataa	480
catcgtaggt	gtctgggtga	acagtttatt	cctggcatcc	actaaatata	atggagcccg	540
ctttttaagc	tggcatccag	aaaaaaaaag	aatcccagca	ccaaaatatt	gttttcttca	600
ccaaccatca	gttcataggt	ccattctctt	agcgcaacta	cagagaacag	gggcacaaac	660
aggcaaaaaa	cgggcacaac	ctcaatggag	tgatgcaacc	tgcctggagt	aaatgatgac	720
acaaggcaat	tgacccacgc	atgtatctat	ctcattttct	tacaccttct	attaccttct	780
gctctctctg	atttggaaaa	agctgaaaaa	aaaggttgaa	accagttccc	tgaaattatt	840
cccctacttg	actaataagt	atataaagac	ggtaggtatt	gattgtaatt	ctgtaaatct	900
atttcttaaa	cttcttaaat	tctactttta	tagttagtct	tttttttagt	tttaaaacac	960
caagaactta	gtttcgaata	aacacacata	aacaaacaaa			1000

- 59 032726 <210> 13 <211> 500 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDH3 терминатор <400> 13

gtgaatttac	tttaaatctt	gcatttaaat	aaattttctt	tttatagctt	tatgacttag	60
tttcaattta	tatactattt	taatgacatt	ttcgattcat	tgattgaaag	ctttgtgttt	120
tttcttgatg	cgctattgca	ttgttcttgt	ctttttcgcc	acatgtaata	tctgtagtag	180
atacctgata	cattgtggat	gctgagtgaa	attttagtta	ataatggagg	cgctcttaat	240
aattttgggg	atattggctt	ttttttttaa	agtttacaaa	tgaatttttt	ccgccaggat	300
aacgattctg	aagttactct	tagcgttcct	atcggtacag	ccatcaaatc	atgcctataa	360
atcatgccta	tatttgcgtg	cagtcagtat	catctacatg	aaaaaaactc	ccgcaatttc	420
ttatagaata	cgttgaaaat	taaatgtacg	cgccaagata	agataacata	tatctagatg	480
cagtaatata	cacagattcc					500

<210> 14 <211> 538 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> A. succinogenes PEP карбоксикиназа где EGY в положениях 120-122 заменено на DAF <400> 14

Met

Thr

Asp

Leu

Asn

Lys

Leu

Val

Lys

Glu

Leu

Asn

Asp

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

Thr

Asp

Val

Lys

G1U

lie

Val

Tyr

Asn

Pro

Ser

Tyr

Glu

Gin

Leu

Phe

20

25

30

Glu

Glu

Glu

Thr

Lys

Pro

Gly

Leu

Glu

Gly

Phe

Asp

Lys

Gly

Thr

Leu

35

40

45

Thr

Thr

Leu

Gly

Ala

Val

Ala

Val

Asp

Thr

Gly

He

Phe

Thr

Gly

Arg

- 60 032726

50

55

60

Ser

Pro

Lys

Asp

Lys

Tyr

He

Val

cys

Asp

Glu

Thr

Thr

Lys

Asp

Thr

65

70

75

80

Val

Trp

Trp

Asn

Ser

Glu

Ala

Ala

Lys

Asn

Asp

Asn

Lys

Pro

Met

Thr

85

90

95

Gln

Glu

Thr

Trp

Lys

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Val

Ala

Lys

Gln

Leu

Ser

100

105

110

Gly

Lys

Arg

Leu

Phe

Val

Val

Asp

Ala

Phe

cys

Gly

Ala

Ser

Glu

Lys

115

120

125

His

Arg

He

Gly

Val

Arg

Met

Val

Thr

Glu

Val

Ala

Trp

Gln

Ala

His

130

135

140

Phe

Val

Lys

Asn

Met

Phe

He

Arg

Pro

Thr

Asp

Glu

Glu

Leu

Lys

Asn

145

150

155

160

Phe

Lys

Ala

Asp

Phe

Thr

Val

Leu

Asn

Gly

Ala

Lys

cys

Thr

Asn

Pro

165

170

175

Asn

Trp

Lys

Glu

Gln

Gly

Leu

Asn

Ser

Glu

Asn

Phe

Val

Ala

Phe

Asn

180

185

190

lie

Thr

Glu

Gly

He

Gln

Leu

He

Gly

Gly

Thr

Trp

Tyr

Gly

Gly

Glu

195

200

205

Met

Lys

Lys

Gly

Met

Phe

Ser

Met

Met

Asn

Tyr

Phe

Leu

Pro

Leu

Lys

210

215

220

Gly

Val

Ala

Ser

Met

His

cys

Ser

Ala

Asn

Val

Gly

Lys

Asp

Gly

Asp

225

230

235

240

Val

Ala

He

Phe

Phe

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr

Gly

Lys

Thr

Thr

Leu

Ser

245

250

255

Thr

Asp

Pro

Lys

Arg

Gln

Leu

He

Gly

Asp

Asp

Glu

His

Gly

Trp

Asp

- 61 032726

260

265

270

Glu

Ser

Gly

Val

Phe

Asn

Phe

Glu

Gly

Gly

cys

Tyr

Ala

Lys

Thr

Ile

275

280

285

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Pro

Asp

Ile

Tyr

Gly

Ala

lie

Arg

Arg

290

295

300

Asp

Ala

Leu

Leu

Glu

Asn

Val

Val

Val

Arg

Ala

Asp

Gly

Ser

Val

Asp

305

310

315

320

Phe

Asp

Asp

Gly

Ser

Lys

Thr

Glu

Asn

Thr

Arg

Val

Ser

Tyr

Pro

Ile

325

330

335

Tyr

His

Ile

Asp

Asn

lie

Val

Arg

Pro

Val

Ser

Lys

Ala

Gly

His

Ala

340

345

350

Thr

Lys

Val

lie

Phe

Leu

Thr

Ala

Asp

Ala

Phe

Gly

Val

Leu

Pro

Pro

355

360

365

Val

Ser

Lys

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Thr

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Leu

Ser

Gly

370

375

380

Phe

Thr

Ala

Lys

Leu

Ala

Gly

Thr

Glu

Arg

Gly

Val

Thr

Glu

Pro

Thr

385

390

395

400

Pro

Thr

Phe

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Ala

Ala

Phe

Leu

Ser

Leu

His

Pro

405

410

415

Ile

Gin

Tyr

Ala

Asp

Val

Leu

Val

Glu

Arg

Met

Lys

Ala

Ser

Gly

Ala

420

425

430

Glu

Ala

Tyr

Leu

Val

Asn

Thr

Gly

Trp

Asn

Gly

Thr

Gly

Lys

Arg

Ile

435

440

445

Ser

Ile

Lys

Asp

Thr

Arg

Gly

lie

lie

Asp

Ala

Ile

Leu

Asp

Gly

Ser

450

455

460

Ile

Glu

Lys

Ala

Glu

Met

Gly

Glu

Leu

Pro

Ile

Phe

Asn

Leu

Ala

Ile

- 62 032726

465

470

475

480

Pro

Lys

Ala

Leu

Pro

Gly

Vai

Asp

Pro

Ala

Ile

Leu

Asp

Pro

Arg

Asp

485

490

495

Thr

Tyr

Ala

Asp

Lys

Ala

Gin

Trp

Gin

Vai

Lys

Ala

Glu

Asp

Leu

Ala

500

505

510

Asn

Arg

Phe

Vai

Lys

Asn

Phe

Vai

Lys

Tyr

Thr

Ala

Asn

Pro

Glu

Ala

515

520

525

Ala

Lys

Leu

Vai

Gly

Ala

Gly

Pro

Lys

Ala

530 535 <210>15 <211>1617 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> nt. A. succinogenes PEP карбоксикиназа кодирующая DAF вместо EGY <400>15 atgactgact taaacaaact cgttaaagaa cttaatgact tagggcttac cgatgttaag60 gaaattgtgt ataacccgag ttatgaacaa cttttcgagg aagaaaccaa accgggtttg120 gagggtttcg ataaagggac gttaaccacg cttggcgcgg ttgccgtcga tacggggatt180 tttaccggtc gttcaccgaa agataaatat atcgtttgcg atgaaactac gaaagacacc240 gtttggtgga acagcgaagc ggcgaaaaac gataacaaac cgatgacgca agaaacttgg300 aaaagtttga gagaattagt ggcgaaacaa ctttccggta aacgtttatt cgtggtagac360 gcattctgcg gcgccagtga aaaacaccgt atcggtgtgc gtatggttac tgaagtggca420 tggcaggcgc attttgtgaa aaacatgttt atccgaccga ccgatgaaga gttgaaaaat480 ttcaaagcgg attttaccgt gttaaacggt gctaaatgta ctaatccgaa ctggaaagaa540 caaggtttga acagtgaaaa ctttgtcgct ttcaatatta ccgaaggtat tcagcttatc600 ggcggtactt ggtacggcgg tgaaatgaaa aaaggtatgt tctcaatgat gaactacttc660 ctgccgttaa aaggtgtggc ttccatgcac tgttccgcca acgtaggtaa agacggtgac720

- 63 032726

gtggctattt tcttcggttt atccggtacg ggtaaaacaa cgctttcgac cgatcctaaa	780
cgccaattaa tcggtgatga cgaacacggt tgggatgaat ccggcgtatt taactttgaa	840
ggcggttgtt acgcgaaaac cattaactta tctcaagaaa acgaaccgga tatttacggc	900
gcaatccgtc gtgacgcatt attagaaaac gtcgtggttc gtgcagacgg ttccgttgac	960
tttgacgacg gttcaaaaac agaaaatacc cgtgtttcat atccgattta ccacatcgac	1020
aacatcgttc gtccggtatc gaaagccggt catgcaacca aagtgatttt cttaaccgcg	1080
gacgcattcg gcgtattgcc gccggtttca aaactgactc cggaacaaac cgaatactac	1140
ttcttatccg gctttactgc aaaattagcg ggtacggaac gcggcgtaac cgaaccgact	1200
ccgacattct cggcctgttt cggtgcggca ttcttaagcc tgcatccgat tcaatatgcg	1260
gacgtgttgg tcgaacgcat gaaagcctcc ggtgcggaag cttatttggt gaacaccggt	1320
tggaacggca cgggtaaacg tatttcaatc aaagataccc gcggtattat cgatgcgatt	1380
ttggacggtt caatcgaaaa agcggaaatg ggcgaattgc caatctttaa tttagcgatt	1440
cctaaagcat taccgggtgt tgatcctgct attttggatc cgcgcgatac ttacgcagac	1500
aaagcgcaat ggcaagttaa agcggaagat ttggcaaacc gtttcgtgaa aaactttgtg	1560
aaatatacgg cgaatccgga agcggctaaa ttagttggcg ccggtccaaa agcataa	1617

<210> 16 <211>1617 <212> ДНК <213> Оптимизированный по кодонам A. succinogenes РЕРСК для S. cerevisiae <400>16 atgactgatt tgaacaaatt ggtcaaggaa ttgaatgatt tgggtttgac tgacgtcaag60 gaaattgtct acaacccatc ttacgaacaa ttattcgaag aagaaaccaa gccaggtttg120 gaaggtttcg acaagggtac tttgaccact ttaggtgctg ttgctgttga caccggtatt180 ttcaccggtc gttctccaaa ggacaaatac attgtttgtg atgaaaccac caaggacacc240 gtctggtgga actctgaagc tgccaagaac gataacaagc caatgactca agaaacctgg300 aaatctttga gagaattggt tgccaagcaa ttgtctggta agagattatt cgttgttgac360 gctttctgtg gtgcttctga aaagcacaga attggtgtca gaatggtcac tgaagttgct420 tggcaagctc atttcgtcaa gaacatgttc atcagaccaa ctgacgaaga attgaagaac480

- 64 032726

ttcaaggctg acttcaccgt tttgaatggt gccaagtgta ccaacccaaa ctggaaggaa	540
caaggtttga actctgaaaa ctttgttgct ttcaacatca ctgaaggtat ccaattgatt	600
ggtggtacct ggtacggtgg tgaaatgaag aagggtatgt tctccatgat gaactatttc	660
ttgccattga aaggtgttgc ttccatgcac tgttctgcca atgtcggtaa ggatggtgac	720
gttgccatct tcttcggtct atccggtact ggtaagacca ctctatccac tgacccaaag	780
agacaattga ttggtgatga cgaacacggt tgggacgaat ctggtgtctt taactttgaa	840
ggtggttgtt acgccaagac catcaactta tctcaagaaa acgaaccaga tatctacggt	900
gccatccgtc gtgatgcttt gttggaaaac gttgttgtca gagctgacgg ttctgttgac	960
ttcgacgacg gttccaagac tgaaaacacc agagtttctt acccaatcta ccacattgac	1020
aacattgtca gacctgtttc caaggctggt cacgctacca aggttatctt cttgactgct	1080
gatgctttcg gtgtcttgcc acctgtttcc aaattgactc cagaacaaac cgaatactac	1140
ttcttgtccg gtttcactgc caaattggct ggtactgaaa gaggtgtcac tgaaccaact	1200
ccaactttct ctgcttgttt cggtgctgct ttcttatctt tgcacccaat ccaatacgct	1260
gatgtcttgg ttgaaagaat gaaggcttct ggtgctgaag cttacttggt caacaccggt	1320
tggaacggta ccggtaagag aatctccatc aaggatacca gaggtatcat tgatgctatc	1380
ttggacggtt ccattgaaaa ggctgaaatg ggtgaattgc caatcttcaa cttggccatt	1440
ccaaaggctt tgccaggtgt tgacccagcc atcttagatc caagagacac ctacgctgac	1500
aaggctcaat ggcaagtcaa ggctgaagat ttggctaaca gattcgtcaa gaactttgtc	1560
aaatacactg ctaacccaga agctgccaaa ttggttggtg ctggtccaaa ggcttaa	1617

