BR112012004265B1

BR112012004265B1 - Processo para a produção de um ácido dicarboxílico

Info

Publication number: BR112012004265B1
Application number: BR112012004265-3A
Authority: BR
Inventors: Mickel Leonardus August Jansen; René Verwaal
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2020-12-15
Also published as: EA201200368A1; BR112012004265A2; EP2470667B1; ES2655308T3; WO2011023700A3; PL2470667T3; EA026438B1; WO2011023700A4; CA2771162C; US9783834B2; CA2771162A1; EP3282017A1; US20120135482A1; WO2011023700A2; EP2470667A2

Abstract

processo de fermentação de ácido dicarboxílico. a presente invenção refere-se a um processo para a produção de um ácido dicarboxílico, compreendendo a fermentação de uma célula fúngica recombinante em um meio de fermentação adequado, na presença de altas concentrações de dióxido de carbono.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácidos dicarboxílicos. Em particular, refere-se à produção de ácidos dicarboxílicos pela fermentação de levedura.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Ácidos dicarboxílicos, tais como ácido málico e ácido succínico, são compostos importantes que são usados na indústria alimentícia para a preparação e conservação de alimentos, na indústria médica para a formulação de produtos médicos e para outros usos industriais, tais como monómeros para (bio) polímeros. Os ácidos dicarboxílicos podem ser produzidos por processos petroquímicos ou processos à base de fermentação, quer por bactérias ou células fúngicas. As bactérias que têm sido estudadas para a produção melhorada de ácido succínico são, por exemplo, E. coli, Mannheimia sp., Atinobacillus sp. ou Corynebacteria. Uma desvantagem dos processos bacterianos de fermentação de ácidos dicarboxílicos é que tais processos devem ser realizados em pH alto e os agentes de neutralização são necessários para manter o pH a um valor desejado. Além disso, os processos de pH neutro requerem condições estéreis de processo, aumentando adicionalmente os custos de produção.

Em contraste com as bactérias, as células fúngicas são capazes de crescer a valores de pH baixos e não requerem condições do processo estritamente estéreis, tornando as células fúngicas uma alternativa atrativa para a produção de ácidos dicarboxílicos.

No documento W02009/065780 as células fúngicas recombinantes, tais como leveduras e fungos filamentosos, foram desenvolvidas para a produção de ácidos dicarboxílicos, resultando em níveis de produção aumentados de ácido succínico e ácido fumárico.

O documento WO2008/14462 mostra que a adição de dióxido de carbono de até 10% v/v aumentou os níveis de produção de ácido málico e ácido succínico por uma célula de levedura recombinante, mas as concentrações mais altas de dióxido de carbono não aumentaram adicionalmente os níveis de produção de ácidos dicarboxílicos.

Apesar das melhorias feitas com células fúngicas geneticamente modificadas para a produção de ácidos dicarboxílicos, existe uma necessidade de melhorar ainda mais a produção de ácido dicarboxílico por células fúngicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de um ácido dicarboxílico, compreendendo a fermentação de uma célula fúngica recombinante em um meio de fermentação adequado, que compreende uma concentração de dióxido de carbono que varia entre 25 e 75% v/v do gás total presente no meio de fermentação e produção de ácido dicarboxílico. Surpreendentemente, verificou-se que o rendimento de ácido dicarboxílico (g/g de açúcar) no processo de acordo com a presente invenção foi aumentado de forma significativa em comparação com um processo que compreende dióxido de carbono fora da faixa de concentração da invenção.

Outra vantagem do processo de acordo com a invenção foi que a produtividade específica (g de ácido dicarboxílico / g de açúcar / h) foi também aumentada significativamente em comparação com um processo para a produção de ácido dicarboxílico que compreende dióxido de carbono fora da faixa de concentração da invenção.

Definições

Os termos "ácido dicarboxílico" e "dicarboxilato", tais como "ácido succínico" e "succinato" têm o mesmo significado neste documento e são usados intercambiavelmente, o primeiro sendo a forma hidrogenada deste último.

O termo fermentação ou fermentar, tal como usado neste documento refere-se à produção microbiana de compostos, tais como álcoois ou ácidos a partir de carboidratos.

