ES2579706T3 - Microorganismos recombinantes para la producción de ácidos C4-dicarboxílicos - Google Patents

Microorganismos recombinantes para la producción de ácidos C4-dicarboxílicos Download PDF

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Abstract

Célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de anhidrasa carbónica, donde la célula huésped es capaz de producir una cantidad superior de ácido C4- dicarboxílico en comparación con la célula huésped sin el polinucleótido heterólogo cuando se cultiva bajo las mismas condiciones; donde la célula huésped recombinante es una célula huésped fúngica; y donde el polinucleótido heterólogo: (a) codifica una anhidrasa carbónica que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 55; (b) hibridiza bajo condiciones de astringencia media con (i) la cadena complementaria en toda su longitud de SEC ID n.º: 54, o (ii) la cadena complementaria en toda su longitud de la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 54; o (c) tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 54 o la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 54.

Description

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Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0068] En otro aspecto, la anhidrasa carbónica es una anhidrasa carbónica de Aspergillus, como la anhidrasa carbónica de Aspergillus clavatus de SEC ID n.º: 55.
[0069] Se entiende que para las especies anteriormente mencionadas, los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, están abarcados independientemente del nombre de la especie por el que son conocidos. Expertos en la técnica fácilmente reconocerán la identidad de equivalentes apropiados.
[0070] Cepas de estas especies son fácilmente accesibles para el público en un número de colecciones de cultivos, tales como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0071] En algunos aspectos, la anhidrasa carbónica tiene al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de la actividad de anhidrasa carbónica del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 55 bajo las mismas condiciones.
[0072] La anhidrasa carbónica también se puede identificar y obtener a partir de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abonos, agua, ensilaje, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, abonos, agua, ensilaje, etc.) utilizando las sondas mencionadas arriba. Técnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica una anhidrasa carbónica se puede derivar luego de forma similar por selección de una genoteca de ADNc o genómica de otros microorganismos o muestra de ADN mezclado. Una vez que un polinucleótido que codifica una anhidrasa carbónica ha sido detectado con sonda(s) adecuadas como se describe en este caso, la secuencia se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son bien conocidas por los técnicos en la materia (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).
Transportadores de bicarbonato y polinucleótidos que codifican transportadores de bicarbonato
[0073] En algunos aspectos de las células huésped recombinantes y métodos descritos aquí, las células huésped tienen actividad de transportador de bicarbonato. El transportador de bicarbonato puede ser cualquier transportador de bicarbonato que sea adecuado para las células huésped y sus métodos de uso descritos aquí, tal como un transportador de bicarbonato de origen natural o una variante del mismo que retenga actividad de transportador de bicarbonato. En un aspecto, el transportador de bicarbonato está presente en el citosol de las células huésped. En algunos aspectos, las células huésped comprenden uno o más (por ejemplo, dos, diferentes) polinucleótidos heterólogos que codifican un transportador de bicarbonato.
[0074] En algunos aspectos, las células huésped que comprenden uno o varios (por ejemplo, dos, diferentes) polinucleótidos heterólogos que codifican un transportador de bicarbonato tienen un nivel aumentado de actividad de transportador de bicarbonato en comparación con las células huésped sin uno o varios polinucleótidos que codifican un transportador de bicarbonato, cuando se cultivan bajo las mismas condiciones. En algunos aspectos, las células huésped que comprenden uno o varios polinucleótidos heterólogos que codifican un transportador de bicarbonato tienen un nivel aumentado de actividad de transportador de bicarbonato de al menos 5%, por ejemplo, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 300% o a 500% en comparación con las células huésped sin uno o varios polinucleótidos que codifican un transportador de bicarbonato, cuando se cultivan bajo las mismas condiciones.
[0075] En algunos aspectos, la célula huésped comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un transportador de bicarbonato. En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica un transportador de bicarbonato se selecciona de:
(a)
un polinucleótido que codifica un transportador de bicarbonato que tiene al menos 65% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 2 o 4; (b) un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas con (i) SEC ID n.º: 1 o 3, (ii) la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 1 o 3, o (iii) la cadena complementaria en toda su longitud de (i) o (ii); y (c) un polinucleótido que tiene al menos 65% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 1 o 3, o la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 1 o 3. Como puede apreciar uno de habilidad en la técnica, en algunos casos el polinucleótido heterólogo que codifica un transportador de bicarbonato pueden calificar bajo más de una de las selecciones (a), (b) y (c) mencionadas por encima.
