BRPI0819275B1 - Célula eucariótica recombinante produtora de ácido succínico e processo para a preparação de ácido succínico - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO EM UMA CÉLULA EUCARIÓTICA. A presente invenção relaciona-se a uma célula eucariótica recombinante selecionada de uma levedura de um fungo filamentoso compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H) que catalisa a conversão de ácido fumárico ao ácido succínico. A invenção ainda se relaciona a um processo para a produção de ácido succínico em que a célula eucariótica de acordo com a presente invenção é usada.

Description

A presente invenção relaciona-se a uma célula eucariótica recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase e um processo para a produção de ácido succínico em que a célula eucariótica recombinante é usada.

O ácido succínico é um precursor potencial para numerosos produtos químicos. Por exemplo, o ácido succínico pode ser convertido em 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano, e gama-butirolactona. Outro produto derivado de ácido succínico é um polímero de poliéster que é feito ligando o ácido succínico e BDO.

O ácido succínico é produzido predominante através dos processos petroquímicos por hidrogenação de butano. Estes processos são considerados prejudiciais para o ambiente e caros. A produção fermentativa de ácido succínico pode ser um processo alternativo atrativo para a produção de ácido succínico, em que a matéria-prima renovável como uma fonte de carbono pode ser usada.

Várias bactérias diferentes tais como Escherichia coli, e as bactérias de rúmen Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, ou Succinimonas, sp. são conhecidas por produzir ácido succínico. A engenharia metabólica destas cepas bacterianas tem melhorado o rendimento e/ou produtividade de ácido succínico, ou reduzido a formação de subproduto.

WO2007/061590 divulga uma levedura negativa de despiruvato carboxilase para produção de ácido málico e/ou ácido succínico que é transformado com uma enzima piruvato carboxilase ou uma carboxilase de fosfoenolpiruvato, uma enzima malato desidrogenase, e uma proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Apesar das melhorias de que foram feitas na produção fermentativa de ácido succínico, permanece uma necessidade para microrganismos melhorados para a produção fermentativa de ácido succínico.

O objetivo da presente invenção é um microrganismo alternativo para produção de ácido succínico.

O objetivo é conseguido de acordo com a invenção com uma célula eucariótica recombinante selecionada do grupo consistindo em uma levedura e um fungo filamentoso compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando fumarato redutase dependente de NAD(H) que catalisa a conversão de ácido fumárico ao ácido succínico.

Surpreendentemente descobriu-se que a célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção produz uma quantidade aumentada de ácido succínico comparada às quantidades de ácido succínico produzidas por uma célula eucariótica tipo selvagem. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção produz pelo menos 1,2, preferivelmente pelo menos 1,5, preferivelmente pelo menos 2 vezes mais ácido succínico do que uma célula eucariótica tipo selvagem que não compreende a sequência de nucleotídeo codificando fumarato redutase dependente de NAD(H).

Como usado aqui, uma célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção é definida como uma célula que contém, ou é transformada ou geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente na célula eucariótica, ou contém cópia ou cópias adicionais de uma sequência de ácido nucléico endógena. Uma célula eucariótica do tipo selvagem é definida aqui como a célula progenitora da célula recombinante.

A sequência de nucleotídeo codificando uma Fumarato redutase dependente de NAD(H) que catalisa a conversão de ácido fumárico ao ácido succínico pode ser uma sequência de nucleotídeo heteróloga ou homóloga, ou codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) heteróloga ou homóloga, que pode ter sido adicionalmente geneticamente modificada por mutação, rompimento ou deleção. As técnicas de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica, tais como em Sambrook e Russel (2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratoty Press.

O termo “homólogo” quando usado para indicar a relação entre dada molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo (recombinante) e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeiroa é compreendido significar que na natureza a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, preferivelmente da mesma variedade ou cepa.

O termo “heterólogo” quando usado com relação a um ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína refere-se a um ácido nucléico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou NA em que está presente, ou em que é encontrado em uma célula ou posição ou posições no genoma ou sequência de DNA ou RNA que diferem daquela em que se encontra na natureza. Os ácidos nucléicos ou proteínas heterólogos não são endógenos à célula em que são introduzidos, mas foram obtidos de outra célula ou sinteticamente ou recombinantemente produzidos.

Uma fumarato redutase dependente de NAD(H) de acordo com a presente invenção usa NAD(H) como um cofator, visto que a maioria das células eucarióticas compreende uma fumarato redutase dependente de FADH2, em que FADH2 é o cofator. Descobriu-se vantajosamente que a célula eucariótica compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H), já que a fumarato redutase dependente de NAD(H) fornece a célula opções adicionais para oxidar NAD(H) a NAD+ e influência o equilíbrio redox na célula.

Preferivelmente, a célula expressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a formação de ácido succínico, em que a sequência de nucleotídeo preferivelmente codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H), compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 1, e/ou Id. de Seq. N°: 3, e/ou Id. de Seq. N°: 4, e/ou Id. de Seq. N°: 6. Preferivelmente, a sequência de nucleotídeo codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) compreendendo a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 1, e/ou Id. de Seq. N°: 3, e/ou Id. de Seq. N°: 4, e/ou Id. de Seq. N°: 6.

A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucléico (polinucleotídeo), como determinado comparando as sequências. Geralmente, as identidades de sequência ou similaridades são comparadas sobre o comprimento inteiro das sequências comparadas. Na técnica, “identidade” também significa o grau de relacionamento de sequência entre o aminoácido ou sequências de ácido nucléico, conforme o caso pode ser, como determinado pela combinação entre fitas de tais sequências.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador públicos. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem BLASTP e BLASTN, publicamente disponíveis de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e col., NCBI NLM NIH Bethesda, DM 20894). Os parâmetros preferidos para comparação de sequências de aminoácido usando BLASTP são abertura gap 11.0, extensão gap 1, matriz Blosum 62.

Sequências de nucleotídeo codificando as enzimas expressas na célula da invenção podem também ser definidas por sua capacidade para hibridizar com sequências de nucleotídeo codificando uma enzima fumarato redutase dependente de NAD(H) de Id. de Seq. N°: 1, Id. de Seq. N°:3, Id. de Seq. N°:4, e/ou Id. de Seq. N°:6, sob condições de hibridização moderadas, ou preferivelmente estritas. As condições de hibridização estritas são definidas aqui como condições que permitem uma sequência de ácido nucléico de pelo menos aproximadamente 25, preferivelmente aproximadamente 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos, hibridizar em uma temperatura de aproximadamente 65°C em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando em 65°C em uma solução compreendendo aproximadamente 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo aproximadamente 90% ou mais de identidade de sequência.

As condições moderadas são definidas aqui como as condições que permitem uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de aproximadamente 200 ou mais nucleotídeos, hibridizar em uma temperatura de aproximadamente 45°C em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando em temperatura ambiente em uma solução compreendendo aproximadamente 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é realizada pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo até 50% de identidade de sequência. A pessoa hábil na técnica poderá modificar estas condições de hibridização a fim de especificamente identificar sequências variando em identidade entre 50% e 90%.

Para aumentar a probabilidade que a enzima introduzida seja expressa na forma ativa em uma célula eucariótica da invenção, a sequência de nucleotídeo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso de codon ao da célula hospedeira eucariótica escolhida. Diversos métodos para a otimização de códon são conhecidos na técnica. Um método preferido para otimizar o uso de códon das sequências de nucleotídeo para a célula eucariótica de acordo com a presente invenção é tecnologia de otimização de pares de códon como divulgado em WO2008/000632. A otimização de par de códons é um método para produzir um polipeptídeo em uma célula hospedeira, em que as sequências de nucleotídeo codificando o polipeptídeo foram modificadas com relação a seu uso de códon, em particular os pares de códon que são usados para obter expressão melhorada da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo e/ou a produção melhorada do polipeptídeo. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

O termo “gene”, como usado aqui, refere-se a uma sequência de ácido nucléico contendo um molde para uma polimerase de ácido nucléico, em eucariotos, polimerase de RNA II. Os genes são transcritos em mRNAs que são então traduzidos em proteína.

O termo “ácido nucléico” como usado aqui, inclui referência a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, isto é um polinucleotídeo, na forma de fita simples ou dupla, e a menos que limitado de outra maneira, engloba análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais que hibridizam aos ácidos nucléicos de fita simples em uma maneira similar aos nucleotídeos naturais (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo). Um polinucleotídeo pode ser completo ou uma subsequência de um gene regulatório ou estrutural heterólogo ou nativo. A menos que indicado de outra maneira, o termo inclui referência à sequência especificada assim como a sequência complementar do mesmo.

Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados permutavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido no qual um ou mais resíduos de aminoácido são um análogo químico artificial de um aminoácido natural correspondente, assim como polímeros de aminoácido naturais. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos naturais é que, quando incorporados em uma proteína, essa proteína é especificamente reativa aos anticorpos eliciados à mesma proteína, mas consistindo inteiramente em aminoácidos naturais. Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são também inclusivos de modificações incluindo, mas não limitadas a, glicosilação, ligação de lipídio, sulfatação, gama carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

O termo “enzima” como usado aqui é definido como uma proteína que catalisa a reação (bio)química em uma célula. Geralmente, a sequência de nucleotídeo codificando uma enzima é operavelmente ligada a um promotor que causa a suficiente expressão da sequência de nucleotídeo correspondente na célula eucariótica de acordo com a presente invenção para conferenciar à célula a habilidade de produzir ácido succínico.

Como usado aqui, o termo “operavelmente ligada” refere-se a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou sequências de codificação ou sequência de ácido nucléico) em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucléico é “operavelmente ligada” quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou melhorador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação, se afeta a transcrição da sequência de codificação.

Como usado aqui, o termo “promotor” refere-se a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, situados a montante com relação à direção de transcrição do local de iniciação de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um local de ligação para a polimerase de RNA dependente de DNA, locais de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA conhecidos a um hábil na técnica. Um promotor “constitutivo” é um promotor que está ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor “induzível” é um promotor que está ativo sob a regulação ambiental ou de desenvolvimento.