Uma célula fúngica recombinante de acordo com a presente invenção é definida neste documento como uma célula que contém um rompimento de um gene ou contém, ou é transformada ou geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula fúngica, ou contém cópia ou cópias adicionais de uma sequência de ácidos nucléicos endógena. Uma célula fúngica do tipo selvagem é definida neste documento como a célula de origem da célula recombinante.

Rompimento, ou deleção ou knock-out de um gene significa que parte de um gene ou o gene inteiro foi removido a partir de uma célula, ou um gene foi modificado de tal modo que o gene não é transcrito na proteína de codificação original.

O termo "homólogo", quando usado para indicar a relação entre um determinado (recombinante) ácido nucleico (DNA ou RNA) , gene ou molécula de polipeptídeo e um determinado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, é entendido para significar que, por natureza, a molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico é produzida por uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, preferencialmente, da mesma variedade ou cepa.

O termo "heterólogo" quando usado com respeito a um ácido nucleico (DNA ou RNA) ou proteína refere-se a um ácido nucleico, gene ou proteína que não ocorre naturalmente como parte da sequência do organismo, célula genoma, ou DNA ou RNA em que o mesmo está presente, ou que é encontrado em uma célula ou local ou locais na sequência de genoma ou DNA ou RNA que difere daquela em que o mesmo é encontro na natureza. Ácidos nucleicos ou proteínas heterólogos não são endógenos para a célula na qual é introduzido, mas foi obtido a partir de outra célula ou produzido sinteticamente ou recombinantemente.

A identidade de sequência é definida neste documento como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos (polinucleotídeo), tal como determinado pela comparação das sequências. Geralmente, as identidades ou similaridades de sequências são comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências comparadas. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relatividade entre as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, conforme o caso pode ser, como determinado pela correspondência entre as filas de tais sequências.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são designados para gerar a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem BLASTP e BLASTN, publicamente disponíveis a partir de NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Parâmetros preferidos para a comparação de sequências de aminoácidos usando BLASTP são gap open 11,0, gap extension 1, matriz Blosum 62.

Existem métodos conhecidos na técnica para a superexpressão de genes que codificam enzimas. Um gene que codifica uma enzima pode ser superexpresso pelo aumento do número de cópias do gene que codifica a enzima na célula, por exemplo, pela integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula, pela expressão do gene a partir de um vetor centromérico, a partir de um vetor de expressão de multicópia epissomal ou pela introdução de um vetor de expressão (epissomal) que compreende múltiplas cópias de um ou mais genes. Preferencialmente, a superexpressão de um gene que codifica uma enzima de acordo com a invenção é alcançada com um promotor constitutivo (forte).

Os promotores adequados em células fúngicas são conhecidos por um versado na técnica. Promotores adequados podem ser, mas não estão limitados a, TDH1, TDH3, GAL7, GAL10, GALI, CYC1, HIS3, ADH1, PH05, ADC1, ACT1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1, AOX1, PGL, GPDA e GAPDH. Outros promotores adequados incluem PDC1, GPD1, PGK1, e TEF1.

Um gene que codifica uma enzima pode ser ligado em um construto de ácido nucleico, por exemplo, um plasmídeo, tal como um plasmídeo de cópia baixa ou um plasmídeo de cópia alta. A célula fúngica de acordo com a presente invenção pode compreender uma cópia única, mas preferencialmente compreende múltiplas cópias de um gene, por exemplo, múltiplas cópias de um construto de nucleotídeo.

Um construto de ácido nucleico pode ser mantido epissomalmente e, portanto, compreende uma sequência para replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autônoma e um centrômero (Sikorski e Hieter, 1989, Genetics 122, 19-27). Um construto de ácido nucleico epissomal adequado pode, por exemplo, basear-se na levedura 2μ ou plasmídeo pKDl (Gleer et al. , 1991, Biotechnology 9: 968- 975), ou nos plasmídeos AMA (Fierro et al. , 1995, Curr. Genet. 29:482-489.). Alternativamente, cada construto de ácido nucleico pode ser integrado em uma ou mais cópias no genoma da célula fúngica. A integração no genoma da célula pode ocorrer ao acaso por recombinação não homóloga, mas preferencialmente, o construto de ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula por recombinação homóloga, como é bem conhecido na técnica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, o processo para a produção de um ácido dicarboxílico, compreendendo a fermentação de uma célula fúngica recombinante em um meio de fermentação adequado compreende uma concentração de dióxido de carbono que varia entre 25 e 75 v/v%, por exemplo, entre 35 e 65 v/v%, ou entre 40 e 60% v/v de gás total presente no meio de fermentação.

