CN110892073B - 增强型代谢物生产酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及代谢物的生物生产领域，尤其是微生物在生物合成途径上游使用草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A作为底物或共底物(特别是使用草酰乙酸)生产的代谢物的生物生产领域。在本领域中迫切需要被转化的、特别是重组的微生物，其至少提高了生产草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A(特别是草酰乙酸)的能力，从而使得在生物合成途径上游使用草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A作为底物或共底物生产的代谢物(特别是氨基酸及其衍生物、脂肪酸、来自甲羟戊酸途径的衍生物(特别是法呢基、角鲨烯、羊毛甾醇、胆固醇及其衍生物和多萜醇)、类黄酮和/或聚酮)的生产能力提高。本发明提出的解决方案是使用包含如本文所述的许多修饰的遗传修饰的酵母。

Description

增强型代谢物生产酵母
技术领域
本发明涉及代谢物的生物生产领域，尤其是微生物在生物合成途径上游使用草酰乙酸(oxaloacetate)、丙酮酸(pyruvate)和/或乙酰辅酶A作为底物或共底物(特别是使用草酰乙酸)生产的代谢物的生物生产领域。所述代谢物优选是氨基酸和氨基酸衍生物。
背景技术
氨基酸和脂肪酸支撑着全球价值数十亿美元的产业。所有二十种氨基酸都在不同领域出售并引起关注，例如动物饲料添加剂，例如赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸，作为医学领域的特殊营养物质和作为增味剂，例如谷氨酸钠、丝氨酸和天冬氨酸。脂肪酸也是令人感兴趣的，并且可用于生产溶剂、增塑剂和/或生物柴油。此外，氨基酸、其衍生物和脂肪酸是制药产业中重要的前体。特别是关于氨基酸的生产，目前有三种通用的生产方法：直接化学合成、使用酶的生物转化和发酵。在这些方法之间进行选择取决于可用的技术、原料成本、市场价格和规模，以及进行发酵相对于合成反应的成本和方法本身对环境的影响。确定哪种方法能够获得更好的产率也很重要。
因为前体通常是化学合成的，或者必须首先通过发酵生产，所以与氨基酸化学合成的方法相比，没有真正的工业或经济优势。
通过从天然来源发酵生产氨基酸当然是生产氨基酸的优选方法之一。实际上，有许多细菌和酵母能够在适当条件下过量生产氨基酸。但是，由于许多氨基酸合成的调控非常复杂，因此只有少数菌株能够生产有价值的量的氨基酸。
在天然氨基酸的生物合成中，氨基酸天冬氨酸是生产其他氨基酸例如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的前体。天冬氨酸由草酰乙酸生产，草酰乙酸是柠檬酸循环的主要代谢产物。
草酰乙酸的大量生产是工业生产草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物(以下称为草酰乙酸衍生物)的先决条件。
在所有情况下，候选草酰乙酸衍生物生产微生物都必须经过许多轮的突变和选择，然后才能作为有价值的生产者被保留。在美国专利号US 4,439,525以及Halasz等人(1996,Periodicica Polytechnica Ser.Chem.Engl.,Vol.40(1-2):53-78)中公开了在自发突变或化学诱导的突变后选择的候选甲硫氨酸生产微生物的说明性实施方案。
通过细菌和酵母的生物合成途径生产必需氨基酸及其衍生物需要NADPH形式的大量还原力。然而，在这些微生物中，特别是在酵母中，葡萄糖代谢的主要途径是糖酵解，然后进行发酵，发酵仅产生NADH。因此，在微生物中保持适当的NADPH/NADH平衡(尽管很复杂)对于优化目的氨基酸和氨基酸衍生物的生物生产，同时获得有活力的重组微生物是至关重要的。
已知的主要细菌性氨基酸生产者是谷氨酸棒状杆菌(C.glutanicum)，其是一种革兰氏阳性、兼性厌氧、非致病性土壤细菌。谷氨酸棒状杆菌被用于大规模工业生产增味剂L-谷氨酸以及食品添加剂L-赖氨酸。
在本领域中仍然需要这样的被转化的微生物，特别是重组的微生物，其至少提高了生产草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A(特别是草酰乙酸)的能力，从而使得在生物合成途径上游使用草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A作为底物或共底物生产的代谢物(特别是氨基酸及其衍生物、脂肪酸、来自甲羟戊酸途径的衍生物(特别是法呢基、角鲨烯、羊毛甾醇、胆固醇及其衍生物和多萜醇)、类黄酮和/或聚酮)的生产能力提高。
特别需要这样的被转化的微生物，特别是重组的微生物，其至少提高了生产草酰乙酸的能力，并且提高了丙酮酸和/或乙酰辅酶A的生产。
本领域更加特别需要这样的被转化的微生物，特别是重组的微生物，其至少提高了生产草酰乙酸的能力，从而允许提高生产草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物的能力，所述草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物在本文中被称为草酰乙酸衍生物。
最后，需要(i)过量生产NADPH，(ii)磷酸烯醇丙酮酸分别向草酰乙酸和丙酮酸受控且平衡的转化，(iii)降低丙酮酸向乙醇的转化，以及(iv)重新转向磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸和/或丙酮酸，特别是向草酰乙酸的转化。
发明内容
因此，本发明涉及一种重组酵母，在其基因组中：
(A)(i)至少一种编码苹果酸脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
(ii)至少一种、优选所有编码苹果酸脱氢酶的核酸不包含其过氧化物酶体靶向序列；
(B)至少一种编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(C)(i)至少一种编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或