Um promotor que poderia ser usado para conseguir a expressão de uma codificação de sequência nucleotídeo para uma enzima, tal como Fumarato redutase dependente de NAD(H) ou qualquer outra enzima introduzida na célula eucariótica da invenção, pode ser não nativa a uma codificação de sequência de nucleotídeo para a enzima ser expressa, isto é um promotor que é heterólogo à sequência de nucleotídeo (sequência de codificação) a qual é operavelmente ligada. Preferivelmente, o promotor é homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira.

Os promotores apropriados neste contexto incluem ambos promotores naturais constitutivos e induzíveis, bem como promotores projetados, que são conhecidos à pessoa hábil na técnica. Os promotores apropriados em células hospedeiro eucariótica podem ser GAL7, GAL10, ou GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, e AOX1. Outros promotores apropriados incluem PDC, GPD1, PGK1, TEF1, e TDH.

Geralmente uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima compreende um terminador. Qualquer terminador, que é funcional na célula eucariótica, pode ser usado na presente invenção. Os terminadores preferidos são obtidos dos genes naturais da célula hospedeira. As sequências de terminador apropriadas são conhecidas na técnica. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que previnem a degradação de mRNA mediada sem sentido na célula hospedeira da invenção (veja, por exemplo: Shirley e col., 2002, Genetics 161:1465-1482).

Em uma modalidade preferida, uma sequência de nucleotídeo codificando um fumarato redutase dependente de NAD(H) pode ser superexpressa para conseguir uma produção suficiente de ácido succínico pela célula.

Há vários meios disponíveis na técnica para superexpressão de sequências de nucleotídeo codificando enzimas em uma célula eucariótica da invenção. Em particular, uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima pode ser superexpressa aumentando número de cópias da codificação de gene para a enzima na célula, por exemplo, ao integrar cópias adicionais do gene no genoma da célula, expressando o gene de um vetor centromérico, de um vetor de expressão de múltiplas cópias epissomal ou introduzindo um vetor de expressão (epissomal) que compreende múltiplas cópias do gene. Preferivelmente, a superexpressão da enzima de acordo com a invenção é conseguida com um promotor constitutivo (forte).

A invenção também se relaciona a uma construção de nucleotídeo compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo selecionadas do grupo consistindo de Id. de Seq. N°: 7, Id. de Seq. N°: 8, Id. de Seq. N°: 9 ou Id. de Seq. N°: 10.

A construção de ácido nucléico pode ser um plasmídeo, por exemplo, uma baixa cópia plasmídeo ou alta cópia de plasmídeo. A célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode compreender uma única cópia, mas preferivelmente compreenda múltiplas cópias da sequência de nucleotídeo codificando uma Fumarato redutase dependente de NAD(H), por exemplo, por múltiplas cópias de uma construção de nucleotídeo.

A construção de ácido nucléico pode ser mantida epissomalmente e assim compreende uma sequência para replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Se a célula eucariótica é de origem fúngica, uma construção de ácido nucléico epissomal apropriada pode, por exemplo, ser baseada baseada nas leveduras de 2μ ou plasmídeos pKD1 (Gleer e col., 1991, Biotechnology 9:968975), ou plasmídeos AMA (Fierro e col., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construção de ácido nucléico pode ser integrada em uma ou mais cópias no genoma da célula eucariótica. A integração no genoma da célula pode ocorrer aleatória por recombinação não homóloga, mas preferivelmente, a construção de ácido nucléico pode ser integrada no genoma da célula por recombinação homóloga como é conhecida na técnica.

A sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H), pode ser uma sequência de nucleotídeo heteróloga ou homóloga. Preferivelmente, a fumarato redutase dependente de NAD(H) é uma enzima heteróloga, que pode ser derivada qualquer origem apropriada, por exemplo, bactérias, fungos, protozoários ou plantas. Preferivelmente, a célula de acordo com a invenção compreende uma fumarato redutase dependente de NAD(H) heteróloga, preferivelmente derivada um Trypanosoma sp., por exemplo, um Trypanosoma brucei.

Em uma modalidade preferida a sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H) é expressa no citosol. Surpreendentemente, a atividade citosólica da enzima resultou em uma produtividade aumentada de ácido succínico pela célula eucariótica. No caso da sequência de nucleotídeo codificando uma Fumarato redutase dependente de NAD(H) compreende um sinal alvo mitocondrial ou peroxissomal, pode ser essencial modificar ou deletar vários aminoácidos (e sequências de nucleotídeo correspondentes na sequência de nucleotídeo de codificação) a fim de prevenir o ataque peroxissomal ou mitocondrial da enzima. A presença de um sinal de ataque peroxissomal pode, por exemplo, ser determinado pelo método divulgado por Schluter e col., Nucleic Acid Research 2007, 35, D815-D822.

Preferivelmente, a fumarato redutase dependente de NAD(H) falta um sinal de ataque peroxissomal ou mitocondrial para atividade citosólica da enzima sob expressão da sequência de nucleotídeo de codificação.

Preferivelmente, a célula expressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a formação de ácido succínico, em que a sequência de nucleotídeo preferivelmente codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H), preferivelmente uma fumarato redutase compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 45, 50, 55, 15 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 3, e/ou Id. de Seq. N°: 6. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) compreendendo a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 3, e/ou Id. de Seq. N°: 6.

A célula eucariótica selecionada do grupo consistindo de uma levedura e um fungo filamentoso, preferivelmente pertence a um dos gêneros Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Torulaspora, Trichosporon,

Brettanomyces, Rhizopus, Zygosaccharomyces, Pachysolen ou Yamadazyma. Preferivelmente, a célula eucariótica pertence a uma espécie Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, P. symplissicum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus orizae ou Zygosaccharomyces bailii.

Além de uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H) que catalisa a conversão de ácido fumárico ao ácido succínico, a célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção pode compreender ainda modificações genéticas, por exemplo, mutações, deleções ou rompimentos, em sequências de nucleotídeo homólogas e/ou transformação com sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas homólogas ou heterólogas que catalisam uma reação na célula resultando em um fluxo aumentado para ácido succínico. Por exemplo, pode ser favorável introduzir, geneticamente modificar e/ou superexpressar sequências de nucleotídeo heterólogas e/ou homólogas codificando: i) uma enzima que catalisa a conversão de fosfoenolpiruvato ou piruvato ao oxaloacetato; ii) uma malato desidrogenase que catalisa a conversão de OAA ao ácido málico; ou iii) uma fumarase que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico.

Uma célula eucariótica pode ser transformada ou geneticamente modificada com qualquer sequência de nucleotídeo apropriada catalisando a reação de uma molécula de carbono C3 à C4, tal como fosfoenolpiruvato (PEP, C3) ao oxaloacetato (OAA, C4) e piruvato (C3) ao OAA ou ácido málico (C3). As enzimas apropriadas são PEP carbóxiquinase (EC 4.1.1.49, EC 4.1.1.38) e PEP carboxilase (EC 4.1.1.31) que catalisa a conversão de PEP ao OAA; piruvato carboxilase (EC 6.4.1.1.), que catalisa a reação de piruvato ao OAA; ou enzima málica (EC 1.1.1.38), que catalisa a reação de piruvato ao ácido málico.

Preferivelmente uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção superexpressa uma sequência de nucleotídeo codificando uma piruvato carboxilase (PYC), preferivelmente uma piruvato carboxilase que está ativo no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo codificando uma PYC, por exemplo, uma PYC compreendendo uma sequência de aminoácido de acordo com a Id. de Seq. N°: 41. Preferivelmente, uma piruvato carboxilase endógena ou homóloga é superexpressa. Surpreendentemente, descobriu-se que a superexpressão de uma piruvato carboxilase endógena resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados pela célula eucariótica de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade preferida, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção ainda compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma PEP carbóxiquinase heteróloga (EC 4.1.1.49) catalisando a reação do fosfoenolpiruvato ao oxaloacetato. Surpreendentemente descobriu-se que uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção ainda compreende uma PEP carbóxiquinase heteróloga produzida de uma quantidade aumentada de ácido succínico em comparação a uma célula eucariótica que não compreende a PEP carbóxiquinase heteróloga. Preferivelmente, uma PEP carbóxiquinase que é derivado das bactérias, mais preferivelmente a enzima tendo atividade de PEP carbóxiquinase é derivada de Escherichia coli, Mannheimia so., Actinobacillus sp., ou Anaerobiospirillum sp., mais preferivelmente Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, ou Anaerobiospirillum succiniciproducens. Preferivelmente, a PEP carbóxiquinase está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo codificando PEP carbóxiquinase já que se descobriu que isto resultou em um aumento de produção de ácido succínico. Em uma modalidade a PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes (PCKa) foi modificado para substituir EGY na posição 120-122 com uma sequência de aminoácido de DAF. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma PEP carbóxiquinase tendo pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a Id. de Seq. N°: 14 ou Id. de Seq. N°: 17, preferivelmente uma PEP carbóxiquinase compreendendo a Id. de Seq. N°: 14 ou Id. de Seq. N°: 17. Surpreendentemente descobriu-se que (super)expressão concomitante de uma PYC e uma PEP carbóxiquinase como descrita aqui resultou em pelo menos 1,5 de aumento em produção de ácido succínico.