O dióxido de carbono presente no meio de fermentação pode ser adicionado ao meio sob a forma de dióxido de carbono gasoso em um fluxo de gás, por exemplo, um fluxo de gás compreendendo dióxido de carbono a uma concentração entre 25 e 75 v/v%. As concentrações adequadas de dióxido de carbono em um fluxo de gás podem variar tal como descrito neste documento acima.

O dióxido de carbono também pode estar presente no meio de fermentação por adição de sal de carbonato ou bicarbonato, por exemplo, carbonato de cálcio ou bicarbonato de cálcio. Normalmente o dióxido de carbono é também formado durante a fermentação de uma célula fúngica recombinante no processo da invenção.

Como usado neste documento o termo gás total no meio de fermentação compreende gás dissolvido e não dissolvido. Ogás total de no meio de fermentação compreende dióxido decarbono e oxigênio, e geralmente compreende aindanitrogênio e pode compreender quaisquer moléculas de gásproduzidas pela fermentação da célula fúngica, ouadicionada ao meio de fermentação por, por exemplo, porpulverização de um fluxo de gás através do meio defermentação.

Verificou-se vantajoso que o gás total na fermentação compreende oxigênio, fornecendo a célula fúngica recombinante para gerar energia por meio de oxidação. Preferencialmente, o gás total compreende baixas quantidades de oxigênio.

Preferencialmente, o processo tal como divulgado neste documento é realizado em condições aeróbicas, preferencialmente em condições microaerofílicas ou condições limitadas de oxigênio. As condições microaerofílicas ou limitadas de oxigênio são refletidas na taxa de consumo de oxigênio (OUR). Por exemplo, o processo descrito neste documento compreende o fornecimento de oxigênio a uma taxa de consumo de oxigênio menor que 8,0 mmol de oxigênio/L/hora e, acima de 0,01 mmol oxigênio/L/ hora.

Em uma modalidade, o OUR é menor que cerca de 6,0 mmol de oxigênio/L/hora, preferencialmente, menor que cerca de 5,0, 4,0, 3,0, ou 2,0 mmol de oxigênio/L/hora, mais preferencialmente, menor que cerca de 1,0, ou 0,5 mmol de oxigênio/L/hora, preferencialmente acima de 0,01 mmol de oxigênio/L/hora. Verificou-se que as condições de oxigênio limitado resultaram em um rendimento aumentado de ácido dicarboxílico no processo de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade o meio de fermentação no processo descrito neste documento compreende uma fonte de carbono, preferencialmente, uma fonte de carbono selecionada dentre o grupo que consiste em glucose, frutose, galactose, xilose, arabinose, sacarose, lactose, maltose, rafinose e glicerol. O meio de fermentação geralmente compreende uma fonte de nitrogênio, tal como amónio ou uréia. O meio de fermentação pode compreender biotina.

Em uma modalidade, no processo para a produção de um ácido dicarboxílico da presente divulgação, uma célula fúngica recombinante superexpressa um gene que codifica uma fosfoenol piruvato carboxicinase (PEP). Qualquer PEP- carboxicinase que catalisa a reação de fosfoenol piruvato para oxaloacetato (4.1.1.49) pode ser adequado para a superexpressão em uma célula fúngica. Uma célula fúngica pode superexpressar um PEP carboxicinase heteróloga, tal como uma PEP carboxicinase derivado de Escherichia coli, Mannheimia sp., Atinobacillus sp. , ou Anaerobiospirillum sp., mais preferencialmente, Mannheimia succiniciproducens, Atinobacillus succinogenes, ou Anaerobiospirillum succiniciproducens. Em uma modalidade, um gene que superexpressa uma PEP carboxicinase em uma célula fúngica no processo divulgado neste documento é expresso no citosol. Em uma modalidade, uma célula fúngica da presente divulgação superexpressa um gene que codifica uma PEP carboxicinase compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Verificou-se que é vantajoso que uma célula fúngica recombinante superexpresse uma PEP carboxicinase no processo para a produção de um ácido dicarboxílico, na presença de 25 a 75 v/v% de dióxido de carbono, uma vez que a superexpressão da PEP carboxicinase resultou em uma fixação aumentada de dióxido de carbono, isto é, a conversão de fosfoenol piruvato (C3) para oxaloacetato (C4) , resultando em um alto rendimento do ácido dicarboxílico.