(ii)至少一种编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(D)至少一种编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(E)(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1的核酸独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下、处于弱启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
如所附实施例所示，本发明的重组酵母至少生产草酰乙酸的能力提高，这导致生产草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物的能力得到改善。
还可通过使酵母与下文所述的另外的修饰重组来进一步提高所述有利性质。
本发明的重组酵母可以是生产草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A衍生物的重组酵母。
因此，本发明特别涉及一种生产至少一种草酰乙酸衍生物、丙酮酸衍生物和/或乙酰辅酶A衍生物，特别是至少一种草酰乙酸衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在培养基中培养本发明的重组酵母；和
(b)从所述培养基中回收草酰乙酸衍生物、丙酮酸衍生物和/或乙酰辅酶A衍生物。
在一个特定的实施方案中，培养基包含至少一种碳源，优选地选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。
本发明还涉及本发明的重组酵母用于生产至少一种草酰乙酸衍生物、丙酮酸衍生物和/或乙酰辅酶A衍生物，特别是至少一种草酰乙酸衍生物的用途。
特别地，本发明的重组酵母至少是生产草酰乙酸衍生物的重组酵母。
因此，本发明的生产草酰乙酸衍生物的重组酵母可以有利地用于生产草酰乙酸衍生物，特别是如下文所述的草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物的方法中，或用于生产草酰乙酸衍生物，特别是生产草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物。
在根据本发明的方法和用途中，所述至少一种草酰乙酸衍生物可以选自由以下组成的组：甲硫氨酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)、2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)、苏氨酸、2,4-二羟基丁酸(2,4-dihydroxybutyrate，2,4-BDH)、赖氨酸、异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸和乙基-高丝氨酸。
具体实施方式
发明人已经构思了遗传修饰的微生物，尤其是遗传修饰的酵母，其具有受控制的平衡丙酮酸/草酰乙酸/乙酰辅酶A生产的能力，从而具有受控制的、有利地提高的获得代谢物的能力，例如源自丙酮酸、草酰乙酸和/或乙酰辅酶A，尤其是源自草酰乙酸的上文描述的那些代谢物。
更特别地，与亲本微生物相比，特别是与亲本酵母相比，发明人构思的本发明的遗传修饰的酵母有利地具有受控制的、优选提高的生产草酰乙酸(即草酰乙酸衍生物，特别是草酰乙酸衍生的氨基酸和氨基酸衍生物)的能力。
与亲本微生物相比，尤其是与亲本酵母相比，本发明的遗传修饰的酵母的另一个优点是它们能够以NADPH的形式而不是NADH的形式生产更多的还原力。在整个本说明书中描述了这些遗传修饰的微生物，包括这些遗传修饰的酵母。
定义
如上文已经指出的，根据本发明的草酰乙酸衍生物是可以由草酰乙酸在被本发明的生产草酰乙酸的微生物中(特别是本发明的生产草酰乙酸的酵母中)天然和/或人工存在的酶修饰后获得的代谢物，特别是氨基酸或氨基酸衍生物。
这种草酰乙酸衍生物的实例可以例如选自由以下组成的组：甲硫氨酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)、2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)、苏氨酸、2,4-二羟基丁酸(2,4-BDH)、赖氨酸、异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸和乙基-高丝氨酸。
根据本发明的丙酮酸衍生物是可以由丙酮酸在被本发明的生产丙酮酸的微生物中(特别是本发明的生产丙酮酸的酵母中)天然和/或人工存在的酶修饰后获得的代谢物。
根据本发明的乙酰辅酶A衍生物是可以由乙酰辅酶A在被本发明的生产乙酰辅酶A的微生物中(特别是本发明的生产乙酰辅酶A的酵母中)天然和/或人工存在的酶修饰后获得的代谢物。
这些丙酮酸衍生物或乙酰辅酶A衍生物的实例可以例如选自由以下组成的组：缬氨酸；丙氨酸；乳酸(lactate)；克雷伯氏循环的成分或衍生物；脂肪酸；类黄酮；聚酮；甲羟戊酸途径衍生物，例如法呢基-pp、香叶基-pp和香叶基-香叶基-pp；类萜(terpenoid)；萜(terpen)；角鲨烯；倍半萜(sequiterpene)；甾醇；多萜醇；羊毛甾醇和甾醇及其衍生物；胡萝卜素；类胡萝卜素和泛醌。
如本文所用，术语“微生物”是指未经人工修饰的酵母。如果微生物提供了将要整合到微生物“受体”的遗传元件(所述“受体”将表达该外源遗传元件)，或者如果微生物用作基因构建或蛋白质表达的工具，则该微生物可能是“供体”。本发明的微生物选自表达用于草酰乙酸和草酰乙酸衍生物的生物合成的基因的酵母。
如本文所用，术语“重组微生物”或“遗传修饰的微生物”或“重组酵母”或“遗传修饰的酵母”是指经遗传修饰或遗传工程改造的酵母。根据这些术语的通常含义，这意味着本发明的微生物不是在自然界中存在的，而是通过引入或通过删除或通过修饰来自自然界中存在的等同微生物的遗传元件而被修饰的。也可以通过在特定选择压力下结合定向诱变和进化来迫使新的代谢途径的发展和进化来对其进行修饰(参见例如WO 2004/076659)。