<210>17 <211>538 <212> белок <213> Mannheimia succinicipoducens <400>17

Met Thr Asp Leu Asn Gln Leu Thr Gln Glu Leu Gly Ala Leu Gly lie 15 1015

His Asp Vai Gln Glu Vai Vai Tyr Asn Pro Ser Tyr Glu Leu Leu Phe

- 65 032726

20

25

30

Ala

Glu

Glu

Thr

Lys

Pro

Gly

Leu

Glu

Gly

Tyr

Glu

Lys

Gly

Thr

Vai

35

40

45

Thr

Asn

Gin

Gly

Ala

Vai

Ala

Vai

Asn

Thr

Gly

Ile

Phe

Thr

Gly

Arg

50

55

60

Ser

Pro

Lys

Asp

Lys

Tyr

lie

Vai

Leu

Asp

Asp

Lys

Thr

Lys

Asp

Thr

65

70

75

80

Vai

Trp

Trp

Thr

Ser

Glu

Lys

Vai

Lys

Asn

Asp

Asn

Lys

Pro

Met

Ser

85

90

95

Gin

Asp

Thr

Trp

Asn

Ser

Leu

Lys

Gly

Leu

Vai

Ala

Asp

Gin

Leu

Ser

100

105

110

Gly

Lys

Arg

Leu

Phe

Vai

Vai

Asp

Ala

Phe

Cys

Gly

Ala

Asn

Lys

Asp

115

120

125

Thr

Arg

Leu

Ala

Vai

Arg

Vai

Vai

Thr

Glu

Vai

Ala

Trp

Gin

Ala

His

130

135

140

Phe

Vai

Thr

Asn

Met

Phe

Ile

Arg

Pro

Ser

Ala

Glu

Glu

Leu

Lys

Gly

145

150

155

160

Phe

Lys

Pro

Asp

Phe

Vai

Vai

Met

Asn

Gly

Ala

Lys

Cys

Thr

Asn

Pro

165

170

175

Asn

Trp

Lys

Glu

Gin

Gly

Leu

Asn

Ser

Glu

Asn

Phe

Vai

Ala

Phe

Asn

180

185

190

Ile

Thr

Glu

Gly

Vai

Gin

Leu

Ile

Gly

Gly

Thr

Trp

Tyr

Gly

Gly

Glu

195

200

205

Met

Lys

Lys

Gly

Met

Phe

Ser

Met

Met

Asn

Tyr

Phe

Leu

Pro

Leu

Arg

210

215

220

Gly

Ile

Ala

Ser

Met

His

Cys

Ser

Ala

Asn

Vai

Gly

Lys

Asp

Gly

Asp

- 66 032726

225

230

235

240

Thr

Ala

lie

Phe

Phe

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr

Gly

Lys

Thr

Thr

Leu

Ser

245

250

255

Thr

Asp

Pro

Lys

Arg

Gin

Leu

He

Gly

Asp

Asp

Glu

His

Gly

Trp

Asp

260

265

270

Asp

Glu

Gly

Vai

Phe

Asn

Phe

Glu

Gly

Gly

cys

Tyr

Ala

Lys

Thr

He

275

280

285

Asn

Leu

Ser

Ala

Glu

Asn

Glu

Pro

Asp

He

Tyr

Gly

Ala

He

Lys

Arg

290

295

300

Asp

Ala

Leu

Leu

Glu

Asn

Vai

Vai

Vai

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Vai

Asp

305

310

315

320

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Lys

Thr

Glu

Asn

Thr

Arg

Vai

Ser

Tyr

Pro

He

325

330

335

Tyr

His

He

Gin

Asn

He

Vai

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

Ala

Gly

Pro

Ala

340

345

350

Thr

Lys

Vai

He

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Ala

Phe

Gly

Vai

Leu

Pro

Pro

355

360

365

Vai

Ser

Lys

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Leu

Ser

Gly

370

375

380

Phe

Thr

Ala

Lys

Leu

Ala

Gly

Thr

Glu

Arg

Gly

He

Thr

Glu

Pro

Thr

385

390

395

400

Pro

Thr

Phe

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Ala

Ala

Phe

Leu

Ser

Leu

His

Pro

405

410

415

Thr

Gin

Tyr

Ala

Glu

Vai

Leu

Vai

Lys

Arg

Met

Gin

Glu

Ser

Gly

Ala

420

425

430

Glu

Ala

Tyr

Leu

Vai

Asn

Thr

Gly

Trp

Asn

Gly

Thr

Gly

Lys

Arg

He

- 67 032726

435

440

445

Ser

He

Lys

Asp

Thr

Arg

Gly

He

He

Asp

Ala

He

Leu

Asp

Gly

Ser

450

455

460

lie

Asp

Lys

Ala

Glu

Met

Gly

Ser

Leu

Pro

He

Phe

Asp

Phe

Ser

He

465

470

475

480

Pro

Lys

Ala

Leu

Pro

Gly

Val

Asn

Pro

Ala

He

Leu

Asp

Pro

Arg

Asp

485

490

495

Thr

Tyr

Ala

Asp

Lys

Ala

Gln

Trp

Glu

Glu

Lys

Ala

Gln

Asp

Leu

Ala

500

505

510

Gly

Arg

Phe

Val

Lys

Asn

Phe

Glu

Lys

Tyr

Thr

Gly

Thr

Ala

Glu

Gly

515

520

525

Gln

Ala

Leu

Val

Ala

Ala

Gly

Pro

Lys

Ala

530 535 <210> 18 <211> 1617 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> РЕР карбоксикиназа М. succiniciproducens сро для S. cerevisiae <400>18 atgaccgatt tgaaccaatt gactcaagaa ttgggtgctt tgggtattca cgatgtccaa60 gaagttgtct acaacccatc ttacgaattg ttgtttgctg aagaaaccaa gccaggtttg120 gaaggttacg aaaagggtac tgttaccaac caaggtgctg ttgctgtcaa caccggtatc180 ttcaccggtc gttctccaaa ggacaaatac attgtcttgg atgacaagac caaggacact240 gtctggtgga cttctgaaaa ggtcaagaac gacaacaaac caatgtccca agacacttgg300 aactctttaa agggtttagt cgctgaccaa ttgtctggta agagattatt cgttgtcgat360 gctttctgtg gtgccaacaa ggacaccaga ttagctgtca gagttgtcac tgaagttgct420 tggcaagctc acttcgttac caacatgttc atcagaccat ctgctgaaga attgaaaggt480

- 68 032726

ttcaagccag atttcgttgt catgaacggt gccaaatgta ccaacccaaa ctggaaggaa	540
caaggtttga actctgaaaa ctttgttgct ttcaacatca ctgaaggtgt tcaattgatt	600
ggtggtacct ggtacggtgg tgaaatgaag aagggtatgt tctccatgat gaactacttc	660
ttgccattga gaggtattgc ttccatgcac tgttctgcca atgtcggtaa ggacggtgac	720
actgccatct tcttcggtct atccggtacc ggtaagacca ctttgtccac tgacccaaag	780
agacaattga ttggtgatga cgaacacggt tgggatgacg aaggtgtttt caactttgaa	840
ggtggttgtt acgccaagac catcaactta tctgctgaaa atgaaccaga tatctatggt	900
gccatcaagc gtgacgctct attggaaaac gttgttgttt tggacaatgg tgacgtcgat	960
tatgctgacg gttccaagac tgaaaacacc agagtttctt acccaatcta ccatattcaa	1020
aacattgtca agccagtttc caaggctggt ccagctacca aagttatctt cttgtctgct	1080
gatgctttcg gtgttttgcc tcctgtttcc aagttgactc cagaacaaac caagtactac	1140
ttcttgtctg gtttcaccgc caagttggct ggtactgaaa gaggtatcac tgaaccaact	1200
ccaactttct ctgcttgttt cggtgctgcc tttttgtctt tgcacccaac tcaatacgct	1260
gaagttttgg tcaagagaat gcaagaatct ggtgctgaag cttacttggt caacactggt	1320
tggaacggta ccggtaagag aatctccatc aaagatacca gaggtatcat cgatgccatc	1380
ttggatggtt ccattgacaa ggctgaaatg ggttctttgc caattttcga tttctccatt	1440
ccaaaggctt tgccaggtgt caacccagcc atcttagacc caagagacac ctacgctgac	1500
aaagctcaat gggaagaaaa ggctcaagac ttggctggta gattcgtcaa gaacttcgaa	1560
aaatacactg gtactgctga aggtcaagct ttggttgctg ctggtccaaa ggcctaa	1617

<210> 19 <211> 365 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> MDH2 S. cerevisiae без первых 12 а.а.

<400> 19

Met Leu Lys lie Ala lie Leu Gly Ala Ala Gly Gly He Gly Gln Ser 15 10 15

- 69 032726

Leu

Ser Leu

Leu 20

Leu Lys Ala Gln

Leu Gln Tyr Gln Leu Lys Glu

Ser

25

30

Asn

Arg

Ser

Val

Thr

His

Ile

His

Leu

Ala

Leu

Tyr Asp

Val

Asn

Gln

35

40

45

Glu

Ala

Ile

Asn

Gly

Val

Thr

Ala

Asp

Leu

Ser

His

Ile

Asp

Thr

Pro

50

55

60

Ile

Ser

Val

Ser

Ser

His

Ser

Pro

Ala

Gly Gly

Ile

Glu

Asn

Cys

Leu

65

70

75

80

His

Asn

Ala

Ser

Ile

Val

Val

Ile

Pro

Ala

Gly

Val

Pro

Arg

Lys

Pro

85

90

95

Gly

Met

Thr

Arg Asp Asp

Leu

Phe

Asn

Val

Asn

Ala

Gly

lie

Ile

Ser

100

105

110

Gln

Leu

Gly Asp

Ser

Ile

Ala

Glu

cys

cys

Asp

Leu

Ser

Lys

Val

Phe

115

120

125

Val

Leu

Val

Ile

Ser

Asn

Pro

Val

Asn

Ser

Leu

Val

Pro

Val

Met

Val

130

135

140

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Asn

His

Pro

Gln

Ser

Arg

Asn

Ser

Gly

Ile

Glu

145

150

155

160

Arg Arg

Ile

Met

Gly

Val

Thr

Lys

Leu

Asp

Ile

Val

Arg

Ala

Ser

Thr

165

170

175

Phe

Leu

Arg

Glu

Ile

Asn

Ile

Glu

Ser

Gly

Leu

Thr

Pro

Arg

Val

Asn

180

185

190

Ser

Met

Pro

Asp

Val

Pro

Val

lie

Gly Gly

His

Ser

Gly

G1U

Thr

lie

195

200

205

Ile

Pro

Leu

Phe

Ser

Gln

Ser

Asn

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Asn

Glu

Asp

210

215

220

- 70 032726

Gln

Leu

Lys

Tyr

Leu

Ile

His

Arg

Val

Gln

Tyr

Gly

Gly

Asp

Glu

Val

225

230

235

240

Val

Lys

Ala

Lys

Asn

Gly

Lys

Gly

Ser

Ala

Thr

Leu

Ser

Met

Ala

His

245

250

255

Ala

Gly

Tyr

Lys

cys

Val

Val

Gln

Phe

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Gly

Asn

260

265

270

Ile

Glu

Gln

Ile

His

Gly

Thr

Tyr

Tyr

Val

Pro

Leu

Lys

Asp

Ala

Asn

275

280

285

Asn

Phe

Pro

Ile

Ala

Pro

Gly

Ala

Asp

Gln

Leu

Leu

Pro

Leu

Val

Asp

290

295

300

Gly

Ala

Asp

Tyr

Phe

Ala

Ile

Pro

Leu

Thr

Ile

Thr

Thr

Lys

Gly

Val

305

310

315

320

Ser

Tyr

Val

Asp

Tyr

Asp

Ile

Val

Asn

Arg

Met

Asn

Asp

Met

Glu

Arg

325

330

335

Asn

Gln

Met

Leu

Pro

Ile

cys

Val

Ser

Gln

Leu

Lys

Lys

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Lys

Gly

Leu

Glu

Phe

Val

Ala

Ser

Arg

Ser

Ala

Ser

Ser

355

360

365

<210> 20 <211> 1099 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> cpo MDH2 S. cerevisiae без первых 12 a.a.

<400>20 atgttgaaga ttgccatctt gggtgctgct ggtggtatcg gtcaatcttt gtctttgttg60 ttgaaggctc aattgcaata ccaattgaag gaatccaaca gatctgttac ccacattcat120 ttggctttgt acgatgtcaa ccaagaagct atcaacggtg tcactgctga cttgtctcac180

- 71 032726

atcgataccc	caatctctgt	ttcctctcac	tctccagctg gtggtattga	aaactgtttg	240
cacaacgctt	ccattgttgt	cattccagcc	ggtgttccaa	gaaagccagg	tatgacccgt	300
gacgatttgt	tcaacgtcaa	tgccggtatc	atctctcaat	taggtgattc	cattgctgaa	360
tgttgtgact	tgtccaaggt	tttcgtcttg gttatctcca	acccagtcaa	ctctttggtt	420
cctgttatgg	tttccaacat	cttgaagaac	cacccacaat	ccagaaactc	tggtattgaa	480
agaagaatca	tgggtgtcac	caaattggac	attgtcagag	cttccacttt	cttgagagaa	540
atcaacattg	aatctggttt	gactccaaga	gtcaactcca	tgccagatgt	tccagttatc	600
ggtggtcact	ctggtgaaac	tatcatccca	ttattctctc	aatctaactt	cttgtccaga	660
ttgaatgaag	atcaattgaa	atacttgatt	caccgtgtcc	aatacggtgg	tgacgaagtt	720
gtcaaggcca	agaacggtaa	gggttctgct	actctatcca	tggctcatgc	cggttacaag	780
tgtgttgtcc	aattcgtttc	tctattatta	ggtaacattg	aacaaatcca	cggtacctac	840
tacgttccat	tgaaagatgc	taacaacttc	ccaattgctc	caggtgctga	ccaattattg	900
ccattagtcg	acggtgctga	ctactttgcc	atcccattga	ccatcactac	caagggtgtt	960
tcttacgttg	actacgatat	cgtcaacaga	atgaacgaca	tggaaagaaa	ccaaatgttg	1020
cctatctgtg	tttctcaatt	gaagaagaac	attgacaagg	gtttggaatt	cgttgcttcc	1080
agatctgctt	ccagttaag					1099

<210> 21 <211> 340 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> MDH3 S. cerevisiae без С-концевого SKL <400> 21

Met

Val

Lys

Val

Ala

Ile

Leu

Gly

Ala

Ser

Gly

Gly

Val

Gly

Gln

Pro

1

5

10

15

Leu

Ser

Leu

Leu

Leu

Lys

Leu

Ser

Pro

Tyr

Val

Ser

Glu

Leu

Ala

Leu

20

25

30

Tyr

Asp

Ile

Arg

Ala

Ala

Glu

Gly

lie

Gly

Lys

Asp

Leu

Ser

His

Ile

- 72 032726

40 45

Asn

Thr

Asn

Ser

Ser

cys

Val

Gly

Tyr

Asp

Lys

Asp

Ser

Ile

Glu

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Ser

Asn

Ala

Gin

Val

Val

Leu

Ile

Pro

Ala

Gly

Val

Pro

Arg

65

70

75

80

Lys

Pro

Gly

Leu

Thr

Arg

Asp

Asp

Leu

Phe

Lys

Met

Asn

Ala

Gly

Ile

85

90

95

Val

Lys

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Val

Gly

Lys

Phe

Ala

Pro

Asn

Ala

Arg

100

105

110

Ile

Leu

Val

Ile

Ser

Asn

Pro

Val

Asn

Ser

Leu

Val

Pro

lie

Ala

Val

115

120

125

Glu

Thr

Leu

Lys

Lys

Met

Gly

Lys

Phe

Lys

Pro

Gly

Asn

Val

Met

Gly

130

135

140

Val

Thr

Asn

Leu

Asp

Leu

Val

Arg

Ala

Glu

Thr

Phe

Leu

Val

Asp

Tyr

145

150

155

160

Leu

Met

Leu

Lys

Asn

Pro

Lys

Ile

Gly

Gin

Glu

Gin

Asp

Lys

Thr

Thr

165

170

175

Met

His

Arg

Lys

Val

Thr

Val

Ile

Gly

Gly

His

Ser

Gly

Glu

Thr

Ile

180

185

190

Ile

Pro

Ile

lie

Thr

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Gin

Leu

Asp

Lys

Gin

195

200

205

Tyr

Glu

His

Phe

Ile

His

Arg

Val

Gin

Phe

Gly

Gly

Asp

Glu

Ile

Val

210

215

220

Lys

Ala

Lys

Gin

Gly

Ala

Gly

Ser

Ala

Thr

Leu

Ser

Met

Ala

Phe

Ala

225

230

235

240

Gly

Ala

Lys

Phe

Ala

Glu

Glu

Val

Leu

Arg

Ser

Phe

His

Asn

Glu

Lys

- 73 032726

245

250

255

Pro

Glu

Thr

Glu

Ser

Leu

Ser

Ala

Phe

Vai Tyr

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

260

265

270

Asn

Gly

Lys

Lys

Ala

Gin

Gin

Leu

Vai

Gly Asp

Asn

Ser

Ile

Glu

Tyr

275

280

285

Phe

Ser

Leu

Pro

Ile

Vai

Leu

Arg

Asn

Gly Ser

Vai

Vai

Ser

Ile

Asp

290

295

300

Thr

Ser

Vai

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Pro

Arg Glu

Glu

Gin

Leu

Vai

Asn

305

310

315

320

Thr

Ala

Vai

Lys

Glu

Leu

Arg

Lys

Asn

Ile Glu

Lys

Gly

Lys

Ser

Phe

325

330

335

He Leu Asp Ser

340 <210> 22 <211> 1024 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> MDH3 S. cerevisiae без SKL кодирующих nt, cpo <400>22 atggttaagg ttgccatctt aggtgcttct ggtggtgtcg gtcaaccatt atctctatta60 ttgaaattgt ctccatacgt ttctgaattg gctttgtacg atatcagagc tgctgaaggt120 attggtaagg atttgtccca catcaacacc aactcctctt gtgttggtta cgacaaggat180 tccatcgaaa acactttgtc caatgctcaa gttgtcttga ttccagctgg tgttccaaga240 aagccaggtt tgaccagaga tgatttgttc aagatgaacg ctggtatcgt taagtctttg300 gttactgctg tcggtaaatt tgccccaaac gctcgtatct tagtcatctc caaccctgtt360 aactctttgg ttccaattgc cgttgaaact ttgaagaaga tgggtaagtt caagccaggt420 aacgttatgg gtgtcaccaa cttggatttg gtcagagctg aaactttctt ggttgactac480

