CN104818224A - 在真核细胞中生产琥珀酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在真核细胞中生产琥珀酸。本发明涉及包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。本发明还涉及生产琥珀酸的方法，其中使用根据本发明的真核细胞。

Description

在真核细胞中生产琥珀酸
本申请是申请号为200880117129.3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2008/065583的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及包含编码延胡索酸还原酶的核苷酸序列的重组真核细胞和使用所述重组真核细胞生产琥珀酸的方法。
背景技术
琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。
琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。
已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas sp.能生产琥珀酸。对这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。
WO2007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母，用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)对所述酵母加以转化。
尽管琥珀的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生物。
发明内容
本发明的一个目的是用于生产琥珀酸的替代性微生物。
根据本发明用包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞实现了这一目的，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。
惊讶地发现，与野生型真核细胞生产的琥珀酸量相比，根据本发明的重组真核细胞生产的琥珀酸的量有所提高。优选地，根据本发明的真核细胞与不包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1.2、优选至少1.5、优选至少2倍的琥珀酸。
在本文中使用时，根据本发明的重组真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽，或所述细胞经天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。
编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列可以是异源或同源的核苷酸序列，或者编码已通过突变、断裂或缺失被进一步遗传修饰的异源或同源的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。重组DNA技术是本领域公知的，如Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring HarborLaboratory Press中。
用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。
关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。
根据本发明的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶使用NAD(H)作为辅助因子，其中大部分真核细胞包含FADH2-依赖型延胡索酸还原酶，其中FADH2是辅助因子。发现：真核细胞包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列是有利的，因为NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶为细胞提供了将NAD(H)氧化为NAD+并影响细胞中氧化还原平衡的其它选项。
优选地，细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列优选地编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述延胡索酸还原酶包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少40％、优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸氨基酸序列。优选地，核苷酸序列编码包含SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。
测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual,Altschul,S.,等,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。
编码在本发明细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或优选严格杂交条件下与编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和/或SEQ ID NO:6的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中定义为下述条件：所述条件允许至少约25个、优选约50个核苷酸、75或100个、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约65℃的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6x SSC(氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在65℃下，在包含约0.1M或更少盐、优选0.2x SSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少进行1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90％或更多序列同一性的序列的特异性杂交。
中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约45℃的温度下，在包含约1M盐的溶液(优选6x SSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在室温下，在包含约1M盐的溶液(优选6x SSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有多达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50％和90％之间变化的序列。
为了提高引入的酶在本发明的真核细胞中以活性形式表达的可能性，可以改变相应的编码核苷酸序列，从而使其密码子选择针对选用的真核宿主细胞而优化。用于密码子优化的若干方法是本领域已知的。针对真核细胞的密码子选择来优化核苷酸序列密码子选择的一种优选的方法是WO2008/000632中公开的密码子对优化技术。密码子对优化是在宿主细胞中生产多肽的一种方法，其中在其密码子使用方面(特别是使用的密码子对)，对编码多肽的核苷酸序列进行了修饰，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或提高的多肽生产。密码子对被定义为编码序列中两个相继三联体(密码子)的集合。
在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。
在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
在本文中使用时，术语“酶”被定义为在细胞中催化(生物)化学反应的蛋白质。
通常，编码酶的核苷酸序列与使得相应核苷酸序列在本发明真核细胞中充分表达的启动子可操作地连接，从而赋予所述细胞生产琥珀酸的能力。
在本文中使用时，“可操作地连接”是指处于功能性关系中的多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被放置为与另一核酸序列处于功能性关系时，其是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子能影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。
在本文中使用时，术语“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，并且在结构上通过DNA-依赖型RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在而被识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
能够用于实现编码酶(例如NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶或引入本发明真核细胞中的任何其它酶)的核苷酸序列表达的启动子对编码待表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。优选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。
本文上下文中合适的启动子既包括组成型又包括诱导型的天然启动子以及经改造的启动子，所述启动子是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其它合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。
通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在真核细胞中有功能的任何终止子。优选的终止子得自宿主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，这类终止子与下述突变组合，所述突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰退(见例如Shirley等,2002,Genetics 161:1465-1482)。
在一个优选的实施方案中，可以过量表达编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列，来实现细胞对琥珀酸的足量生产。
本领域可获得多种手段用于在本发明的真核细胞中过量表达编码酶的核苷酸序列。具体地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过量表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过量表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成型启动子实现根据本发明的酶的过量表达。