如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则可以对微生物进行修饰以表达这些外源基因。可以对微生物进行修饰以调节内源基因的表达水平。用外源DNA修饰或“转化”微生物，如酵母，是本领域技术人员的常规工作。特别地，根据本发明的微生物的遗传修饰，特别是本文定义的遗传修饰，可以通过使用CRISPR-Cas系统进行，如DiCarlo等人(Nucl.Acids Res.,vol.41,No.7,2013:4336-4343)中所述。
术语“内源基因”是指该基因在任何遗传修饰之前存在于野生型株的微生物中。可以通过引入异源序列以补充或替代内源性调节元件，或通过向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝，来使内源基因过表达。也可以对内源基因进行修饰以调节其表达和/或活性。例如，可以向编码序列中引入突变以修饰基因产物，或者可以引入异源序列以补充或替代内源调节元件。内源基因的调节可导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者，导致内源基因产物的活性的下调和/或减弱。增强内源基因表达的另一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。
术语“外源基因”是指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入到微生物中，而该基因不是天然存在于野生型微生物中的。如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则微生物可以表达这些外源基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规工作。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或由质粒或载体在染色体外表达。本领域已知多种质粒，它们的复制起点和它们在细胞中的拷贝数是不同的。可以修改外源基因的序列以在宿主微生物中表达。实际上，本领域技术人员知晓密码子使用偏好的概念以及如何针对特定的密码子使用偏好修改核酸序列而不更改推断蛋白质。
术语“异源基因”是指该基因衍生自不同于表达它的受体微生物的微生物物种。它是指不天然存在于该微生物中的基因。
在本申请中，所有基因均以其通用名称并参考其核苷酸序列，以及有的情况也参考其氨基酸序列进行指代。使用已知基因的登录号(accession number)给出的索引，本领域技术人员能够确定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共有序列进行，所述共有序列可以通过以下方法确定：与衍生自其他微生物的基因进行序列比对并设计简并探针(degenerated probe)以克隆另一生物体中的相应基因。
本领域技术人员知晓调节(特别是上调或下调)内源基因表达的不同方法。例如，增强内源基因表达的一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。
另一种方法是用更强的启动子代替基因的内源启动子。这些启动子可以是同源的或异源的。在本说明书的其他地方更详细地描述了在本发明中特别令人感兴趣的启动子。
核酸表达构建体还可以包含5'和/或3'识别序列和/或选择标记。
术语“过表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达增加。通过增加编码所述酶的基因的表达来增加酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来增加基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算过表达的核酸上游实施强启动子，或在启动子(特别是强启动子)和终止子之间引入所述核酸的多个拷贝。
术语“低表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达降低。通过降低编码所述酶的基因的表达来降低酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来降低基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算低表达的核酸上游实施弱启动子。还可以提及的是实施编码比亲本酶的活性更低的所述酶的变体，或在细胞中比亲本酶更快速地降解的所述酶的变体的核酸。比亲本酶更快速地降解的所述亲本酶的变体涵盖降解决定子(degron)标记的酶。还可以提及的是降低目的基因的转录激活子的表达。
术语“诱导型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被诱导(即增加)的启动子：
-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越强；或者
-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会诱导启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越强。
术语“抑制型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被抑制(即降低)的启动子：
-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越弱；或者
-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会抑制启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越弱。