Em outra modalidade, no processo para a produção de um ácido dicarboxílico da presente divulgação, uma célula fúngica recombinante superexpressa uma piruvato carboxilase (PYC), que catalisa a reação de piruvato para oxaloacetato (CE 6.4.1.1). Preferencialmente, a piruvato carboxilase é ativa no citosol após expressão do gene. Preferencialmente, uma piruvato carboxilase endógena ou homóloga é superexpressa.

Em outra modalidade, uma célula fúngica recombinante no processo para a produção de um ácido dicarboxílico divulgado neste documento compreende um rompimento de um gene que codifica uma enzima da via de fermentação de etanol. Um gene que codifica uma enzima de uma via de fermentação de etanol pode ser piruvato descarboxilase (CE 4.1.1.1), que catalisa a reação de piruvato para acetaldeído, ou álcool desidrogenase (CE 1.1.1.1), que catalisa a reação de acetaldeído para etanol. Preferencialmente, uma célula fúngica no processo como descrito neste documento compreende um rompimento de um, dois ou mais genes que codificam uma álcool desidrogenase. No caso da célula fúngica ser uma levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, o Saccharomyces cerevisiae preferencialmente compreende um rompimento de um gene da álcool desidrogenase adhl e/ou adh2.

O processo para a produção de um ácido dicarboxílico da presente divulgação foi verificado particularmente vantajoso para as células que compreendem um rompimento de um gene que codifica uma enzima da via de fermentação de etanol. Isto resultou num aumento de rendimento de ácido dicarboxílico e, ao mesmo tempo, as células que não apresentam a capacidade de produzir energia sob a forma de ATP por fermentação de etanol, foram capazes de satisfazer o requisito de formação ATP por meio de oxidação.

Em outra modalidade, uma célula fúngica divulgada neste documento compreende um rompimento de um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase. O rompimento de um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase geralmente resulta em uma formação reduzida de glicerol. No caso da célula fúngica ser uma levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, a célula fúngica compreende preferencialmente um rompimento de um gene gpdl.

Em uma modalidade, a célula fúngica recombinante ainda superexpressa um gene que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em uma malato desidrogenase, uma fumarase, uma fumarato redutase dependente de (NAD(H)) e uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico.

As modalidades preferidas destas enzimas são como descritas neste documento abaixo.

Em uma modalidade uma célula fúngica da presente divulgação ainda superexpressa um gene que codifica uma malato desidrogenase (MDH) ativa no citosol após expressão do gene. Uma MDH citossólica pode ser qualquer malato desidrogenase homóloga ou heteróloga adequada, que catalisa a reação de oxaloacetato para malato (EC 1.1.1.37). Preferencialmente, uma célula fúngica compreende um gene que codifica uma malato desidrogenase que tem pelo menos 70, 80, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

Em outra modalidade, uma célula fúngica da presente divulgação ainda superexpressa um gene que codifica uma fumarase, que catalisa a reação de ácido málico para ácido fumárico (CE 4.2.1.2) . Um gene que codifica a fumarase pode ser derivado de qualquer origem adequada, preferencialmente, de origem microbiana, por exemplo, uma levedura tal como Saccharomyces ou um fungo filamentoso, tal como Rhizopus oryzae. Uma célula fúngica da presente divulgação pode superexpressar uma sequência de nucleotídeos que codifica um fumarase que tem pelo menos 70%, ou, 80, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade a enzima que catalisa a conversão do ácido málico para o ácido fumárico é ativa no citosol mediante a expressão da sequência de nucleotídeos. Verificou-se que a atividade citossólica da fumarase resultou em uma alta produtividade de um ácido dicarboxílico pela célula fúngica.Em outra modalidade, a célula fúngica superexpressa qualquer gene heterólogo ou homólogo adequado que codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H), que catalisar a reação de fumarato para succinato (CE 1.3.1.6). A fumarato redutase dependente de NAD(H) pode ser uma enzima heteróloga, que pode ser derivada de qualquer origem adequada, por exemplo, bactérias, fungos, protozoários ou plantas. Uma célula fúngica da presente discolsure compreende uma fumarato redutase dependente de NAD(H) heteróloga, preferencialmente derivada de um Trypanosoma sp. , por exemplo, um Trypanosoma brucei. Em uma modalidade, a fumarato redutase dependente de NAD(H) é expressa no citosol. A célula fúngica pode superexpressar um gene que codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H) que tem pelo menos 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7.

