ES2655308T3 - Procedimiento de fermentación de ácido dicarboxílico - Google Patents

Procedimiento de fermentación de ácido dicarboxílico Download PDF

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ES2655308T3 ES10747024.7T ES10747024T ES2655308T3 ES 2655308 T3 ES2655308 T3 ES 2655308T3 ES 10747024 T ES10747024 T ES 10747024T ES 2655308 T3 ES2655308 T3 ES 2655308T3
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Abstract

Un procedimiento para producir un ácido dicarboxílico seleccionado del grupo que consiste en: ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, que comprende fermentar una levadura recombinante en un medio de fermentación adecuado, que comprende una concentración de dióxido de carbono que oscila entre el 25 % v/v y el 75 % v/v de gas total presente en dicho medio de fermentación, en el que la fermentación se lleva a cabo en condiciones microaerófilas y que produce dicho ácido dicarboxílico.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de fermentación de ácido dicarboxílico Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos dicarboxílicos. En particular, se refiere a la producción de ácidos dicarboxílicos por fermentación de levadura.
Antecedentes de la invención
Los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido málico y ácido succínico, son compuestos importantes que se usan en la industria alimentaria para la preparación y la conservación de los alimentos, en la industria médica para la formulación de productos médicos y para otros usos industriales, tales como monómeros para (bio)polímeros. Los ácidos dicarboxílicos pueden producirse por procedimientos petroquímicos o procedimientos a base de fermentación mediante bacterias o células fúngicas.
Las bacterias que se han estudiado para la producción mejorada de ácido succínico son, por ejemplo, E. coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp. o Corynebacteria. Una desventaja de los procedimientos de fermentación con ácido dicarboxílico bacterianos es que se requiere que esos procedimientos se lleven a cabo a alto pH y se requieren agentes neutralizantes para mantener el pH en un valor deseado. Además, los procedimientos a pH neutro requieren condiciones del procedimiento estériles, aumentando los costes de producción, además.
Al contrario que las bacterias, las células fúngicas pueden crecer a valores de pH bajos y no requieren condiciones del procedimiento estrictamente estériles, haciendo las células fúngicas una alternativa atractiva para la producción de ácidos dicarboxílicos.
En la patente internacional WO2009/065780 se desarrollaron células fúngicas recombinantes tales como levadura y hongos filamentos para la producción de ácidos dicarboxílicos, dando como resultado niveles de producción aumentados de ácido succínico y ácido fumárico.
La patente internacional WO2008/144626 muestra que la adición de dióxido de carbono de hasta niveles de producción aumentados del 10 % v/v de ácido málico y ácido succínico mediante una célula de levadura recombinante, pero mayores concentraciones de dióxido de carbono no aumentaron más los niveles de producción de ácido dicarboxílico.
A pesar de las mejoras realizadas con células fúngicas genéticamente modificadas para la producción de ácidos dicarboxílicos, hay la necesidad de producción de ácido dicarboxílico mejorada además mediante células fúngicas.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido dicarboxílico seleccionado del grupo que consiste en ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, que comprende fermentar una levadura recombinante en un medio de fermentación adecuado, que comprende una concentración de dióxido de carbono que oscila entre el 25 % y el 75 % v/v del gas total presente en el medio de fermentación, en donde la fermentación se lleva a cabo en condiciones microaerófilas, y que produce dicho ácido dicarboxílico. Sorprendentemente, se encontró que el rendimiento de ácido dicarboxílico (g/g de azúcar) en el procedimiento según la presente invención aumentó significativamente comparado con un procedimiento que comprende dióxido de carbono fuera del intervalo de concentración de la invención.
Otra ventaja del procedimiento según la invención fue que la productividad específica (g de ácido dicarboxílico/ g de azúcar/ h) también aumentó significativamente cuando se compara con un procedimiento para la producción de ácido dicarboxílico que comprende dióxido de carbono fuera del intervalo de concentración de la invención.
Definiciones
Los términos “ácido dicarboxílico” y “dicarboxilato” tales como “ácido succínico” y “succinato” tienen el mismo significado en la presente memoria y se usan de manera intercambiable, siendo el primero la forma hidrogenada del último.
El término fermentar o fermentación como se usa en la presente memoria se refiere a la producción microbiana de compuestos tales como alcoholes o ácidos a partir de carbohidratos.