如本文所用，“降解决定子标记的”酶是指包含添加的蛋白质降解信号氨基酸序列的酶，该氨基酸序列充当破坏信号，所述破坏信号将使所述酶成为降解的对象，所述降解可以是)非泛素依赖性降解或(ii)泛素依赖性降解。所述添加的蛋白质降解信号，在本领域中也称为“降解决定子”，其涵盖用作破坏信号的氨基酸序列，所述氨基酸序列由引起靶蛋白降解的可转移降解信号组成。降解决定子涵盖“N-降解决定子”，它们是可转移的N-末端氨基酸，可遵循众所周知的N-末端规则引起靶蛋白降解(Bachmair等人,1986,Science,Vol.234(4773):179-186)。N-降解决定子的不稳定性质归因于其首要氨基酸，这些氨基酸容易发生乙酰化或精氨酰化修饰，并最终导致泛素化和降解。通常，降解决定子需要至少两种组分以确保靶蛋白降解：(i)靶降解识别标签，例如聚泛素标签，和(ii)与该降解识别标签紧邻的非结构化氨基酸序列。为了对蛋白质进行降解决定子标记，特别是在本文中对酶进行降解决定子标记，本领域技术人员可以参考Yu等人(2015,Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)、Cho等人(2010,Genes&Development,Vol.24:438-442)，或参考Fortmann等人(2015,J Mol Biol,Vol.427(17):2748-2756)、Ravid等人(2008,NatRev Mol Cell Biol,Vol.9(9):679-690)和Hochstrasser(1996,Annu Rev Genet,Vol.30:405-439)。
酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，在本发明的上下文中表示酶催化所需反应的能力。
术语酶的“活性降低”或“活性减弱”是指通过氨基酸序列突变实现蛋白质的比催化活性降低，和/或通过核苷酸序列突变，或通过删除相应的同源基因，或还通过对蛋白质进行降解决定子标记实现细胞中蛋白质的浓度降低。
术语酶的“活性增强”表示例如通过编码酶的基因的过表达实现酶的比催化活性提高和/或细胞中酶的数量/利用率提高。
术语“编码”是指多核苷酸通过转录和翻译的机制生产氨基酸序列的过程。
编码本发明中考虑的酶的基因可以是外源的或内源的。
基因的“衰减”是指基因以比在未修饰的微生物中更慢地速度表达。衰减可以通过本领域技术人员已知的手段和方法来实现，并且包含通过同源重组实现的基因缺失、通过将外部元件插入到基因中的基因衰减或在弱启动子下的基因表达。本领域技术人员知晓表现出不同强度的多种启动子以及哪个启动子用于弱遗传表达。
在本发明中实施的方法优选地需要使用一种或多种染色体整合构建体，用于将异源核苷酸序列稳定地引入到染色体上的特定位置，或者用于在功能上破坏遗传修饰的微生物细胞中的一种或多种靶基因。在一些实施方案中，靶基因的破坏阻止了相关功能蛋白的表达。在一些实施方案中，靶基因的破坏导致被破坏的基因表达非功能蛋白。
在本发明的实践中可以改变的染色体整合构建体的参数包括但不限于同源序列的长度；同源序列的核苷酸序列；整合序列的长度；整合序列的核苷酸序列；和靶基因座的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个同源序列的长度的有效范围是20至5,000个碱基对，优选50至100个碱基对。在特定的实施方案中，每个同源序列的长度为约50个碱基对。有关基因靶向所需的同源性长度的更多信息，请参见D.Burke等人,Methods in yeastGenetics–A cold spring harbor laboratory course Manual(2000)。
在一些实施方案中，打算插入上述DNA构建体的被破坏的基因可以有利地包含一种或多种用于选择转化的微生物细胞的选择标记。优选地，所述选择标记包含在根据本发明的DNA构建体中。
在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性标记。抗生素抗性标记的说明性实例包括但不限于NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>和SH BLE基因产物。来自诺尔斯式链霉菌(S.noursei)的NAT 1基因产物赋予了对诺尔丝菌素(nourseothricin)的抗性；来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的AURl-C基因产物赋予了对Auerobasidin A(AbA)的抗性；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的HPH基因产物赋予了对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸作为唯一氮源的平板上生长；Tn903转座子的KAN<R>基因赋予了对G418的抗性；印度斯坦链异壁链霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的SH BLE基因产物赋予了对Zeocin(博来霉素)的抗性。
在一些实施方案中，在分离出本发明的遗传修饰的微生物细胞之后，删除抗生素抗性标记。本领域技术人员能够在特定的遗传背景下选择合适的标记。
在一些实施方案中，选择标记拯救了遗传修饰的微生物细胞中的营养缺陷型(例如营养性营养缺陷型)。在这样的实施方案中，亲本微生物细胞在一种或多种在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的基因产物(例如酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET 15、TRP1、ADE2和URA3基因产物)中包含功能性破坏，这使得亲本微生物细胞无法在不添加一种或多种营养物质(营养缺陷表型)的培养基中生长。然后可以通过用编码被破坏的基因产物的功能性拷贝(NB：基因的功能性拷贝可以源自近缘种，例如克鲁维酵母(Kluveromyces)、念珠菌(Candida)等)的染色体整合体转化亲本微生物细胞来拯救营养缺陷表型，并可以根据亲本微生物细胞的营养缺陷表型的损失来选择所产生的遗传修饰微生物细胞。
对于包含启动子序列、编码序列(例如酶编码序列)或终止子序列的每个核酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考核酸序列具有特定百分比的核酸同一性的核酸序列。
对于每一个或多个目的氨基酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考氨基酸序列具有特定百分比的氨基酸同一性的氨基酸序列(例如酶氨基酸序列)。
由于明显的原因，在整个本说明书中，分别符合所考虑的核苷酸或氨基酸同一性的特定核酸序列或特定氨基酸序列应进一步导致获得显示出所需生物活性的蛋白质(或酶)。如本文所用，两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较窗口来比较两条最佳比对的序列来确定的。