Em outra modalidade, a célula fúngica superexpressa um gene que codifica uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico, por exemplo, uma proteína transportadora de ácido málico (MAE). Uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico pode ser uma proteína homóloga ou heteróloga. Uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico pode ser derivada de qualquer organismo adequado, por exemplo, a partir de Schizosaccharomyces pombe. Uma célula fúngica, tal como divulgada neste documento pode compreender uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico que tem pelo menos 70, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10.

Em uma modalidade da célula fúngica é uma levedura ou um fungo filamentoso, por exemplo, pertencente ao gênero Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Issatchenkia, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Rhizopus, Zygosaccharomyces, Pachysolen ou Yamadazyma. A célula fúngica pode, por exemplo, pertencer a uma espécie Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. latis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Issatchenkia orientalis, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus oryzae ou Zygosaccharomyces bailii. Em uma modalidade da célula fúngica é uma levedura, por exemplo, pertencente a um Saccharomyces sp. , preferencialmente, um Saccharomyces cerevisiae.

Qualquer ácido dicarboxílico adequado pode ser produzido no processo como descrito neste documento, por exemplo, ácido succínico, ácido fumárico ou ácido málico, por exemplo, ácido succínico.

O processo para a produção de um ácido dicarboxílico da presente divulgação pode ser realizado em qualquer pH adequado entre 1 e 8. O pH no caldo de fermentação pode ser entre 2 e 7, preferencialmente, entre 3 e 5.

Uma temperatura adequada na qual o processo da presente divulgação é relizado está entre 5 e 60°C, ou entre 10 e 50°C, por exemplo, entre 15 e 45°C, ou entre 20°C e 40°C. O versado na técnica conhece as temperaturas ótimas para a fermentação de uma célula fúngica específica.

Em outra modalidade, o processo compreende a recuperação do ácido dicarboxílico a partir do meio de fermentação por um método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por tecnologia de cristalização, precipitação de amónio, ou troca iônica.

Em uma modalidade, o ácido dicarboxílico que é preparado no processo de acordo com a presente invenção é ainda convertido em um produto farmacêutico, cosmético, alimentos, rações, ou polímero de poliéster. 0 ácido succínico pode, por exemplo, ser ainda convertido em um polímero, tal como succinato de polibutileno (PBS).

Em outra modalidade, o processo de acordo com a presente invenção é realizado a uma escala industrial. Industrial é definido neste documento como um processo de fermentação que é realizado em um volume de pelo menos 10 litros, preferencialmente, pelo menos 100 litros, preferencialmente pelo menos 1 metro cúbico (m3) , mais preferivelmente, pelo menos 10, 100 ou 1000 de metros cúbicos (m3) , geralmente abaixo de 10.000 metros cúbicos (m3) .

A invenção também se refere a um processo para a produção de um ácido dicarboxílico compreendendo a fermentação de uma célula fúngica recombinante em um meio de fermentação adequado, em que o dióxido de carbono em uma concentração de 20 a 80% v/v de gás total presente no meio de fermentação é usado para aumentar produção de ácido dicarboxílico.

FIGURAS

Figura 1. Efeito da concentração de C02 (v/v%) sobre o rendimento de ácido dicarboxílico (Yps) após 90 h de fermentação de levedura SUC-200 a pH 5. Quadrado fechado: Rendimento de ácido succínico (Yps SA) ; Quadrado aberto: Rendimento de ácido succínico + ácido málico (YPS SA + MA)

Figura 2. Efeito da concentração de C02 (v/v%) sobre a produtividade específica de ácido dicarboxílico (qp) após 90h de fermentação de levedura SUC-200 a pH 5. Quadrado fechado: Produtividade de ácido succínico (qpSA) ; Quadrado Aberto: Produtividade de ácido succínico + ácido málico (qp SA + MA)