Una levadura recombinante según la presente invención se define en la presente memoria como una levadura que contiene una alteración de un gen o contiene o se transforma o se modifica genéticamente con una secuencia de nucleótidos que no se encuentra en la naturaleza en la levadura o contiene copia o copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos endógena. Una levadura natural se define en la presente memoria como la levadura parental de la levadura recombinante. La alteración o supresión o eliminación de un gen significa que parte de un gen o el gen completo ha sido retirado de una célula o un gen ha sido modificado de manera que el gen no se
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transcribe en la proteína codificadora original.
El término “homólogo” cuando se usa para indicar la relación entre un determinado ácido nucleico (recombinante) (ADN o ARN), gen o molécula de polipéptido y un organismo huésped o célula huésped determinados, se entiende que significa que en la naturaleza se produce el ácido nucleico o la molécula de polipéptido mediante una célula huésped u organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa.
El término “heterólogo” cuando se usa con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína se refiere a un ácido nucleico, gen o proteína que no se encuentra en la naturaleza como parte del organismo, la célula, el genoma o la secuencia de ADN o ARN en la que está presente o que se encuentra en una célula o posición o posiciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difiere de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos, o las proteínas, heterólogos, no son endógenos para la célula en la que se introducen, pero se han obtenido a partir de otra célula o se han producido de manera sintética o de manera recombinante.
Se define identidad de secuencia en la presente memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o secuencias de dos o más ácidos nucleicos (polinucleótido), cuando se determina por comparación de las secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de secuencias se comparan por la longitud total de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” también significa al grado de relación de secuencias entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, como puede ser el caso, cuando se determina por la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias.
Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad para proporcionar la mayor correspondencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas de ordenador disponibles para el público. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, disponibles para el público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NcBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Los parámetros preferidos para comparación de secuencias de aminoácidos usando BLASTP son abertura de hueco 11.0, extensión de huecos 1, matriz Blosum 62.
Hay métodos conocidos en la técnica para sobreexpresión de genes que codifican enzimas. Un gen que codifica una enzima puede sobreexpresarse aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula, por ejemplo, integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula, expresando el gen a partir de un vector centromérico, a partir de un vector de expresión de multicopia episomal o por introducción de un vector de expresión (episomal) que comprende múltiples copias de uno o más genes. Preferiblemente, la sobreexpresión de un gen que codifica una enzima se consigue con un promotor constitutivo (fuerte).
Los promotores adecuados en células fúngicas son conocidos para el experto la materia. Los promotores adecuados pueden ser, pero nos que no están limitados a, TDH1, TDH3, GAL7, GAL10, GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PH05, ADC1, ACT1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1, AOX1, PGL, GPDA y GAPDH. Otros promotores adecuados incluyen PDC1, GPD1, PGK1 y TEF1.
Un gen que codifica una enzima puede estar ligado a una construcción de ácidos nucleicos, por ejemplo, un plásmido, tal como un plásmido de baja copia o un plásmido de alta copia. La levadura para uso en el procedimiento de la presente invención puede comprender una única copia, pero preferiblemente comprende múltiples copias de un gen, por ejemplo, mediante múltiples copias de una construcción de nucleótidos.
Una construcción de ácidos nucleicos puede mantenerse de manera episomal y así comprende una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia de replicación de manera autónoma y un centrómero (Sikorski y Hieter,1989, Genetics 122, 19-27). Una construcción de ácidos nucleicos episomal adecuada puede basarse por ejemplo en la levadura 2|j o los plásmidos pKD1 (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975) o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr. Genet. 29: 482-489). Alternativamente, cada construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en una o más copias en el genoma de la levadura. La integración en el genoma de la célula puede tener lugar al azar por recombinación no homóloga pero preferiblemente, la construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en el genoma de la célula por recomendación homóloga como es conocido en la técnica.
Descripción detallada de la invención
El procedimiento para producir un ácido dicarboxílico seleccionado del grupo que consiste en ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, que comprende fermentar una levadura recombinante en un medio de fermentación adecuado, en el que la fermentación se lleva a cabo en condiciones microaerófilas, comprende una concentración de dióxido de carbono que oscila entre 25 % v/v y 75 % v/v, por ejemplo entre 35 % v/v y 65 v/v% o entre 40 % v/v y 60 % v/v de gas total presente en el medio de fermentación.