本发明还涉及包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10构成的组的一种或多种核苷酸序列的核苷酸构建体。
编码酶的核苷酸序列可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的真核细胞可包含单个、但是优选地包含多个拷贝的编码NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列，例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。
核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体复制序列。如果真核细胞是真菌来源的，则合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等,1991,Biotechnology 9:968-975)或AMA质粒(Fierro等,1995,Curr Genet.29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进真核细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，但是优选地，可以如本领域所公知的，通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中。
编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列可以是异源或同源的核苷酸序列。优选地，NADH-依赖型延胡索酸还原酶是异源酶，其可以来自任何来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的细胞包含异源的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述酶优选地来自Trypanosoma sp，例如来自Trypanosoma brucei。
在一个优选的实施方案中，编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列在胞质溶胶中表达。令人惊讶的是，酶的胞质溶胶活性导致真核细胞对琥珀酸的提高的生产力。
在编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列包含过氧化物酶体或线粒体靶向信号的情况下，为了防止酶的过氧化物酶体或线粒体靶向，可能必须修饰或缺失大量氨基酸(和编码核苷酸序列中相应的核苷酸序列)。过氧化物酶体靶向信号的存在可例如通过Schlüter等,Nucleic acidResearch 2007,35,D815-D822公开的方法测定。
优选地，NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶缺少编码核苷酸序列表达后酶的胞质溶胶活性所需的过氧化物酶体或线粒体靶向信号。
优选地，细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列优选地编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，优选地编码包含下述氨基酸序列的延胡索酸还原酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少40％、优选地至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。优选地，核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。
选自酵母和丝状真菌的真核细胞优选地属于以下属之一：Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Rhizopus、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Zygosaccharomyces、Pachysolen或Yamadazyma。更优选地，真核细胞是Saccharomyces cervisiae、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、C.glabrata、Hansenula polymorpha、Torulaspora delbrueckii、Brettanomycesbruxellensis、Rhizopus orizae或Zygosaccharomyces bailii。
除了编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列以外，根据本发明的重组真核细胞可包含其它遗传修饰，例如同源核苷酸序列中的突变、缺失或断裂，和/或用编码同源或异源的下述酶的核苷酸序列转化，所述酶在细胞中催化反应，导致提高的朝向琥珀酸的通量。例如可有利地引入、遗传修饰和/或过量表达下述异源和/或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列编码i)催化磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸转化成草酰乙酸的酶；ii)催化从OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶；或iii)催化苹果酸转化成延胡索酸的延胡索酸酶。
可以用催化C3到C4碳分子反应的任何合适的核苷酸序列转化或遗传修饰真核细胞，所述反应例如为磷酸烯醇丙酮酸(PEP,C3)到草酰乙酸(OAA,C4)和丙酮酸(C3)到OAA或苹果酸(C3)。合适的酶是催化PEP转化成OAA的PEP羧激酶(EC 4.1.1.49,EC 4.1.1.38)和PEP羧化酶(EC4.1.1.31)；催化丙酮酸反应成为OAA的丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1.)；或催化丙酮酸反应成为苹果酸的苹果酸酶(EC 1.1.1.38)。
优选地，根据本发明的真核细胞过量表达下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码丙酮酸羧化酶(PYC)，优选地编码在编码PYC的核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的丙酮酸羧化酶，例如包含根据SEQ ID NO:41的氨基酸序列的PYC。优选地，过量表达内源或同源的丙酮酸羧化酶。惊讶地发现，过量表达内源丙酮酸羧化酶导致根据本发明的真核细胞具有提高的琥珀酸生产水平。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞还包含编码异源PEP羧激酶(EC 4.1.1.49)的核苷酸序列，所述PEP羧激酶催化磷酸烯醇丙酮酸成为草酰乙酸的反应。惊讶地发现，与不包含异源PEP羧激酶的真核细胞相比，还包含异源PEP羧激酶的根据本发明的真核细胞生产琥珀酸的量有所提高。优选地，PEP羧激酶来自于细菌，更优选具有PEP羧激酶活性的酶来自于Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或Anaerobiospirillum sp.，更优选地来自于Mannheimia succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes或Anaerobiospirillum succiniciproducens。优选地，在编码PEP羧激酶的核苷酸序列表达后PEP羧激酶在胞质溶胶中有活性，因为发现这导致提高的琥珀酸生产。在一个实施方案中，对Actinobacillus succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)进行修饰，用DAF氨基酸序列代替120-122位的EGY。优选地，根据本发明的真核细胞包含与SEQID NO:14或SEQ ID NO:17具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的PEP羧激酶，优选地，含有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17的PEP羧激酶。惊讶地发现，本文所述PYC和PEP羧激酶的相伴(过量)表达导致琥珀酸生产至少1.5的提高。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞还包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)。胞质溶胶MDH可以是任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶。所述MDH可以是S.cerevisiae MDH3或S.cerevisiae MDH1。优选地，所述MDH缺乏过氧化物酶体或线粒体靶向信号，从而将酶定位于胞质溶胶中。或者，所述MDH是已经修饰的S.cerevisiae MDH2，从而其在存在葡萄糖时不失活，并且在胞质溶胶中有活性。已知向葡萄糖-饥饿的细胞中添加葡萄糖后MDH2的转录被阻抑并且Mdh2p降解。缺失最初12个氨基端氨基酸的Mdh2p对葡萄糖诱导的降解更不易感(Minard和McAlister-Henn,J Biol Chem.1992Aug 25；267(24):17458-64)。优选地，根据本发明的真核细胞包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，所述苹果酸脱氢酶与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。优选地，所述苹果酸脱氢酶包含SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:21。优选地，通过本领域已知的方法过量表达编码核苷酸序列，来提高苹果酸脱氢酶的活性。
优选地，根据本发明的真核细胞还包含编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶的核苷酸序列，所述酶可以是异源或同源酶，例如延胡索酸酶(FUM)。编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶的核苷酸序列可来自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，优选地来自酵母例如Saccharomyces cerevisiae或丝状真菌例如Rhizopus oryzae。优选地，根据本发明的真核细胞包含编码下述延胡索酸酶的核苷酸序列，所述延胡索酸酶与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，优选地为包含SEQ ID NO:23的延胡索酸酶。优选地，在编码具有延胡索酸酶活性的酶的核苷酸序列表达后，具有延胡索酸酶活性的酶在胞质溶胶中有活性。惊讶地发现，还包含具本文所述具有延胡索酸酶活性的酶的真核细胞生产琥珀酸的量有所提高。