EXEMPLOS Exemplo 1. Produção de ácido dicarboxílico por Saccharomyces cerevisiae 1.1. Construção de Cepa de levedura 1.1.1. Construção de construtos de expressão

O construto de expressão pGBS414PPK-3 foi criado após uma restrição BamH/Notl do vetor de expressão pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. e Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) e posteriormente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamH/Notl consistindo no construto do gene sintético de fosfoenolpiruvato carboxicinase {Actinobacillus succinogenes de origem) (SEQ ID NO: 1) . A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen) , resultando no construto de expressão de levedura pGBS414PPK-l. Subsequentemente, pGBK414PPK-l foi restringido com Asci e Notl. Para criar pGBS414PPK-3, um fragmento de restrição Asci/Notl consistindo na fumarato redutase glicossomal do construto de gene sintético T. brucei (FRDg) (SEQ ID NO: 2) foi ligado no vetor pGBS414PPK-l restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP10 (Invitrogen), resultando no construto de expressão de levedura pGBS414PPK-3.

O construto de expressão pGBS415FUM-3 foi criado após uma restrição Ascl/Notl do vetor de expressão pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122 (1) :19-27) e, subsequentemente, ligando neste vetor um fragmento de restrição Ascl/Notl que consiste no construto de gene sintético de fumarase (Rhizopus oryzae de origem) (SEQ ID NO: 3) . A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOPIO (Invitrogen), resultando no construto de expressão de levedura pGBS415FUM-l. Subsequentemente, pGBK415FUM-l foi restringido com Ascl e Notl. Para criar pGBS415FUM-3, um fragmento de restrição Ascl/Notl consistindo em malato desidrogenase peroxissomal a partir do construto de gene sintético de S. cerevisiae (MDH3) (SEQ ID NO: 4) foi ligado no vetor pGBS415FUM-l restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOPIO (Invitrogen) , resultando no construto de expressão de levedura pGBS415FUM-3.

0 construto de expressão pGBS416MAE-l foi criado após uma restrição de Asci/Notl do vetor de expressão pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. e Hieter P., Genetics, 1989, 122(1):19-27) e, subsequentemente, ligando neste vetor um fragmento de restrição Ascl/Notl que consiste no construto de gene sintético de transportador de malato Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 5) . A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOP 10 (Invitrogen), resultando na expressão do construto de levedura construir pGBS416MAE-l.

1.1.2. Construção da cepa de S. cerevisiae

Os plasmídeos pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 e pGBS416MAE-l (descrito em 1.1.1) foram transformados por eletroporação em cepa de S. cerevisiae RWB064 (MATA ura3-52 ieu2-112 trpl-289 adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanlox) para criar a cepa SUC-200, superexpressando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg e SpMAEI. Todos os genes eram pares de códon otimizados para a expressão em S. cerevisiae de acordo com a W02008/000632.

1.2. Fermentação do ácido dicarboxílico 1.2.1. Condições de fermentação

A cepa de levedura SUC-200 conforme descrito no parágrafo 1.1. foi cultivada em frasco de agitação (2 x 300 ml) durante 3 dias a 30°C e 220 rpm. 0 meio foi baseado em Verduyn (Verduyn et. al., 1992, Yeast 8, 501-517), masmodificações na fonte de carbono e nitrogênio foram feitas, como mostrado nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1. Composição do meio do frasco de agitação com Pré-cultura.

Subsequentemente, o conteúdo dos frascos de agitação de foram transferidos para um fermentador de 10L (Peso inicial 6 kg), que continha o seguinte meio: Tabela 2. Composição meio de fermentação principal.

O pH durante a fermentação foi controlado a 5,0 por adição de KOH 6N. A temperatura foi controlada a 3 0°C. A concentração de glucose foi mantida limitada (<1 g/1) por alimentação controlada para o fermentador. A taxa de consumo de oxigênio (OUR) foi controlada a 5 mmol/kg/h durante a fermentação, que resultou na limitação de oxigênio. Um fluxo de gás total de 0,33 vvm foi aplicado, com percentagens variantes de CO2 na mistura gasosa. Durante a cultura de 90 horas o crescimento ocorreu a uma concentração de biomassa típica de 8 g/L. 1.2.2. Análises de RMN

As concentrações de ácido dicarboxílico no sobrenadante da fermentação foram determinadas por meio de espectroscopia de RMN.