[0076] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo codifica un transportador de bicarbonato que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%
o 100% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 2 o 4. En un aspecto, la secuencia del transportador de bicarbonato
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polinucleótido que tiene al menos 65% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 7 o la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 7. Como puede ser apreciado por uno de habilidad en la técnica, en algunos casos el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa pueden calificar bajo más de una de las selecciones (a), (b) y (c) mencionadas por encima.
[0116] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo codifica una malato deshidrogenasa que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%
o 100% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 8. En un aspecto, la secuencia de malato deshidrogenasa difiere en no más de diez aminoácidos, por ejemplo, no más de cinco aminoácidos, no más de cuatro aminoácidos, no más de tres aminoácidos, no más de dos aminoácidos o un aminoácido de SEC ID n.º: 8.
[0117] En un aspecto, la malato deshidrogenasa comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 8, una variante alélica de la misma, o un fragmento de la anterior, que tiene actividad de malato deshidrogenasa. En otro aspecto, la malato deshidrogenasa comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 8. En otro aspecto, la malato deshidrogenasa comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 330 de SEC ID n.º: 8.
[0118] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo codifica una malato deshidrogenasa que tiene una sustitución, eliminación, y/o inserción de aminoácidos de uno o varios (por ejemplo, dos, diferentes) aminoácidos de SEC ID n.º: 8, como se describe supra. En algunos aspectos, el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos de SEC ID n.º: 8, no es más de 10, por ejemplo, no más de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.
[0119] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia bajas, por ejemplo, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas con (i) SEC ID n.º: 7, (ii) la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 7 o (iii) la cadena complementaria en toda su longitud de (i) o (ii) (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, supra). En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia bajas, por ejemplo, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas con SEC ID n.º: 7, o la cadena complementaria en toda su longitud de la misma. En otro aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa hibridiza bajo al menos condiciones de astringencia bajas, por ejemplo, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas, o condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 7, o la cadena complementaria en toda su longitud de la misma.
[0120] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa tiene al menos 65%, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%
o 100% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 7 o la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 7. En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa tiene al menos 65%, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID n.º: 7. En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa tiene al menos 65%, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ADNc de SEC ID n.º: 7.
[0121] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo que codifica una malato deshidrogenasa comprende SEC ID n.º: 7. En un aspecto, el polinucleótido heterólogo comprende los nucleótidos 1 a 1430 de SEC ID n.º: 7. En un aspecto, el polinucleótido heterólogo comprende una subsecuencia de SEC ID n.º: 7, donde la subsecuencia codifica un polipéptido que tiene actividad de malato deshidrogenasa. En un aspecto, el número de residuos de nucleótidos en la subsecuencia es al menos 75%, por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90% o 95% del número de residuos de nucleótidos en SEC ID n.º:
7.
[0122] En un aspecto, el polinucleótido heterólogo codifica un fragmento de SEC ID n.º: 8, donde el fragmento tiene actividad de malato deshidrogenasa. En un aspecto, el número de residuos de aminoácidos en el fragmento es al menos 75%, por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90% o 95% del número de residuos de aminoácidos en SEC ID n.º: 8.
[0123] La malato deshidrogenasa también puede ser una variante alélica o variante artificial de una malato deshidrogenasa.
[0124] La malato deshidrogenasa puede también incluir polipéptidos fusionados o polipéptidos divisibles de fusión, como se describe supra.
[0125] Técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica una malato deshidrogenasa son descritas supra.
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Medio de lote fermentador estaba compuesto por 140 g de glucosa, 120 g de CaCO3, 9 g de Bacto-peptona, 150 mg de KH2PO4, 150 mg de K2HPO4, 100 mg de MgSO4·7H2O, 100 mg de CaCl2·2H2O, 5 mg de FeSO4·7H2O, 5 mg de NaCl, 5 ml de L61 plurónico y agua desionizada hasta 1 litro. 1000X Solución Micronutriente estaba compuesta por 5 g de NaCl, 5 g de FeSO4·7H2O, 1 g de ácido cítrico y agua desionizada hasta 1 litro. Placas de PDA estaban compuestas por 39 g/l de agar de dextrosa de patata. Placas 2XiT+amp estaban compuestas por 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 100 mg de ampicilina, 15 g de Bacto agar y agua desionizada hasta 1 litro. Placas MM estaban compuestas por 50 ml 20X MM solución salina, 1 mL de solución de oligoelementos de COVE, 10 g de glucosa, 20 ml de solución madre de biotina, 500mg de MgSO4-7H2O, 20g de agar noble, pH 6,5 con NaOH y agua desionizada hasta 1 litro. Placas de sacarosa 2 MM + 1M estaban compuestas por 50ml 20X MM solución salina, 1 ml de solución de oligoelementos de COVE, 342,3g de sacarosa, 10g de glucosa, 20ml de solución madre de biotina, 500mg de MgSO4-7H2O, 20g de agar noble, pH 6,5 con NaOH y agua desionizada hasta 1 litro. Solución salina 20X MM estaba compuesta por 120g de NaNO3, 10,4g de KCl, 30,4g de KH2PO4 y agua desionizada hasta 1 litro. Solución madre de biotina estaba compuesta por 5 mM de biotina en 100 mM de tampón Tris (pH 8,0).