El dióxido de carbono presente en el medio de fermentación puede añadirse al medio en la forma de dióxido de carbono gaseoso en un flujo de gas, por ejemplo, un flujo de gas que comprende dióxido de carbono a una concentración entre 25 % v/v y 75 % v/v. Las concentraciones adecuadas de dióxido de carbono en un flujo de gas pueden oscilar como se describió en la presente memoria anteriormente.
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El dióxido de carbono también puede estar presente en el medio de fermentación por adición de sal de carbonato o bicarbonato, por ejemplo, carbonato de calcio o bicarbonato de calcio. El dióxido de carbono normalmente también se forma durante la fermentación de una célula de levadura recombinante en el procedimiento de la invención.
Como se usa en la presente memoria el término gas total en el medio de fermentación comprende gas disuelto y no disuelto. El gas total en el medio de fermentación comprende dióxido de carbono y oxígeno y normalmente comprende además nitrógeno y puede comprender cualquier molécula de gas producida por fermentación de la célula de levadura o añadida al medio de fermentación por ejemplo mediante burbujeo de un flujo de gas por el medio de fermentación.
Se encontró ventajoso que el gas total en la fermentación comprendiera oxígeno, proporcionando la célula de levadura recombinante para generar energía por oxidación. Preferiblemente, el gas total comprende cantidades bajas de oxígeno. El procedimiento como se describe en la presente memoria se lleva a cabo en condiciones microaerófilas o condiciones limitadas de oxígeno. Las condiciones microaerófilas o limitadas de oxígeno se reflejan en la velocidad de absorción de oxígeno (OUR, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el procedimiento descrito en la presente memoria comprende suministrar oxígeno a una velocidad de absorción de oxígeno menor que 8,0 mmol de oxígeno/l/hora y por encima de 0,01 mmol de oxígeno/l/hora.
En una realización, la OUR es menor que aproximadamente 6,0 mmol de oxígeno/l/hora, preferiblemente menor que aproximadamente 5,0, 4,0, 3,0 o 2,0 mmol de oxígeno/l/hora, más preferiblemente menor que aproximadamente 1,0 o 0,5 mmol de oxígeno/l/hora, preferiblemente por encima de 0,01 mmol de oxígeno/l/hora. Se encontró que las condiciones limitadas de oxígeno daban como resultado un rendimiento aumentado de ácido dicarboxílico en el procedimiento según la presente invención.
En una realización el medio de fermentación en el procedimiento descrito en la presente memoria comprende una fuente de carbono, preferiblemente una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, maltosa, rafinosa y glicerol. El medio de fermentación normalmente comprende una fuente de nitrógeno tal como amonio o urea. El medio de fermentación puede comprender biotina.
En una realización en el procedimiento para producir un ácido dicarboxílico de la presente descripción, una levadura recombinante sobreexpresa un gen que codifica una fosfoenolpiruvato (PEP) carboxicinasa. Cualquier PEP- carboxicinasa que catalize la reacción de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato (4.1.1.49) puede ser adecuado para sobreexpresión en una célula de levadura. Una levadura puede sobreexpresar una PEP carboxicinasa heteróloga, tal como una PEP carboxicinasa procedente de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., o Anaerobiospirillum sp., más preferiblemente Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes o Anaerobiospirillum succiniciproducens. En una realización un gen que sobreexpresa una PEP carboxicinasa en una levadura en el procedimiento descrito en la presente memoria se sobreexpresa en el citosol. En una realización una levadura de la presente descripción sobreexpresa un gen que codifica una PEP-carboxicinasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.° 6.
Se encontró ventajoso que una levadura recombinante sobreexpresaba una PEP-carboxicinasa en el procedimiento para producir un ácido dicarboxílico en presencia de 25 % v/v a 75 % v/v de dióxido de carbono, puesto que la sobreexpresión de PEP carboxicinasa dio como resultado una fijación aumentada de dióxido de carbono, es decir, la conversión de fosfoenolpiruvato (C3) en oxaloacetato (C4), dando como resultado un mayor rendimiento de ácido dicarboxílico.
En otra realización en el procedimiento para producir un ácido dicarboxílico de la presente descripción una levadura recombinante sobreexpresa una piruvato carboxilasa (PYC, por sus siglas en inglés), que cataliza la reacción de piruvato a oxaloacetato (EC 6.4.1.1). Preferiblemente la piruvato carboxilasa es activa en el citosol en la expresión del gen. Preferiblemente, se sobreexpresa una piruvato carboxilasa endógena u homóloga.