- 74 032726

ttgatgttga	agaacccaaa	gatcggtcaa	gaacaagaca	agaccaccat	gcacagaaag	540
gtcaccgtca	tcggtggtca	ctctggtgaa	accatcattc	caatcatcac	tgacaaatcc	600
ttggttttcc	aattggacaa	gcaatacgaa	catttcatcc	acagagtcca	attcggtggt	660
gacgaaattg tcaaggccaa	gcaaggtgcc	ggttctgcta	ccttgtccat	ggctttcgct	720
ggtgccaaat	ttgctgaaga	agtcttacgt	tctttccaca	acgaaaagcc	agaaactgaa	780
tctttgtctg	ctttcgtcta	cttgccaggt	ttgaagaacg	gtaagaaggc	tcaacaatta	840
gtcggtgaca	actccattga	atacttctct	ttgccaattg	ttttgagaaa	cggttccgtt	900
gtttccattg	acacttctgt	tttggaaaaa	ttgtctccaa	gagaagaaca	attggtcaac	960
actgctgtca	aggaattgag	aaagaacatt	gaaaagggta	agtctttcat	cttggacagt	1020

taag1024 <210>23 <211>472 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Fumarase R. oryzae без первых 23 aa+ новый Μ <40θ> 23

Met

Ser

Ser

Ala

Ser

Ala

Ala

Leu

Gln

Lys

Phe

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

1

5

10

15

Thr

Phe

Gly

Asp

Leu

Gln

Vai

Pro

Ala

Asp

Arg

Tyr

Trp

Gly

Ala

Gln

20

25

30

Thr

Gln

Arg

Ser

Leu

Gln

Asn

Phe

Asp

He

Gly

Gly

Pro

Thr

Glu

Arg

35

40

45

Met

Pro

Glu

Pro

Leu

He

Arg

Ala

Phe

Gly

Vai

Leu

Lys

Lys

Ala

Ala

50

55

60

Ala

Thr

Vai

Asn

Met

Thr

Tyr

Gly

Leu

Asp

Pro

Lys

Vai

Gly

Glu

Ala

65

70

75

80

lie

Gln

Lys

Ala

Ala

Asp

Glu

Vai

He

Asp

Gly

Ser

Leu

He

Asp

His

- 75 032726

85

90

95

Phe

Pro

Leu

Val

Val

Trp

Gln

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Gln

Thr

Lys Met

100

105

110

Asn

Val

Asn

Glu

Val

He

Ser

Asn

Arg

Ala

He

Glu

Leu

Leu

Gly Gly

115

120

125

Glu

Leu

Gly

Ser

Lys

Ala

Pro

Val

His

Pro

Asn

Asp

His

Val

Asn

Met

130

135

140

Ser

Gln

Ser

Ser

Asn

Asp

Thr

Phe

Pro

Thr

Ala

Met

His

Val

Ala

Ala

145

150

155

160

Val

Val

Glu

He

His

Gly Arg

Leu

He

Pro

Ala

Leu

Thr

Thr

Leu

Arg

165

170

175

Asp

Ala

Leu

Gln

Ala

Lys

Ser

Ala

Glu

Phe

Glu

His

He

He

Lys

He

180

185

190

Gly Arg

Thr

His

Leu

Gln

Asp

Ala

Thr

Pro

Leu

Thr

Leu

Gly

Gln

Glu

195

200

205

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Gln

Gln

Leu

Thr

Tyr Gly

He

Ala

Arg

Val

Gln

210

215

220

Gly

Thr

Leu

Glu

Arg

Leu

Tyr

Asn

Leu

Ala

Gln

Gly

Gly

Thr

Ala

Val

225

230

235

240

Gly

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala

Lys

Val

Ala

Glu

245

250

255

Ala

lie

Ala

Ser

He

Thr

Gly

Leu

Pro

Phe

Lys

Thr

Ala

Pro

Asn

Lys

260

265

270

Phe

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

His

Asp

Ala

Leu

Val

Glu

Ala

His

Gly

Ala

275

280

285

Leu

Asn

Thr

Val

Ala

Cys

Ser

Leu

Met

Lys

He

Ala

Asn

Asp

He

Arg

- 76 032726

290 295300

Туг

Leu

Gly

Ser

Gly

Pro

Arg

cys

Gly

Leu

Gly

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

305

310

315

320

Glu

Asn

Glu

Pro

Gly

Ser

Ser

He

Met

Pro

Gly

Lys

Val

Asn

Pro

Thr

325

330

335

Gin

Cys

Glu

Ala

Met

Thr

Met

Val

Cys

Ala

Gin

Val

Met

Gly

Asn

Asn

340

345

350

Thr

Ala

He

Ser

Val

Ala

Gly

Ser

Asn

Gly

Gin

Phe

Glu

Leu

Asn

Val

355

360

365

Phe

Lys

Pro

Val

Met

He

Lys

Asn

Leu

He

Gin

Ser

He

Arg

Leu

He

370

375

380

Ser

Asp

Ala

Ser

He

Ser

Phe

Thr

Lys

Asn

Cys

Val

Val

Gly

He

Glu

385

390

395

400

Ala

Asn

Glu

Lys

Lys

He

Ser

Ser

He

Met

Asn

Glu

Ser

Leu

Met

Leu

405

410

415

Val

Thr

Ala

Leu

Asn

Pro

His

He

Gly

Tyr

Asp

Lys

Ala

Ala

Lys

Cys

420

425

430

Ala

Lys

Lys

Ala

His

Lys

Glu

Gly

Thr

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Ala

Leu

435

440

445

Ser

Leu

Gly

Tyr

Leu

Thr

Ser

Glu

Glu

Phe

Asp

Gin

Trp

Val

Arg

Pro

450 455 460

Glu Asp Met lie Ser Ala Lys Asp

465470 <210>24 <211>1419 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 77 032726 <220>

<223> Fumarase R. oryzae без nt кодирующей первые аа + Μ <400> 24

atgtcctctg cttctgctgc tttgcaaaaa	ttcagagctg	aaagagatac	cttcggtgac	60
ttgcaagttc cagctgaccg ttactggggt	gctcaaactc	aaagatcttt	gcaaaacttt	120
gacattggtg gtccaactga	aagaatgcca	gaaccattaa	tcagagcttt	cggtgttttg	180
aagaaggctg	ctgccaccgt	caacatgacc	tacggtttgg	acccaaaggt	tggtgaagcc	240
atccaaaagg	ctgctgacga	agttatcgat	ggttctttga	ttgaccattt	cccattggtt	300
gtctggcaaa	ccggttctgg	tactcaaacc	aagatgaacg	tcaatgaagt	catctccaac	360
agagccattg	aattgttggg	tggtgaatta	ggttccaagg	ctccagtcca	cccaaacgat	420
catgtcaaca	tgtctcaatc	ttccaacgac	actttcccaa	ctgccatgca	cgttgctgcc	480
gttgttgaaa	ttcacggtag	attgattcca	gctttgacca	ctttgagaga	tgctttgcaa	540
gccaaatctg	ctgaattcga	acacatcatc	aagattggta	gaacccactt	gcaagatgct	600
accccattga	ctttaggtca	agaattctcc	ggttacactc	aacaattgac	ctacggtatt	660
gctcgtgttc	aaggtacttt	ggaaagatta	tacaacttgg	ctcaaggtgg tactgctgtc	720
ggtactggtt	tgaacaccag	aaagggtttc	gatgccaagg ttgctgaagc	cattgcttcc	780
atcactggtt	taccattcaa	gaccgctcca	aacaaattcg	aagctttggc	tgctcacgac	840
gctttggttg	aagctcacgg tgctttgaac	accgttgctt	gttctttgat	gaagattgcc	900
aacgatatcc	gttacttggg ttctggtcca	agatgtggtt	taggtgaatt	gtctctacca	960
gaaaacgaac	caggttcttc	catcatgcca	ggtaaggtca	acccaactca	atgtgaagct	1020
atgaccatgg tttgtgctca	agtcatgggt	aacaacactg	ccatctctgt	tgctggttcc	1080
aacggtcaat	tcgaattgaa	tgtctttaaa	ccagtcatga	tcaagaactt	gatccaatcc	1140
atcagattaa	tctctgacgc	ttccatctct	ttcaccaaga	actgtgttgt	cggtattgaa	1200
gctaacgaaa	agaagatctc	ctccatcatg	aacgaatctt	tgatgttggt	cactgctttg	1260
aaccctcaca	ttggttacga	caaggctgcc	aagtgtgcca	agaaggctca	caaggaaggt	1320
accactttga	aagaagctgc	tctatctttg ggttacttga	cctctgaaga	attcgaccaa	1380
tgggttagac	ctgaggacat	gatttctgcc aaggattaa			1419

- 78 032726 <210> 25 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDH1 промотор <400> 25

cttccctttt	acagtgcttc	ggaaaagcac	agcgttgtcc	aagggaacaa	tttttcttca	60
agttaatgca	taagaaatat	ctttttttat	gtttagctaa	gtaaaagcag	cttggagtaa	120
aaaaaaaaat	gagtaaattt	ctcgatggat	tagtttctca	caggtaacat	aacaaaaacc	180
aagaaaagcc	cgcttctgaa	aactacagtt	gacttgtatg	ctaaagggcc	agactaatgg	240
gaggagaaaa	agaaacgaat	gtatatgctc	atttacactc	tatatcacca	tatggaggat	300
aagttgggct	gagcttctga	tccaatttat	tctatccatt	agttgctgat	atgtcccacc	360
agccaacact	tgatagtatc	tactcgccat	tcacttccag	cagcgccagt	agggttgttg	420
agcttagtaa	aaatgtgcgc	accacaagcc	tacatgactc	cacgtcacat	gaaaccacac	480
cgtggggcct	tgttgcgcta	ggaataggat	atgcgacgaa	gacgcttctg	cttagtaacc	540
acaccacatt	ttcagggggt	cgatctgctt	gcttccttta	ctgtcacgag	cggcccataa	600
tcgcgctttt	tttttaaaag	gcgcgagaca	gcaaacagga	agctcgggtt	tcaaccttcg	660
gagtggtcgc	agatctggag	actggatctt	tacaatacag taaggcaagc	caccatctgc	720
ttcttaggtg	catgcgacgg	tatccacgtg	cagaacaaca	tagtctgaag	aaggggggga	780
ggagcatgtt	cattctctgt	agcagtaaga	gcttggtgat	aatgaccaaa	actggagtct	840
cgaaatcata	taaatagaca	atatattttc	acacaatgag	atttgtagta	cagttctatt	900
ctctctcttg	cataaataag	aaattcatca	agaacttggt	ttgatatttc	accaacacac	960
acaaaaaaca	gtacttcact	aaatttacac	acaaaacaaa			1000

<210> <211> <212> <213>	26 500 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223>	TDH1 терминатор

- 79 032726

<400> 26 ataaagcaat cttgatgagg ataatgattt	ttttttgaat atacataaat actaccgttt	60
ttctgctaga ttttgtgaag acgtaaataa	gtacatatta ctttttaagc caagacaaga	120
ttaagcatta actttaccct tttctcttct	aagtttcaat actagttatc actgtttaaa	180
agttatggcg agaacgtcgg cggttaaaat	atattaccct gaacgtggtg aattgaagtt	240
ctaggatggt ttaaagattt ttcctttttg	ggaaataagt aaacaatata ttgctgcctt	300
tgcaaaacgc acatacccac aatatgtgac	tattggcaaa gaacgcatta tcctttgaag	360
aggtggatac tgatactaag agagtctcta	ttccggctcc acttttagtc cagagattac	420
ttgtcttctt acgtatcaga acaagaaagc	atttccaaag taattgcatt tgcccttgag	480
cagtatatat atactaagaa		500

<210> 27 <211> 600 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

<220>
<223> второй TDH3 промотор <400> 27 ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc	tgtaacccgt	acatgcccaa	aatagggggc	60
gggttacaca	gaatatataa	catcgtaggt	gtctgggtga	acagtttatt	cctggcatcc	120
actaaatata	atggagcccg	ctttttaagc	tggcatccag	aaaaaaaaag	aatcccagca	180
ccaaaatatt	gttttcttca	ccaaccatca	gttcataggt	ccattctctt	agcgcaacta	240
cagagaacag	gggcacaaac	aggcaaaaaa	cgggcacaac	ctcaatggag	tgatgcaacc	300
tgcctggagt	aaatgatgac	acaaggcaat	tgacccacgc	atgtatctat	ctcattttct	360
tacaccttct	attaccttct	gctctctctg	atttggaaaa	agctgaaaaa	aaaggttgaa	420
accagttccc	tgaaattatt	cccctacttg	actaataagt	atataaagac	ggtaggtatt	480
gattgtaatt	ctgtaaatct	atttcttaaa	cttcttaaat	tctactttta	tagttagtct	540
tttttttagt	tttaaaacac	caagaactta	gtttcgaata	aacacacata	aacaaacaaa	600

<210> 28 <211> 300

- 80 032726 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> второй TDH3 терминатор <400>28 gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag60 tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt120 tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag180 atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat240 aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat300 <210>29 <211>3148 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDHlp-PCKm-TDHlt искуственная конструкция <400> 29

ggatcccttc	ccttttacag tgcttcggaa	aagcacagcg	ttgtccaagg gaacaatttt	60
tcttcaagtt	aatgcataag	aaatatcttt	ttttatgttt	agctaagtaa	aagcagcttg	120
gagtaaaaaa	aaaaatgagt	aaatttctcg	atggattagt	ttctcacagg	taacataaca	180
aaaaccaaga	aaagcccgct	tctgaaaact	acagttgact	tgtatgctaa	agggccagac	240
taatgggagg	agaaaaagaa	acgaatgtat	atgctcattt	acactctata	tcaccatatg	300
gaggataagt	tgggctgagc	ttctgatcca	atttattcta	tccattagtt	gctgatatgt	360
cccaccagcc	aacacttgat	agtatctact	cgccattcac	ttccagcagc	gccagtaggg	420
ttgttgagct	tagtaaaaat	gtgcgcacca	caagcctaca	tgactccacg	tcacatgaaa	480
ccacaccgtg gggccttgtt	gcgctaggaa	taggatatgc	gacgaagacg	cttctgctta	540
gtaaccacac	cacattttca	gggggtcgat	ctgcttgctt	cctttactgt	cacgagcggc	600
ccataatcgc	gctttttttt	taaaaggcgc	gagacagcaa	acaggaagct	cgggtttcaa	660
ccttcggagt	ggtcgcagat	ctggagactg gatctttaca	atacagtaag	gcaagccacc	720
atctgcttct	taggtgcatg	cgacggtatc cacgtgcaga	acaacatagt	ctgaagaagg	780