在另一个实施方案中，根据本发明的真核细胞包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码二羧酸转运蛋白，优选地编码苹果酸转运蛋白(MAE)。二羧酸转运蛋白可以是同源或异源的蛋白质。优选地，二羧酸转运蛋白是异源蛋白质。二羧酸转运蛋白可来自于任何合适的生物，优选地来自于Schizosaccharomyces pombe。优选地，二羧酸转运蛋白是与SEQ IDNO:36具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的苹果酸转运蛋白(MAE)。优选地，MAE包含SEQ ID NO:36。惊讶地发现，与不包含二羧酸转运蛋白的真核细胞相比，还包含本文所述二羧酸转运蛋白例如苹果酸转运蛋白的本发明真核细胞生产琥珀酸的量有所提高。
本发明还涉及二羧酸转运蛋白例如苹果酸转运蛋白在真核细胞中提高琥珀酸生产的用途。优选地，所述二羧酸转运蛋白来自于Schizosaccharomyces pombe。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞是包含下述核苷酸序列并如本文所述过量表达丙酮酸羧化酶(PYC)的酵母，所述核苷酸序列编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶、苹果酸还原酶、异源延胡索酸酶、异源PEP羧激酶和异源二羧酸转运蛋白，包括上文的优选的实施方案。惊讶地发现，与单独包含任一核苷酸序列的酵母相比，包含编码本文所述酶的核苷酸序列的本发明酵母生产琥珀酸的量有所提高。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞包含：与野生型细胞中酶的活性相比，降低的将NAD(H)转化成NAD+的酶活性。
优选地，根据本发明的细胞是其中至少一种编码醇脱氢酶的基因无功能的细胞。无功能的醇脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其与所有编码醇脱氢酶的基因都有功能的细胞相比包含降低的醇脱氢酶活性。可以通过本领域已知的方法，例如通过突变、断裂或缺失，例如通过Gueldener等2002,Nucleic Acids Research,Vol.30,No.6,e23所公开的方法，使基因变得无功能。优选地，真核细胞是酵母细胞例如Saccharomyces cerevisiae，其中编码醇脱氢酶的一个或多个基因adh1和/或adh2失活。
优选地，根据本发明的细胞还包含至少一种编码无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其中例如通过突变、断裂或缺失编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因而包含降低的甘油-3-磷酸脱氢酶活性，导致与野生型酵母相比降低的甘油形成。惊讶地发现，与其中一个或多个编码醇脱氢酶和/或甘油-3-磷酸脱氢酶的基因未失活的细胞相比，包含降低的醇脱氢酶活性和/或甘油-3-磷酸脱氢酶活性和NAD(H)-依赖型延胡索酸酶的真核细胞得到提高的琥珀酸生产。
本发明还涉及用于生产琥珀酸的方法，所述方法包括发酵下述真核细胞，所述真核细胞的至少一个编码醇脱氢酶的基因无功能和/或至少一个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因无功能。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的重组真核细胞包含至少一种编码无功能的琥珀酸脱氢酶的基因。无功能的琥珀酸脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其通过突变、断裂或缺失至少一种编码琥珀酸脱氢酶的基因而包含降低的琥珀酸脱氢酶活性，导致与野生型细胞相比提高的琥珀酸形成。包含编码无功能琥珀酸脱氢酶的基因的真核细胞可以例如是Aspergillus niger，优选地为其中一个或多个编码琥珀酸脱氢酶的基因(例如sdhA和sdhB)无功能的Aspergillus niger，例如通过缺失这些基因来实现。
优选地，根据本发明的真核细胞是酵母，优选地为Saccharomycescerevisiae，优选地为包含一个或多个选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的核苷酸序列。根据本发明的真核细胞也可以是丝状真菌，优选地为A.niger，优选地为包含一个或多个选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核苷酸序列的A.niger。
优选地，包含本文所述任一遗传修饰的本发明真核细胞能够生产至少0.3、0.5、0.7g/L的琥珀酸，优选地至少1g/L的琥珀酸，优选地至少1.5g/L，优选地至少2g/L或2.5、4.5g/L，优选地至少8、10、15或20g/L的琥珀酸，但是通常低于200g/L或低于150g/L。
根据本发明的优选的真核细胞可以能够在本领域已知的任何合适碳源上生长，并将其转化为琥珀酸。真核细胞可以能够直接转化植物生物量、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的宿主生物表达将纤维素转化为葡萄糖单体和将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体的酶，例如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化为葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，细胞能够转化选自下组的碳源，所述组由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖(raffinose)、乳糖和甘油组成。
在另一方面中，本发明涉及用于制备琥珀酸的方法，所述方法包括发酵根据本发明的真核细胞，其中琥珀酸被制备。
发现：在生产琥珀酸的方法中，使用根据本发明的真核细胞是有利的，因为大部分真核细胞不需要无菌条件用于繁殖，并且对噬菌体感染不敏感。
优选地，在根据本发明的方法中制备的琥珀酸被进一步转化成期望的产物。期望的产物可以例如是聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)、消冰剂或表面活性剂。
根据本发明的方法可以在需氧和缺氧的条件下进行。优选地，所述方法在缺氧条件下或微需氧或氧受限的条件下进行。缺氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，其在无氧时进行，或其中基本无氧(优选地少于5、2.5或1mmol/L/h)被消耗，并且其中有机分子发挥电子供体以及电子受体两种作用。
氧受限的发酵方法是其中氧消耗受从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵装置的实际混合/物量转移性能决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率至少为5.5mmol/L/h，更优选地至少为6mmol/L/h，甚至更优选地至少为7mmol/L/h。
根据本发明的用于生产琥珀酸的方法可以在1和9之间的任何合适的pH下进行。优选地，发酵液中的pH在2和7之间，优选地在3和5之间。发现：能够在低pH下进行根据本发明的方法是有利的，因为这防止细菌污染。另外，因为琥珀酸生产期间pH降低，所以将pH保持在期望水平需要更少量的滴定剂。
可以进行根据本发明的方法的合适温度在5℃和60℃之间，优选地在10℃和50℃之间，更优选地在15℃和35℃之间，更优选地在18℃和30℃之间。本领域技术人员已知哪些最适温度适用于发酵特定真核细胞。
优选地，通过本领域已知的合适方法，例如通过结晶和铵沉淀，从发酵液中回收琥珀酸。
优选地，在根据本发明的方法中制备的琥珀酸被进一步转化成药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。琥珀酸可以被进一步转化成聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)或由其衍生的任何合适的聚合物。
本发明还涉及包含能够通过根据本发明的方法获得的琥珀酸的发酵液。
本发明涉及通过酵母或丝状真菌作为琥珀酸生产者来生产琥珀酸的方法，其中使用来自Trypanosoma brucei的延胡索酸还原酶提高琥珀酸生产，其中优选地所述延胡索酸还原酶在胞质溶胶中有活性。
      遗传修饰
标准的遗传技术例如宿主细胞中酶的过量表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术是本领域已知的方法，例如如Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版),Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press或F.Ausubel等编,"Currentprotocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)中所述。用于真菌宿主细胞转化、遗传修饰等等的方法从EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中已知。
以下实施例仅用于阐述的目的，而不应解释为限制本发明。
附图说明
图1：用于在A.niger中表达延胡索酸还原酶的pGBTOP-11载体的图谱。
图2：pGBS414SUS-07的质粒图谱，其编码来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。CPO代表经密码子对优化的。
图3：pGBS414SUS-08的质粒图谱，其编码来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。CPO代表经密码子对优化的。
图4：pDEL-SDHA的质粒图谱。
图5：用于在A.niger中过量表达FRDm1的质粒pGBTPAn1的图谱。
图6：sdhA的置换流程
图7：pGBS416FRD-1的质粒图谱，其编码来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。CPO代表经密码子对优化的。
图8：pGBS416FRE-1的质粒图谱，其编码来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。CPO代表经密码子对优化的。