Em outra modalidade preferida uma célula de acordo com a presente invenção ainda compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma malato desidrogenase (MDH) que está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo. Uma MDH citosólica pode ser qualquer malato desidrogenase homóloga ou heteróloga apropriada. A MDH pode ser uma MDH3 de S. cerevisiae ou MDH1 S. cerevisiae. Preferivelmente, a MDH falta um sinal de ataque peroxissomal ou mitocondrial a fim de localizar a enzima no citosol. Alternativamente, a MDH é MDH2 S. cerevisiae que foi modificada tal que não é inativada na presença de glicose e está ativa no citosol. Sabe-se que a transcrição de MDH2 é reprimida e Mdh2p é degradada sob adição de glicose às células sem glicose. Mdh2p deletada para os primeiros 12 aminoácidos amino-terminais é menos suscetível para a degradação induzida por glicose (Minard e McAlister- Henn, J. Biol. Chem. agosto de 1992 25;267(24):17458-64). Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma malato desidrogenase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 19 ou Id. de Seq. N°: 21. Preferivelmente a malato desidrogenase compreende Id. de Seq. N°: 19 ou Id. de Seq. N°: 21. Preferivelmente, a atividade de malato desidrogenase é aumentada superexpressando a sequência de nucleotídeo de codificação por métodos conhecidos na técnica.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção ainda compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico, que pode ser uma enzima heteróloga ou homóloga, por exemplo, uma fumarase (FUM). Uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima heteróloga que catalisa a conversão de ácido málico ao ácido fumárico, pode ser derivada de qualquer origem apropriada, preferivelmente de origem microbiana, preferivelmente de uma levedura, por exemplo, Saccharomyces cervisiae ou um fungo filamentoso, por exemplo, Rhizopus oryzae. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma fumarase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% identidade de sequência com a sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 23. Preferivelmente, a fumarase compreende a Id. de Seq. N°: 23. Preferivelmente a enzima tendo atividade de fumarase está ativa no citosol sob expressão da sequência de nucleotídeo codificando a enzima tendo a atividade de fumarase. Surpreendentemente, descobriu-se que uma célula eucariótica ainda compreende uma enzima tendo a atividade de fumarase como descrita aqui produziu uma quantidade aumentada de ácido succínico.

Em outra modalidade, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico, preferivelmente uma proteína transportadora de ácido málico (MAE). Uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico pode ser uma proteína homóloga ou heteróloga. Preferivelmente a proteína transportadora de ácido dicarboxílico é uma proteína heteróloga. Uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico pode ser derivada de qualquer organismo apropriado, preferivelmente de Schizosaccharomyces pombe. Preferivelmente, uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico é uma proteína transportadora de ácido málico (MAE) que tem pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a Id. de Seq. N°: 36. Preferivelmente a MAE compreende a Id. de Seq. N°: 36. Surpreendentemente, descobriu-se que uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção ainda compreende um transportador de ácido dicarboxílico, tal como um transportador de ácido málico como descrito aqui produziu uma quantidade aumentada de ácido succínico em comparação a uma célula eucariota não compreendendo uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico.

A presente invenção também relaciona-se ao uso de um transportador ácido dicarboxílico, preferivelmente uma proteína transportadora de ácido málico, em uma célula eucariótica para aumentar a produção de ácido succínico. Preferivelmente, o transportador de ácido málico é derivado de Schizosaccharomyces pombe.

Em uma modalidade preferida uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção é uma levedura compreendendo sequências de nucleotídeo codificando uma fumarato redutase dependente de NAD(H), uma malato desidrogenase, uma fumarase heteróloga, uma PEP carbóxiquinase heteróloga e um transportador de ácido dicarboxílico heterólogo e superexpressar uma piruvato carboxilase (PYC), como descrito, incluindo as modalidades preferidas, aqui acima. Surpreendentemente, descobriu-se que uma levedura da invenção compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando as enzimas como descritas aqui produziu uma quantidade aumentada de ácido succínico em comparação a uma levedura compreendendo qualquer uma das sequências de nucleotídeo sozinha.

Em outra modalidade preferida uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreende a atividade reduzida de enzimas que convertem NAD(H) à NAD+ comparada à atividade destas enzimas em uma célula tipo selvagem.

Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção é uma célula em que pelo menos um gene codificando álcool desidrogenase não está funcional. Um gene de álcool desidrogenase que não está funcional é usado aqui para descrever uma célula eucariótica que compreende uma atividade de álcool desidrogenase reduzida comparada a uma célula em que todos genes codificando uma álcool desidrogenase estão funcionais. Um gene pode se tornar não funcional por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por mutação, rompimento, ou deleção, por exemplo, pelo método divulgado por Gueldener e col. 2002, Nucleic Acids Research, Vol. 30, N°. 6, e23. Preferivelmente, uma célula eucariótica é uma célula de levedura, tal como Saccharomyces cervisiae, em que um ou mais genes adh1 e/ou adh2, codificando álcool desidrogenase são inativados.

Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção ainda compreende pelo menos um gene codificando glicerol-3-fosfato desidrogenase que não está funcional. Um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase que não está funcional é usado aqui para descrever uma célula eucariótica, que compreende uma atividade de desidrogenase glicerol-3-fosfato reduzida, por exemplo por mutação, rompimento, ou deleção do gene codificando desidrogenase glicerol-3-fosfato, resultando em uma formação diminuída de glicerol em comparação à célula tipo selvagem. Surpreendentemente, descobriu-se que a célula eucariótica compreendendo a atividade de álcool desidrogenase reduzida e/ou a atividade de glicerol-3-fosfato desidrogenase e uma fumarase dependente de NAD(H) conduziu à produção de ácido succínico aumentada em comparação a uma célula em que um ou mais codificando genes de álcool desidrogenase e/ou glicerol-3-fosfato desidrogenase são não inativados.

A presente invenção também se relaciona a um processo para a produção de ácido succínico compreendendo fermentar uma célula eucariótica compreendendo pelo menos um gene codificando álcool desidrogenase está não funcional e/ou pelo menos um gene codificando glicerol-3-fosfato desidrogenase que não está funcional.

Em outra modalidade preferida a célula eucariótica recombinante de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um gene codificando succinato desidrogenase que não está funcional. Uma succinato desidrogenase que não está funcional é usada aqui para descrever uma célula eucariótica, que compreende uma atividade de succinato desidrogenase reduzida por mutação, rompimento, ou deleção, de pelo menos um gene codificando succinato desidrogenase resultando em uma formação aumentada de ácido succínico em comparação à célula tipo selvagem. Uma célula eucariótica compreendendo um gene codificando succinato desidrogenase que não está funcional pode, por exemplo, ser Aspergillus niger, preferivelmente um Aspergillus niger, em que um ou mais genes codificando succinato desidrogenase, tal como sdhA e sdhB estão não funcionais, por exemplo, por deleção destes genes. Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a invenção é uma levedura, preferivelmente Saccharomyces cervisiae, preferivelmente uma Saccharomyces cervisiae compreendendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo selecionadas de Id. de Seq. N°: 9 e Id. de Seq. N°: 10. Uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode também ser um fungo filamentoso, preferivelmente A. niger, preferivelmente A. niger compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo selecionadas de Id. de Seq. N°: 7 e Id. de Seq. N°: 8.

Preferivelmente, uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção compreendendo qualquer uma das modificações genéticas descritas aqui é capaz de produzir pelo menos 0,3, 0,5, 0,7, g/l de ácido succínico, preferivelmente pelo menos 1 g/l de ácido succínico, preferivelmente pelo menos 1,5, preferivelmente pelo menos 2, ou 2,5, 4,5 preferivelmente pelo menos 8, 10, 15, ou 20 g/l de ácido succínico mas geralmente abaixo de 200 ou abaixo de 150 g/l.

Uma célula eucariótica preferida de acordo com a presente invenção pode ser capaz de crescer em qualquer fonte de carbono apropriada conhecida na técnica e convertê-la ao ácido succínico. A célula eucariótica pode ser capaz de converter diretamente biomassa de planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol. Portanto, um organismo hospedeiro preferido expressa enzimas, tais como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo- e exoxilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glicurônico e ácido galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. Preferivelmente, a célula é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de glicose, frutose, galactose, xilose, arabinose, sacarose, lactose, rafinose e glicerol.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um processo para a preparação de ácido succínico, compreendendo fermentar a célula eucariótica de acordo com a presente invenção, em que ácido succínico é preparado.

Descobriu-se vantajosamente usar dentro uma célula eucariótica de acordo com a invenção no processo para a produção de ácido succínico, pois a maioria das células eucarióticas não exige condições estéreis para a propagação e são insensíveis às infecções de bacteriófagos.

Preferivelmente, o ácido succínico que é preparado no processo de acordo com a presente invenção é ainda convertido em um produto desejável. Um produto desejável pode, por exemplo, ser um polímero, tal como ácido succínico de polibutileno (PBS), um agente de remoção de gelo, ou um tensoativo.

O processo de acordo com a presente invenção pode ser feito sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Preferivelmente, o processo é realizado sob condições anaeróbicas ou sob condições limitadas de oxigênio ou microaerofílicas. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação feito na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, e em que as moléculas orgânicas servem como doador de elétron e aceptor de elétron.

Um processo de fermentação limitado de oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás ao líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades de transferência de mistura/massa real do equipamento de fermentação usado. Preferivelmente, em um processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é pelo menos 5,5, mais preferivelmente pelo menos 6 e mais preferivelmente pelo menos 7 mmol/l/h.

O processo para a produção de ácido succínico de acordo com a presente invenção pode ser realizada em qualquer pH apropriado entre 1 e 9. Preferivelmente, o pH no caldo de fermentação está entre 2 e 7, preferivelmente entre 3 e 5. Descobriu-se vantajoso poder realizar o processo de acordo com a presente invenção em um pH baixo, já que isto previne a contaminação bacteriana. Além disso, já que o pH cai durante a produção de ácido succínico, uma quantidade mais baixa de titulante pode ser necessária para manter o pH em nível desejado.

Uma temperatura apropriada em que o processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado está entre 5 e 60°C, preferivelmente entre 10 e 50°C, mais preferivelmente entre 15 e 35°C, mais preferivelmente entre 18°C e 30°C. O hábil na técnica conhece quais as temperaturas ótimas são apropriadas para fermentar uma célula eucariótica específica.

Preferivelmente, o ácido succínico é recuperado do caldo de fermentação por um método conhecido apropriado na técnica, por exemplo, por cristalização e precipitação de amônio.

Preferivelmente, o ácido succínico que é preparado no processo de acordo com a presente invenção é ainda convertido em um produto farmacêutico, cosmético, alimentício, ou químico. O ácido succínico pode ainda ser convertido em um polímero, tal como succinato de polibutileno (PBS) ou outros polímeros apropriados derivados do mesmo.

A presente invenção também se relaciona a um caldo de fermentação compreendendo um ácido succínico obtenível por um processo de acordo com a presente invenção.

A invenção relaciona-se a um processo para a produção de ácido succínico por uma levedura ou um fungo filamentoso como o produtor de ácido succínico, por meio da fumarato redutase de Trypanosoma brucei é usada para aumentar a produção de ácido succínico, em que preferivelmente a fumarato redutase está ativa no citosol.