- 81 032726

gggggaggag	catgttcatt	ctctgtagca	gtaagagctt	ggtgataatg	accaaaactg	840
gagtctcgaa	atcatataaa	tagacaatat	attttcacac	aatgagattt	gtagtacagt	900
tctattctct	ctcttgcata	aataagaaat	tcatcaagaa	cttggtttga	tatttcacca	960
acacacacaa	aaaacagtac	ttcactaaat	ttacacacaa	aacaaaatga	ctgatttgaa	1020
caaattggtc	aaggaattga	atgatttggg tttgactgac	gtcaaggaaa	ttgtctacaa	1080
cccatcttac	gaacaattat	tcgaagaaga	aaccaagcca	ggtttggaag	gtttcgacaa	1140
gggtactttg	accactttag	gtgctgttgc	tgttgacacc	ggtattttca	ccggtcgttc	1200
tccaaaggac	aaatacattg tttgtgatga	aaccaccaag	gacaccgtct	ggtggaactc	1260
tgaagctgcc	aagaacgata	acaagccaat	gactcaagaa	acctggaaat	ctttgagaga	1320
attggttgcc	aagcaattgt	ctggtaagag attattcgtt	gttgacgctt tctgtggtgc	1380
ttctgaaaag	cacagaattg	gtgtcagaat	ggtcactgaa	gttgcttggc	aagctcattt	1440
cgtcaagaac	atgttcatca	gaccaactga	cgaagaattg	aagaacttca	aggctgactt	1500
caccgttttg	aatggtgcca	agtgtaccaa	cccaaactgg	aaggaacaag	gtttgaactc	1560
tgaaaacttt	gttgctttca	acatcactga	aggtatccaa	ttgattggtg	gtacctggta	1620
cggtggtgaa	atgaagaagg gtatgttctc	catgatgaac	tatttcttgc	cattgaaagg	1680
tgttgcttcc	atgcactgtt	ctgccaatgt	cggtaaggat	ggtgacgttg	ccatcttctt	1740
cggtctatcc	ggtactggta	agaccactct	atccactgac	ccaaagagac	aattgattgg	1800
tgatgacgaa	cacggttggg	acgaatctgg tgtctttaac	tttgaaggtg gttgttacgc	1860
caagaccatc	aacttatctc	aagaaaacga	accagatatc	tacggtgcca	tccgtcgtga	1920
tgctttgttg	gaaaacgttg	ttgtcagagc	tgacggttct	gttgacttcg	acgacggttc	1980
caagactgaa	aacaccagag	tttcttaccc	aatctaccac	attgacaaca	ttgtcagacc	2040
tgtttccaag gctggtcacg	ctaccaaggt	tatcttcttg	actgctgatg	ctttcggtgt	2100
cttgccacct	gtttccaaat	tgactccaga	acaaaccgaa	tactacttct	tgtccggttt	2160
cactgccaaa	ttggctggta	ctgaaagagg tgtcactgaa	ccaactccaa	ctttctctgc	2220
ttgtttcggt	gctgctttct	tatctttgca	cccaatccaa	tacgctgatg tcttggttga	2280
aagaatgaag gcttctggtg	ctgaagctta cttggtcaac	accggttgga acggtaccgg	2340

- 82 032726

taagagaatc	tccatcaagg ataccagagg tatcattgat gctatcttgg acggttccat	2400
tgaaaaggct	gaaatgggtg aattgccaat cttcaacttg gccattccaa aggctttgcc	2460
aggtgttgac	ccagccatct tagatccaag agacacctac gctgacaagg ctcaatggca	2520
agtcaaggct	gaagatttgg ctaacagatt cgtcaagaac tttgtcaaat acactgctaa	2580
cccagaagct	gccaaattgg ttggtgctgg tccaaaggct taaggcccgg gcataaagca	2640
atcttgatga	ggataatgat ttttttttga atatacataa atactaccgt ttttctgcta	2700
gattttgtga	agacgtaaat aagtacatat tactttttaa gccaagacaa gattaagcat	2760
taactttacc	cttttctctt ctaagtttca atactagtta tcactgttta aaagttatgg	2820
cgagaacgtc	ggcggttaaa atatattacc ctgaacgtgg tgaattgaag ttctaggatg	2880
gtttaaagat	ttttcctttt tgggaaataa gtaaacaata tattgctgcc tttgcaaaac	2940
gcacataccc	acaatatgtg actattggca aagaacgcat tatcctttga agaggtggat	3000
actgatacta	agagagtctc tattccggct ccacttttag tccagagatt acttgtcttc	3060
ttacgtatca	gaacaagaaa gcatttccaa agtaattgca tttgcccttg agcagtatat	3120
atatactaag	aaggcgcgcc gcggccgc	3148

<210> 30 <211> 3148 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDHlp-PCKl-TDHlt искусственная конструкция <400> 30

ggatcccttc	ccttttacag tgcttcggaa	aagcacagcg	ttgtccaagg	gaacaatttt	60
tcttcaagtt	aatgcataag	aaatatcttt	ttttatgttt	agctaagtaa	aagcagcttg	120
gagtaaaaaa	aaaaatgagt	aaatttctcg	atggattagt	ttctcacagg	taacataaca	180
aaaaccaaga	aaagcccgct	tctgaaaact	acagttgact	tgtatgctaa	agggccagac	240
taatgggagg	agaaaaagaa	acgaatgtat	atgctcattt	acactctata	tcaccatatg	300
gaggataagt	tgggctgagc	ttctgatcca	atttattcta	tccattagtt	gctgatatgt	360
cccaccagcc	aacacttgat	agtatctact	cgccattcac	ttccagcagc	gccagtaggg	420

- 83 032726

ttgttgagct tagtaaaaat	gtgcgcacca	caagcctaca	tgactccacg	tcacatgaaa	480
ccacaccgtg gggccttgtt	gcgctaggaa	taggatatgc	gacgaagacg	cttctgctta	540
gtaaccacac	cacattttca	gggggtcgat	ctgcttgctt	cctttactgt	cacgagcggc	600
ccataatcgc	gctttttttt	taaaaggcgc	gagacagcaa	acaggaagct	cgggtttcaa	660
ccttcggagt	ggtcgcagat	ctggagactg gatctttaca	atacagtaag	gcaagccacc	720
atctgcttct	taggtgcatg	cgacggtatc	cacgtgcaga	acaacatagt	ctgaagaagg	780
gggggaggag	catgttcatt	ctctgtagca	gtaagagctt	ggtgataatg	accaaaactg	840
gagtctcgaa	atcatataaa	tagacaatat	attttcacac	aatgagattt	gtagtacagt	900
tctattctct	ctcttgcata	aataagaaat	tcatcaagaa	cttggtttga	tatttcacca	960
acacacacaa	aaaacagtac	ttcactaaat	ttacacacaa	aacaaaatga	ccgatttgaa	1020
ccaattgact	caagaattgg	gtgctttggg tattcacgat	gtccaagaag ttgtctacaa	1080
cccatcttac	gaattgttgt	ttgctgaaga	aaccaagcca	ggtttggaag gttacgaaaa	1140
gggtactgtt	accaaccaag	gtgctgttgc	tgtcaacacc	ggtatcttca	ccggtcgttc	1200
tccaaaggac	aaatacattg	tcttggatga	caagaccaag	gacactgtct	ggtggacttc	1260
tgaaaaggtc	aagaacgaca	acaaaccaat	gtcccaagac	acttggaact	ctttaaaggg	1320
tttagtcgct	gaccaattgt	ctggtaagag	attattcgtt	gtcgatgctt	tctgtggtgc	1380
caacaaggac	accagattag	ctgtcagagt	tgtcactgaa	gttgcttggc	aagctcactt	1440
cgttaccaac	atgttcatca	gaccatctgc	tgaagaattg	aaaggtttca	agccagattt	1500
cgttgtcatg	aacggtgcca	aatgtaccaa	cccaaactgg	aaggaacaag	gtttgaactc	1560
tgaaaacttt	gttgctttca	acatcactga	aggtgttcaa	ttgattggtg	gtacctggta	1620
cggtggtgaa	atgaagaagg gtatgttctc	catgatgaac	tacttcttgc	cattgagagg	1680
tattgcttcc	atgcactgtt	ctgccaatgt	cggtaaggac	ggtgacactg	ccatcttctt	1740
cggtctatcc	ggtaccggta	agaccacttt	gtccactgac	ccaaagagac	aattgattgg	1800
tgatgacgaa	cacggttggg	atgacgaagg tgttttcaac	tttgaaggtg	gttgttacgc	I860
caagaccatc	aacttatctg	ctgaaaatga accagatatc	tacggtgcca	tcaagcgtga	1920
cgctctattg	gaaaacgttg	ttgttttgga caatggtgac	gtcgattatg	ctgacggttc	1980

- 84 032726

caagactgaa	aacaccagag	tttcttaccc	aatctaccat	attcaaaaca	ttgtcaagcc	2040
agtttccaag gctggtccag	ctaccaaagt	tatcttcttg	tctgctgatg	ctttcggtgt	2100
tttgcctcct	gtttccaagt	tgactccaga	acaaaccaag	tactacttct	tgtctggttt	2160
caccgccaag	ttggctggta	ctgaaagagg tatcactgaa	ccaactccaa	ctttctctgc	2220
ttgtttcggt	gctgcctttt	tgtctttgca cccaactcaa	tacgctgaag ttttggtcaa	2280
gagaatgcaa	gaatctggtg	ctgaagctta	cttggtcaac	actggttgga	acggtaccgg	2340
taagagaatc	tccatcaaag	ataccagagg tatcatcgat	gccatcttgg	atggttccat	2400
tgacaaggct	gaaatgggtt	ctttgccaat	tttcgatttc	tccattccaa	aggctttgcc	2460
aggtgtcaac	ccagccatct	tagacccaag	agacacctac	gctgacaaag	ctcaatggga	2520
agaaaaggct	caagacttgg	ctggtagatt	cgtcaagaac	ttcgaaaaat	acactggtac	2580
tgctgaaggt	caagctttgg	ttgctgctgg tccaaaggcc	taaggcccgg gcataaagca	2640
atcttgatga	ggataatgat	ttttttttga	atatacataa	atactaccgt	ttttctgcta	2700
gattttgtga	agacgtaaat	aagtacatat	tactttttaa	gccaagacaa	gattaagcat	2760
taactttacc	cttttctctt	ctaagtttca	atactagtta	tcactgttta	aaagttatgg	2820
cgagaacgtc	ggcggttaaa	atatattacc	ctgaacgtgg tgaattgaag ttctaggatg	2880
gtttaaagat	ttttcctttt	tgggaaataa	gtaaacaata tattgctgcc	tttgcaaaac	2940
gcacataccc	acaatatgtg	actattggca	aagaacgcat tatcctttga	agaggtggat	3000
actgatacta	agagagtctc	tattccggct	ccacttttag tccagagatt	acttgtcttc	3060
ttacgtatca	gaacaagaaa	gcatttccaa	agtaattgca tttgcccttg	agcagtatat	3120
atatactaag	aaggcgcgcc	gcggccgc				3148

<210> 31 <211> 2637 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDH3p-delta 12N MDH2-TDH3t искусственная конструкция <400> 31 ggatccggcg cgccctattt tcgaggacct tgtcaccttg agcccaagag agccaagatt 60

- 85 032726

taaattttcc	tatgacttga	tgcaaattcc caaagctaat aacatgcaag acacgtacgg	120
tcaagaagac	atatttgacc	tcttaacagg ttcagacgcg	actgcctcat cagtaagacc	180
cgttgaaaag	aacttacctg	aaaaaaacga	atatatacta	gcgttgaatg ttagcgtcaa	240
caacaagaag	tttaatgacg	cggaggccaa	ggcaaaaaga	ttccttgatt	acgtaaggga	300
gttagaatca	ttttgaataa	aaaacacgct	ttttcagttc	gagtttatca	ttatcaatac	360
tgccatttca	aagaatacgt	aaataattaa	tagtagtgat	tttcctaact	ttatttagtc	420
aaaaaattag	ccttttaatt	ctgctgtaac	ccgtacatgc	ccaaaatagg	gggcgggtta	480
cacagaatat	ataacatcgt	aggtgtctgg gtgaacagtt	tattcctggc	atccactaaa	540
tataatggag	cccgcttttt	aagctggcat	ccagaaaaaa	aaagaatccc	agcaccaaaa	600
tattgttttc	ttcaccaacc	atcagttcat	aggtccattc	tcttagcgca	actacagaga	660
acaggggcac	aaacaggcaa	aaaacgggca	caacctcaat	ggagtgatgc	aacctgcctg	720
gagtaaatga	tgacacaagg	caattgaccc	acgcatgtat	ctatctcatt	ttcttacacc	780
ttctattacc	ttctgctctc	tctgatttgg aaaaagctga	aaaaaaaggt	tgaaaccagt	840
tccctgaaat	tattccccta	cttgactaat	aagtatataa	agacggtagg tattgattgt	900
aattctgtaa	atctatttct	taaacttctt	aaattctact	tttatagtta	gtcttttttt	960
tagttttaaa	acaccaagaa	cttagtttcg	aataaacaca	cataaacaaa	caaaatgttg	1020
aagattgcca	tcttgggtgc	tgctggtggt	atcggtcaat	ctttgtcttt	gttgttgaag	1080
gctcaattgc	aataccaatt	gaaggaatcc	aacagatctg	ttacccacat	tcatttggct	1140
ttgtacgatg tcaaccaaga	agctatcaac	ggtgtcactg	ctgacttgtc	tcacatcgat	1200
accccaatct ctgtttcctc	tcactctcca	gctggtggta	ttgaaaactg tttgcacaac	1260
gcttccattg ttgtcattcc	agccggtgtt	ccaagaaagc	caggtatgac	ccgtgacgat	1320
ttgttcaacg	tcaatgccgg	tatcatctct	caattaggtg	attccattgc	tgaatgttgt	1380
gacttgtcca	aggttttcgt	cttggttatc	tccaacccag	tcaactcttt	ggttcctgtt	1440
atggtttcca	acatcttgaa	gaaccaccca	caatccagaa	actctggtat	tgaaagaaga	1500
atcatgggtg	tcaccaaatt	ggacattgtc	agagcttcca	ctttcttgag	agaaatcaac	1560
attgaatctg gtttgactcc	aagagtcaac	tccatgccag	atgttccagt	tatcggtggt	1620

- 86 032726

cactctggtg	aaactatcat	cccattattc	tctcaatcta	acttcttgtc	cagattgaat	1680
gaagatcaat	tgaaatactt	gattcaccgt	gtccaatacg	gtggtgacga	agttgtcaag	1740
gccaagaacg	gtaagggttc	tgctactcta	tccatggctc	atgccggtta	caagtgtgtt	1800
gtccaattcg	tttctctatt	attaggtaac	attgaacaaa	tccacggtac	ctactacgtt	I860
ccattgaaag	atgctaacaa	cttcccaatt	gctccaggtg	ctgaccaatt	attgccatta	1920
gtcgacggtg	ctgactactt	tgccatccca	ttgaccatca	ctaccaaggg tgtttcttac	1980
gttgactacg	atatcgtcaa	cagaatgaac	gacatggaaa	gaaaccaaat	gttgcctatc	2040
tgtgtttctc	aattgaagaa	gaacattgac	aagggtttgg	aattcgttgc	ttccagatct	2100
gcttccagtt	aaggcccggg	cgtgaattta	ctttaaatct	tgcatttaaa	taaattttct	2160
ttttatagct	ttatgactta	gtttcaattt	atatactatt	ttaatgacat	tttcgattca	2220
ttgattgaaa	gctttgtgtt	ttttcttgat	gcgctattgc	attgttcttg tctttttcgc	2280
cacatgtaat	atctgtagta	gatacctgat	acattgtgga	tgctgagtga	aattttagtt	2340
aataatggag	gcgctcttaa	taattttggg	gatattggct	ttttttttta	aagtttacaa	2400
atgaattttt	tccgccagga	taacgattct	gaagttactc	ttagcgttcc	tatcggtaca	2460
gccatcaaat	catgcctata	aatcatgcct	atatttgcgt	gcagtcagta	tcatctacat	2520
gaaaaaaact	cccgcaattt	cttatagaat	acgttgaaaa	ttaaatgtac	gcgccaagat	2580
aagataacat	atatctagat	gcagtaatat	acacagattc	cggccggccg	cggccgc	2637