Ejemplo 1: clonación de un gen de transportador de bicarbonato de Aspergillus oryzae (bt1) y construcción de vector de expresión pAmFs69
[0225] El gen de transportador de bicarbonato bt1 (AO090012000782) fue clonado a partir de ADN genómico de Aspergillus oryzae NRRL3488 por amplificación de PCR usando cebadores homólogos del gen de transportador de bicarbonato predicho de Aspergillus oryzae número de modelo AO090012000782 encontrado en la secuencia genómica publicada de A. oryzae ATCC 42149 (Galagan et al., 2005, Nature 438: 1105-1115).
[0226] ADN genómico de A. oryzae NRRL3488 fue aislado por inoculación de 100 ml de medio YEG en un matraz de agitación con 2X106 de esporas e incubación del matraz a 37°C durante toda la noche con agitación a 200 r.p.m. Los micelios fueron cosechados en embudo forrado con MIRACLOTH® (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) y aproximadamente 2 gramos de tejido fue congelado en nitrógeno líquido. Los micelios fueron interrumpidos por trituración en un mortero frío y mano de mortero. El ADN genómico fue aislado de los micelios en polvo utilizando un kit DNeasy® Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El gen bt1 de Aspergillus oryzae fue amplificado utilizando el cebador sentido 069824 y cebador antisentido 069825 mostrado por debajo:
Cebador 069824:
5'-GTGATAGAACATCGTCCATAATGGAATCCAGCGCTGTACA-3' (SEC ID n.º: 11)
Cebador 069825:
5'-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCAGATTTCAATCTCGTCTT-3' (SEC ID n.º: 12)
[0227] Las reacciones de amplificación fueron realizadas utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® Hot Start (Finnzymes Inc., Massachusetts, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada reacción por PCR contenía 47 ng de ADN genómico de Aspergillus oryzae NRRL3488, 200 µM dNTPs, 50 pM de cebador sentido, 50 pM de cebador antisentido, 1X tampón de reacción Phusion® GC Buffer (Finnzymes Inc.), y 50 unidades de ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® Hot Start en un volumen final de 50 µl. Las reacciones de amplificación fueron incubadas en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® (Eppendorf Scientific Inc., Westbury, NY, EE.UU.) programado para 1 ciclo a 98°C durante 30 segundos; 35 ciclos a 98°C durante 10 segundos, 66°C durante 30 segundos y 72°C durante 2,5 minutos; y 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos. El producto de PCR fue purificado por 1% de electroforesis en gel de agarosa en 50 mM de base Tris-50 mM de acetate-0,1 mM tampón de disodio EDTA (TAE). Un fragmento de aproximadamente 2,5 kb fue extirpado del gel y extraído de la agarosa utilizando un kit de extracción en gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc.).
[0228] El plásmido pShTh60 (figura 1, véase también el número de solicitud PCT: PCT/US10/47002, solicitada el 27 de agosto de 2010) fue digerido con Sex Al y Pac I, separado por 0,8% de electroforesis en gel de agarosa en tampón TBE (10,8 g/L Tris Base, 5,5 g/L ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8,0) y purificado utilizando un kit de extracción en gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc.). El producto de PCR purificado anteriormente fue luego insertado en el fragmento pShTh60 digerido utilizando un equipo de reacción Advantage de In-Fusion™ (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante dando como resultado el plásmido pAmFs69 (figura 2).
[0229] Una parte alícuota de 2,5 µl de la reacción de ligamiento anterior fue transformada en células de E. coli químicamente competentes ONE SHOT@ TOP10 (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los transformantes fueron colocados en placas sobre placas 2XiT+amp e incubados a 37°C durante toda la noche.