Modificações genéticas

As técnicas genéticas padrões, tais como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridização, são métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Sambrook e Russel (2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, ou F. Ausubel e col., eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Os métodos para transformação, modificação genética etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos de, por exemplo, EP-A-O 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 e US 6.265.186.

Os seguintes exemplos são para finalidades ilustrativas somente e não são interpretados como limitação da invenção.

Descrição das figuras

Figura 1: Mapa do vetor pGBTOP-11 usado para a expressão de fumarato redutase em A. niger. Figura 2: Mapa de plasmídeo de pGBS414SUS-07, codificando fumarato redutase mitocondrial m1 (FRDm1) de Trypanosoma brucei para a expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 3: Mapa de plasmídeo de pGBS414SUS-08, codificando fumarato redutase glicossomal (FRDg) de Trypanosoma brucei para a expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado. Figura 4: Mapa de plasmídeo de pDEL-SDHA.

Figura 5: Mapa de plasmídeo de pGBTPAn1, para a superexpressão de FRDm1 em A. niger. Figura 6: Esquema de substituição de sdhA. Figura 7: Mapa de plasmídeo de pGBS416FRD-1, codificando fumarato redutase mitocondrial m1 (FRDm1) de Trypanosoma brucei para a expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado. Figura 8: Mapa de plasmídeo de pGBS416FRE-1, codificando fumarato redutase glicossomal (FRDg) de Trypanosoma brucei para a expressão em Saccharomyces cervisiae. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 9: Mapa de plasmídeo de pGBS414PPK-1, contendo PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes (PCKa) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. A construção de gene sintética TDH1 promotor-PCKa-TDH1 terminador foi clonada em vetor de expressão pRS414. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 10: Mapa de plasmídeo de pGBS414PPK-2, contendo PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes (PCKa) e fumarato redutase mitocondrial m1 de Trypanosoma brucei (FRDm1) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas TDH1 de promotor-PCKa-TDH1 terminador e TDH3 promotor-FRDm1-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS414. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 11: Mapa de plasmídeo de pGBS414PPK-3, contendo PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes (PCKa) e fumarato redutase glicossomal de Trypanosoma brucei (FRDg) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas TDH1 promotor-PCKa-TDH1 terminador e TDH3 promotor-FRDg-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS414. CPO denota pares de códon otimizado.

Figura 12: Mapa de plasmídeo de pGBS414PEK-1, contendo PEP carbóxiquinase de Mannheimia succiniciproducens (PCKm) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. A construção de gene sintética de TDH1 promotor-PCKm-TDH1 terminador foi clonada em vetor de expressão pRS414. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 13: Mapa de plasmídeo de pGBS414PEK-2, contendo PEP carbóxiquinase de Mannheimia succiniciproducens (PCKm) e fumarato redutase mitocondrial m1 de Trypanosoma brucei (FRDm1) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas de TDH1 promotor-PCKm-TDH1 terminador e TDH3 promotor-FRDm1-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS414. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 14: Mapa de plasmídeo de pGBS414PEK-3, contendo PEP carbóxiquinase de Mannheimia succiniciproducens (PCKm) e fumarato redutase glicossomal de Trypanosoma brucei (FRDg) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas de TDH1 promotor-PCKm-TDH1 terminador e TDH3 promotor-FRDg-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS414. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 15: Mapa de plasmídeo de pGBS415FUM-2, contendo fumarase de Rhizopus oryzae (FUMR) e malato desidrogenase citoplásmica de Saccharomyces cervisiae truncadas para os primeiros 12 aminoácidos (delta12N MDH2) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas de TDH1 promotor-FUMR-TDH1 terminador e TDH3 promotor-MDH3-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS415. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 16: Mapa de plasmídeo de pGBS415FUM-3, contendo umarase de Rhizopus oryzae (FUMR) e malato desidrogenase peroxissomal de Saccharomyces cervisiae (MDH3) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. As construções de gene sintéticas de TDH1 promotor-FUMR-TDH1 terminador e TDH3 promotor-MDH3-TDH3 terminador foram clonadas no vetor de expressão pRS415. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 17: Níveis de ácido succínico em cepas SUC-101 (O, controle de vetores vazio), SUC-148 (■, superexpressão de PCKa, MDH3, FUMR, FRDm1), SUC-149 (□, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-150 (♦, PCKm, MDH3, FUMR, FRDm1), SUC-151 (◊, PCKm, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-152 (•, PCKa, MDH3, FUMR), SUC-154 (X, PCKm, MDH3, FUMR) e SUC-169 (▲, PCKm, delta12NMDH2, FUMR, FRDm1). Todos os genes superexpressos eram pares de códon otimizados para a expressão em S. cerevisiae. Todos os dados representam médias de 3 experimentos de crescimento independentes de SUC-148, 149, 150, 151, 152, 154 e SUC-169 e médias de 6 experimentos de crescimento independentes de SUC-101.

Figura 18: Mapa de plasmídeo de pGBS416MAE-1, contendo malato permease de Schizosaccharomyces pombe (SpMAE1) para a expressão em Saccharomyces cervisiae. A construção de gene sintética Eno1 promotor-MAE1-Eno1 terminador foi clonada no vetor de expressão pRS416. CPO denota o par de códons otimizado.

Figura 19: Os níveis de ácido succínico nas cepas SUC- 101 (O, controle de vetores vazio), SUC-169 (▲, PCKm, delta12NMDH2, FUMR, FRDm1) e SUC-194 (■, PCKm, delta12NMDH2, FUMR, FRDm1, SpMAE1). Todos os genes superexpressos eram pares de códon otimizados para expressão em S. cerevisiae. Todos os dados representam médias de 3 experimentos de crescimento independentes de SUC-169 e SUC-194 e médias de 6 experimentos de crescimento independentes de SUC-101.

Figura 20: Níveis de ácido succínico em cepas SUC-103 (O, adh1/2 e mutante de deleção gpd1; controle de vetores vazios), SUC-201 (□, adh1/2 e mutante de deleção gpd1; PCKa, MDH3, FUMR, FRDg) e SUC-200 (■, adh1/2 e mutante de deleção gpd1; PCKa, MDH3, FUMR, FRDg, SpMAE1). Todos os genes superexpressos eram pares de códon otimizados para a expressão em S. cerevisiae.

Figura 21: Mapa de plasmídeo de pGBS426PYC-2, contendo piruvato carboxilase de Saccharomyces cervisiae para expressão em Saccharomyces cervisiae. A sequência de nucleotídeo de codificação PYC2 foi obtida por PCR usando DNA genômico da cepa CEN.PK113-5D como molde e o produto de PCR foi clonado no vetor de expressão p426GPD.

Figura 22: Mapa de plasmídeo de pGBS414FRE-1, codificando fumarato redutase glicossomal (FRDg) de Trypanosoma brucei para a expressão em Saccharomyces cerevisiae. A construção de gene sintética de TDH3 promotor-FRDg-TDH3 terminador foi clonada em vetor de expressão pRS414.

Figura 23: Os níveis de ácido succínico nas cepas SUC- 226 (□, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), -227 (▲, PYC2, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-228 (■, PYC2, MDH3, FUMR, FRDg) e SUC-230 (O, MDH3, FUMR, FRDg). Os dados representam a média de 3 experimentos de crescimento independentes.

EXEMPLOS Exemplo 1

Clonagem de redutases de fumarato de Trypanosoma brucei em Aspergillus niger 1.1. Construções de expressão Fumarato redutase mitocondrial m1 (FRDm1) [E.C. 1.3.1.6], número de acesso GenBank 60460035, de Trypanosoma brucei foi analisada para a presença de sequências de sinal usando SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. e col. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 e TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O e col. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. Uma sequência alvo mitocondrial putativa na metade N-terminal da proteína foi identificada, incluindo um possível local de clivagem entre a posição 25 e 26 (D-S).

Mostrou-se que a proteína recombinante FRDm1 faltando os 68 resíduos N-terminais, relocalizados ao citosol dos tripanossomos pró-cíclicos (Coustou e col., J. Biol. Chem. abril de 2005 29;280(17):16559-70). Estes resultados indicam que a porção de sinal N-terminal prevista de FRDm1 é exigida para atacar a mitocôndria. Os primeiros 68 aminoácidos foram removidos da Id. de Seq. N°: 1 (correspondendo à sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 2) e um novo aminoácido de metionina foi reintroduzido, que resultou na Id. de Seq. N°: 3. A Id. de Seq. N°: 3 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para A. niger. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 7 foi colocada atrás da sequência de promotor GPDA constitutiva de Id. de Seq. N°: 11, em que as últimas 10 sequências de nucleotídeo foram substituídas com sequência Kozak ótima CACCGTAAA. Os locais de restrição convenientes foram adicionados. O códon de parada TAA na Id. de Seq. N°: 7 foi modificado para TAAA. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). O fragmento era SnaBI, SfiI clonado no vetor de expressão de A. niger pGBTOP11 (Figura 1) usando locais de restrição apropriados. O plasmídeo resultante compreendendo FRDm1 foi nomeado pGBTOPAn1 (Figura 5).

Do mesmo modo, fumarato redutase glicossomal (FRDg) [E.C. 1.3.1.6], número de acesso GenBank 23928422, de Trypanosoma brucei foi analisada para atacar peroxissomal em fungos filamentoso usando o preditor PTS1 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1preditor.jsp com a função de predição fungo específica. Os aminoácidos C-terminais na posição 1140-1142 (SKI) foram removidos da proteína de Id. de Seq. N°: 4 (correspondendo à sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 5), resultando na Id. de Seq. N°: 6. A Id. de Seq. N°: 6, foi submetida ao método de par de códons como divulgado em PCT/EP2007/05594 para A. niger. O códon de parada TAA na Id. de Seq. N°: 8 foi modificado para TAAA. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 8 foi colocada atrás da sequência promotora GPDA constitutiva de Id. de Seq. N°: 11, e locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). O fragmento era SnaBI, SfiI clonado no vetor de expressão de A. niger pGBTOP11 (Figura 1) usando locais de restrição apropriados.