<210> 32 <211> 1966

<212> <213>	ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223>	TDH3p-MDH3-TDH3t искусственная конструкция
<400>	32
ggatccggcg cgccacgcgt ggccggcctt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg 60
taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt 120
ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg 180
gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt 240

- 87 032726

tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg	300
ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg	360
acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat	420
ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac	480
taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact	540
tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt taaaacacca agaacttagt	600
ttcgaataaa cacacataaa caaacaaaat ggttaaggtt gccatcttag gtgcttctgg	660
tggtgtcggt caaccattat ctctattatt gaaattgtct ccatacgttt ctgaattggc	720
tttgtacgat atcagagctg ctgaaggtat tggtaaggat ttgtcccaca tcaacaccaa	780
ctcctcttgt gttggttacg acaaggattc catcgaaaac actttgtcca atgctcaagt	840
tgtcttgatt ccagctggtg ttccaagaaa gccaggtttg accagagatg atttgttcaa	900
gatgaacgct ggtatcgtta agtctttggt tactgctgtc ggtaaatttg ccccaaacgc	960
tcgtatctta gtcatctcca accctgttaa ctctttggtt ccaattgccg ttgaaacttt	1020
gaagaagatg ggtaagttca agccaggtaa cgttatgggt gtcaccaact tggatttggt	1080
cagagctgaa actttcttgg ttgactactt gatgttgaag aacccaaaga tcggtcaaga	1140
acaagacaag accaccatgc acagaaaggt caccgtcatc ggtggtcact ctggtgaaac	1200
catcattcca atcatcactg acaaatcctt ggttttccaa ttggacaagc aatacgaaca	1260
tttcatccac agagtccaat tcggtggtga cgaaattgtc aaggccaagc aaggtgccgg	1320
ttctgctacc ttgtccatgg ctttcgctgg tgccaaattt gctgaagaag tcttacgttc	1380
tttccacaac gaaaagccag aaactgaatc tttgtctgct ttcgtctact tgccaggttt	1440
gaagaacggt aagaaggctc aacaattagt cggtgacaac tccattgaat acttctcttt	1500
gccaattgtt ttgagaaacg gttccgttgt ttccattgac acttctgttt tggaaaaatt	1560
gtctccaaga gaagaacaat tggtcaacac tgctgtcaag gaattgagaa agaacattga	1620
aaagggtaag tctttcatct tggacagtta aggtgaattt actttaaatc ttgcatttaa	1680
ataaattttc tttttatagc tttatgactt agtttcaatt tatatactat tttaatgaca	1740
ttttcgattc attgattgaa agctttgtgt tttttcttga tgcgctattg cattgttctt	1800

- 88 032726

gtctttttcg ccacatgtaa tatctgtagt agatacctga tacattgtgg atgctgagtg	I860
aaattttagt taataatgga ggcgctctta ataattttgg ggatattggc tttttttttt	1920
aaagtttaca aatgaatttt ttccgccagg atgggcccgc ggccgc	1966
<210> 33 <211> 2950 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> TDHl-FUMR-TDHlt искусственная конструкция <400> 33 ggatcccttc ccttttacag tgcttcggaa aagcacagcg ttgtccaagg gaacaatttt	60
tcttcaagtt aatgcataag aaatatcttt ttttatgttt agctaagtaa aagcagcttg	120
gagtaaaaaa aaaaatgagt aaatttctcg atggattagt ttctcacagg taacataaca	180
aaaaccaaga aaagcccgct tctgaaaact acagttgact tgtatgctaa agggccagac	240
taatgggagg agaaaaagaa acgaatgtat atgctcattt acactctata tcaccatatg	300
gaggataagt tgggctgagc ttctgatcca atttattcta tccattagtt gctgatatgt	360
cccaccagcc aacacttgat agtatctact cgccattcac ttccagcagc gccagtaggg	420
ttgttgagct tagtaaaaat gtgcgcacca caagcctaca tgactccacg tcacatgaaa	480
ccacaccgtg gggccttgtt gcgctaggaa taggatatgc gacgaagacg cttctgctta	540
gtaaccacac cacattttca gggggtcgat ctgcttgctt cctttactgt cacgagcggc	600
ccataatcgc gctttttttt taaaaggcgc gagacagcaa acaggaagct cgggtttcaa	660
ccttcggagt ggtcgcagat ctggagactg gatctttaca atacagtaag gcaagccacc	720
atctgcttct taggtgcatg cgacggtatc cacgtgcaga acaacatagt ctgaagaagg	780
gggggaggag catgttcatt ctctgtagca gtaagagctt ggtgataatg accaaaactg	840
gagtctcgaa atcatataaa tagacaatat attttcacac aatgagattt gtagtacagt	900
tctattctct ctcttgcata aataagaaat tcatcaagaa cttggtttga tatttcacca	960
acacacacaa aaaacagtac ttcactaaat ttacacacaa aacaaaatgt cctctgcttc	1020
tgctgctttg caaaaattca gagctgaaag agataccttc ggtgacttgc aagttccagc	1080

- 89 032726

tgaccgttac	tggggtgctc	aaactcaaag	atctttgcaa	aactttgaca	ttggtggtcc	1140
aactgaaaga	atgccagaac	cattaatcag	agctttcggt	gttttgaaga	aggctgctgc	1200
caccgtcaac	atgacctacg	gtttggaccc	aaaggttggt	gaagccatcc	aaaaggctgc	1260
tgacgaagtt	atcgatggtt	ctttgattga	ccatttccca	ttggttgtct	ggcaaaccgg	1320
ttctggtact	caaaccaaga	tgaacgtcaa	tgaagtcatc	tccaacagag	ccattgaatt	1380
gttgggtggt	gaattaggtt	ccaaggctcc	agtccaccca	aacgatcatg	tcaacatgtc	1440
tcaatcttcc	aacgacactt	tcccaactgc	catgcacgtt	gctgccgttg	ttgaaattca	1500
cggtagattg	attccagctt	tgaccacttt	gagagatgct	ttgcaagcca	aatctgctga	1560
attcgaacac	atcatcaaga	ttggtagaac	ccacttgcaa	gatgctaccc	cattgacttt	1620
aggtcaagaa	ttctccggtt	acactcaaca	attgacctac	ggtattgctc	gtgttcaagg	1680
tactttggaa	agattataca	acttggctca	aggtggtact	gctgtcggta	ctggtttgaa	1740
caccagaaag	ggtttcgatg	ccaaggttgc	tgaagccatt	gcttccatca	ctggtttacc	1800
attcaagacc	gctccaaaca	aattcgaagc	tttggctgct	cacgacgctt	tggttgaagc	I860
tcacggtgct	ttgaacaccg ttgcttgttc	tttgatgaag	attgccaacg	atatccgtta	1920
cttgggttct	ggtccaagat	gtggtttagg tgaattgtct	ctaccagaaa	acgaaccagg	1980
ttcttccatc	atgccaggta	aggtcaaccc	aactcaatgt	gaagctatga	ccatggtttg	2040
tgctcaagtc	atgggtaaca	acactgccat	ctctgttgct	ggttccaacg gtcaattcga	2100
attgaatgtc	tttaaaccag tcatgatcaa	gaacttgatc	caatccatca	gattaatctc	2160
tgacgcttcc	atctctttca	ccaagaactg	tgttgtcggt	attgaagcta	acgaaaagaa	2220
gatctcctcc	atcatgaacg	aatctttgat	gttggtcact	gctttgaacc	ctcacattgg	2280
ttacgacaag	gctgccaagt	gtgccaagaa	ggctcacaag	gaaggtacca	ctttgaaaga	2340
agctgctcta	tctttgggtt	acttgacctc	tgaagaattc	gaccaatggg ttagacctga	2400
ggacatgatt	tctgccaagg	attaaggccc	gggcataaag	caatcttgat	gaggataatg	2460
attttttttt	gaatatacat	aaatactacc	gtttttctgc	tagattttgt	gaagacgtaa	2520
ataagtacat	attacttttt	aagccaagac	aagattaagc	attaacttta	cccttttctc	2580
ttctaagttt	caatactagt	tatcactgtt	taaaagttat	ggcgagaacg	tcggcggtta	2640

- 90 032726

aaatatatta	ccctgaacgt	ggtgaattga	agttctagga	tggtttaaag	atttttcctt	2700
tttgggaaat	aagtaaacaa	tatattgctg	cctttgcaaa	acgcacatac	ccacaatatg	2760
tgactattgg	caaagaacgc	attatccttt	gaagaggtgg	atactgatac	taagagagtc	2820
tctattccgg	ctccactttt	agtccagaga	ttacttgtct	tcttacgtat	cagaacaaga	2880
aagcatttcc	aaagtaattg	catttgccct	tgagcagtat	atatatacta	agaaggcgcg	2940
ccgcggccgc						2950

<210> 34 <211> 5037 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TDH3p-FRDml-TDH3t искусственная конструкция <400> 34

ggatccggcg	cgccctattt	tcgaggacct tgtcaccttg	agcccaagag	agccaagatt	60
taaattttcc	tatgacttga	tgcaaattcc	caaagctaat	aacatgcaag	acacgtacgg	120
tcaagaagac	atatttgacc	tcttaacagg ttcagacgcg	actgcctcat	cagtaagacc	180
cgttgaaaag	aacttacctg	aaaaaaacga	atatatacta	gcgttgaatg ttagcgtcaa	240
caacaagaag	tttaatgacg	cggaggccaa	ggcaaaaaga	ttccttgatt	acgtaaggga	300
gttagaatca	ttttgaataa	aaaacacgct	ttttcagttc	gagtttatca	ttatcaatac	360
tgccatttca	aagaatacgt	aaataattaa	tagtagtgat	tttcctaact	ttatttagtc	420
aaaaaattag	ccttttaatt	ctgctgtaac	ccgtacatgc	ccaaaatagg gggcgggtta	480
cacagaatat	ataacatcgt	aggtgtctgg gtgaacagtt	tattcctggc	atccactaaa	540
tataatggag	cccgcttttt	aagctggcat	ccagaaaaaa	aaagaatccc	agcaccaaaa	600
tattgttttc	ttcaccaacc	atcagttcat	aggtccattc	tcttagcgca	actacagaga	660
acaggggcac	aaacaggcaa	aaaacgggca	caacctcaat	ggagtgatgc	aacctgcctg	720
gagtaaatga	tgacacaagg	caattgaccc	acgcatgtat	ctatctcatt	ttcttacacc	780
ttctattacc	ttctgctctc	tctgatttgg aaaaagctga	aaaaaaaggt	tgaaaccagt	840
tccctgaaat	tattccccta	cttgactaat aagtatataa	agacggtagg tattgattgt	900

- 91 032726

aattctgtaa	atctatttct	taaacttctt	aaattctact	tttatagtta	gtcttttttt	960
tagttttaaa	acaccaagaa	cttagtttcg	aataaacaca	cataaacaaa	caaaatgggt	1020
gctgatggta	tttcttctgc	ttccattgtt	gttactgacc	cagaagctgc	tgccaagaag	1080
cgtgacagaa	tggccagaga	attgttgtcc	tccaactctg gtctatgtca	agaagatgaa	1140
ccaaccatca	tcaacttaaa	gggtttggaa	cacaccattc	catacagatt	ggccgttgtt	1200
ttgtgtaact	ccagatccac	tggtgaattc	gaagccaagg	ctgctgaaat	cttgagaaag	1260
gctttccaca	tggttgacta	ctctttgaat	tgtttcaacc	cagaatctga	attgtcccgt	1320
gtcaactctt	taccagtcgg tgaaaagcac	caaatgtccg	aagatctaag	acatgtcatg	1380
gaatgtacca	tttctgtcca ccactcctct	ggtatgggtt	tcgacccagc	tgctggtcca	1440
atcatctcca	gattgagagg tgccatgaga	gatcacaacg	acatgtccga	tatctccgtc	1500
actgaagctg	aagttgaatt	attctctttg gctcaatctt	tcgatgtcga	cttggaagaa	1560
ggtactattg	ccagaaagca	ctctgaagcc	agattggatt	tgggtggtgt	caacaagggt	1620
tacactgttg	actacgttgt	tgaccatttg	agagctgctg	gtatgccaaa	cgtcttgttc	1680
gaatggggtg	gtgatatcag	agcttctggt	agaaacatca	agggtaactt	gtgggctgtt	1740
gccatcaagc	gtccaccatc	tgttgaagaa	gttatccgtc	gtgccaaggg taagatgtta	1800
aagatgggtg	aagaagaaca	agaagaaaag	gacgatgact	ctccatcttt	gttgcacgtt	I860
gttgaattgg	atgacgaagc	tttgtgtacc	tctggtgact	acgaaaacgt	cttataccat	1920
ccaaagcacg	gtgttgctgg	ttccattttc	gactggcaac	gtcgtggttt	attgtctcca	1980
gaagaaggtg	ctttagctca	agtttccgtc	aaatgttact	ctgccatgta	cgctgatgct	2040
ttggccactg	tttgtttggt	caagagagat	gctgtcagaa	tcagatactt	gttggaaggt	2100
tggagatacg	tcagatctcg	tgtcaccaac	tacttcgctt	acaccagaca	aggtgaaaga	2160
ttggctcaca	tgcacgaaat	tgctcaagaa	accagagaat	taagagaaat	cagaattgct	2220
ggttctttgc	catccagaat	tgttatcgtc	ggtggtggtt	tggctggtct	atccgctgcc	2280
attgaagctg	cttcttgtgg tgctcaagtc	attttgatgg	aaaaggaagg	tagaattggt	2340
ggtaactctg	ccaaggctac ctctggtatc	aacggttggg	gtaccagaac	ccaagccaag	2400
tctgatatct	tggatggtgg taagtacttt	gaaagagaca	ctttcttgtc	cggtgtcggt	2460