En otra realización, una célula fúngica recombinante en el procedimiento para producir un ácido dicarboxílico descrito en la presente memoria comprende una alteración de un gen que codifica una enzima de la ruta de fermentación del etanol. Un gen que codifica una enzima de una ruta de fermentación de etanol, puede ser piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1), que cataliza la reacción de piruvato a acetaldehído, o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), que cataliza la reacción de acetaldehído a etanol. Preferiblemente, una levadura en el procedimiento como se describe en la presente memoria comprende una alteración de uno, dos o más genes que codifican una alcohol deshidrogenasa. En el caso de que la levadura sea, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, la Saccharomyces cerevisiae comprende preferiblemente una alteración de un gen de alcohol deshidrogenasa adh1 y/o adh2.
El procedimiento para producir un ácido dicarboxílico de la presente descripción se encontró particularmente ventajoso para células que comprenden una alteración de un gen que codifica una enzima de la ruta de fermentación del etanol. Esto dio como resultado un aumento de rendimiento de ácido dicarboxílico y al mismo tiempo células que carecían de la capacidad para producir energía en la forma de ATP por fermentación de etanol, pudieron satisfacer el requerimiento de formación de ATP por oxidación.
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En otra realización, una levadura descrita en la presente memoria comprende una alteración de un gen que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. La alteración de un gen que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa normalmente da como resultado una formación reducida de glicerol. En una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, la levadura comprende preferiblemente una alteración de un gen gpdl.
En una realización la levadura recombinante sobreexpresa además un gen que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste en una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa dependiente de (NAD(H) y una proteína transportadora de ácido dicarboxílico. Las realizaciones preferidas de estas enzimas son como se describen a continuación en la presente memoria.
En una realización una levadura de la presente descripción sobreexpresa además un gen que codifica una malato deshidrogenasa (MDH) activa en el citosol en la expresión del gen. Una MDH citosólica puede ser cualquier malato deshidrogenasa homóloga o heteróloga adecuada, que catalize la reacción del oxaloacetato a malato (EC 1.1.1.37). Preferiblemente, una levadura comprende un gen que codifica una malato deshidrogenasa que presenta al menos 70, 80, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.° 9.
En otra realización, una levadura de la presente descripción sobreexpresa además un gen que codifica una fumarasa, que cataliza la reacción de ácido málico a ácido fumárico (EC 4.2.1.2). Un gen que codifica fumarasa puede proceder de cualquier origen adecuado, preferiblemente de origen microbiano, por ejemplo, una levadura tal como Saccharomyces o un hongo filamentoso, tal como Rhizopus oryzae. Una levadura de la presente descripción puede sobreexpresar una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarasa que presenta al menos el 70 % u 80 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.° 8. En una realización, la enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico es activa en el citosol en la expresión de la secuencia de nucleótidos. Se encontró que la actividad citosólica de la fumarasa daba como resultado una alta productividad de un ácido dicarboxílico por la levadura. En otra realización, la levadura sobreexpresa cualquier gen heterólogo u homólogo adecuado que codifique una fumarato reductasa dependiente de NAD(H), que catalize la reacción de fumarato a succinato (EC 1.3.1.6). La fumarato reductasa dependiente de NADH puede ser una enzima heteróloga, que puede proceder de cualquier origen adecuado, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos o plantas. Una levadura de la presente descripción comprende una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) heteróloga, preferiblemente procedente de una Trypanosoma sp, por ejemplo, una Trypanosoma brucei. En una realización, la fumarato reductasa dependiente de NAD(H) se expresa en el citosol. La levadura puede sobreexpresar un gen que codifique una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 100 % de identidad de secuencias con la SEC ID n.° 7.
En otra realización, la levadura sobreexpresa un gen que codifica una proteína transportadora de ácido dicarboxílico, por ejemplo, una proteína transportadora de ácido málico (MAE). Una proteína transportadora de ácido dicarboxílico puede ser una proteína homóloga o heteróloga. Una proteína transportadora de ácido dicarboxílico puede ser una proteína homóloga o heteróloga. Una proteína transportadora de ácido dicarboxílico puede proceder de cualquier organismo adecuado, por ejemplo, de Schizosaccharomyces pombe. Una levadura como se describe en la presente memoria puede comprender una proteína transportadora de ácido dicarboxílico que tenga al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 o 100 % de secuencia de identidad con la SEC ID n.° 10.