1.2. Transformação de A. niger A. niger WT-1: Esta cepa de A. niger é CBS513.88 compreendendo deleções dos genes codificando glucoamilase (glaA), amilase fúngica e amilase de ácido. A. niger WT1 foi construído usando a abordagem de “MARKER-GENE FREE” como descrito na EP 0 635 574 B1.

As construções de expressão são co-transformadas para a cepa de A. niger WT-1 de acordo com o método descrito por Tilburn, J. e col. (1983) Gene 26, 205-221 e Kelly J. & Hynes, M. (1985) EMBO J. 4, 475-479 com as seguintes modificações: - Os esporos são germinados e cultivados por 16 horas em 30°C em um frasco de agitação colocado em um agitador rotatório em 300 rpm no meio mínimo de Aspergillus (100ml).

O meio mínimo de Aspergillus contém por litro: 6 g NaNO3, 0,52 g KCl, 1,52 g KH2PO4, 1,12 ml KOH 4 M, 0,52 g MgSO4.7H2O, 10 g de glicose, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnSO4^7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeSO4^7H2O, 1,7 mg de CoCl2^6H2O, 1,6 mg de CuSO4^5H2O, 5 mg de MnCl2.2H2O, 1,5 mg de Na2MoO4.2H2O, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCL, 0,2 mg de ácido pantotênico, 4 g de biotina, 10 ml de solução de Penicilina (5000 IU/ml) Estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco). - Novozym 234™ (Novo Industries) em vez de helicase é usado para a preparação de protoplastos; - Após a formação de protoplasto (60-90 minutos), tampão de KCL (KCL 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) é adicionado a um volume final de 45 ml, a suspensão de protoplasto é centrifugada por 10 minutos em 3000 rpm em 4°C em um rotor de cuba oscilante. Os protoplastos são ressuspensos em 20 ml de tampão KC e subsequentemente 25 ml de tampão de STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é adicionado. A suspensão de protoplasto é centrifugada por 10 minutos em 3000 rpm em 4°C em um rotor de cuba oscilante, lavada no STC-tampão e ressuspensa em tampão STC em uma concentração de 10E8 protoplastos/ml; - A 200 microlitros da suspensão de protoplasto, o fragmento de DNA, dissolvido 10 microlitros de tampão TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) e 100 microlitros de solução PEG (20% de PEG 4000 (Merck), sorbitol 0,8 M, Tris- HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é adicionado; - Após a incubação da suspensão de DNA-protoplasto por 10 minutos em temperatura ambiente, 1,5 ml de solução PEG (60% de PEG 4000 (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) é lentamente adicionada, com mistura repetida dos tubos. Após incubação por 20 minutos em temperatura ambiente, as suspensões são diluídas com 5 ml de sorbitol 1,2 M, misturadas por inversão e centrifugadas por 10 minutos em 4000 rpm em temperatura ambiente. Os protoplastos são ressuspensos delicadamente em 1 ml de sorbitol 1,2 M e colocados em placas em meio de regeneração seletivo sólido consistindo em meio mínimo de Aspergillus sem riboflavina, tiamina.HCL, nicotinamida, piridoxina, ácido pantotênico, biotina, casaminoácidos e glicose. No caso de seleção de acetamida o meio contém acetamida 10 mM como a única fonte de nitrogênio e sacarose 1 M como osmoticum e C-fonte. Alternativamente, os protoplastos são colocados em placas em PDA (ágar de dextrose de batata, Oxoid) suplementados com 1-50 mg/ml de fleomicina e sacarose 1 M como osmosticum. As placas de regeneração são solidificadas usando 2% de ágar (ágar N°.1, Oxoid L11). Após incubação por 6-10 dias em 30°C, os conidioesporos de transformantes são transferidos às placas consistindo de meio seletivo de Aspergillus (meio mínimo contendo acetamida como a única fonte de nitrogênio no caso da seleção de acetamida ou PDA suplementado com 1-50 mg/ml de fleomicina no caso de seleção de fleomicina) com 2 % de glicose e 1,5 % de agarose (Invitrogen) e incubados por 5-10 dias em 30°C. Os únicos transformantes são isolados e esta etapa de purificação seletiva é repetida uma vez sob os quais os transformantes purificados são armazenados.

1.3 . Crescimento de frasco de agitação de A. niger No total 10 transformantes são selecionados para cada construção e a presença da construção é confirmada por PCR usando primers específicas para as construções. Subsequentemente os esporos são inoculados no 100 ml de meio enriquecido mínimo de Aspergillus compreendendo 100 g/l de glicose. As cepas são crescidas em uma incubadora em 250 rotações por minuto por quatro dias em 34°C. O sobrenadante do meio de cultura é analisado para formação de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico por HPLC e comparado a uma cepa não transformada.

1.4 Análise de HPLC HPLC é realizada para a determinação de ácidos orgânicos e açúcares em tipos diferentes de amostras. O princípio da separação em uma coluna de Phenomenex Rezex- RHM-Monossacarídeo é baseado na exclusão de tamanho, exclusão de íon e troca iônica usando mecanismos de fase reversa. A detecção ocorre por índice refrativo diferencial e detectores ultravioletas.

Exemplo 2A

Clonagem de redutases de fumarato de Trypanosoma brucei em Saccharomyces cervisiae 2A.1. Construções de expressão Fumarato redutase mitocondrial m1 (FRDm1) [E.C. 1.3.1.6], número de acesso GenBank 60460035, de Trypanosoma brucei foi analisada para a presença de sequências de sinal e códon otimizado como descrito na seção 1.1 para expressão em S. cerevisiae. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 9 foi colocada atrás da sequência promotora TDH3 constitutiva de Id. de Seq. N°: 12 e antes da sequência terminadora TDH3 de Id. de Seq. N°: 13, e os locais de restrição convenientes foram adicionados. O códon de parada

TGA na Id. de Seq. N°: 9 foi modificado para TAAG. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). A construção de expressão pGBS414SUS-07 foi criada após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamHI/NotI consistindo na construção de gene sintética de fumarato redutase (Figura 2). A mistura de ligação é usada para a transformação de E. coli DH10B (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414SUS-07 (Figura 2).

Do mesmo modo, fumarato redutase glicossomal (FRDg) [E.C. 1.3.1.6], número de acesso GenBank 23928422, de Trypanosoma brucei foi analisada para ataque peroxissomal e otimização de códon foi aplicada como descrita na seção 1.1 para expressão em S. cerevisiae. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 10 foi colocada atrás da sequência promotora TDH3 constitutiva Id. de Seq. N°: 12 e antes da sequência terminadora TDH3 de Id. de Seq. N°: 13, e locais de restrição convenientes foram adicionados. O códon de parada TGA na Id. de Seq. N°: 10 foi modificado para TAAG. A sequência resultante foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). A construção de expressão pGBS414SUS- 08 foi criada após uma restrição BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fumarato redutase (Figura 3). A mistura de ligação é usada para a transformação de E. coli DH10B (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414SUS-08 (Figura 3).

As construções pGBS414SUS-07 e pGBS414SUS-08 são independentemente transformadas em cepas de S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), RWB066 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox) e RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox). As misturas de transformação são colocadas em placas na base de nitrogênio de levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose suplementadas com aminoácidos apropriados. OS transformantes são inoculados em meio de Verduyn compreendendo glicose suplementada com aminoácidos apropriados (Verduyn e col., 1992, Yeast. Julho; 8(7):501- 17) e crescido sob condições aeróbicas, anaeróbicas e limitadas de oxigênio em frascos de agitação. O meio para cultivo anaeróbico é suplementado com 0,01 g/l de ergosterol e 0,42 g/l de Tween 80 dissolvido em etanol (Andreasen e Stier, 1953, J. Cell Physiol, 41, 23-36; Andreasen e Stier, 1954, J. Cell Physiol, 43:271-281). Todas as culturas de levedura são crescidas em 30°C em uma incubadora de agitação em 250-280 rpm. Em tempos de incubação diferentes, as alíquotas das culturas são removidas, centrifugadas e o meio é analisado por HPLC para formação de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico como descrito na seção 1.4.

Exemplo 2B

Clonagem de redutases de fumarato de Trypanosoma brucei em Saccharomyces cervisiae 2B.1. Construções de expressão Em uma maneira similar como divulgado no Exemplo 2A.1 a fumarato redutase mitocondrial de Trypanosoma brucei (FRDm, Id. de Seq. N°: 9) foi ligada em um vetor de expressão de S. cerevisiae pRS416 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27). A mistura de ligação foi usada para transformação de células de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando nas construções de expressão de levedura e pGBS416FRD-1 (Figura 7). Do mesmo modo, fumarato redutase glicossomal (FRDg, Id. de Seq. N°: 10) de Trypanosoma brucei foi ligada em um vetor de expressão de S. cerevisiae pRS416. A mistura de ligação foi usada para a transformação de células de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS416FRE-1 (Figura 8).

2B.2. Experimentos de crescimento de transformação e microplacas de título (MTP) As construções pGBS416FRD-1 e pGBS416FRE-1 foram independentemente transformadas na cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATA ura3-52). Como vetor vazio de controle negativo pRS416 foi transformado na cepa CEN.PK 113-5D. As misturas de transformação foram colocadas em placas na base de nitrogênio de levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose. Os seguintes números de transformantes individuais foram inoculados in duplo no meio de Verduyn de 250 ml compreendendo 2% de glicose em 96 poços profundos de MTP’s e pré-cultivados em 30°C, em 550 rpm, e uma umidade de 80% em um incubadora de agitação Infors Microplate: transformantes de controle de vetor vazios 12 pGBS416FRD-1 (FRDm1), 12 pGBS416FRE-1 (FRDg) e 24 pRS416. Após 3 dias, 25 ml da pré-cultura presente nos poços das placas de MTP foram transferidos aos novos 96 poços profundos de MTP contendo meio de Verduyn contendo glicose e CaCO3 (concentrações finais: 10% de glicose, CaCO3 1% de peso/vol em um volume total de 250 ml). Após 3 e 7 dias de crescimento em 30°C, 550 rpm, e em uma umidade de 80% em uma incubadora de agitação de Infors Microplate, os MTPs foram centrifugados por 2 minutos em 2000 rpm, e 200 microlitros de sobrenadante foram colhidos usando Multimek 96 (Beckman). O sobrenadante foi analisado por HPLC como descrito no Exemplo 1.4 para a presença de ácido succínico. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Efeito de introdução de redutase de fumarato mitocondrial (FRDm1) e glicossomal (FRDg) de T. brucei em S. cerevisiae nos níveis de produção de ácido succínico após 3 e 7 dias de incubação:

Os resultados na Tabela 1 mostram que a introdução e superexpressão redutase mitocondrial de fumarato (FRDm1) de T. brucei resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados (2,47 vezes, p=6,96E-14, teste t de Student, após uma incubação de 3 dias e 1,97 vezes, p=8.63E-14, teste t de Student após uma incubação de 7 dias).