因此，与参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的核苷酸或氨基酸序列部分可以包括添加或缺失(例如“空位”)，以获得两个序列之间的最佳比对。
通过如下方法计算同一性百分比：确定可以注释两条比较序列为相同核酸碱基或相同氨基酸残基的位置数，然后将在两个核酸碱基之间或在两个氨基酸残基之间均可观察到同一性的位置数除以比较窗口中的总位置数，然后将结果乘以100，得到两条序列之间的核苷酸同一性百分比或两条序列之间的氨基酸同一性百分比。
序列最佳比对的比较可以使用已知算法由计算机来执行。
最优选地，使用CLUSTAL W软件(版本1.82)确定序列同一性百分比，参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝"全长"；(3)OUTPUT FORMAT＝"aln w/数目"；(4)OUTPUT ORDER＝"对齐的"；(5)COLOR ALIGNMENT＝"否"；(6)KTUP(字长)＝"默认"；(7)WINDOW LENGTH＝"默认"；(8)SCORE TYPE＝"百分比"；(9)TOPDIAG＝"默认"；(10)PAIRGAP＝"默认"；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝"无"；(12)MATRIX＝"默认"；(13)GAP OPEN＝"默认"；(14)END GAPS＝"默认"；(15)GAP EXTENSION＝"默认"；(16)GAPDISTANCES＝"默认"；(17)TREE TYPE＝"分支图"和(18)TREE GRAP DISTANCES＝"隐藏"。
“发酵”或“培养”通常在发酵罐中进行，发酵罐含有适合于所培养微生物的合适的培养基，该培养基含有至少一种简单碳源，和共底物(必要的话)。
本文公开的微生物可以在发酵培养基中生长以从草酰乙酸生产产物。为了最大程度地生产草酰乙酸衍生物，用作生产宿主的微生物株优选具有高的碳水化合物利用率。这些特征可以通过诱变和选择、基因工程改造来赋予，或者可以是天然的。用于本细胞的发酵培养基或“培养基”可包含至少约10g/L的葡萄糖。另外的碳底物可以包括但不限于单糖，例如果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如乳糖麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透玉米浆、甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可包括甘油。
因此，预期本发明中使用的碳源可以涵盖各种各样的含碳底物，并且仅受生物选择的限制。
尽管预期所有上述碳底物及其混合物均适用于本发明，但是对于被改造为使用C5糖(更特别是葡萄糖)的微生物，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。
优选的碳底物是葡萄糖。
除了合适的碳源外，发酵培养基还可以包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适合于培养物的生长和促进生产所需产物所必需的酶促途径的其他组分。
此外，可以考虑适合于根据本发明的重组微生物的生长的其他遗传修饰。
术语“需氧条件”是指培养基中的氧浓度足以使需氧或兼性厌氧微生物使用双氧(di-oxygene)作为末端电子受体。
“微需氧条件”是指其中氧浓度低于空气中的氧浓度(即氧浓度多达6％O2)的培养基。
“合适的培养基”是指包含对细胞的维持和/或生长必不可少或有益的营养物质的培养基(例如无菌液体培养基)，所述营养物质例如碳源或碳底物、氮源，例如胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸一钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子，例如氨基酸、维生素、生长促进剂等。根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”是指可以被本领域技术人员使用用来支持微生物正常生长的任何碳源，包括己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、寡糖、二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、纤维素、半纤维素及其组合。
根据本发明引入的遗传修饰的一般特征
-基因因两种非互斥的修饰而过表达：
·将它们置于强启动子控制之下；和/或
·插入所考虑的基因的多个拷贝。
-所有基因组修饰均根据已知的遗传工程技术插入到酵母中：
-根据本发明的酵母基因组中引入的基因构建体中所包括的连续基因具有以下结构：
Prom1-ORF1-term1-ORF2-gene2-term2-…/…-Promn-ORFn-termn，其中：
-Prom1是调节编码序列(ORF1)的表达的序列，
-ORF1是编码所需蛋白质PROT1(尤其是所需酶PROT1)的核酸序列，
-Term1是转录终止子序列，其通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，这些信号触发了从转录复合物中释放mRNA的过程，并且
-“1”、“2”、.../...“n”可以描述或可以不描述相同的ORF(开放阅读框)、启动子或终止子。基因的顺序无关紧要，“n”是通常在5到20之间的整数。这些构建体被插入在酵母染色体之一中的受控位置。在一些实施方案中，插入位点对于被插入的构建体的功能或对于所得的遗传修饰的酵母的生存力不是必需的。
-当酵母是例如酿酒酵母时，通常将引入到酵母基因组中的、源自酿酒酵母以外的其他生物体的基因进行“转码”(通常将其进行密码子优化)，这意味着这些基因是以表达酿酒酵母的最佳密码子用法合成的。来自酿酒酵母的一些基因的核苷酸序列(而不是蛋白质序列)也已被修饰(“转码”)以使与所述基因的内源性拷贝的重组最小化。
-可以通过酵母遗传工程化中使用的标准方法删除基因。在一些实施方案中，可以通过插入上述基因构建体之一而中断靶向删除的基因，或者，用一小段核苷酸取代靶向删除的基因。