- 92 032726

ggtaccactg	acccagcttt	ggtcaaggtc	ttgtccgtca	aatctggtga	cgctatcggt	2520
tggttaactt	ctttgggtgt	cccattgtcc	gttttgtctc	aattgggtgg	tcactctttc	2580
aagagaactc	acagagctcc	agacaagact	gatggtactc	cattaccaat	tggtcacacc	2640
atcatgagaa	ctttggaaga	tcatatcaga	aacaacttgt	ctgaaagagt	taccatcatg	2700
acccacgttt	ctgttactga	attgttgcac	gaaactgaca	ccactccaga	tggtgcttct	2760
gaagttcgtg	tcaccggtgt	ccgttacaga	gacttgtctg atgtcgatgg	tcaaccttcc	2820
aaactattgg	ctgacgctgt	tgttttggcc	actggtggtt tctccaacga	cagagaagaa	2880
aactctttgt	tgtgtaaata	cgctcctcat	ttggcttctt tcccaactac	caacggtcca	2940
tgggctactg	gtgacggtgt	caaattggcc	acctccgttg gtgccaagtt	ggttgacatg	3000
gacaaggttc	aattgcaccc	aactggtttg	attgacccaa	aggacccagc	taacaccact	3060
aagatcttgg	gtccagaagc	tttgagaggt	tctggtggta	ttttgttgaa	caagcaaggt	3120
aagagattcg tcaacgaatt	ggacttgaga	tccgttgttt	ccaaggccat	taacactcaa	3180
ggtaacgaat	acccaggttc	tggtggttgt	tactttgctt	actgtgtctt	aaacgaagat	3240
gctaccaact	tattctgtgg	tggtgctttg ggtttctacg gtaagaaatt	aggtttgttc	3300
caaagagctg	aaactgttga	agaattggcc	aaattgattg gttgtgacga	aggtgaattg	3360
agagacactt	tggaaaaata	cgaaacctgt	tccaaggcca	aggttgcttg tccagtcact	3420
ggtaaggttg ttttcccatg	tgttgtcggt	accagaggtc	catacaatgt tgctttcgtc	3480
actccatcca	tccactacac	catgggtggt	tgtttgatct	ctccagctgc tgaagtcttg	3540
caagaataca agggtttgaa	tatcttggaa	aaccacagac	caatcagatg tttgttcggt	3600
gctggtgaag tcactggtgg tgtccacggt	ggtaacagat	taggtggtaa	ctctctattg	3660
gaatgtgttg tctttggtaa	gattgctggt	gacagagctg	ccactatctt	gcaaaagaga	3720
gaaattgctt	tgtccaagac	ctcctggacc	tctgttgttg	tcagagaatc	cagatctggt	3780
gaacaattcg	gtaccggttc	cagagttttg	agattcaact	tgccaggtgc	tttacaaaga	3840
accggtttga	acttgggtga	attcgttgcc	atcagaggtg	aatgggatgg	tcaacaatta	3900
gtcggttact	tctctccaat	cactttgcca	gaagatttgg	gtaccatctc	tttgttggtc	3960
agagctgaca	agggtacttt	gaaggaatgg	atctgtgctt	tgcgtccagg	tgactccgtt	4020

- 93 032726

gaaatcaagg cttgtggtgg	tctaagaatt gaccaagatc cagtcaagaa atgtttgttg	4080
ttcagaaaca	gaccaattac	cagatttgct	ttggttgctg ctggtaccgg tgttgctcca	4140
atgttgcaag	ttatcagagc	tgctttgaag	aagccatacg tcgacacttt	ggaatccatc	4200
agattgatct	acgctgctga	agaatatgac	actttaacct	acagatctat	cttgcaaaga	4260
tttgctgaag	aattcccaga	caaattcgtt	tgtaacttcg	tcttaaacaa	ccctccagaa	4320
ggttggaccg	gtggtgttgg tttcgtcaac	aagaaatctt	tgcaaaaggt	tttgcaacca	4380
ccttcttctg	aaccattgat	tgttgtttgt	ggtccacctg ttatgcaaag	agatgtcaaa	4440
aatgaattgt	tgtccatggg	ttacgacaag gaattggttc	acactgtcga	tggtgaatct	4500
ggtaccttgt	aaggcccggg	cgtgaattta	ctttaaatct	tgcatttaaa	taaattttct	4560
ttttatagct	ttatgactta	gtttcaattt	atatactatt	ttaatgacat	tttcgattca	4620
ttgattgaaa	gctttgtgtt	ttttcttgat	gcgctattgc	attgttcttg tctttttcgc	4680
cacatgtaat	atctgtagta	gatacctgat	acattgtgga	tgctgagtga	aattttagtt	4740
aataatggag	gcgctcttaa	taattttggg gatattggct	ttttttttta	aagtttacaa	4800
atgaattttt	tccgccagga	taacgattct	gaagttactc	ttagcgttcc	tatcggtaca	4860
gccatcaaat	catgcctata	aatcatgcct	atatttgcgt	gcagtcagta	tcatctacat	4920
gaaaaaaact	cccgcaattt	cttatagaat	acgttgaaaa	ttaaatgtac	gcgccaagat	4980
aagataacat	atatctagat	gcagtaatat	acacagattc	cggccggccg	cggccgc	5037

<210> 35 <211> 4959 <212> ДНК <213> Artificial construct <220>

<223> TDH3p-FRDg-TDH3t Искусственная последовательность <400>35 ggatccggcg cgccctattt tcgaggacct tgtcaccttg agcccaagag agccaagatt60 taaattttcc tatgacttga tgcaaattcc caaagctaat aacatgcaag acacgtacgg120 tcaagaagac atatttgacc tcttaacagg ttcagacgcg actgcctcat cagtaagacc180 cgttgaaaag aacttacctg aaaaaaacga atatatacta gcgttgaatg ttagcgtcaa240

- 94 032726

caacaagaag	tttaatgacg cggaggccaa ggcaaaaaga ttccttgatt acgtaaggga	300
gttagaatca	ttttgaataa aaaacacgct ttttcagttc gagtttatca ttatcaatac	360
tgccatttca	aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc	420
aaaaaattag	ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta	480
cacagaatat	ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa	540
tataatggag	cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa	600
tattgttttc	ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga	660
acaggggcac	aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg	720
gagtaaatga	tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc	780
ttctattacc	ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt	840
tccctgaaat	tattccccta cttgactaat aagtatataa agacggtagg tattgattgt	900
aattctgtaa	atctatttct taaacttctt aaattctact tttatagtta gtcttttttt	960
tagttttaaa	acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca cataaacaaa caaaatggtt	1020
gatggtagat	cttctgcttc cattgttgcc gttgacccag aaagagctgc cagagaaaga	1080
gatgctgctg	ccagagcttt gttgcaagac tctccattgc acaccaccat gcaatacgct	1140
acctctggtt	tggaattgac tgttccatac gctttgaagg ttgttgcttc tgctgacact	1200
ttcgacagag	ccaaggaagt tgctgatgaa gtcttgagat gtgcctggca attggctgac	1260
accgttttga	actctttcaa cccaaactct gaagtctctt tagtcggtag attaccagtc	1320
ggtcaaaagc	atcaaatgtc tgctccattg aaacgtgtca tggcttgttg tcaaagagtc	1380
tacaactcct	ctgctggttg tttcgaccca tccactgctc cagttgccaa ggctttgaga	1440
gaaattgctt	tgggtaagga aagaaacaat gcttgtttgg aagctttgac tcaagcttgt	1500
accttgccaa	actctttcgt cattgatttc gaagctggta ctatctccag aaagcacgaa	1560
cacgcttctt	tggatttggg tggtgtttcc aagggttaca tcgtcgatta cgtcattgac	1620
aacatcaatg	ctgctggttt ccaaaacgtt ttctttgact ggggtggtga ctgtcgtgcc	1680
tccggtatga	acgccagaaa cactccatgg gttgtcggta tcactagacc tccttccttg	1740
gacatgttgc	caaaccctcc aaaggaagct tcttacatct ccgtcatctc tttggacaat	1800

- 95 032726 gaagctttgg ctacctctgg tgattacgaa aacttgatct acactgctga cgataaacca I860 ttgacctgta cctacgattg gaaaggtaag gaattgatga agccatctca atccaatatc 1920 gctcaagttt ccgtcaagtg ttactctgcc atgtacgctg acgctttggc taccgcttgt 1980 ttcatcaagc gtgacccagc caaggtcaga caattgttgg atggttggag atacgttaga 2040 gacaccgtca gagattaccg tgtctacgtc agagaaaacg aaagagttgc caagatgttc 2100 gaaattgcca ctgaagatgc tgaaatgaga aagagaagaa tttccaacac tttaccagct 2160 cgtgtcattg ttgttggtgg tggtttggct ggtttgtccg ctgccattga agctgctggt 2220 tgtggtgctc aagttgtttt gatggaaaag gaagccaagt tgggtggtaa ctctgccaag 2280 gctacctctg gtatcaacgg ttggggtact agagctcaag ctaaggcttc cattgtcgat 2340 ggtggtaagt acttcgaaag agatacctac aagtctggta tcggtggtaa caccgatcca 2400 gctttggtta agactttgtc catgaaatct gctgacgcta tcggttggtt gacttctcta 2460 ggtgttccat tgactgtttt gtcccaatta ggtggtcact ccagaaagag aactcacaga 2520 gctccagaca agaaggatgg tactccattg ccaattggtt tcaccatcat gaaaacttta 2580 gaagatcatg ttagaggtaa cttgtccggt agaatcacca tcatggaaaa ctgttccgtt 2640 acctctttgt tgtctgaaac caaggaaaga ccagacggta ccaagcaaat cagagttacc 2700 ggtgtcgaat tcactcaagc tggttctggt aagaccacca ttttggctga tgctgttatc 2760 ttggccaccg gtggtttctc caacgacaag actgctgatt ctttgttgag agaacatgcc 2820 ccacacttgg ttaacttccc aaccaccaac ggtccatggg ctactggtga tggtgtcaag 2880 ttggctcaaa gattaggtgc tcaattggtc gatatggaca aggttcaatt gcacccaact 2940 ggtttgatca acccaaagga cccagccaac ccaaccaaat tcttgggtcc agaagctcta 3000 agaggttctg gtggtgtttt gttgaacaaa caaggtaaga gatttgtcaa cgaattggat 3060 ttgagatctg ttgtttccaa ggccatcatg gaacaaggtg ctgaataccc aggttctggt 3120 ggttccatgt ttgcttactg tgtcttgaac gctgctgctc aaaaattgtt tggtgtttcc 3180 tctcacgaat tctactggaa gaagatgggt ttgttcgtca aggctgacac catgagagac 3240 ttggctgctt tgattggttg tccagttgaa tccgttcaac aaactttaga agaatacgaa 3300 agattatcca tctctcaaag atcttgtcca attaccagaa aatctgttta cccatgtgtt 3360

- 96 032726

ttgggtacca	aaggtccata	ctatgtcgcc	tttgtcactc	catctatcca	ctacaccatg	3420
ggtggttgtt	tgatttctcc	atctgctgaa	atccaaatga	agaacacttc	ttccagagct	3480
ccattgtccc	actccaaccc	aatcttgggt	ttattcggtg	ctggtgaagt	caccggtggt	3540
gtccacggtg gtaacagatt	aggtggtaac	tctttgttgg	aatgtgttgt	tttcggtaga	3600
attgccggtg	acagagcttc	taccattttg	caaagaaagt	cctctgcttt	gtctttcaag	3660
gtctggacca	ctgttgtttt	gagagaagtc	agagaaggtg	gtgtctacgg	tgctggttcc	3720
cgtgtcttga	gattcaactt	accaggtgct	ctacaaagat	ctggtctatc	cttgggtcaa	3780
ttcattgcca	tcagaggtga	ctgggacggt	caacaattga	ttggttacta	ctctccaatc	3840
actttgccag	acgatttggg tatgattgac	attttggcca	gatctgacaa	gggtacttta	3900
cgtgaatgga	tctctgcttt ggaaccaggt	gacgctgtcg	aaatgaaggc	ttgtggtggt	3960
ttggtcatcg	aaagaagatt atctgacaag	cacttcgttt	tcatgggtca	cattatcaac	4020
aagctatgtt	tgattgctgg tggtaccggt	gttgctccaa	tgttgcaaat	catcaaggcc	4080
gctttcatga	agccattcat	cgacactttg gaatccgtcc	acttgatcta	cgctgctgaa	4140
gatgtcactg	aattgactta	cagagaagtt	ttggaagaac	gtcgtcgtga	atccagaggt	4200
aaattcaaga	aaactttcgt	tttgaacaga	cctcctccat	tatggactga	cggtgtcggt	4260
ttcatcgacc	gtggtatctt	gaccaaccac	gttcaaccac	catctgacaa	cttattggtt	4320
gccatctgtg gtccaccagt	tatgcaaaga	attgtcaagg	ccactttaaa	gactttaggt	4380
tacaacatga	acttggtcag	aaccgttgac	gaaactgaac	catctggaag ttaaggcccg	4440
ggcgtgaatt	tactttaaat	cttgcattta	aataaatttt	ctttttatag	ctttatgact	4500
tagtttcaat	ttatatacta	ttttaatgac	attttcgatt	cattgattga	aagctttgtg	4560
ttttttcttg	atgcgctatt	gcattgttct	tgtctttttc	gccacatgta	atatctgtag	4620
tagatacctg	atacattgtg	gatgctgagt	gaaattttag ttaataatgg	aggcgctctt	4680
aataattttg	gggatattgg	cttttttttt	taaagtttac	aaatgaattt	tttccgccag	4740
gataacgatt	ctgaagttac	tcttagcgtt	cctatcggta	cagccatcaa	atcatgccta	4800
taaatcatgc	ctatatttgc	gtgcagtcag	tatcatctac	atgaaaaaaa	ctcccgcaat	4860
ttcttataga	atacgttgaa	aattaaatgt	acgcgccaag	ataagataac	atatatctag	4920

- 97 032726 atgcagtaat atacacagat tccggccggc cgcggccgc4959 <210>36 <211>438 <212> белок <213> Schizosaccharomyces pombe <400>36