Do mesmo modo, introdução e superexpressão de fumarato redutase glicossomal (FRDg) de T. brucei resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados (3,55 vezes, p=5.08E-32, teste t de Student, após uma incubação de 3 dias e um aumento de 2,55 vezes, p=8.63E- 25, teste t de Student após uma incubação de 7 dias).

Exemplo 2C Expressão de PEP carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes ou Mannheimia succiniciproducens e malato desidrogenase de Saccharomyces cervisiae e fumarase de Rhizopus oryzae e fumarato redutase de Trypanosoma brucei em Saccharomyces cervisiae

2C.1 Sequências de gene Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase: Fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49], número de acesso de GenBank 152977907, de Actinobacillus succinogenes foi analisada para a presença de sequências de sinal usando SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. e col. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 e TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. e col. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. A análise como descrita por Schluter e col., (2007) NAR, 35, D815-D822 revelou uma sequência de sinal PTS2 putativa na posição 115-123. A sequência de A. succinogenes foi modificada para se assemelhar sequência de proteína Mannheimia succiniciproducens substituindo os aminoácidos EGY na posição 120-122 com DAF resultando na sequência de aminoácido de Id. de Seq. N°: 14 (sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 15). A Id. de Seq. N°: 14 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. O códon de parada TAA na sequência de nucleotídeo resultante de Id. de Seq. N°: 16 foi modificado para TAAG. Esta Id. de Seq. N°:16 contendo o códon de parada TAAG foi colocada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva de Id. de Seq. N°: 25 e antes da sequência terminadora TDH1 de Id. de Seq. N°: 26, e os locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 29 foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha).

Do mesmo modo, fosfoenolpiruvato carbóxiquinase [E.C. 4.1.1.49], número de acesso GenBank 52426348, de Mannheimia succiniciproducens foi analisada para a presença de sequências de sinal como descrita em Schluter e col., (2007) NAR, 35, D815-D822. A sequência como mostrada na Id. de Seq. N°: 17 não exigiu nenhuma modificação. A Id. de Seq. N°: 17 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. O códon de parada TAA na sequência resultante de Id. de Seq. N°: 18 foi modificado para TAAG. A Id. de Seq. N°: 18 contendo o códon de parada TAAG foi colocada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva de Id. de Seq. N°: 25 e antes da sequência terminadora TDH1 de Id. de Seq. N°: 26. Os locais de restrição convenientes foram adicionados. A construção sintética resultante (Id. de Seq. N°: 30) foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha).

Malato desidrogenase

A malato desidrogenase citoplásmica (Mdh2p) [E.C. 1.1.1.37], número de acesso GenBank 171915, é regulada por repressão de catabólito de carbono: a transcrição de MDH2 é reprimida e Mdh2p é degradada sob adição de glicose às células sem glicose. Mdh2p deletada para os 12 aminoácidos amino-terminais é menos suscetível para a degradação induzida por glicose (Minard e McAlister-Henn, J. Biol. Chem. agosto 1992 25;267(24):17458-64). Para evitar degradação induzida por glicose de Mdh2, os nucleotídeos codificando os primeiros 12 aminoácidos foram removidos, e um novo aminoácido de metionina foi introduzido (Id. de Seq. N°: 19) para a superexpressão de Mdh2 em S. cerevisiae. A Id. de Seq. N°: 19 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. O códon de parada TAA na Id. de Seq. N°: 20 resultante, foi modificado para TAAG. A Id. de Seq. N°: 20 contendo um códon de parada modificado TAAG, codificando delta12NMDH2, foi colocado atrás da sequência promotora TDH3 constitutiva de Id. de Seq. N°: 12 e antes da sequência terminadora TDH3 de Id. de Seq. N°: 13, e os locais de restrição convenientes foram adicionados. A construção sintética resultante (Id. de Seq. N°: 31) foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha).

Malato desidrogenase peroxissomal (Mdh3p) [E.C. 1.1.1.37], número de acesso GenBank 1431095, foi analisada para o ataque peroxissomal em fungos filamentosos usando preditor PTS1 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/ PTS1preditor.jsp com a função de predição fungo específica. Os aminoácidos C-terminais na posição 341-343 (SKL) foram removidos da proteína MDH3 resultando na Id. de Seq. N°: 21. A Id. de Seq. N°: 21 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae. O códon de parada TGA na sequência resultante de Id. de Seq. N°: 22 foi modificado para TAAG. A Id. de Seq. N°: 22 contendo TAAG como códon de parada foi sintetizada atrás da sequência promotora TDH3 constitutiva de Id. de Seq. N°: 27 (600 pb a montante do códon de começo) e antes da sequência terminadora TDH3 de Id. de Seq. N°: 28 (300 pb a jusante do códon de parada), e os locais de restrição convenientes foram adicionados. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 32 foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). Fumarase: Fumarase [E.C. 4.2.1.2], número de acesso GenBank 469103, de Rhizopus oryzae (FumR) foi analisado para a presença de sequências de sinal usando SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. e col. (2004) Mol. Biol., 340:783-795 e TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. e col. (2007) Nature Protocols, 953-971. Uma sequência de ataque mitocondrial putativa nos 23 primeiros aminoácidos da proteína foi identificada. Para evitar ataque potencial às mitocôndria em S. cerevisiae, os primeiros 23 aminoácidos foram removidos de FumR e um aminoácido de metionina foi reintroduzido resultando em Id. de Seq. N°: 23. A Id. de Seq. N°: 23 foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae resultando na Id. de Seq. N°: 24. O códon de parada TAA na Id. de Seq. N°: 24 foi modificado para TAAG. A Id. de Seq. N°: 24 contendo TAAG como o códon de parada foi sintetizada atrás da sequência promotora TDH1 constitutiva de Id. de Seq. N°: 25 e antes da sequência terminadora TDH1 de Id. de Seq. N°: 26 e locais de restrição convenientes foram adicionados. A construção sintética resultante Id. de Seq. N°: 33 foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha).

Fumarato redutase: As sequências de gene de fumarato redutase mitocondrial (FRDm1) e fumarato redutase glicossomal (FRDg) de T. brucei foram projetadas e sintetizadas como descrito sob 2A.1. 2C.2. Construção de construções de expressão

As construções de expressão pGBS414PPK-1 (Figura 9), pGBS414PPK-2 (Figura 10) e pGBS414PPK-3 (Figura 11) foram criadas após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamHI/NotI consistindo em fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (origem Actinobacillus succinogenes) construção de gene sintética (Id. de Seq. N°: 29). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PPK-1. Subsequentemente, pGBK414PPK-1 foi restringido com AscI e NotI. Para criar pGBS414PPK-2, um fragmento de restrição AscI/NotI consistindo no fumarato redutase mitocondrial da construção de gene sintética de T. brucei (FRDm1) (Id. de Seq. N°: 34) foi ligada no vetor pGBS414PPK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PPK-2 (Figura 10). Para criar pGBS414PPK-3, um fragmento de restrição de AscI/NotI consistindo de fumarato redutase glicossomal de construção de gene sintética de T. brucei (FRDg) (Id. de Seq. N°: 35) foi ligada no vetor pGBS414PPK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando em a construção de expressão de levedura pGBS414PPK-3 (Figura 11).

As construções de expressão pGBS414PEK-1 (Figura 12), pGBS414PEK-2 (Figura 25 13) e pGBS414PEK-3 (Figura 14) foram criadas após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1): 19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamHI/NotI consistindo de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (origem Mannheimia succiniciproducens) construção de gene sintética (Id. de Seq. N°: 30). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PEK-1. Subsequentemente, pGBK414PEK-1 foi restringida com AscI e NotI. Para criar pGBS414PEK-2, um fragmento de restrição de AscI/NotI de fumarato redutase mitocondrial de construção de gene sintética de T. brucei (FRDm1) (Id. de Seq. N°: 34) foi ligada no vetor pGBS414PEK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PEK-2 (Figura 13). Para criar pGBS414PEK-3, um fragmento de restrição de AscI/NotI consistindo de fumarato redutase glicossomal da construção de gene sintética de T. brucei (FRDg) (Id. de Seq. N°: 35) foi ligado no vetor pGBS414PEK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PEK-3 (Figura 14).

A construção de expressão pGBS415FUM-2 (Figura 15) e pGBS415FUM-3 (Figura 16) foi criada após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS415 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1): 19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fumarase (origem Rhizopus oryzae) (Id. de Seq. N°: 33). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS415FUM-1. Subsequentemente, pGBK415FUM-1 era restringido com AscI e NotI. Para criar pGBS415FUM-2, um fragmento de restrição AscI/NotI consistindo de malato desidrogenase citoplásmica de construção de gene sintética S. cerevisiae (delta12N MDH2) (Id. de Seq. N°: 31) foi ligado no vetor pGBS415FUM-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS415FUM-2 (Figura 15). Para criar pGBS415FUM-3, fragmento de restrição de AscI/NotI consistindo de malato desidrogenase peroxissomal da construção de gene sintética S. cerevisiae (MDH3) (Id. de Seq. N°: 32) foi ligado no vetor pGBS415FUM-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS415FUM-3 (Figura 16).