-可以通过如下方法下调基因表达：破坏基因的内源性拷贝并用处于弱启动子的控制之下的ORF的拷贝替代它。弱启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。
-可以通过如下方法使基因“可诱导或可抑制”：删除基因的内源性拷贝(如果需要的话)并将新的ORF的拷贝置于诱导型或抑制型启动子的控制之下。诱导型或抑制型启动子是在环境条件改变或外部刺激时其活性被调节和控制(即增加或降低)的启动子。诱导或抑制可以是人为控制的，其涵盖通过非生物因素，例如目标生物体中非天然存在的化合物、光、氧水平、热或冷，进行诱导或抑制。诱导型或抑制型启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。
-如已在本文其他地方规定的，可以通过使用Yu等人2015,(Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)中描述的“降解决定子”技术，通过去稳定化，使蛋白质低表达。简而言之，该技术在于在蛋白质序列中引入将蛋白质靶向降解的修饰。它可以仅包含两个首要氨基酸，遵循被称为N-末端规则的原则，或包含一个更大的序列，其将整个蛋白质靶向泛素-蛋白酶体(ubiquitin-preoteasome)降解途径。
根据本发明的重组酵母
发明人已经构思了重组微生物，尤其是重组酵母，其生产草酰乙酸和NADPH，特别是草酰乙酸酯衍生物的能力提高。
本发明涉及草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A衍生物的生产提高，特别是草酰乙酸衍生物的生产提高的重组酵母，其中所述生产提高是通过由基因工程方法引入到其基因组中的多种改变而获得的。
本发明涉及重组酵母，特别是生产草酰乙酸衍生物的重组酵母，在其基因组中：
(A)(i)至少一种编码苹果酸脱氢酶MDH3的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
(ii)至少一种、优选所有编码苹果酸脱氢酶MDH3的核酸不包含其过氧化物酶体靶向序列；
(B)至少一种编码NADP依赖性苹果酸酶ME3的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(C)(i)至少一种编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或
(ii)至少一种编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PEPCK的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(D)至少一种编码乙醛辅酶A脱氢酶MHPF的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(E)(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1PYK1的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1PYK1的核酸独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下、处于弱启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
发明人已经发现，酵母细胞的提高的草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A衍生物的生产，特别是提高的草酰乙酸衍生物的生产，可以通过在这些酵母细胞的基因组中引入多种遗传改变来达到。如本文中充分描述的，所述多种遗传改变涵盖某些基因的过表达、某些其他基因的受控表达以及另外的其他基因的抑制或缺失。
发明人已经通过以下方法实现了酵母细胞的受控制特别是提高的草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A衍生物的生产，特别是提高的草酰乙酸衍生物的生产：优化葡萄糖的代谢，从而使随后的人工修饰的代谢途径主要导向草酰乙酸、丙酮酸和/或乙酰辅酶A的生产，特别是草酰乙酸、丙酮酸和乙酰辅酶A的生产，而同时维持所得遗传修饰的酵母细胞的最佳生存力。
在漫长的研究时间之后，本发明人已经确定，通过如下方法获得酵母细胞的草酰乙酸衍生物的高生产：增加磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化，但也增加向连续中间代谢物苹果酸、丙酮酸、乙醛和乙酰辅酶A的转化，同时尤其重要的是，保持氧化还原状态，从而使所得重组酵母细胞具有良好的生存力。这些代谢物的可获得性增加能够实现草酰乙酸衍生物的高生产，这可以通过下文所述的其他修饰进一步改善。
保持能够使所得重组酵母细胞具有良好的生存力的氧化还原状态显然是至关重要的，并且在整个研究工作中对发明人构成了重大挑战。
根据本发明提出的解决方案出乎意料地使得能够通过消耗较少的还原力，消耗NADH形式而不是NADPH形式的还原力，和/或生产NADH而不是NADPH，在酵母细胞中在整个代谢物生产途径中维持可行的NADH/NADPH平衡。
如在本说明书中详细公开的，所得重组酵母细胞被遗传修饰，以实现(i)至少一种苹果酸脱氢酶编码基因(MDH3)特别是不含有其过氧化物酶体靶向序列的苹果酸脱氢酶编码基因(MDH3)、(ii)至少一种NADP依赖性苹果酸酶编码基因(ME3)和(iii)至少一种乙醛辅酶A脱氢酶编码基因(MHPF)的过表达和/或受控表达。
此外，还对根据本发明的重组酵母进行了遗传修饰，以实现(i)至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因(PEPC)(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)和/或(ii)至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因(PEPCK)(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)的过度表达和/或受控表达。