Três mililitros (3 ml) de caldo foram centrifugados durante 10 min a 4500 x g. Aproximadamente 500 microlitros de sobrenadante foram pesados com precisão para um frasco com espaço livre (headspace). Para cada amostra de 0,5 ml de tampão de pen C-2696 (contendo 5,62 mg/ml de ácido maleico) foi adicionado. As amostras foram tapadas e cozidas durante cerca de 10 minutos em um banho maria (e em banho de óleo na amostra de controle CF292706-11 e CF292706-12) a 100°C. As amostras foram liofilizadas, o resíduo foi dissolvido em 1 ml de D2O.

Os espectros foram registados a uma frequência de prótons de Bruker DRX 3 60 MHz, a uma temperatura de sonda de 300 K. As medições quantitativas foram realizadas com o programa de pulso zg, pulso de excitação de 30 - 90 graus e um atraso de relaxamento de 40s.

A Figura 1 mostra que uma concentração de CO2 aumentando para cerca de 50% v/v resultou em um rendimento aumentado de Yps (g/g) de ácido succínico e rendimento aumentado de ácido málico (MA) mais ácido succínico (SA) de cerca de 10 a 30% em comparação com uma concentração de CO2 de 10% v/v.

Um rendimento global de SA + MA de 0,4 9 g/g foi obtido ao se aplicar 50 v/v% de CO2, enquanto que 10 v/v% de CO2 resultaram em um rendimento de 0,3 6 g/g de SA + MA. 0 rendimento de SA + MA sem a adição de CO2 durante a fermentação foi de 0,23 g/g.

Da mesma forma a produtividade específica qp (g/g/h) aumentou a concentrações mais altas de CO2 (Figura 2). Uma concentração de 50 v/v% de CO2 resultou em um aumento da produtividade específica de SA + MA (qp SA +MA) de 0,047 g/g/h em comparação com 0,03 9 g/g/h, usando 10 v/v% de CO2.

Conclusão

Os resultados mostram que as concentrações de dióxido de carbono entre 25 e 75 v/v% tiveram um efeito positivo sobre o rendimento e produtividade específica de um ácido dicarboxílico (ácido succínico e ácido málico) por uma célula fúngica recombinante, tal como uma Saccharomyces cerevisiae recombinante.

Claims

1. Processo para a produção de um ácido dicarboxílico, caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo em ácido succínico, ácido fumárico e ácido málico, compreendendo a fermentação de uma célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado, que compreende uma concentração de dióxido de carbono que varia entre 25 e 75% v/v de gás total presente no referido meio de fermentação e produzindo o referido ácido dicarboxílico, em que a célula de levedura recombinante superexpressa um gene que compreende uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 1, codificando uma fosfoenol piruvato carboxicinase.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação é realizada em condições microaerofílicas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de oxigênio a uma taxa de consumo de oxigênio menor que 8,0 mmol de oxigênio/L/hora e, acima de 0,01 mmol de oxigênio/L/hora.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura recombinante compreende um rompimento de um gene que codifica uma enzima da via de fermentação de etanol, a enzima sendo preferencialmente piruvato descarboxilase.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a enzima é um álcool desidrogenase.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura recombinante superexpressa ainda: - um gene compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 4, que codifica uma malato desidrogenase, - um gene compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 3, que codifica um fumarase, - um gene compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 2, que codifica uma fumarato redutase dependente de NAD(H), e - um gene compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, que codifica uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura pertence a uma espécie Saccharomyces sp., preferencialmente Saccharomyces cerevisiae.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação tem um valor de pH de entre 2 e 6.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a recuperação do ácido dicarboxílico.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado em uma escala industrial.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o ácido dicarboxílico é ainda convertido em um produto farmacêutico, cosmético, alimentos, rações, ou polímero de poliéster.

12. Processo para a produção de um ácido dicarboxílico caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo de ácido succínico, ácido fumárico e ácido málico, compreendendo a fermentação de uma célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado, em que o dióxido de carbono em uma concentração de 25 a 75% v/v de gás total presente no meio de fermentação é usado para aumentar a produção de ácido dicarboxílico, em que a célula de levedura recombinante superexpressa um gene compreendendo uma sequência de DNA de SEQ5 ID NO: 1, codificando uma fosfoenol piruvato carboxicinase.