Met

Gly

Glu

Leu

Lys

Glu

He

Leu

Lys

Gln

Arg

Tyr

His

Glu

Leu

Leu

1

5

10

15

Asp

Trp

Asn

Vai

Lys

Ala

Pro

His

Vai

Pro

Leu

Ser

Gln

Arg

Leu

Lys

20

25

30

His

Phe

Thr

Trp

Ser

Trp

Phe

Ala

cys

Thr

Met

Ala

Thr

Gly

Gly

Vai

35

40

45

Gly

Leu

He

He

Gly

Ser

Phe

Pro

Phe

Arg

Phe

Tyr

Gly

Leu

Asn

Thr

50

55

60

lie

Gly

Lys

He

Vai

Tyr

He

Leu

Gln

He

Phe

Leu

Phe

Ser

Leu

Phe

65

70

75

80

Gly

Ser

Cys

Met

Leu

Phe

Arg

Phe

He

Lys

Tyr

Pro

Ser

Thr

He

Lys

85

90

95

Asp

Ser

Trp

Asn

His

His

Leu

Glu

Lys

Leu

Phe

He

Ala

Thr

cys

Leu

100

105

110

Leu

Ser

He

Ser

Thr

Phe

He

Asp

Met

Leu

Ala

He

Tyr

Ala

Tyr

Pro

115

120

125

Asp

Thr

Gly

Glu

Trp

Met

Vai

Trp

Vai

He

Arg

He

Leu

Tyr

Tyr

He

130

135

140

Tyr

Vai

Ala

Vai

Ser

Phe

He

Tyr

cys

Vai

Met

Ala

Phe

Phe

Thr

He

145

150

155

160

Phe

Asn

Asn

His

Vai

Tyr

Thr

He

Glu

Thr

Ala

Ser

Pro

Ala

Trp

He

165

170

175

- 98 032726

Leu

Pro

Ile Phe 180

Pro Pro Met Ile Cys Gly Val Ile Ala Gly Ala Val

185

190

Asn

Ser

Thr

Gln

Pro

Ala

His

Gln

Leu

Lys

Asn

Met

Val

Ile

Phe

Gly

195

200

205

Ile

Leu

Phe

Gln

Gly

Leu

Gly

Phe

Trp

Val

Tyr

Leu

Leu

Leu

Phe

Ala

210

215

220

Val

Asn

Val

Leu

Arg

Phe

Phe

Thr

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

Pro

Gln

Asp

225

230

235

240

Arg

Pro

Gly

Met

Phe

Met

Phe

Val

Gly

Pro

Pro

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

245

250

255

Ala

Leu

lie

Asn

lie

Ala

Arg Gly

Ala

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ile

260

265

270

Phe

Val

Gly

Ala

Asn

Ser

Ser

Glu

Tyr

Leu

Gly

Phe

Val

Ser

Thr

Phe

275

280

285

Met

Ala

lie

Phe

lie

Trp

Gly

Leu

Ala

Ala

Trp Cys

Tyr

cys

Leu

Ala

290

295

300

Met

Val

Ser

Phe

Leu

Ala

Gly

Phe

Phe

Thr

Arg

Ala

Pro

Leu

Lys

Phe

305

310

315

320

Ala

Cys

Gly

Trp

Phe

Ala

Phe

Ile

Phe

Pro

Asn

Val

Gly

Phe

Val

Asn

325

330

335

Cys

Thr

Ile

Glu

Ile

Gly

Lys

Met

Ile

Asp

Ser

Lys

Ala

Phe

Gln

Met

340

345

350

Phe

Gly

His

Ile

Ile

Gly

Val

Ile

Leu

cys

Ile

Gln

Trp

Ile

Leu

Leu

355

360

365

Met

Tyr

Leu

Met

Val

Arg

Ala

Phe

Leu

Val

Asn

Asp

Leu

cys

Tyr

Pro

370

375

380

- 99 032726

Gly 385

Lys

Asp Glu

Asp Ala His Pro Pro Pro Lys Pro Asn Thr Gly Val

390

395

400

Leu

Asn

Pro

Thr

Phe

Pro

Pro

Glu

Lys

Ala

Pro

Ala

Ser

Leu

Glu

Lys

405

410

415

Val

Asp

Thr

His

Val

Thr

Ser

Thr

Gly

Gly

Glu

Ser

Asp

Pro

Pro

Ser

420

425

430

Ser

Glu

His

Glu

Ser

Val

435 <210> 37 <211> 1317 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> S. pombe malae пермеаза сро для S. cerevisiae <400>37 atgggtgaat tgaaggaaat cttgaagcaa cgttaccatg aattgttgga ctggaacgtc60 aaggctccac acgttccatt gtctcaaaga ttgaagcatt tcacctggtc ctggtttgct120 tgtaccatgg ccactggtgg tgtcggtttg atcattggtt ctttcccatt cagattctac180 ggtttgaaca ccattggtaa gattgtctac atcttacaaa tcttcttatt ctctttgttt240 ggttcttgta tgttgttcag attcatcaaa tacccatcta ccatcaagga ctcctggaac300 caccacttgg aaaaattatt cattgctacc tgtttgctat ccatctccac tttcattgac360 atgttggcca tctacgctta cccagacact ggtgaatgga tggtctgggt tatcagaatc420 ttatactaca tctacgttgc tgtctctttc atctactgtg tcatggcttt cttcaccatt480 ttcaacaacc acgtttacac cattgaaact gcttctccag cttggatctt accaattttc540 ccaccaatga tctgtggtgt cattgctggt gctgtcaact ccactcaacc agctcaccaa600 ttgaagaaca tggttatctt cggtatctta ttccaaggtt tgggtttctg ggtttacttg660 ttgttgtttg ctgtcaacgt tttgagattc ttcaccgttg gtttggccaa gcctcaagac720 agaccaggta tgttcatgtt tgttggtcca ccagctttct ccggtttggc tttgatcaac780

- 100 032726 attgcccgtg gtgctatggg ttccagacca tacattttcg tcggtgccaa ttcttctgaa840 tacttgggtt tcgtttccac tttcatggcc attttcatct ggggtttggc tgcttggtgt900 tactgtttgg ccatggtttc tttcttggct ggtttcttca ccagagctcc attgaaattt960 gcttgtggtt ggtttgcttt catcttccca aacgtcggtt tcgttaactg taccattgaa1020 attggtaaga tgattgactc caaggccttc caaatgttcg gtcacatcat cggtgtcatc1080 ctatgtatcc aatggatctt gttgatgtac ttgatggtca gagctttctt ggtcaacgat1140 ttgtgttacc caggtaagga tgaagatgct cacccacctc caaagccaaa cactggtgtt1200 ttgaacccaa ctttcccacc agaaaaggct ccagcttctt tggaaaaggt tgacacccac1260 gttacttcca ctggtggtga atctgatcct ccatcttctg aacacgaaag cgtttaa1317 <210>38 <211> 600 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> EN01 промотор T в положении -5 заменено на А чтобы получить лучшую последовательность Козак <400> 38

ccgcggaacc	gccagatatt	cattacttga	cgcaaaagcg	tttgaaataa	tgacgaaaaa	60
gaaggaagaa	aaaaaaagaa	aaataccgct	tctaggcggg	ttatctactg	atccgagctt	120
ccactaggat	agcacccaaa	cacctgcata	tttggacgac	ctttacttac	accaccaaaa	180
accactttcg	cctctcccgc	ccctgataac	gtccactaat	tgagcgatta	cctgagcggt	240
cctcttttgt	ttgcagcatg	agacttgcat	actgcaaatc	gtaagtagca	acgtctcaag	300
gtcaaaactg tatggaaacc	ttgtcacctc	acttaattct	agctagccta	ccctgcaagt	360
caagaggtct	ccgtgattcc	tagccacctc	aaggtatgcc	tctccccgga	aactgtggcc	420
ttttctggca	cacatgatct	ccacgatttc	aacatataaa	tagcttttga	taatggcaat	480
attaatcaaa	tttattttac	ttctttcttg	taacatctct	cttgtaatcc	cttattcctt	540
ctagctattt	ttcataaaaa	accaagcaac	tgcttatcaa	cacacaaaca	ctaaaacaaa	600

<210> 39

- 101 032726 <211> 300 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> EN01 терминатор <400>39 agcttttgat taagccttct agtccaaaaa acacgttttt ttgtcattta tttcattttc60 ttagaatagt ttagtttatt cattttatag tcacgaatgt tttatgattc tatatagggt120 tgcaaacaag catttttcat tttatgttaa aacaatttca ggtttacctt ttattctgct180 tgtggtgacg cgggtatccg cccgctcttt tggtcaccca tgtatttaat tgcataaata240 attcttaaaa gtggagctag tctatttcta tttacatacc tctcatttct catttcctcc300 <210> 40 <211> 2240

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> ENOlp-SpMAE-ENOlt искусственная конструкция
<400> 40 ggatccggcg	cgccccgcgg	aaccgccaga	tattcattac	ttgacgcaaa	agcgtttgaa	60
ataatgacga	aaaagaagga	agaaaaaaaa	agaaaaatac	cgcttctagg	cgggttatct	120
actgatccga	gcttccacta	ggatagcacc	caaacacctg	catatttgga	cgacctttac	180
ttacaccacc	aaaaaccact	ttcgcctctc	ccgcccctga	taacgtccac	taattgagcg	240
attacctgag	cggtcctctt	ttgtttgcag	catgagactt	gcatactgca	aatcgtaagt	300
agcaacgtct	caaggtcaaa	actgtatgga	aaccttgtca	cctcacttaa	ttctagctag	360
cctaccctgc	aagtcaagag	gtctccgtga	ttcctagcca	cctcaaggta	tgcctctccc	420
cggaaactgt	ggccttttct	ggcacacatg	atctccacga	tttcaacata	taaatagctt	480
ttgataatgg	caatattaat	caaatttatt	ttacttcttt	cttgtaacat	ctctcttgta	540
atcccttatt	ccttctagct	atttttcata	aaaaaccaag	caactgctta	tcaacacaca	600
aacactaaaa	caaaatgggt	gaattgaagg	aaatcttgaa	gcaacgttac	catgaattgt	660
tggactggaa	cgtcaaggct	ccacacgttc	cattgtctca	aagattgaag	catttcacct	720
ggtcctggtt	tgcttgtacc	atggccactg gtggtgtcgg tttgatcatt	ggttctttcc	780

- 102 032726

cattcagatt	ctacggtttg	aacaccattg	gtaagattgt	ctacatctta	caaatcttct	840
tattctcttt	gtttggttct	tgtatgttgt	tcagattcat	caaataccca	tctaccatca	900
aggactcctg	gaaccaccac	ttggaaaaat	tattcattgc	tacctgtttg	ctatccatct	960
ccactttcat	tgacatgttg	gccatctacg	cttacccaga	cactggtgaa	tggatggtct	1020
gggttatcag	aatcttatac	tacatctacg ttgctgtctc	tttcatctac	tgtgtcatgg	1080
ctttcttcac	cattttcaac	aaccacgttt	acaccattga	aactgcttct	ccagcttgga	1140
tcttaccaat	tttcccacca	atgatctgtg	gtgtcattgc	tggtgctgtc	aactccactc	1200
aaccagctca	ccaattgaag	aacatggtta	tcttcggtat	cttattccaa	ggtttgggtt	1260
tctgggttta	cttgttgttg tttgctgtca	acgttttgag	attcttcacc	gttggtttgg	1320
ccaagcctca	agacagacca	ggtatgttca	tgtttgttgg	tccaccagct	ttctccggtt	1380
tggctttgat	caacattgcc	cgtggtgcta	tgggttccag	accatacatt	ttcgtcggtg	1440
ccaattcttc	tgaatacttg	ggtttcgttt	ccactttcat	ggccattttc	atctggggtt	1500
tggctgcttg	gtgttactgt	ttggccatgg	tttctttctt	ggctggtttc	ttcaccagag	1560
ctccattgaa	atttgcttgt	ggttggtttg	ctttcatctt	cccaaacgtc	ggtttcgtta	1620
actgtaccat	tgaaattggt	aagatgattg	actccaaggc	cttccaaatg	ttcggtcaca	1680
tcatcggtgt	catcctatgt	atccaatgga	tcttgttgat	gtacttgatg	gtcagagctt	1740
tcttggtcaa	cgatttgtgt	tacccaggta	aggatgaaga	tgctcaccca	cctccaaagc	1800
caaacactgg	tgttttgaac	ccaactttcc	caccagaaaa	ggctccagct	tctttggaaa	1860
aggttgacac	ccacgttact	tccactggtg gtgaatctga	tcctccatct	tctgaacacg	1920
aaagcgttta	agagcttttg	attaagcctt	ctagtccaaa	aaacacgttt	ttttgtcatt	1980
tatttcattt	tcttagaata	gtttagttta	ttcattttat	agtcacgaat	gttttatgat	2040
tctatatagg	gttgcaaaca	agcatttttc	attttatgtt	aaaacaattt	caggtttacc	2100
ttttattctg	cttgtggtga	cgcgggtatc	cgcccgctct	tttggtcacc	catgtattta	2160
attgcataaa	taattcttaa	aagtggagct	agtctatttc	tatttacata	cctctcattt	2220
ctcatttcct	ccgcggccgc					2240

- 103 032726 <210> 41 <211> 1180 <212> белок <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 41