En una realización, la levadura pertenece al género Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Issatchenkia, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Zygosaccharomyces, Pachysolen o Yamadazyma. La célula de levadura puede pertenecer, por ejemplo, a una especie Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Issatchenkia orientalis, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis o Zygosaccharomyces bailii. En una realización, la levadura pertenece a una Saccharomyces sp., preferiblemente una Saccharomyces cerevisiae. Los ácidos dicarboxílicos producidos en el procedimiento como se describe en la presente memoria, se seleccionan del grupo que consiste en ácido succínico, ácido fumárico o ácido málico, por ejemplo, ácido succínico.
El procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico de la presente descripción puede llevarse a cabo a cualquier pH adecuado entre 1 y 8. El pH en el caldo de fermentación puede estar entre 2 y 7, preferiblemente entre 3 y 5.
Una temperatura adecuada a la que se lleva a cabo el procedimiento de la presente descripción es entre 5 °C y 60 °C o entre 10 °C y 50 °C, por ejemplo, entre 15 °C y 45 °C o entre 20 °C y 40 °C. El experto la materia conoce las temperaturas óptimas para fermentar una levadura específica.
En otra realización el procedimiento comprende recuperar el ácido dicarboxílico del medio de fermentación por un método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por cristalización, precipitación de amonio o tecnología de intercambio iónico.
En una realización, el ácido dicarboxílico que se prepara en el procedimiento según la presente invención se
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convierte además en un producto farmacéutico, cosmético, alimento, pienso o polímero de poliéster. El ácido succínico puede ser, por ejemplo, convertido además en un polímero, tal como poli(succinato de butileno) (PBS, por sus siglas en inglés).
En otra realización el procedimiento según la presente invención se lleva a cabo en una escala industrial. Industrial se define en la presente memoria como un procedimiento de fermentación que se lleva a cabo en un volumen de al menos 10 litros, preferiblemente al menos 100 litros, preferiblemente al menos 1 metro cúbico (m3), más preferiblemente al menos 10, 100 o 1000 metros cúbicos (m3), normalmente por debajo de 10 000 metros cúbicos
(m3).
Figuras
Figura 1. Efecto de la concentración de CO2 (% v/v) en el rendimiento de ácido dicarboxílico (Yps) después de fermentación de 90 h de levadura SUC-200 a pH 5. Cuadrado cerrado: Rendimiento de ácido succínico (Yps as); Cuadrado abierto: Rendimiento de ácido succínico + ácido málico (Ypsas+am).
Figura 2. Efecto de la concentración de CO2 (% v/v) sobre la productividad específica de ácido dicarboxílico (qp) después de fermentación de 90 h de levadura SUC-200 a pH 5. Cuadrado cerrado: Productividad de ácido succínico (qpAs); Cuadrado abierto: Productividad de ácido succínico + ácido málico (qp as+am).
Ejemplos
Ejemplo 1. Producción de ácido dicarboxílico por Saccharomyces cerevisiae
1.1. Cepa de levadura de construcción
1.1.1. Construcción de construcciones de expresión
La construcción de expresión pGBS414PPK-3 se creó después de una restricción de BamHI/NotI del vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consiste en la construcción génica sintética de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (origen Actinobacillus succinogenes) (SEC ID n.° 1). Se usó la mezcla de ligadura para transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construcción de expresión de la levadura pGBS414PPK-1. Con posterioridad, se restringió pGBK414PPK-1 con AscI y NotI. Para crear pGBS414PPK-3, se ligó un fragmento de restricción AscI/NotI que consistía en glicosomal fumarato reductasa de construcción génica sintética de T. brucei (FRDg) (SEC ID n.° 2) al vector pGBS414PPK-1 restringido. Se usó la mezcla de ligadura para transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construcción de expresión de levadura pGBS414PPK-3.
La construcción de expresión pGBS415FUM-3 se creó después de una restricción de BamHI/NotI del vector de expresión pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consiste en la construcción génica sintética de fumarasa (origen Rhizopus oryzae) (SEC ID n.° 3). Se usó la mezcla de ligadura para transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construcción de expresión de levadura pGBS415FUM-1. Con posterioridad, se restringió pGBK415FUM-1 con AscI y NotI. Para crear pGBS415FUM-3, se ligó un fragmento de restricción AscI/NotI que consistía en malato deshidrogenasa peroxisomal a partir de construcción génica sintética de S. cerevisiae (MDH3) (SEC ID n.° 4) al vector pGBS415FUM-1 restringido. Se usó la mezcla de ligadura para transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construcción de expresión de levadura pGBS415FUM-3.