图9：pGBS414PPK-1的质粒图谱，其含有来自Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶(PCKa)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH1启动子-PCKa-TDH1终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图10：pGBS414PPK-2的质粒图谱，其含有来自Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶(PCKa)和来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKa-TDH1终止子和TDH3启动子-FRDm1-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图11：pGBS414PPK-3的质粒图谱，其含有来自Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶(PCKa)和来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKa-TDH1终止子和TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图12：pGBS414PEK-1的质粒图谱，其含有来自Mannheimiasucciniciproducens的PEP羧激酶(PCKm)(用于在Saccharomycescerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKm-TDH1终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图13：pGBS414PEK-2的质粒图谱，其含有来自Mannheimiasucciniciproducens的PEP羧激酶(PCKm)和来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKm-TDH1终止子和TDH3启动子-FRDm1-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图14：pGBS414PEK-2的质粒图谱，其含有来自Mannheimiasucciniciproducens的PEP羧激酶(PCKm)和来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKm-TDH1终止子和TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。CPO代表经密码子对优化的。
图15：pGBS415FUM-2的质粒图谱，其含有来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(FUMR)和最初12个氨基酸截短的来自Saccharomycescerevisiae的细胞质苹果酸脱氢酶(Δ12N MDH2)(用于在Saccharomycescerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-FUMR-TDH1终止子和TDH3启动子-MDH3-TDH3终止子克隆进表达载体pRS415中。CPO代表经密码子对优化的。
图16：pGBS415FUM-3的质粒图谱，其含有来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(FUMR)和来自Saccharomyces cerevisiae的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(MDH3)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH 1启动子-FUMR-TDH1终止子和TDH3启动子-MDH3-TDH3终止子克隆进表达载体pRS415中。CPO代表经密码子对优化的。
图17：菌株SUC-101(O，空载体对照)、SUC-148(■，PCKa、MDH3、FUMR、FRDm1的过量表达)、SUC-149(□，PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)、SUC-150(◆，PCKm、MDH3、FUMR、FRDm1)、SUC-151(◇，PCKm、MDH3、FUMR、FRDg)、SUC-152(●，PCKa、MDH3、FUMR)、SUC-154(X，PCKm、MDH3、FUMR)和SUC-169(▲，PCKm、Δ12NMDH2、FUMR、FRDm1)中的琥珀酸水平。针对在S.cerevisiae中的表达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。所有数据代表SUC-148、149、150、151、152、154和SUC-169的3个独立生长实验和SUC-101的6个独立生长实验的均值。
图18：pGBS416MAE-1的质粒图谱，其含有来自Schizosaccharomyces pombe的苹果酸通透酶(SpMAE1)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体Eno1启动子-MAE1-Eno1终止子克隆进表达载体pRS416中。CPO代表经密码子对优化的。
图19：菌株SUC-101(O，空载体对照)、SUC-169(□，PCKm、Δ12NMDH2、FUMR、FRDm1)和SUC-194(■，Δ12NMDH2、FUMR、FRDm1、SpMAE1)中的琥珀酸水平。针对在S.cerevisiae中的表达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。所有数据代表SUC-169和SUC-194的3个独立生长实验和SUC-101的6个独立生长实验的均值。
图20：菌株SUC-103(O，adh1/2和gpd1缺失突变体；空载体对照)、SUC-201(□，adh1/2和gpd1缺失突变体；PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)和SUC-200(■，adh1/2和gpd1缺失突变体；PCKa、MDH3、FUMR、FRDg、SpMAE1)中的琥珀酸水平。针对在S.cerevisiae中的表达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。
图21：pGBS426PYC-2的质粒图谱，其含有来自Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。使用来自菌株CEN.PK113-5D的基因组DNA作为模板，通过PCR获得编码PYC2的核苷酸序列，并将PCR产物克隆进表达载体P426GPD中。
图22：pGBS414FRE-1的质粒图谱，其编码来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)(用于在Saccharomyces cerevisiae中表达)。将合成基因构建体TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。
图23：菌株SUC-226(□，PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)、-227(▲，PYC2、PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)、SUC-228(■，PYC2、MDH3、FUMR、FRDg)和SUC-230(O，MDH3、FUMR、FRDg)中的琥珀酸水平。数据代表3个独立生长实验的均值。
具体实施方式
      实施例
      实施例1：在Aspergillus niger中克隆来自Trypanosoma brucei的延胡索酸 还原酶
1.1.表达构建体
使用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)Bendtsen,J.等(2004)Mol.Biol.,340:783-795和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)Emanuelsson,O.等(2007)NatureProtocols 2,953-971，针对信号序列的存在，分析来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)[E.C.1.3.1.6],GenBank查询号60460035。鉴定了蛋白质N-端一半中推定的线粒体靶向序列，其在25和26位之间包含可能的切割位点(D-S)。
显示：缺少68个N-端残基的FRDm1重组蛋白质重新定位于procyclic trypanosomes的胞质溶胶中(Coustou等,J Biol Chem.2005 Apr29；280(17):16559-70)。这些结果表明FRDm1的预测的N-端信号基序是靶向至线粒体所需要的。从SEQ ID NO:1(对应于核苷酸序列SEQ ID NO:2)中去除最初68个氨基酸并再引入新的甲硫氨酸氨基酸，得到SEQ IDNO:3。如WO2008/000632中所公开的，针对A niger对SEQ ID NO:3进行密码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO:7置于组成型GPDA启动子序列SEQ ID NO:11之后，其中用最优的Kozak序列CACCGTAAA替换最后10个核苷酸序列。添加便利的限制性消化位点。将SEQ ID NO:7中的终止密码子TAA修饰为TAAA。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的序列。使用适当的限制性消化位点将片段SnaBI、SfiI克隆进A.niger表达载体pGBTOPH(图1)中。将得到的包含FRDm1的质粒称作pGBTOPAn1(图5)。
类似地，使用具有真菌特异性预测功能的PTS1预测器http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp分析来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)[E.C.1.3.1.6]，GenBank查询号23928422在丝状真菌中的过氧化物酶体靶向。从蛋白质SEQ ID NO:4(对应于核苷酸序列SEQ ID NO:5)中去除1140-1142位的C-端氨基酸(SKI)，得到SEQ ID NO:6。针对A.niger对SEQ ID NO:6进行如PCT/EP2007/05594中所公开的密码子对方法。将SEQ ID NO:8中的终止密码子TAA修饰为TAAA。将得到的序列SEQ ID NO:8置于组成型GPDA启动子序列SEQ ID NO:11之后，并添加便利的限制性消化位点。在Sloning(Puchheim，德国)合成得到的序列。使用适当的限制性消化位点将片段SnaBI、SfiI克隆进A.niger表达载体pGBTOPH(图1)中。
1.2.A.niger的转化
A.niger WT-1：该A.niger菌株是包含编码葡糖淀粉酶(glaA)、真菌淀粉酶和酸性淀粉酶的基因缺失的CBS513.88。通过使用如EP 0 635 574 B1中所述的“无标记物基因”("MARKER-GENE FREE")途径构建A.nigerWT-1。
根据Tilburn,J.等(1983)Gene 26,205-221和Kelly,J.&Hynes,M.(1985)EMBO J.,4,475-479中所述方法，使用以下修饰用表达构建体共转化菌株A.niger WT-1：
-在Aspergillus最小培养基(100ml)中，在置于300rpm旋转摇床中的摇瓶中，在30℃下使孢子萌发并培养16小时。每升Aspergillus最小培养基含有：6g NaNO3、0.52g KCl、1.52g KH2PO4、1.12ml 4M KOH、0.52g MgSO4.7H2O、10g葡萄糖、1g水解酪蛋白氨基酸、22mgZnSO4.7H2O、11mg H3BO3、5mg FeSO4.7H2O、1.7mg CoCl2.6H2O、1.6mg CuSO4.5H2O、5mg MnCl2.2H2O、1.5mg Na2MoO4.2H2O、50mgEDTA、2mg核黄素、2mg硫胺-HCl、2mg烟酰胺、1mg吡哆醇-HCL、0.2mg泛酸、4g生物素、10ml青霉素(5000IU/ml)、链霉素(5000UG/ml)溶液(Gibco)。