Met

Ser

Ser

Ser

Lys

Lys

Leu

Ala

Gly

Leu

Arg

Asp

Asn

Phe

Ser

Leu

1

5

10

15

Leu

Gly

Glu

Lys

Asn

Lys

Ile

Leu

Vai

Ala

Asn

Arg

Gly

Glu

Ile

Pro

20

25

30

Ile

Arg

Ile

Phe

Arg

Ser

Ala

His

Glu

Leu

Ser

Met

Arg

Thr

Ile

Ala

35

40

45

Ile

Tyr

Ser

His

Glu

Asp

Arg

Leu

Ser

Met

His

Arg

Leu

Lys

Ala

Asp

50

55

60

Glu

Ala

Tyr

Vai

Ile

Gly

Glu

Glu

Gly

Gin

Tyr

Thr

Pro

Vai

Gly

Ala

65

70

75

80

Tyr

Leu

Ala

Met

Asp

Glu

Ile

Ile

Glu

Ile

Ala

Lys

Lys

His

Lys

Vai

85

90

95

Asp

Phe

Ile

His

Pro

Gly

Tyr

Gly

Phe

Leu

Ser

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

100

105

110

Ala

Asp

Lys

Vai

Vai

Lys

Ala

Gly

Ile

Thr

Trp

lie

Gly

Pro

Pro

Ala

115

120

125

Glu

Vai

lie

Asp

Ser

Vai

Gly

Asp

Lys

Vai

Ser

Ala

Arg

His

Leu

Ala

130

135

140

Ala

Arg

Ala

Asn

Vai

Pro

Thr

Vai

Pro

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Ile

Glu

145

150

155

160

Thr

Vai

Gin

Glu

Ala

Leu

Asp

Phe

Vai

Asn

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Vai

165

170

175

Ile

Ile

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Gly

Gly

Gly

Arg

Gly

Met

Arg

Vai

Vai

- 104 032726

180

185

190

Arg

Glu

Gly

Asp

Asp

Val

Ala

Asp

Ala

Phe

Gln

Arg

Ala

Thr

Ser

Glu

195

200

205

Ala

Arg

Thr

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Thr

cys

Phe

Val

Glu

Arg

Phe

Leu

210

215

220

Asp

Lys

Pro

Lys

His

Ile

Glu

Val

Gln

Leu

Leu

Ala

Asp

Asn

His

Gly

225

230

235

240

Asn

Val

Val

His

Leu

Phe

Glu

Arg

Asp

Cys

Ser

Val

Gln

Arg

Arg

His

245

250

255

Gln

Lys

Val

Val

Glu

Val

Ala

Pro

Ala

Lys

Thr

Leu

Pro

Arg

Glu

Val

260

265

270

Arg

Asp

Ala

Ile

Leu

Thr

Asp

Ala

Val

Lys

Leu

Ala

Lys

Val

cys

Gly

275

280

285

Tyr

Arg

Asn

Ala

Gly

Thr

Ala

Glu

Phe

Leu

Val

Asp

Asn

Gln

Asn

Arg

290

295

300

His

Tyr

Phe

Ile

Glu

Ile

Asn

Pro

Arg

Ile

Gln

Val

Glu

His

Thr

Ile

305

310

315

320

Thr

Glu

Glu

Ile

Thr

Gly

Ile

Asp

Ile

Val

Ser

Ala

Gln

Ile

Gln

Ile

325

330

335

Ala

Ala

Gly

Ala

Thr

Leu

Thr

Gln

Leu

Gly

Leu

Leu

Gln

Asp

Lys

Ile

340

345

350

Thr

Thr

Arg

Gly

Phe

Ser

Ile

Gln

cys

Arg

Ile

Thr

Thr

Glu

Asp

Pro

355

360

365

Ser

Lys

Asn

Phe

Gln

Pro

Asp

Thr

Gly

Arg

Leu

Glu

Val

Tyr

Arg

Ser

370

375

380

Ala

Gly

Gly

Asn

Gly

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Gly

Asn

Ala

Tyr

Ala

Gly

- 105 032726

385

390

395

400

Ala

Thr

Ile

Ser

Pro

His

Tyr

Asp

Ser

Met

Leu

Val

Lys

Cys

Ser

Cys

405

410

415

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Glu

Ile

Val

Arg

Arg

Lys

Met

Ile

Arg

Ala

Leu

420

425

430

Ile

Glu

Phe

Arg

Ile

Arg

Gly

Val

Lys

Thr

Asn

Ile

Pro

Phe

Leu

Leu

435

440

445

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

Pro

Val

Phe

Ile

Glu

Gly

Thr

Tyr

Trp

Thr

Thr

450

455

460

Phe

lie

Asp

Asp

Thr

Pro

Gln

Leu

Phe

Gln

Met

Val

Ser

Ser

Gln

Asn

465

470

475

480

Arg

Ala

Gln

Lys

Leu

Leu

His

Tyr

Leu

Ala

Asp

Leu

Ala

Val

Asn

Gly

485

490

495

Ser

Ser

Ile

Lys

Gly

Gln

Ile

Gly

Leu

Pro

Lys

Leu

Lys

Ser

Asn

Pro

500

505

510

Ser

Val

Pro

His

Leu

His

Asp

Ala

Gln

Gly

Asn

Val

Ile

Asn

Val

Thr

515

520

525

Lys

Ser

Ala

Pro

Pro

Ser

Gly

Trp

Arg

Gln

Val

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly

530

535

540

Pro

Ser

Glu

Phe

Ala

Lys

Gln

Val

Arg

Gln

Phe

Asn

Gly

Thr

Leu

Leu

545

550

555

560

Met

Asp

Thr

Thr

Trp

Arg

Asp

Ala

His

Gln

Ser

Leu

Leu

Ala

Thr

Arg

565

570

575

Val

Arg

Thr

His

Asp

Leu

Ala

Thr

Ile

Ala

Pro

Thr

Thr

Ala

His

Ala

580

585

590

Leu

Ala

Gly

Ala

Phe

Ala

Leu

Glu

cys

Trp

Gly

Gly

Ala

Thr

Phe

Asp

- 106 032726

595

600

605

Val

Ala

Met

Arg

Phe

Leu

His

Glu

Asp

Pro

Trp

Glu

Arg

Leu

Arg

Lys

610

615

620

Leu

Arg

Ser

Leu

Val

Pro

Asn

He

Pro

Phe

Gin

Met

Leu

Leu

Arg

Gly

625

630

635

640

Ala

Asn

Gly

Val

Ala

Tyr

Ser

Ser

Leu

Pro

Asp

Asn

Ala

He

Asp

His

645

650

655

Phe

Val

Lys

Gin

Ala

Lys

Asp

Asn

Gly

Val

Asp

He

Phe

Arg

Val

Phe

660

665

670

Asp

Ala

Leu

Asn

Asp

Leu

Glu

Gin

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Asn

Ala

Val

675

680

685

Lys

Lys

Ala

Gly

Gly

Val

Val

Glu

Ala

Thr

Val

cys

Tyr

Ser

Gly

Asp

690

695

700

Met

Leu

Gin

Pro

Gly

Lys

Lys

Tyr

Asn

Leu

Asp

Tyr

Tyr

Leu

Glu

Val

705

710

715

720

Val

Glu

Lys

lie

Val

Gin

Met

Gly

Thr

His

He

Leu

Gly

He

Lys

Asp

725

730

735

Met

Ala

Gly

Thr

Met

Lys

Pro

Ala

Ala

Ala

Lys

Leu

Leu

He

Gly

Ser

740

745

750

Leu

Arg

Thr

Arg

Tyr

Pro

Asp

Leu

Pro

He

His

Val

His

Ser

His

Asp

755

760

765

Ser

Ala

Gly

Thr

Ala

Val

Ala

Ser

Met

Thr

Ala

Cys

Ala

Leu

Ala

Gly

770

775

780

Ala

Asp

Val

Val

Asp

Val

Ala

He

Asn

Ser

Met

Ser

Gly

Leu

Thr

Ser

785

790

795

800

Gin

Pro

Ser

He

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

He

Asp

- 107 032726

805

810

815

Thr

Gly

He

Asn

Val

Glu

His

Val

Arg

Glu

Leu

Asp

Ala

Tyr

Trp

Ala

820

825

830

Glu

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Ser

cys

Phe

Glu

Ala

Asp

Leu

Lys

Gly

Pro

835

840

845

Asp

Pro

Glu

Val

Tyr

Gin

His

Glu

He

Pro

Gly

Gly

Gin

Leu

Thr

Asn

850

855

860

Leu

Leu

Phe

Gin

Ala

Gin

Gin

Leu

Gly

Leu

Gly

Glu

Gin

Trp

Ala

Glu

865

870

875

880

Thr

Lys

Arg

Ala

Tyr

Arg

Glu

Ala

Asn

Tyr

Leu

Leu

Gly

Asp

He

Val

885

890

895

Lys

Val

Thr

Pro

Thr

Ser

Lys

Val

Val

Gly

Asp

Leu

Ala

Gin

Phe

Met

900

905

910

Val

Ser

Asn

Lys

Leu

Thr

Ser

Asp

Asp

He

Arg

Arg

Leu

Ala

Asn

Ser

915

920

925

Leu

Asp

Phe

Pro

Asp

Ser

Val

Met

Asp

Phe

Phe

Glu

Gly

|_eu

He

Gly

930

935

940

Gin

Pro

Tyr

Gly

Gly

Phe

Pro

Glu

Pro

Leu

Arg

Ser

Asp

Val

Leu

Arg

945

950

955

960

Asn

Lys

Arg

Arg

Lys

Leu

Thr

cys

Arg

Pro

Gly

Leu

Glu

Leu

Glu

Pro

965

970

975

Phe

Asp

Leu

Glu

Lys

He

Arg

Glu

Asp

Leu

Gin

Asn

Arg

Phe

Gly

Asp

980

985

990

He Asp Glu Cys Asp Val Ala Ser Tyr Asn Met Tyr Pro Arg Val Tyr 995 1000 1005

Glu Asp Phe Gin Lys He Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Leu Ser Val

- 108 032726

1010 10151020

Leu Pro

Thr

Lys Asn

Phe Leu 1030

Ala Pro Ala Glu Pro 1035

Asp Glu Glu

1025

Ile

Glu

Val

Thr

Ile

Glu

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ile

Ile

Lys

Leu

1040

1045

1050

Gin

Ala

Val

Gly Asp

Leu

Asn

Lys

Lys

Thr

Gly

Gin

Arg

Glu

Val

1055

1060

1065

Tyr

Phe

Glu

Leu

Asn

Gly

Glu

Leu

Arg

Lys

Ile

Arg

Val

Ala

Asp

1070

1075

1080

Lys

Ser

Gin

Asn

Ile

Gin

Ser

Val

Ala

Lys

Pro

Lys

Ala

Asp

Val

1085

1090

1095

His

Asp

Thr

His

Gin

Ile

Gly

Ala

Pro

Met

Ala

Gly

Val

Ile

Ile

1100

1105

1110

Glu

Val

Lys

Val

His

Lys

Gly

Ser

Leu

Val

Lys

Lys

Gly

Glu

Ser

1115

1120

1125

Ile

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Met

Lys

Met

Glu

Met

Val

Val

Ser

Ser

1130

1135

1140

Pro

Ala

Asp Gly

Gin

Val

Lys

Asp

Val

Phe

Ile

Lys

Asp

Gly

Glu

1145

1150

1155

Ser

Val

Asp Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Val

Val

Leu

Glu

Glu

Glu

Thr

1160 1165 1170

Leu Pro Pro Ser Gin Lys Lys

11751180 <210>42 <211>3543 <212> ДНК <213> Saccharomyces cerevisiae

- 109 032726 <400> 42

atgagcagta gcaagaaatt ggccggtctt agggacaatt tcagtttgct cggcgaaaag	60
aataagatct tggtcgccaa tagaggtgaa attccgatta gaatttttag atctgctcat	120
gagctgtcta tgagaaccat cgccatatac tcccatgagg accgtctttc aatgcacagg	180
ttgaaggcgg acgaagcgta tgttatcggg gaggagggcc agtatacacc tgtgggtgct	240
tacttggcaa tggacgagat catcgaaatt gcaaagaagc ataaggtgga tttcatccat	300
ccaggttatg ggttcttgtc tgaaaattcg gaatttgccg acaaagtagt gaaggccggt	360
atcacttgga tcggccctcc agctgaagtt attgactctg tgggtgacaa agtctctgcc	420
agacacttgg cagcaagagc taacgttcct accgttcccg gtactccagg acctatcgaa	480
actgtgcaag aggcacttga cttcgttaat gaatacggct acccggtgat cattaaggcc	540
gcctttggtg gtggtggtag aggtatgaga gtcgttagag aaggtgacga cgtggcagat	600
gcctttcaac gtgctacctc cgaagcccgt actgccttcg gtaatggtac ctgctttgtg	660
gaaagattct tggacaagcc aaagcatatt gaagttcaat tgttggctga taaccacgga	720
aacgtggttc atcttttcga aagagactgt tctgtgcaaa gaagacacca aaaagttgtc	780
gaagtcgctc cagcaaagac tttgccccgt gaagttcgtg acgctatttt gacagatgct	840
gttaaattag ctaaggtatg tggttacaga aacgcaggta ccgccgaatt cttggttgac	900
aaccaaaaca gacactattt cattgaaatt aatccaagaa ttcaagtgga gcataccatc	960
actgaagaaa tcaccggtat tgacattgtt tctgcccaaa tccagattgc cgcaggtgcc	1020
actttgactc aactaggtct attacaggat aaaatcacca cccgtgggtt ttccatccaa	1080
tgtcgtatta ccactgaaga tccctctaag aatttccaac cggataccgg tcgcctggag	1140
gtctatcgtt ctgccggtgg taatggtgtg agattggacg gtggtaacgc ttatgcaggt	1200
gctactatct cgcctcacta cgactcaatg ctggtcaaat gttcatgctc tggttctact	1260
tatgaaatcg tccgtaggaa gatgattcgt gccctgatcg aattcagaat cagaggtgtt	1320
aagaccaaca ttcccttcct attgactctt ttgaccaatc cagtttttat tgagggtaca	1380
tactggacga cttttattga cgacacccca caactgttcc aaatggtatc gtcacaaaac	1440
agagcgcaaa aactgttaca ctatttggca gacttggcag ttaacggttc ttctattaag	1500
ggtcaaattg gcttgccaaa actaaaatca aatccaagtg tcccccattt gcacgatgct	1560

- 110 032726

cagggcaatg	tcatcaacgt	tacaaagtct	gcaccaccat	ccggatggag acaagtgcta	1620
ctggaaaagg	gaccatctga	atttgccaag	caagtcagac	agttcaatgg tactctactg	1680
atggacacca	cctggagaga	cgctcatcaa	tctctacttg	caacaagagt	cagaacccac	1740
gatttggcta	caatcgctcc	aacaaccgca	catgcccttg	caggtgcttt	cgctttagaa	1800
tgttggggtg	gtgctacatt	cgacgttgca	atgagattct	tgcatgagga	tccatgggaa	1860
cgtctgagaa	aattaagatc	tctggtgcct	aatattccat	tccaaatgtt	attacgtggt	1920
gccaacggtg	tggcttactc	ttcattacct	gacaatgcta	ttgaccattt	tgtcaagcaa	1980
gccaaggata	atggtgttga	tatatttaga	gtttttgatg	ccttgaatga	tttagaacaa	2040
ttaaaagttg	gtgtgaatgc	tgtcaagaag	gccggtggtg	ttgtcgaagc	tactgtttgt	2100
tactctggtg	acatgcttca	gccaggtaag	aaatacaact	tagactacta	cctagaagtt	2160
gttgaaaaaa	tagttcaaat	gggtacacat	atcttgggta	ttaaggatat	ggcaggtact	2220
atgaaaccgg	ccgctgccaa	attattaatt	ggctccctaa	gaaccagata	tccggattta	2280
ccaattcatg	ttcacagtca	tgactccgca	ggtactgctg ttgcgtctat	gactgcatgt	2340
gccctagcag gtgctgatgt	tgtcgatgta	gctatcaatt	caatgtcggg	cttaacttcc	2400
caaccatcaa	ttaatgcact	gttggcttca	ttagaaggta	acattgatac	tgggattaac	2460
gttgagcatg	ttcgtgaatt	agatgcatac	tgggccgaaa	tgagactgtt	gtattcttgt	2520
ttcgaggccg	acttgaaggg	accagatcca	gaagtttacc	aacatgaaat	cccaggtggt	2580
caattgacta	acttgttatt	ccaagctcaa	caactgggtc	ttggtgaaca	atgggctgaa	2640
actaaaagag	cttacagaga	agccaattac	ctactgggag	atattgttaa	agttacccca	2700
acttctaagg	ttgtcggtga	tttagctcaa	ttcatggttt	ctaacaaact	gacttccgac	2760
gatattagac	gtttagctaa	ttctttggac	tttcctgact	ctgttatgga	cttttttgaa	2820
ggtttaattg	gtcaaccata	cggtgggttc	ccagaaccat	taagatctga	tgtattgaga	2880
aacaagagaa	gaaagttgac	gtgccgtcca	ggtttagaat	tagaaccatt	tgatctcgaa	2940
aaaattagag	aagacttgca	gaacagattc	ggtgatattg atgaatgcga	tgttgcttct	3000
tacaatatgt	atccaagggt	ctatgaagat	ttccaaaaga tcagagaaac	atacggtgat	3060
ttatcagttc	taccaaccaa	aaatttccta	gcaccagcag aacctgatga	agaaatcgaa	3120

- 111 032726 gtcaccatcg aacaaggtaa gactttgatt atcaaattgc aagctgttgg tgacttaaat

3180 aagaaaactg ggcaaagaga agtgtatttt gaattgaacg gtgaattaag aaagatcaga

3240 gttgcagaca agtcacaaaa catacaatct gttgctaaac caaaggctga tgtccacgat

3300 actcaccaaa tcggtgcacc aatggctggt gttatcatag aagttaaagt acataaaggg

3360 tctttggtga aaaagggcga atcgattgct gttttgagtg ccatgaaaat ggaaatggtt

3420 gtctcttcac cagcagatgg tcaagttaaa gacgttttca ttaaggatgg tgaaagtgtt

3480 gacgcatcag atttgttggt tgtcctagaa gaagaaaccc tacccccatc ccaaaaaaag

3540 taa

3543 <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Искусственная последовательность <220>

<223>

Pl праймер <400> ggactagtat gagcagtagc aagaaattgg <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Искусственная последовательность <220>

<223>

P2 праймер <400> ccgctcgagt tacttttttt gggatggggg t

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантная эукариотическая клетка для продукции янтарной кислоты, выбираемая из группы, состоящей из клеток дрожжей и клеток мицелиальных грибов, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу, которая катализирует превращение фумаровой кислоты в янтарную кислоту, причем NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза активна в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей NAD(H)-зависимую фумаратредуктазу.
2. 2. Клетка по п.1, которая экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую NAD(H)зависимую фумаратредуктазу, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 40% последовательности SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 6.
3. 3. Клетка по п. 1 или 2, где NAD(H)-зависимая фумаратредуктаза происходит из Trypanosoma sp.
4. 4. Клетка по любому из пп.1-3, которая сверхэкспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую пируваткарбоксилазу.
5. 5. Клетка по любому из пп.1-4, дополнительно включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную фосфоенолпируваткарбоксикиназу.
6. 6. Клетка по любому из пп.1-5, дополнительно включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую малатдегидрогеназу, активную в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную малатдегидрогеназу.
7. 7. Клетка по любому из пп.1-6, дополнительно включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую фумаразу, активную в цитозоле после экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей указанную фумаразу.
8. 8. Клетка по любому из пп.1-7, дополнительно включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую транспортер дикарбоновых кислот.
9. 9. Клетка по любому из пп.1-8, где по меньшей мере один ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу, не является функциональным.
10. 10. Клетка по любому из пп.1-9, где по меньшей мере один ген, кодирующий глицерол-3фосфатдегидрогеназу, не является функциональным.
11. 11. Клетка по любому из пп.1-10, где по меньшей мере один ген, кодирующий сукцинатдегидрогеназу, не является функциональным.

    - 112 032726
12. 12. Клетка по любому из пп.1-11, которая представляет собой клетку Aspergillus, предпочтительно клетку Aspergillus niger.
13. 13. Клетка по любому из пп.1-11, которая представляет собой клетку Saccharomyces cerevisiae.
14. 14. Способ получения янтарной кислоты, включающий ферментацию эукариотической клетки по любому из пп.1-13 в подходящей для ферментации среде и извлечение янтарной кислоты.

    - 113 032726

    Фиг. 7

    Фиг. 8

    - 114 032726

    Фиг. 9

    Фиг. 10

    Фиг. 11