2C.3. Cepas S. cerevisiae Combinações diferentes de plasmídeo pGBS414PPK-1, pGBS414 PPK-2, pGBS414PPK-3, pGBS414PEK-1, pGBS414PEK-2, pGBS414PEK-3, pGBS415FUM-2, pGBS415-FUM-3 foram transformadas na cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), resultando nas cepas de levedura descritas na Tabela 2. Além dos plasmídeos mencionados, pRS416 (vetor vazio) foi transformado para criar cepas de levedura prototróficas. Os vetores de expressão foram transformados na levedura por eletroporação. As misturas de transformação foram colocadas em placas na base de nitrogênio de levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose. 5 Tabela 2: Cepas de levedura construídas pelo Exemplo 2C.

2C.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico Os transformantes foram inoculados em 20 ml de meio de pré-cultura consistindo de meio Verduyn (Verduyn e col., 1992, Yeast. Julho; 8(7):501-17) compreendendo 2% de galactose (peso/vol) e crescido sob condições aeróbicas em frascos de agitação de 100 ml em uma incubadora de agitação em 30°C em 250 rpm. Após 72 horas, a cultura foi centrifugada por 5 minutos em 4750 rpm. 1 ml de sobrenadante foi usado para medir níveis de ácido succínico por HPLC como descrito na seção 1.4. O sobrenadante restante foi decantado e os grânulos (células) foram ressuspensos em 1 ml de meio de produção. O meio de produção consistiu de meio Verduyn com 10% de galactose (peso/vol) e 1% de CaCO3 (peso/vol). As células ressuspensas foram inoculadas no meio de produção de 50 ml em frascos de agitação de 100 ml e crescidas em uma incubadora de agitação em 30°C em 100 rpm. Em vários pontos de tempo, 1 ml de amostra foi tomada dos níveis de ácido succínico de cultura foi medido por HPLC como descritos na seção 1.4 (Figura 17).

As cepas transformadas com vetores vazios (cepa de controle) produziram até 0,3 g/l de ácido succínico. A superexpressão de PEP carbóxiquinase de M. succiniciproducens (PCKm), malato desidrogenase peroxissomal (MDH3) de S. cerevisiae e fumarase de R. oryzae (FUMR) resultaram na produção de 0,9 g/l de produção de ácido succínico. A superexpressão de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa), MDH3 e FUMR resultaram em um aumento ligeiro na produção de ácido succínico para 1,0 g/l.

Estes resultados mostram que em S. cerevisiae como descrito a produção de ácido succínico aumentou aproximadamente 3 vezes. A superexpressão adicional de fumarato redutase mitocondrial (FRDm1) de T. brucei adicionalmente aumentou os níveis de produção de ácido succínico; a superexpressão de PCKa, MDH3, FUMR, FRDm1 resultou na produção de 2,6 g/l de ácido succínico, e superexpressão de PCKm, MDH3, FUMR e FRDm1 resultou na produção de 2,7 g/l de ácido succínico. A superexpressão de delta12NMDH2 em combinação com PCKm, FUMR e FRDm1 resultou na produção de 2,7 g/l de ácido succínico, indicando que níveis similares de ácido succínico foram produzidos usando MDH2 ou MDH3 truncado. A superexpressão adicional de fumarato redutase glicossomal (FRDg) de T. brucei resultou em um aumento mais elevado em níveis de produção de ácido succínico; a superexpressão de PCKa, MDH3, FUMR e FRDg resultou na produção de 3,9 g/l de ácido succínico, visto que a superexpressão de PCKm, MDH3, FUMR e FRDg resultou em ligeiramente menor produção de 3,6 g/l de ácido succínico.

Os resultados mostram a adição de fumarato redutase dependente de NAD(H) como divulgado aqui em um S. cerevisiae compreendendo uma modificação genética de PCKa/m, MDH3 e FUMR significativamente aumentaram níveis de produção de ácido succínico. A superexpressão de FRDg teve um efeito mais positivo em níveis de produção de ácido succínico em S. cerevisiae comparados à superexpressão de FRDm1 em S. cerevisiae.

Exemplo 2D Efeito de superexpressão de um transportador de ácido dicarboxílico na produção de ácido succínico em células de S. cerevisiae produtoras de ácido succínico

2D.1. Sequências de gene Malato permease, número de acesso GenBank 119368831, de Schizosaccharomyces pombe (Id. de Seq. N°: 36) foi submetida ao método de par de códons como divulgado em WO2008/000632 para S. cerevisiae resultando na Id. de Seq. N°: 37. O códon de parada TAA na Id. de Seq. N°: 37 foi modificado para TAAG. A Id. de Seq. N°: 37 contendo TAAG como o códon de parada foi colocado atrás da sequência promotora ENO1 constitutiva de Id. de Seq. N°: 38 e antes da sequência terminadora ENO1 de Id. de Seq. N°: 39, e locais de restrição convenientes foram adicionados. No promotor ENO1, T na posição 596 (-5) foi mudado para A a fim de obter uma melhor sequência Kozak. A sequência resultante de Id. de Seq. N°: 40 foi sintetizada em Sloning (Puchheim, Alemanha). 2D.2. Construção de construções de expressão

As construções de expressão pGBS416MAE-1 (Figura 18) foram criadas após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS416 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamHI/NotI consistindo na construção de gene sintética de transportador de malato de Schizosaccharomyces pombe (Id. de Seq. N°: 40). A mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS416MAE-1. 2D.3. Cepas de S. cerevisiae Os plasmídeos pGBS414PEK-2, pGBS415FUM-2 e pGBS416MAE- 1 (descritos sob 2C.2.) foram transformados na cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) para criar a cepa SUC-194, superexpressando PCKm, delta12NMDH2, FUMR, FRDm1 e SpMAE1. Todos os genes eram pares de códon otimizados para a expressão em S. cerevisiae.

Os vetores de expressão foram transformados em levedura por eletroporação. As misturas de transformação foram colocadas em placas na base de nitrogênio de levedura (YNB) sem AA (Difco) + 2% de glicose. As cepas SUC-101 são descritas na tabela 2. Tabela 3: Cepas de levedura construídas para o Exemplo 2D.

2D.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico em cepas CEN.PK do tipo selvagem Os parâmetros de crescimento e análise de amostra foram realizados como descrito sob o Exemplo 2C.4 com as seguintes modificações: a pré-cultura foi realizada usando 2% de glicose (peso/vol) como fonte de carbono. No meio de produção 10% de glicose (peso/vol) foi usada como fonte de carbono.

As cepas transformadas com vetores vazios (cepa de controle) produziram até 0,3 g/l ácido succínico. A superexpressão adicional de SpMAE1 na cepa SUC-194, superexpressando PCKm, delta12NMDH2, FUMR e FRDm1 resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados a 4,6 g/l, visto que a cepa SUC-132, superexpressando PCKm, delta12NMDH2, FUMR e FRDm1 resultou na produção de 2,7 g/l de ácido succínico.

Os resultados mostram essa inserção de um transportador de malato em um S. cerevisiae compreendendo as modificações genéticas como descritas aqui adicionalmente aumentaram a produção de ácido succínico em pelo menos 1,5 vez.

Exemplo 2E Efeito de um transportador de ácido dicarboxílico em S. cerevisiae compreendendo uma deleção dos genes de álcool desidrogenase 1 e 2 (adh1, adh2) e o gene glicerol-3- fosfato desidrogenase 1 (gpd1) nos níveis de produção de ácido succínico.

2E.1. Sequências de gene Descrito sob 2D.1. 2E.2. Construção de construções de expressão Descrito sob 2D.2. 2E.3. Cepas de S. cerevisiae Plasmídeos pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 e pGBS416MAE-1 (descritos sob 2C.2.) foram transformados na cepa de S. cerevisiae RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox) para criar a cepa SUC-201, superexpressando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg e SpMAE1. Todos os genes eram pares de códon otimizados para a expressão em S. cerevisiae. Tabela 4: Cepas de levedura construídas para o Exemplo 2E.

2E.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico em cepas de CEN.PK deletadas para os genes álcool desidrogenase 1 e 2 (adh1, adh2) e o gene glicerol-3- fosfato desidrogenase 1 (gpd1).

Os parâmetros de crescimento e a análise de amostra foram realizados como descrito abaixo sob o Exemplo 2C.4 com as seguintes modificações: a pré-cultura foi realizada usando 2% de galactose (peso/vol) como fonte de carbono. 5% de Galactose (peso/vol) foram adicionados para o meio de produção em t=0, 3 e 7 dias. A cepa SUC-103 transformada com vetores vazios (cepa de controle) produziu 0,9 g/l de ácido succínico após o crescimento por 10 dias no meio de produção (Figura 20). A superexpressão de PCKa, MDH3, FUMR e FRDg na cepa RWB064 resultou em níveis de produção de ácido succínico aumentados a 2,5 g/l (cepa SUC-201, Figura 20). A superexpressão adicional de SpMAE1 além de PCKa, MDH3, FUMR e FRDg na cepa RWB064 resultou em um aumento adicional dos níveis de produção de ácido succínico para 11,9 g/l (cepa SUC-200, Figura 20).

Os resultados mostram que a superexpressão de um transportador de malato em S. cerevisiea compreendendo uma deleção de genes de álcool desidrogenase e glicerol-3- fosfato desidrogenase resultou em um aumento significativo em níveis de produção de ácido succínico. Além disso, foi mostrado que a deleção do gene adh1, adh2 e gpd1 (SUC 103) resultou em níveis aumentados de produção de ácido succínico como compara a uma cepa tipo selvagem (SUC 101, Tabela 2).