此外，还对根据本发明的重组酵母进行了遗传修饰，以(i)删除至少一种丙酮酸激酶1编码基因(PYK1)、(ii)实现至少一种丙酮酸激酶1编码基因(PYK1)的可抑制表达、(iii)实现至少一种丙酮酸激酶1编码基因(PYK1)的弱表达和/或(iv)实现至少一种丙酮酸激酶1编码基因(PYK1)去稳定形式的表达。
与不包含上述遗传修饰的亲本酵母相比，根据本发明的重组酵母生产草酰乙酸衍生物的产率更高。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶2PYK2的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶2PYK2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
在一些实施方案中，本发明的重组酵母的基因组使得(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶1ADH1的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶1ADH1的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
在一些实施方案中，本发明的重组酵母的基因组使得：
(A)(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶1PYC1的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶PYC1的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式；和/或
(B)(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶2PYC2的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶2PYC2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
在一些实施方案中，本发明的重组酵母的基因组使得：
(A)(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶3ADH3的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶3ADH3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式；
(B)(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶4ADH4的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶4ADH4的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式；和/或
(C)(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶5ADH5的核酸已被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶5ADH5的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
在一些实施方案中，苹果酸脱氢酶(MDH3)核酸优选来自酵母，特别是来自酿酒酵母。
在一些实施方案中，NADP依赖性苹果酸酶由独立地选自由以下组成的组的核酸编码：细菌、植物、真菌、原生生物或动物，特别是由选自由以下组成的组的核酸编码：来自拟南芥、大肠杆菌、木立芦荟(Aloe arborescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄菊属物种(Flaveria species)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、水稻(Oryzasativa)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、玉米(Zea mays)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的核酸，更优选地由拟南芥ME3.At基因编码或由大肠杆菌ME3.Ec基因编码，最优选地由拟南芥ME3.At基因编码。
在一些实施方案中，编码将磷酸烯醇丙酮酸PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸是来自原核生物或真核生物的核酸，特别是来自由以下组成的组的核酸：大肠杆菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、Succinatimoras hippie、萨利尔斯氏拟杆菌(Bacteroides salyersiae)、克氏锥虫和热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，更优选地是大肠杆菌PEPCK.Ec基因。
在一些实施方案中，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸独立地选自细菌或真核生物，特别是选自由以下组成的组：来自大肠杆菌、肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinalis)、假单胞菌属的细菌、克鲁氏梭菌(Clostridium kluyveri)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)和变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)的核酸，更优选是由大肠杆菌MHPF.Ec基因编码的。
在一些实施方案中，所述至少一种编码丙酮酸激酶1(PYK1)的核酸是来自酵母的核酸，特别是来自酿酒酵母的核酸。