La construcción de expresión pGBS416MAE-1 se creó después de una restricción de BamHINotI del vector de expresión pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en la construcción génica sintética de transportador de malato de Schizosaccharomyces pombe (SEC ID n.° 5). Se usó la mezcla de ligadura para transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construcción de expresión de levadura pGBS416MAE-1.
1.1.2. Cepa de construcción de S. cerevisiae
Se transformaron los plásmidos pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 y pGBS416MAE-1 (descritos en 1.1.1) por electroporación en cepa RWB064 de S. cerevisiae (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox) para crear cepa SUC-200, sobreexpresando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg y SpMAE1. Todos los genes fueron de pares de codones optimizados para expresión en S. cerevisiae según la patente internacional WO2008/000632.
1.2. Fermentación de ácido dicarboxílico 1.2.1. Condiciones de fermentación
Se cultivó la cepa de levadura SUC-200 como se describe en el párrafo 1.1, en frasco agitador (2 x 300 ml) durante 3 días a 30 °C y 23 rad/s (220 rpm). El medio se basó en Verduyn (Verduyn et. al., 1992, Yeast 8, 501-517), pero se hicieron modificaciones en la fuente de carbono y nitrógeno como se muestra en la Tabla 1 y 2.
Tabla 1. Composición de medio de frasco agitador de precultivo.
Materia prima
Fórmula Concentración (g/l)
Galactosa
C6H12O6 • H2O 20,0
Urea
(NH2)2CO 2,3
Dihidrogenofosfato de potasio
KH2PO4 3,0
Sulfato de magnesio
MgSO4 •7H2O 0,5
Solución de elementos traza3
1
Solución de vitaminas6
1
aSolución de vitaminas
5
Componente
Fórmula Concentración (g/kg)
Biotina (D-)
C10H16N2O3S 0,05
pantotenato Ca D(+)
C18H32CaN2O-i0 1,00
Ácido nicotínico
C6H5NO2 1,00
Mio-inositol
C6H12O6 25,00
Hidrocloruro de cloruro de tiamina
C12H18Cl2N4OS • XH2O 1,00
Hidrocloruro de piridoxol
C8H12ClNO3 1,00
ácido p-aminobenzoico
C7H7NO2 0,20
AEDT
C10H14N2Na2O8 • 2H2O 15,00
Sulfato de zinc. 7H2O
ZnSO4^7H2O 4,50
Cloruro de manganeso. 2H2O
MnCl2 • 2H2O 0,84
Cloruro de cobalto (II). 6H2O
CoCl2 • 6H2O 0,30
Sulfato de cobre (II). 5H2O
CuSO4 •5H2O 0,30
Sodio-molibdeno. 2H2O
Na2MoO4 • 2H2O 0,40
Cloruro de calcio. 2H2O
CaCb 2H2O 4,50
Sulfato de hierro. 7H2O
FeSO4^7H2O 3,00
5
10
15
20
25
30
Componente
Fórmula Concentración (g/kg)
Ácido bórico
H3BO3 1,00
Yoduro de potasio
Kl 0,10
bSolución de elementos traza
Con posterioridad, se transfirieron los contenidos de los matraces agitadores a un fermentador de 10 l (Peso de partida 6 kg), que contenía el siguiente medio:
Tabla 2. Composición de medio de fermentación principal.
Materia prima
Concentración (g/l)
Sulfato de amonio
(NH4)2SO4 2,5
Dihidrogenofosfato de potasio
KH2PO4 3,0
Sulfato de magnesio
MgSO4. 7H2O 0,5
Solución de elementos traza
1
Solución de vitaminas
1
Se controló el pH durante la fermentación a 5,0 por adición de KOH 6 N. Se controló la temperatura a 30 °C. Se mantuvo limitada la concentración de glucosa (< 1 g/l) por alimentación controlada al fermentador. La velocidad de absorción de oxígeno (OUR) se controló a 5 mmol/kg/h durante la fermentación, que dio como resultado limitación de oxígeno. Se aplicó un flujo de gases totales de 0,33 vvm, con porcentajes variables de CO2 en la mezcla de gases.
Durante el cultivo de 90 horas tuvo lugar crecimiento a una concentración de biomasa típica de 8 g/l.
1.2.2. Análisis de RMN
Se determinaron concentraciones de ácido dicarboxílico en el sobrenadante de fermentación mediante espectroscopía de RMN.