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[0278] Tres transformantes SaMF58Q de Aspergillus oryzae descritos en el ejemplo 9 y el transformante de control de
A. oryzae ShTh6900 (la cepa original para transformante SaMF58Q, pero carente del gen de anhidrasa carbónica heteróloga de SEC ID n.º: 54) se dejaron crecer durante aproximadamente 7 días a 34°C en placas PDA. Un volumen de 5-6 ml de tampón de fosfato sódico estéril (50 mM, pH 6,8) que contenía 0,2% TWEEN® 80 se añadió a cada placa y las esporas fueron suspendidas por raspado con un bucle de inoculación. Cada suspensión fue transferida por pipeta a un tubo cónico de 50 ml. Para cada tubo, 25 ml de tampón de fosfato de sodio estéril (50 mM, pH 6,8) que contenía 0,2% TWEEN® 80 se añadió a un matraz de 500 ml sin deflectores que contenía 75 ml de medio de semilla, que fue luego inoculado con 2 ml de suspensión de esporas. Los matraces fueron luego incubados a 34°C y 180 r.p.m. durante aproximadamente 24 horas. Los matraces de semillas fueron combinados para suministrar el inóculo de 144 ml requerido por tanque.
[0279] Fermentadores de tres litros que contenían 1,8 litros de medio de lote fermentador (con o sin 15 µM ZnSO4 adicional) fueron individualmente inoculados introduciendo 144 ml (8%) del caldo de cultivo de semillas de tres matraces de semillas combinados de bien transformantes SaMF58Q de Aspergillus oryzae o transformantes ShTh6900 de Aspergillus oryzae. Los fermentadores fueron equilibrados a 34°C ± 0,1 °C y agitados a 700 r.p.m. La corriente de aire de entrada fue mantenida a 1 v/v/m. Una corriente de 30% de glucosa fue administrada a una velocidad de aproximadamente 7,3 g/hr empezando en alrededor de 20 horas de fermentación, aumentando a 9,3 g/hr a 68 horas. 150 G de CaCO3 estéril fue añadido en el día 3 para mantener el pH de fermentación en el rango de 6 a 7.
[0280] Las muestras fueron retiradas diariamente y analizadas para producción de ácido málico por cromatografía en fase líquida acoplada con espectrometría de masas en serie (LC-MS/MS) utilizando un sistema LC-MS/MS de Agilent con detectores Quad triples y terminal de trabajo Masshunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) basado en lo siguiente:
Columna LC: columna Waters XBridge Amide, 3,5 µm, 150X2.1 mm ID (Waters, Milford, MA, USA; P/N: 186004861) Volumen de inyección: 2,0 µL Tampón de muestra: 584,48 mg EDTA, 154,16 mg NH4Ac, 200 mL MeOH, 800 mL H2O, 500 uL 25% NH3·H2O, 11,44 mg, estándar interno de ácido málico marcado 13C ((Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, MA, EE.UU.) y agua desionizada hasta 1 litro (pH 8,3). Solvente A para HPLC: 5 mM NH4Ac en 80% MeOH Solvente B para HPLC: 50 mM (NH4)2CO3 en 20% AcN, ajuste pH a 10 utilizando 25% NH3·H2O Condición de desarrollo: isocrático 30% B, velocidad de flujo 0,3 mL/min; temperatura de columna 45°C Estándares: ácido málico: 60 g/L, 51 g/L, 45 g/L, 30 g/L, 15 g/L, 7.5 g/L, 3,75 g/L, 1,875 g/L cada uno diluido 100 veces con agua destilada doblemente y 10 veces con tampón de muestra (dilución final 1000 veces); ácido succínico, ácido fumárico, ácido cítrico y ácido oxálico: cada uno diluido en 8 niveles a 1000 veces de una manera similar a partir de un caldo de 5-10 g/L. Ajustes de MS: gas temp.: 300°C, flujo de gas: 10 L/min, nebulizador: 32 psi, Delta EMV(-): 450 Ajustes de MRM: tabla 1 por debajo.
Tabla 1.
Compuesto
Precursor MS1 Res Producto MS2 Res Permanencia Fragmentador Energía de colisión Polaridad
C13 Ácido málico
137 unidad 92 unidad 50 60 8 negativa
C13 Ácido málico
137 unidad 74 unidad 50 60 10 negativa
Ácido málico
133 unidad 89 unidad 50 60 8 negativa
Ácido málico
133 unidad 71 unidad 50 60 10 negativa
Ácido succínico
117 unidad 99 unidad 150 50 5 negativa
Ácido succínico
117 unidad 73 unidad 50 50 5 negativa
Ácido fumárico
115 unidad 71 unidad 50 60 3 negativa
Ácido fumárico
115 unidad 27 unidad 50 60 4 negativa
Ácido cítrico
191 unidad 111 unidad 50 80 5 negativa
Ácido cítrico
191 unidad 87 unidad 50 80 11 negativa
38
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