-使用Novozym 234TM(Novo Industries)代替螺旋酶来制备原生质体；
-原生质体形成(60-90分钟)后，添加KCl缓冲液(0.8M KCl、9.5mM柠檬酸，pH 6.2)至45ml的终体积，将原生质体悬浮液在4℃下于摆动桶转子(swinging-bucket rotor)中3000rpm离心10分钟。将原生质子重悬于20ml KC缓冲液中，随后添加25ml SYC缓冲液(1.2M山梨糖醇、10mM Tris-HCl pH 7.5，50mM CaCl2)。将原生质体悬浮液在4℃下于摆动桶转子中3000rpm离心10分钟，在STC-缓冲液中洗涤，并以10E8原生质体/ml的浓度重悬于STC-缓冲液中；
-向200微升原生质体悬浮液中，添加溶于100微升TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5,0.1mM EDTA)中的DNA片段和100微升PEG溶液(20％PEG 4000(Merck)、0.8M山梨糖醇、10mM Tris-HCl pH 7.5、50mM CaCl2)。
-将DNA-原生质体悬浮液在室温下孵育10分钟后，缓慢添加1.5mlPEG溶液(60％PEG 4000(Merck)、10mM Tris-HCl pH 7.5、50mMCaCl2)，期间对管加以重复混合。在室温下孵育20分钟后，用5ml 1.2M山梨糖醇稀释悬浮液，通过翻转混合，并在室温下于4000rpm离心10分钟。将原生质体柔和地重悬于1ml 1.2M山梨糖醇中，并置于固体选择性再生培养基上，所述培养基由的任一Aspergillus最小培养基(不含核黄素、硫胺、HCl、烟酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、水解酪蛋白氨基酸和葡萄糖)组成。在乙酰胺选择的情况下，培养基含有10mM乙酰胺作为唯一氮源，以及1M蔗糖作为渗压剂和C-源。或者将原生质体涂布在下述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Oxoid)上，所述PDA补充有1-50微克/ml腐草霉素和1M蔗糖作为渗压剂。使用2％琼脂(琼脂No.1,Oxoid L11)固化再生平板。在30℃孵育6-10天后，将转化体的分生孢子转移至由含2％葡萄糖和1.5％琼脂糖(Invitrogen)的Aspergillus选择性培养基(在乙酰胺选择的情况下含有乙酰胺作为唯一氮源的最小培养基，或在腐草霉素选择的情况下补充有1-50微克/ml腐草霉素的PDA)构成的平板上，并在30℃下孵育5-10天。分离单个转化体并将该选择性纯化步骤重复一次，之后储藏经纯化的转化体。
1.3.A.niger的摇瓶生长
对每个构建体而言总计选择10个转化体，使用构建体特异性引物通过PCR证实构建体的存在。随后将孢子接种于100ml含100g/l葡萄糖的Aspergillus最小富集培养基中。在34℃下将菌株在250rpm的培养箱中培养4天。通过HPLC分析培养基上清液的草酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸形成，并与未经转化的菌株比较。
1.4HPLC分析
进行HPLC来测定不同种类样品中的有机酸和糖。Phenomenex Rezex-RHM-单糖柱上的分离原则基于使用反相机制的离子交换、离子排除和尺寸排除。检测通过示差折射系数(differential refractive index)和紫外检测器进行。
      实施例2A
      在Saccharomyces cerevisia中克隆来自Trypanosoma brucei的延胡索酸还原 酶
2A.1.表达构建体
如章节1.1中针对在S.cerevisiae中的表达所述，针对信号序列的存在，分析来自Trypanosoma brucei的线粒体延胡索酸还原酶m1(FRDm1)[E.C.1.3.1.6]GenBank查询号60460035中。将得到的序列SEQ ID NO:9置于组成型TDH3启动子序列SEQ ID NO:12之后和TDH3终止子序列SEQ IDNO:13之前，并添加便利的限制性消化位点。将SEQ ID NO:9中的终止密码子TGA修饰为TAAG。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的序列。BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)后，随后在该载体中连接由延胡索酸还原酶合成基因构建体组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，制造表达载体pGBS414SUS-07(图2)。使用连接混合物转化E.coli DH 10B(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414SUS-07(图2)。
类似地，针对过氧化物酶体靶向，分析来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)[E.C.1.3.1.6],GenBank查询号23928422，并如章节1.1中所述针对在S.cerevisiae中的表达应用密码子对优化。将得到的序列SEQ ID NO:10置于组成型TDH3启动子序列SEQ IDNO:12之后和TDH3终止子序列SEQ ID NO:13之前，并添加便利的限制性消化位点。将SEQ ID NO:10中的终止密码子TGA修饰为TAAG。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的序列。BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)后，随后在该载体中连接由延胡索酸还原酶合成基因构建体组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达载体pGBS414SUS-08(图3)。使用连接混合物转化E.coli DH 10B(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414SUS-08(图3)。
将构建体pGBS414SUS-07和pGBS414SUS-08独立地转化进S.cerevisiae菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289)、RWB066(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox)和RWB064(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox)中。将转化混合物涂布在补充有适当氨基酸的酵母氮基础(YNB)w/o AA(Difco)+2％葡萄糖上。将转化体接种于包含葡萄糖、补充有适当氨基酸的Verduyn培养基(Verduyn等,1992,Yeast.Jul；8(7):501-17)中，并在摇瓶中于需氧、缺氧和氧受限条件下生长。用于缺氧培养的培养基补充有溶于乙醇中的0.42g/l Tween 80和0.01g/l麦角固醇(Andreasen和Stier,1953,J.cell.Physiol,41,23-36；Andreasen和Stier,1954,J.Cell.Physiol,43:271-281)。所有酵母培养物在30℃下于250-280rpm的摇动培养箱中生长。在不同的孵育时间取出培养物的小份试样，离心并如章节1.4中所述通过HPLC分析草酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸形成。
      实施例2B
      在Saccharomyces cerevisiae中克隆来自Trypanosoma brucei的延胡索酸还 原酶
2B.1.表达构建体
以与实施例2A.1中所公开相似的方式，将来自Trypanosoma brucei的延胡索酸还原酶(FRDm,SEQ ID NO:9)连接进S.cerevisiae表达载体pRS416(Sirkoski R.S.和Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)中。使用连接混合物转化E.coli TOP10细胞(Invitrogen)，得到酵母表达构建体和pGBS416FRD-1(图7)。
类似地，将来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg,SEQ ID NO:10)连接进S.cerevisiae表达载体pRS416中。使用连接混合物转化E.coli TOP10细胞(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS416FRE-1(图8)。
2B.2.转化和微量滴定板(MTP's)生长实验
将构建体pGBS416FRD-1和pGBS416FRE-1独立地转化进S.cerevisiae菌株CEN.PK1 13-5D(MATA ura3-52)中。作为阴性对照，将空载体pRS416转化进菌株CEN.PK 113-5D中。将转化混合物涂布在酵母氮基础(YNB)w/o AA(Difco)+2％葡萄糖上。将以下数量的个体转化体一式两份(in duplo)接种于96深孔MTP中250微升包含2％葡萄糖的Verduyn培养基中，并在30℃、550rpm和80％的湿度下，在Infors微量培养板摇动培养箱中预培养：12个pGBS416FRD-1(FRDm1)、12个pGBS416FRE-1(FRDg)和24个pRS416空载体对照转化体。3天后将MTP平板孔中存在的25微升预培养物转移至含有Verduyn培养基的新的96深孔MTP中，所述Verduyn培养基含有葡萄糖和CaCO3(终浓度：250微升总体积中葡萄糖10％，CaCO31％w/v)。在30℃、550rpm和80％湿度下在Infors微量培养板摇动培养箱中生长3天和7天后，将MTP以2000rpm离心2分钟，使用Multimek 96(Beckman)收获200微升上清液。如实施例1.4中所述通过HPLC分析上清液中琥珀酸的存在。结果展示于表1中。
表1.在S.cerevisiae中引入来自T.brucei的线粒体(FRDm1)和糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)对培养3天和7天后琥珀酸生产水平的影响。
      
表1中的结果显示，引入并过量表达来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)导致提高的琥珀酸生产水平(孵育3天后2.74倍，p＝6.96E-14，学生t-检验，孵育7天后1.97倍，p＝8.63E-14，学生t-检验)。
类似地，引入并过量表达来自T.brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)导致提高的琥珀酸生产水平(孵育3天后3.55倍，p＝5.08E-32，学生t-检验，孵育7天后2.55倍的增加，p＝8.63E-25，学生t-检验)。