Se centrifugaron 3 ml de caldo durante 10 min a 4500 x g. Se pesaron con precisión aproximadamente 500 microlitros de sobrenadante a un vial con espacio de cabeza. Para cada muestra se añadieron 0,5 ml de tampón de pluma C-2696 (que contenía 5,62 mg/ml de ácido maleico). Se taparon las muestras y se cocieron durante aproximadamente 10 minutos en un baño de agua (y en baño de aceite en la muestra de control CF292706-11 y CF292706-12) a 100 °C. Se liofilizaron las muestras, se disolvió el residuo en 1 ml D2O.
Se registraron los espectros a una frecuencia de protones de Bruker DRX 360 MHz a una temperatura de la sonda de 300 K. Se realizaron las mediciones cuantitativas con programa de pulso zg, pulso de excitación de 30 - 90 grados y un retardo de relajación de 40 s.
La figura 1 muestra que una concentración de CO2 que aumenta a aproximadamente 50 % v/v dio como resultado un rendimiento aumentado Yps (g/g) de ácido succínico y rendimiento mejorado de ácido málico (AM) más ácido succínico (AS) de aproximadamente 10 % a 30 % cuando se compara con una concentración de CO2 del 10 % v/v. Se consiguió un rendimiento total de AS + AM de 0,49 g/g cuando se aplicó el 50 % v/v de CO2, mientras el 10 % v/v de CO2 dio como resultado un rendimiento de 0,36 g/g de AS + AM. El rendimiento de AS +AM sin la adición de CO2 durante la fermentación fue 0,23 g/g.
Asimismo, la productividad específica qp (g/g/h) aumentó a mayores concentraciones de CO2 (Figura 2). Una concentración del 50 % v/v de CO2 dio como resultado una productividad específica aumentada de AS + AM (qp as+am) de 0,047 g/g/h comparado con 0,039 g/g/h usando el 10 % v/v de CO2.
10
15
20
Conclusión
Los resultados muestran que las concentraciones de dióxido de carbono de entre el 25 % v/v y el 75 % v/v tuvieron un efecto positivo sobre el rendimiento y la productividad específica de un ácido dicarboxílico (ácido succínico y ácido málico) mediante una célula de levadura recombinante, tal como una Saccharomyces cerevisiae recombinante.
Listado de secuencias
<110> DSM IP Assets B. V.
Jansen, Mickel Verwaal, René
<120> Procedimiento de fermentación de ácido dicarboxílico <130> 27431-patente internacional WO-PCT <160> 10
<170> PatentIn versión 3.5 <210> 1
< 211> 3148
< 212> ADN
< 213> Secuencia artificial <220>
< 223> Construcción sintética TDH1p-PCKa-TDH1t para expresión en S. cerevisiae <400> 1

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir un ácido dicarboxílico seleccionado del grupo que consiste en: ácido succínico, ácido fumárico y ácido málico, que comprende fermentar una levadura recombinante en un medio de fermentación adecuado, que comprende una concentración de dióxido de carbono que oscila entre el 25 % v/v y el 75 % v/v de gas total presente en dicho medio de fermentación, en el que la fermentación se lleva a cabo en condiciones microaerófilas y que produce dicho ácido dicarboxílico.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende suministrar oxígeno y una velocidad de absorción de oxígeno menor que 8,0 mmol de oxígeno/l/hora y por encima de 0,01 mmol de oxígeno/l/hora.
  3. 3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha levadura recombinante sobreexpresa un gen que codifica una fosfoenolpiruvato carboxicinasa.
  4. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha levadura recombinante comprende una alteración de un gen que codifica una enzima de la ruta de fermentación del etanol.
  5. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha enzima es una alcohol deshidrogenasa.
  6. 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha levadura recombinante sobreexpresa además un gen que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste en: una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) y una proteína transportadora de ácido dicarboxílico.
  7. 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha levadura pertenece a una Saccharomyces sp.
  8. 8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho medio de fermentación presenta un valor de pH de entre 2 y 6.
  9. 9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además recuperar dicho ácido dicarboxílico.
  10. 10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo en una escala industrial.
  11. 11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ácido dicarboxílico se convierte además en un producto farmacéutico, cosmético, alimento, pienso o polímero de poliéster.
  12. 12. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha levadura es una Saccharomyces cerevisiae.
    imagen1
    qp (g/gh)
    imagen2
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