Exemplo 2F

Clonagem de fosfoenolpiruvato carbóxiquinase de Actinobacillus succinogenes, piruvato carboxilase de Saccharomyces cervisiae, malato desidrogenase de Saccharomyces cervisiae, fumarase de Rhizopus oryzae em Saccharomyces cervisiae e fumarato redutase de Trypanosoma brucei. 2F.1. Sequências de gene As sequências de gene de PEP carbóxiquinase de A. succinogenes, malato desidrogenase de S. cerevisiae, fumarase de R. oryzae e fumarato redutase de T. brucei são descritas sob 2F.1. A piruvato carboxilase citoplásmica de Saccharomyces cervisiae (Pyc2p) [E.C. 6.4.1.1.], número de acesso GenBank 1041734, Id. de Seq. N°: 41, é codificada pela sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 42. DNA genômico de cepa S. cerevisiae CEN.PK113-5D (MATA ura3-52) foi usada como molde para amplificar a sequência de codificação PYC2 (Id. de Seq. N°: 42), usando primers P1 (Id. de Seq. N°: 43) e P2 (Id. de Seq. N°: 44), e a polimerase de Phusion DNA (Finnzymes, Finlandia) de acordo com as instruções do fabricante. Os locais de restrição convenientes foram incluídos nos primers para finalidades de clonagem adicionais. 2F.2. Construção de construções de expressão A construção de expressão pGBS426PYC-2 (Figura 21) foi criada após uma restrição SpeI/XhoI do vetor de expressão de S. cerevisiae p426GPD (Mumberg e col, Gene. abril 1995 14; 156 (1): 119-22) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição SpeI/XhoI consistindo da sequência de nucleotídeo PYC2 amplificada (Id. de Seq. N°: 42). A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS426PYC-2 (Figura 21). A construção de vetores de expressão pGBS414PPK-3 e pGBS415FUM-3 é descrita sob 2C.2. A construção de expressão pGBS414FRE-1 foi criada após uma restrição de BamHI/NotI do vetor de expressão de S. cerevisiae pRS414 (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamHI/NotI consistindo da construção de gene sintética de fumarato redutase glicossomal (origem Trypanosoma brucei) (Id. de Seq. N°: 35). A mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414FRE-1 (Figura 22). 2F.3. Cepas S. cerevisiae

As cepas SUC-226, SUC-227, SUC-228 e SUC-230 foram obtidas por transformação de combinações diferentes dos 5 plasmídeo pGBS414FRE-1, pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-1, pGBS426PYC-2 e p426GPD na cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), como descrito na Tabela 5. Tabela 5: Cepas de levedura construídas pelo Exemplo 2F.

2F.4. Experimentos de crescimento e produção de ácido succínico

Os parâmetros de crescimento e análise de amostra foram realizados como descrito sob o Exemplo 2C.4 com as seguintes modificações: a pré-cultura foi realizada usando 2% de glicose (peso/vol) como fonte de carbono. No meio de produção 10% de glicose (peso/vol) foram usados como fonte de carbono.

Como descrito na figura 23, a cepa SUC-230, superexpressando MDH3, FUMR e FRDg, produzida até 3,0 g/l de ácido succínico. A superexpressão adicional de PCKa aumentou a produção de ácido succínico até 3,4 g/l (cepa SUC-226), e superexpressão adicional de produção de ácido succínico aumentada PYC2 até 3,7 g/l (cepa SUC-228). Surpreendentemente, a superexpressão de ambas PCKa e PYC2 (SUC-227) resultou em 1,5 aumento de níveis de produção de ácido succínico até 5,0 g/l, em comparação ao efeito de PCK e PYC sozinho. Estes resultados mostram um efeito sinergístico de superexpressão combinada de ambas PEP carbóxiquinase de A. succinogenes (PCKa) e piruvato carboxilase de S. cerevisiae (PYC2) em níveis de produção de ácido succínico em S. cerevisiae.

Exemplo 3

Inativação de genes de codificação de succinato desidrogenase em Aspergillus niger

3.1. Identificação O DNA genômico da cepa de Aspergillus niger CBS513.88 foi sequenciado e analisado. Dois genes com proteínas traduzidas anotadas como homólogos às proteínas de succinato desidrogenase foram identificados e nomeados sdhA e sdhB respectivamente. As sequências dos loci sdhA (An16g07150) e sdhB (An02g12770) estão disponíveis no genbank com números de acesso 145253004 e 145234071 respectivamente. Os vetores de substituição de gene para sdhA e sdhB foram projetados de acordo com princípios conhecidos e construídos de acordo com procedimentos de clonagem rotineiros (veja a Figura 6). Os vetores compreendem as regiões de flanquemento de aproximadamente 1000 pb da sdh ORFs para recombinação homóloga em loci genômicos predestinados. Além disso, contêm o marcador de seleção de amdS bidirecional de A. nidulans conduzido pelo promotor de gpdA, entre repetições diretas. O projeto geral destes vetores de deleção foi descrito previamente em EP635574B e WO 98/46772. 3.2. Inativação do gene de sdhA em Aspergillus niger.

O DNA linear de vetor de deleção pDEL-SDHA (Figura 4) foi isolado e usado para transformar Aspergillus niger CBS513.88 como descrito em: Biotechnology of Filamentous fungi: Technology and Products. (1992) Reed Publication (EUA); Capítulo 6: Transformation p. 113 156. Este DNA linear pode integrar no genoma no locus de sdhA, assim substituindo o gene de sdhA pelo gene de amdS como descrito na figura 6. Os transformantes foram selecionados em meios de acetamida e colônia purificada de acordo com os procedimentos padrões como descritos em EP635574B. Os esporos foram colocados em placas em meios de fluoroacetamida para selecionar cepas, que perderam o marcador amdS. As colônias crescentes foram diagnosticadas por PCR para integração no locus de sdhA e cepas candidatas testadas por análises de Southern para deleção do gene de sdhA. A deleção do gene de sdhA foi detectável pela redução de tamanho de ~2,2 kb de fragmentos de DNA (fragmento tipo selvagem de 4,6 kb versus 2,4 kb para uma deleção de sucesso de SDHA) cobrindo o locus inteiro e hibridizado para sondas apropriadas. Aproximadamente 9 cepas mostraram uma remoção do gene de sdhA genômico de uma associação de aproximadamente 96 transformantes iniciais. A cepa dSDHA foi selecionada como uma cepa representativa com o gene de sdhA inativado. A produção de ácido succínico de dSDHA foi determinada em microplacas de título como descrita no Exemplo 4.

Exemplo 4

Clonagem de FRDm de Trypanosoma brucei em dSDHA de Aspergillus niger A cepa dSDHA de A. niger de exemplo 3.2. foi transformada com a construção de expressão pGBTOPAn1 (Figura 5) compreendendo redutase fumarato mitocondrial m1 truncada (FRDm1, Id. de Seq. N°: 7) como descrita no Exemplo 1.1. O DNA de E. coli foi removido pela digestão de NotI. Os transformantes de A. niger foram escolhidos usando Qpix e transferidos em MTP’s contendo meios seletivos de Aspergillus. Após uma incubação de 7 dias em 30°C a biomassa foi transferida às placas de microtítulo (MTP’s) contendo PDA à mão ou máquina escolhedora. Após uma incubação de 7 dias em 30°C, a biomassa foi esporulada. Estes esporos foram ressuspensos usando o Multimek 96 (Beckman) no meio de Aspergillus enriquecido mínimo de 100 ml contendo 10% de glicose. Subsequentemente 2 MTP com 170 ml meio de Aspergillus enriquecido mínimo contendo 10% de glicose e 1% de CaCO3 foram inoculados com 30 ml da suspensão de esporo. Do mesmo modo, as cepas de A. niger dSDHA e CBS513.88 foram inoculados em MTP’s. Estes MTP’s foram incubados por 5 dias em 34° e 80% de umidade. Após 5 dias 160 ml foram colhidos usando o Multimek 96 (Beckman) e ácido succínico foi determinado por HPLC como descrito no Exemplo 1.4. Os resultados são mostrados na Tabela 6. Tabela 6: Efeito de deleção de succinato desidrogenase (SDHA) e inserção de redutase mitocondrial de fumarato

A tabela 6 mostra claramente uma produção aumentada de ácido succínico por A. niger que compreende fumarato 5 redutase mitocondrial de T. brucei.

Claims (13)

1. Célula eucariótica recombinante selecionada do grupo consistindo em uma levedura e um fungo filamentoso caracterizada por compreender uma sequência de nucleotídeo heteróloga selecionada de Id. de Seq. N°: 7 e Id. de Seq. N°: 9 que codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) heteróloga que catalisa a conversão de ácido fumárico para ácido succínico, em que a fumarato redutase dependente de NAD(H) possui a sequência de aminoácidos da Id. de Seq. N°: 3; ou uma sequência de nucleotídeo heteróloga selecionada de Id. de Seq. N°: 8 e Id. de Seq. N°: 10 que codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) heteróloga que catalisa a conversão de ácido fumárico para ácido succínico, em que a fumarato redutase dependente de NAD(H) possui a sequência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 6, em que a fumarato redutase dependente de NAD(H) é ativa no citosol mediante a expressão da sequência de nucleotídeo codificando a fumarato redutase dependente de NAD(H).

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fumarato redutase dependente de NAD(H) é derivada de uma Trypanosoma sp.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula superexpressa uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 42 que codifica uma piruvato carboxilase de Id. de Seq. N°: 41.

4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por comprender ainda uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 15 que codifica uma fosfoenolpiruvato carbóxiquinase heteróloga de Id. de Seq. N°: 14 ou uma sequência de nucleotídeos de Id. de Seq. N°: 18 que codifica uma fosfoenolpiruvato carbóxiquinase heteróloga de Id. de Seq. N°: 17.

5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por comprender ainda uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 20 que codifica uma malato desidrogenase de Id. de Seq. N°: 19 ou uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 22 que codifica uma malato desidrogenase de Id. de Seq. N°: 21 que é ativa no citosol mediante a expressão da sequência de nucleotídeo codificando malato desidrogenase.

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por comprender ainda uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 24 que codifica uma fumarase de Id. de Seq. N°: 23 que é ativa no citosol mediante a expressão da sequência de nucleotídeo codificando a fumarase.

7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por comprender ainda uma sequência de nucleotídeo de Id. de Seq. N°: 37 que codifica um transportador de ácido dicarboxílico de Id. de Seq. N°: 36.

8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene codificando álcool desidrogenase não é funcional.

9. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene codificando glicerol-3-fosfato deshidrogenase não é funcional.

10. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene codificando succinato desidrogenase não é funcional.

11. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é um Aspergillus, preferivelmente um Aspergillus niger.

12. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 5 a 11, caracteriz ada pelo fato de que é uma Saccharomyces, preferivelmente uma Saccharomyces cerevisiae.

13. Processo para a preparação de ácido succínico caracterizado por compreender fermentar uma célula eucariótica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em um 10 meio de fermentação apropriado, em que ácido succínico é preparado.

Images