      实施例2C
      在Saccharomyces cerevisiae中表达来自Actinobacillus succinogenes或 Mannheimia succiniciproducens的PEP羧激酶和来自Saccharomyces  cerevisiae的苹果酸脱氢酶和来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶和来自 Trypanosoma brucei的延胡索酸还原酶
2C.1.基因序列
      磷酸烯醇丙酮酸羧激酶：
使用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)Bendtsen,J.等(2004)Mol.Biol.,340:783-795和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)Emanuelsson,O.等(2007)NatureProtocols 2,953-971，针对信号序列的存在，分析来自Actinobacillussuccinogenes的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[E.C.4.1.1.49],GenBank查询号152977907。Schlüter等,Nucleic acid Research 2007,35,D815-D822描述的分析揭示了115-123位的推定的PTS2信号序列。通过用DAF替换120-122位上的氨基酸EGY来修饰A.succinogenes序列，使其模拟Mannheimia succiniciproducens蛋白质序列，得到氨基酸序列SEQ ID NO:14(核苷酸序列SEQ ID NO:15)。针对S.cerevisiae对序列SEQ ID NO:14进行如WO2008/000632中公开的密码子对方法。将得到的序列SEQ IDNO:16中的终止密码子TAA修饰成TAAG。将含有终止密码子TAAG的该SEQ ID NO:16置于组成型TDH1启动子序列SEQ ID NO:25之后和TDH1终止子序列SEQ ID NO:26之前，并添加便利的限制性消化位点。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的序列SEQ ID NO:29。
类似地，如Schlüter等,(2007)NAR,35,D815-D822所述，针对信号序列的存在，分析来自Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[E.C.4.1.1.49]、GenBank查询号52426348。如SEQ ID NO:17中所示的序列不需要修饰。随后针对S.cerevisiae对SEQ ID NO：17进行如WO2008/000632中公开的密码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO:18中的终止密码子TAA修饰成TAAG。将含有终止密码子TAAG的SEQ IDNO:18置于组成型TDH1启动子序列SEQ ID NO:25之后和TDH1终止子序列SEQ ID NO:26之前。添加便利的限制性消化位点。得到的合成构建体(SEQ ID NO:30)在Sloning(Puchheim,德国)合成。
      苹果酸脱氢酶：
细胞质苹果酸脱氢酶(Mdh2p)[E.C.1.1.1.37],GenBank查询号171915由碳分解代谢物阻抑调节：向葡萄糖-饥饿的细胞中添加葡萄糖后MDH2的转录被阻抑并且Mdh2p被降解。12个氨基端氨基酸缺失的Mdh2p对葡萄糖诱导的降解更不易感(Minard和McAlister-Henn,J Biol Chem.1992Aug 25；267(24):17458-64)。为了避免葡萄糖诱导的Mdh2降解，去除编码最初12个氨基酸的核苷酸，并引入新的甲硫氨酸氨基酸(SEQ ID NO:19)，用于在S.cerevisiae中过量表达Mdh2。针对S.cerevisiae对SEQ IDNO:19进行如WO2008/000632中公开的密码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO:20中的终止密码子TAA修饰成TAAG。将含有经修饰的终止密码子TAAG的SEQ ID NO:20(编码Δ12NMDH2)置于组成型TDH3启动子序列SEQ ID NO:12之后和TDH3终止子序列SEQ ID NO:13之前，并添加便利的限制性消化位点。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的合成构建体(SEQ ID NO:31)。
使用具有真菌特异性预测功能的PTS1预测器http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp，针对在丝状真菌中的过氧化物酶体靶向，对过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(Mdh3p)[E.C.1.1.1.37],GenBank查询号1431095加以分析。从蛋白质MDH3中去除341-343(SKL)位的C-端氨基酸(SKI)，得到SEQ ID NO:21。针对S.cerevisiae对SEQ ID NO:21进行如WO2008/000632中公开的密码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO:22中的终止密码子TGA修饰成TAAG。将含有TAAG作为终止密码子的SEQ ID NO:22合成在组成型TDH3启动子序列SEQ ID NO:27之后(起始密码子上游600bp)和TDH3终止子序列SEQID NO:28之前(终止密码子下游300bp)，并添加便利的限制性消化位点。在Sloning(Puchheim,德国)合成得到的序列SEQ ID NO:32。
      延胡索酸酶：
使用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)Bendtsen,J.等(2004)Mol.Biol.,340:783-795和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)Emanuelsson,O.等(2007)NatureProtocols 2,953-971，针对信号序列的存在，分析来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(FUMR)[E.C.4.2.1.2]，GenBank查询号469103。鉴定了蛋白质最初23个氨基酸中推定的线粒体靶向序列。为了避免S.cerevisiae中可能的到线粒体的靶向，从FumR中去除最初23个氨基酸并引入甲硫氨酸氨基酸，得到SEQ ID NO:23。针对S.cerevisiae，对SEQ ID NO:23进行WO2008/000632中公开的密码子对方法，得到SEQ ID NO:24。将SEQ IDNO:24中的终止密码子TAA修饰为TAAG。将含有TAAG作为终止密码子的核苷酸序列SEQ ID NO:24合成在组成型TDH1启动子序列SEQ IDNO:25之后和TDH1终止子序列SEQ ID NO:26之前，并添加便利的限制性位点。得到的合成构建体SEQ ID NO:33在Sloning(Puchheim，德国)合成。
      延胡索酸还原酶：
如2A.1所述设计和合成来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)和糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)的基因序列。
2C.2.表达构建体的构建
BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)并随后在该载体中连接由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(来源Actinobacillus succinogenes)合成基因构建体(SEQID NO:29)组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS414PPK-1(图9)、pGBS414PPK-2(图10)和pGBS414PPK-3(图11)。使用连接混合物转化E.coli DH 10B(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBS414PPK-1。为了得到pGBS414PPK-2，将由来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)合成基因构建体(SEQ ID NO:34)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS414PPK-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-2(图10)。为了得到pGBS414PPK-3，将由来自T.brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)合成基因构建体(SEQ ID NO:35)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS414PPK-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-3(图11)。
BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)并随后在该载体中连接由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(来源Mannheimia succiniciproducens)合成基因构建体(SEQ ID NO:30)组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS414PEK-1(图12)、pGBS414PEK-2(图13)和pGBS414PEK-3(图14)。使用连接混合物转化E.coli DH 10B(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PEK-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBS414PEK-1。为了得到pGBS414PEK-2，将由来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)合成基因构建体(SEQ ID NO:34)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS414PEK-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PEK-2(图13)。为了得到pGBS414PEK-3，将由来自T.brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)合成基因构建体(SEQ ID NO:35)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS414PEK-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PEK-3(图14)。
BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS415(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)并随后在该载体中连接由延胡索酸酶(来源Rhizopus oryzae)合成基因构建体(SEQ ID NO:33)组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS415FUM-2(图15)和pGBS415FUM-3(图16)。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415FUM-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBS415FUM-1。为了得到pGBS415FUM-2，将由来自S.cerevisiae的细胞质苹果酸脱氢酶(Δ12N MDH2)合成基因构建体(SEQ IDNO:31)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS415FUM-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415FUM-2(图15)。为了得到pGBS415FUM-3，将由来自S.cerevisia的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(MDH3)合成基因构建体(SEQ ID NO:32)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS415FUM-1载体中。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415FUM-3(图16)。
2C.3.S.cerevisiae菌株
将质粒pGBS414PPK-1、pGBS414PPK-2、pGBS414PPK-3、pGBS414PEK-1、pGBS414PEK-2、pGBS414PEK-3、pGBS415FUM-2、pGBS415-FUM-3的不同组合转化进S.cerevisiae菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289)中，得到表2中展示的酵母菌株。除了所述质粒以外，转化pRS416(空载体)创建原养型的酵母菌株。通过电穿孔将表达载体转化进酵母中。将转化混合物涂布于酵母氮基础(YNB)w/oAA(Difco)+2％葡萄糖上。
表2：实施例2C构建的酵母菌株。
      
      
2D.4.生长实验和琥珀酸生产
将转化体接种于20ml预培养基中并在30℃和250rpm下在摇动培养箱中100ml摇瓶中于需氧条件下培养，所述预培养基由含有2％葡萄糖(w/v)的Verduyn培养基(Verduyn等,1992,Yeast.Jul；8(7):501-17)组成。72小时后将培养物在4750rpm下离心5分钟。使用1ml上清液，如章节1.4中所述通过HPLC测量琥珀酸水平。倾析剩余的上清液，将沉淀物(细胞)重悬于1ml生产培养基中。生产培养基由含10％半乳糖(w/v)和1％CaCO3(w/v)的Verduyn培养基组成。将重悬的细胞接种于100ml摇瓶中50ml生产培养基中，并于30℃和100rpm下在摇动培养箱中培养。在不同的时间点从培养物中取出1ml样品。如章节1.4中所述通过HPLC测量琥珀酸水平(图17)。
用空载体转化的菌株(对照菌株)生产至多0.3g/L琥珀酸。来自M.succiniciproducens的PEP羧激酶(PCKm)、来自S.cerevisiae的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(MDH3)和来自R.oryzae的延胡索酸酶(FUMR)的过量表达导致0.9g/L的琥珀酸生产。来自A.succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)、MDH3和FUMR的过量表达导致琥珀酸生产轻微提高至1.0g/L。这些结果显示在所述的S.cerevisiae中，琥珀酸生产被提高约3倍。
来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)的额外过量表达进一步提高了琥珀酸生产水平；PCKa、MDH3、FUMR、FRDm1的过量表达导致2.6g/L的琥珀酸生产，PCKm、MDH3、FUMR和FRDm1的过量表达导致2.7g/L的琥珀酸生产。Δ12NMDH2与PCKm、FUMR和FRDm1组合的过量表达导致2.7g/L的琥珀酸生产，表明使用截短的MDH2或MDH3中任一时生产相似水平的琥珀酸。来自T.brucei的糖酵解酶体延胡索酸还原酶(FRDg)的额外过量表达导致甚至更高的琥珀酸生产水平；PCKa、MDH3、FUMR和FRDg的过量表达导致3.9g/L的琥珀酸生产，而PCKm、MDH3、FUMR和FRDg的过量表达导致略微更低的3.6g/L的琥珀酸生产。
结果显示：在包含PCKa/m、MDH3和FUMR的遗传修饰的S.cerevisiae中，添加本文公开的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶显著地提高了琥珀酸生产水平。
与S.cerevisiae中FRDm1的过量表达相比，FRDg的过量表达对S.cerevisiae中琥珀酸生产水平具有更积极的影响。
      实施例2D
      在生产琥珀酸的S.cerevisia细胞中过量表达二羧酸转运蛋白对琥珀酸生产 的影响
2D.1.基因序列
针对S.cerevisiae，对来自Schizosaccharomyces pombe的苹果酸通透酶GenBank查询号119368831(SEQ ID NO:36)进行WO2008/000632中公开的密码子对方法，得到SEQ ID NO:37。将SEQ ID NO:37中的终止密码子TAA修饰为TAAG。将含有TAAG作为终止密码子的SEQ ID NO:37置于组成型ENO1启动子序列SEQ ID NO:38之后和ENO1终止子序列SEQ ID NO:39之前，添加便利的限制性消化位点。在ENO1启动子中，将596(-5)位的T更换为A，从而获得更好的Kozek序列。得到的序列SEQ ID NO:40在Sloning(Puchheim，德国)合成。
2D.2.表达构建体的构建
BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS416(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)并随后在该载体中连接由Schizosaccharomyces pombe苹果酸转运蛋白合成基因构建体(SEQ ID NO:40)组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS416MAE-1(图18)。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-1。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS416MAE-1。
2D.3.S.cerevisiae菌株
通过将质粒pGBS414PEK-2、pGBS415FUM-2和pGBS416MAE-1(描述于2C.2中)转化进S.cerevisiae菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3-52leu2-112 trp1-289)中，获得过量表达PCKm、Δ12NMDH2、FUMR、FRDm1和SpMAE1的菌株SUC-194。针对在S.cerevisiae中的表达对所有基因进行密码子对优化。
通过电穿孔将表达载体转化进酵母中。将转化混合物涂布于酵母氮基础(YNB)w/o AA(Difco)+2％葡萄糖上。菌株SUC-101被描述于表2中。
表3：实施例2D中构建的酵母菌株。
      
2D.4.生长实验和野生型GEN.PK菌株中的琥珀酸生产
如实施例2C.4中所述进行生长参数和样品分析，所述分析具有以下变更：使用2％葡萄糖(w/v)作为碳源进行预培养。在生产培养基中使用10％葡萄糖(w/v)作为碳源。
用空载体转化的菌株(对照菌株)生产至多0.3g/L的琥珀酸。菌株SUC-194中SpMAE1的额外过量表达，过量表达PCKm、Δ12NMDH2、FUMR和FRDm1导致琥珀酸生产水平提高至4.6g/L，而过量表达PCKm、Δ12NMDH2、FUMR和FRDm1的菌株SUC-132导致2.7g/L的琥珀酸生产。
结果显示在包含本文所述遗传修饰的S.cerevisiae中插入苹果酸转运蛋白进一步将琥珀酸生产提高至至少1.5倍。
      实施例2E
      缺失醇脱氢酶1和2基因(adh1、adh2)和甘油-3-磷酸脱氢酶1基因 (gpd1)的S.cerevisiae中，二羧酸转运蛋白对琥珀酸生产水平的影响。
2E.1.基因序列
描述于2D.1中。
2E.2.表达构建体的构建
描述于2D.2中。
2E.3.S.cerevisiae菌株
将质粒pGBS414PPK-3、pGBS415FUM-3和pGBS416MAE-1(描述于2C.2中)转化进S.cerevisiae菌株RWB064(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox)中，产生过量表达PCKa、MDH3、FUMR、FRDg和SpMAE1的菌株SUC-201。针对在S.cerevisiae中的表达对所有基因进行密码子对优化。
表4：实施例2E中构建的酵母菌株。
      
      
2E.4.生长实验和缺失醇脱氢酶1和2基因(adh1、adh2)和甘油-3-磷酸脱氢酶1基因(gpd1)的CEN.PK菌株中的琥珀酸生产
如实施例2C.4中所述进行生长参数和样品分析，所述分析具有以下变更：使用2％半乳糖(w/v)作为碳源进行预培养。在t＝0、3和7天时向生产培养基中添加5％半乳糖(w/v)。
在生长培养基中生长10天后，用空载体转化的菌株(对照菌株)SUC-103生产0.9g/L的琥珀酸(图20)。菌株RWB064中PCKa、MDH3、FUMR和FRDg的过量表达导致琥珀酸生产被提高至2.5g/L(菌株SUC-201，图20)。菌株RWB064中除PCKa、MDH3、FUMR和FRDg以外SpMAE1的额外过量表达导致琥珀酸生产水平被进一步提高至11.9g/L(菌株SUC-200，图20)。
结果显示在缺失醇脱氢酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因的S.cerevisiea中，苹果酸转运蛋白的过量表达导致琥珀酸生产水平的显著提高。另外还显示与野生型菌株(SUC 101，表2)相比，缺失基因adh1、adh2和gpd1(SUC 103)导致提高的琥珀酸生产。
      实施例2F
      在Saccharomyces cerevisiae中克隆来自Actinobacillus succinogenes的 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、来自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸羧化酶、 来自Saccharomyces cerevisiae的苹果酸脱氢酶、来自Rhizopus oryzae的延 胡索酸酶和来自Trypanosoma brucei的延胡索酸还原酶。
2F.1.基因序列
来自A.succinogenes的PEP羧激酶、来自S.cerevisiae的苹果酸脱氢酶、来自R.oryzae的延胡索酸酶和来自T.brucei的延胡索酸还原酶描述于2F.1。来自Saccharomyces cerevisiae的细胞质丙酮酸羧化酶(Pyc2p)[E.C.6.4.1.1.],GenBank查询号1041734,SEQ ID NO:41由核苷酸序列SEQ IDNO:42编码。使用来自S.cerevisiae菌株CEN.PK113-5D(MATA ura3-52)的基因组DNA用作为模板，使用引物P1(SEQ ID NO:43)和P2(SEQ IDNO:44)和Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，根据制造商的说明扩增PYC2编码序列(SEQ ID NO:42)。引物中包括进便利的限制性消化位点，用于进一步克隆的目的。
2F.2.表达构建体的构建
SpeI/XhoI限制性消化S.cerevisiae表达载体p426GPD(Mumberg等,Gene.1995Apr 14；156(1):119-22)并随后在该载体中连接由扩增的PYC2核苷酸序列(SEQ ID NO:42)组成的SpeI/XhoI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS426PYC-2(图21)。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS426PYC-2(图21)。表达载体pGBS414PPK-3和pGBS415FUM-3的构建描述于2C.2中。BamHI/NotI限制性消化S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P,Genetics,1989,122(1):19-27)并随后在该载体中连接由糖酵解酶体延胡索酸还原酶(来源Trypanosoma brucei)合成基因构建体(SEQ ID NO:35)组成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，创建表达构建体pGBS414FRE-1。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414FRE-1(图22)。
2F.3.S.cerevisiae菌株
通过将质粒pGBS414FRE-1、pGBS414PPK-3、pGBS415FUM-1、pGBS426PYC-2和p426GPD的不同组合转化进菌株CEN.PK113-6B(MATAura3-52 leu2-112 trp1-289)中，获得菌株SUC-226、SUC-227、SUC-228和SUC-230，如表5中所示。
表5：实施例2F中构建的酵母菌株。
      
2F.4.生长实验和琥珀酸生产
如实施例2C.4中所述进行生长参数和样品分析，所述分析具有以下变更：使用2％葡萄糖(w/v)作为碳源进行预培养。在生产培养基中使用10％葡萄糖(w/v)作为碳源。
如图23中所示，过量表达MDH3、FUMR和FRDg的菌株SUC-230产生至多3.0g/L的琥珀酸。PCKa的额外过量表达将琥珀酸生产提高至高达3.4g/L(菌株SUC-226)，PYC2的额外过量表达将琥珀酸生产提高至高达3.7g/L(菌株SUC-228)。令人惊讶的是，PCKa和PYC2二者的过量表达(SUC-227)导致与单独的PCK和PYC的作用相比，琥珀酸生产水平被提高至1.5倍，多达5.0g/L。这些结果显示来自A.succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)和来自S.cerevisiae的丙酮酸羧化酶(PYC2)二者的组合过量表达对S.cerevisiae中琥珀酸生产水平的协同作用。
      实施例3：在Aspergillus niger中使编码琥珀酸脱氢酶的基因失活
3.1.鉴定
对Aspergillus niger菌株CBS513.88的基因组DNA进行测序和分析。鉴定了翻译的蛋白质被注释为与琥珀酸脱氢酶蛋白质同源的两个基因，将其分别命名为sdhA和sdhB。sdhA(An16g07150)和sdhB(An02g12770)基因座的序列可以在genbank中分别以查询号145253004和145234071获得。根据已知的原则设计sdhA和sdhB的基因替换载体，并根据常规的克隆步骤构建(见图6)。载体包含sdh ORF的约1000bp侧翼区，用于在预定的基因组基因座处进行同源重组。另外，它们在直接重复中间含有被gpdA启动子驱动的A.nidulans双向amdS选择标记物。这些缺失载体的一般设计先前描述于EP635574B和WO 98/46772中。
3.2.使Aspergillus niger中的sdhA基因失活
如Biotechnology of Filamentous fungi:Technology and Products.(1992)Reed Publishing(USA)；Chapter 6:Transformation p.113to 156中所述，分离缺失载体pDEL-SDHA(图4)的线性DNA，并用于转化Aspergillusniger CBS513.88。所述线性DNA能够在sdhA基因座上整合进基因组中，从而如图6中所示用amdS基因替换sdhA基因。在乙酰胺培养基上选择转化体，并根据EP635574B中所述标准步骤纯化菌落。将孢子涂布在氟乙酰胺培养基上来选择丢失amdS标记物的菌株。通过PCR验证生长的菌落在sdhA基因座上的整合，并通过Southern分析测试候选菌株中sdhA基因的缺失。sdhA基因的缺失可以通过下述DNA片段～2.2kb的尺寸减小(4.6kb野生型片段与成功缺失SDHA的2.4kb相比)来检测，所述DNA片段覆盖整个基因座并且与适当的探针杂交。在约96个初始转化体的库中，约9个菌株显示去除了基因组sdhA基因。
选择菌株dSDHA作为具有失活的sdhA基因的代表性菌株。如实施例4中所述在微量滴定板中测定dSDHA菌株的琥珀酸生产。
      实施例4
      在Aspergillus niger dSDHA中克隆来自Trypanosoma brucei的FRDm
如实施例1.1中所述，用包含截短的线粒体延胡索酸还原酶酶m1(FRDm1，SEQ ID NO:7)的表达构建体pGBTOPAn1(图5)转化实施例3.2的A.niger菌株dSDHA。使用Qpix挑取A.niger转化体并转移至含有Aspergillus选择性培养基的MTP's上。在30℃孵育7天后，用手或菌落采集器将生物质转移至含PDA的微量滴定板(MTP's)上。在30℃孵育7天后，生物质形成孢子。使用Multimek 96(Beckman)将这些孢子重悬于100微升含10％葡萄糖的最小富集的Aspergillus培养基中。随后用30微升孢子悬浮液接种两个MTP's，所述MTP's中有含有10％葡萄糖和1％CaCO3的170微升最小富集的Aspergillus培养基。类似地，在MTP's中接种A.niger菌株dSDHA和CBS513.88。将这些MTP's在34℃、80％湿度下孵育5天。5天后使用Multimek 96(Beckman)收获160微升，并如实施例1.4中所述通过HPLC测定琥珀酸。结果展示于表6中。
表6：在A.niger中缺失琥珀酸脱氢酶(SDHA)和插入来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶(FRDm1)对琥珀酸生产水平的影响。
      
表6清楚地显示，包含来自T.brucei的线粒体延胡索酸还原酶的A.niger具有提高的琥珀酸生产。

Claims (17)

1.包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。
2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述延胡索酸还原酶包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少40％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶来自Trypanosoma sp。
4.根据权利要求1到3中任一项的细胞，其中编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的所述核苷酸序列表达后，所述NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶在胞质溶胶中有活性。
5.根据权利要求1到4中任一项的细胞，其中所述细胞过量表达编码丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求1到5中任一项的细胞，其还包含编码异源磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。
7.根据权利要求1到6中任一项的细胞，其还包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，在编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列表达后，所述苹果酸脱氢酶在胞质溶胶中有活性。
8.根据权利要求1到7中任一项的细胞，其还包含编码下述酶的核苷酸序列，在编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶的核苷酸序列表达后，所述酶在胞质溶胶中催化苹果酸转化成延胡索酸。
9.根据权利要求1到8中任一项的细胞，其还包含编码二羧酸转运蛋白的核苷酸序列。
10.根据权利要求1到9中任一项的细胞，其中至少一个编码醇脱氢酶的基因是无功能的。
11.根据权利要求1到10中任一项的细胞，其中至少一个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因是无功能的。
12.根据权利要求1到11中任一项的细胞，其中至少一个编码琥珀酸脱氢酶的基因是无功能的。
13.根据权利要求1到12中任一项的细胞，其为Aspergillus，优选地为Aspergillus niger。
14.根据权利要求1到12中任一项的细胞，其为Saccharomycescerevisiae。
15.用于制备琥珀酸的方法，包括在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求1到14中任一项的真核细胞，其中，琥珀酸被制备。
16.根据权利要求15的方法，其中制备的琥珀酸用于生产药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。
17.包含能够通过根据权利要求16的方法获得的琥珀酸的发酵液。
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