苹果酸脱氢酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，苹果酸脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的包含苹果酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的苹果酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的包含苹果酸脱氢酶(MDH3)编码序列的表达盒包含允许苹果酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种苹果酸脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信苹果酸脱氢酶的过表达可以增强中间体草酰乙酸向苹果酸的转化。当至少一种苹果酸脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些优选的实施方案中，所述苹果酸脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的MDH3基因，如本文实施例中所示和之前讨论的。
在优选的实施方案中，将所述苹果酸脱氢酶编码基因置于强启动子pTEF3或强启动子pPDC1的控制之下。
说明性地，可以将苹果酸脱氢酶基因插入在GNP1基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。
NADP依赖性苹果酸酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，NADP依赖性苹果酸酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的包含NADP依赖性苹果酸酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的NADP依赖性苹果酸酶和NADP依赖性苹果酸酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的包含NADP依赖性苹果酸酶编码序列的表达盒包含允许NADP依赖性苹果酸酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种NADP依赖性苹果酸酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信NADP依赖性苹果酸酶的过表达可以增强中间体苹果酸向丙酮酸的转化。当至少一种NADP依赖性苹果酸酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些优选的实施方案中，所述NADP依赖性苹果酸酶编码基因是来自拟南芥的ME3基因，如本文的实施例中所示和先前讨论的。
在优选的实施方案中，将所述NADP依赖性苹果酸酶编码基因置于强启动子pCCW12的控制之下。
说明性地，可以将NADP依赖性苹果酸酶基因插入在GNP1基因内和/或MUP3基因内和/或URA3基因内，如本文实施例所示。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码序列的表达盒而获得的，该磷酸烯醇丙酮酸羧化酶将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸。本发明所涵盖的、将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的包含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码序列的表达盒包含允许磷酸烯醇丙酮酸羧化酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的过表达可以增强中间代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向草酰乙酸的转化。当至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些优选的实施方案中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因是来自大肠杆菌的PEPC或PPC基因。
在优选的实施方案中，将所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)置于强启动子pTDH3或诱导型或抑制型启动子pACU3p的控制之下。
说明性地，可以将磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因插入在URA3基因内和/或TRP1基因内。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)编码序列(其将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸)的表达盒而获得的。本发明所涵盖的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸，并在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码序列的表达盒包含允许磷酸烯醇丙酮酸羧激酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过表达可以增强中间代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向草酰乙酸的转化。当至少一种磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些优选的实施方案中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因是来自大肠杆菌的PEPCK基因。
在优选的实施方案中，将所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因置于强启动子pPDC1、强启动子pTDH3或诱导型或抑制型启动子pACU1的控制之下。
说明性地，可以将磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因插入在GNP1基因内和/或MUP3基因内和/或PYK1基因内。
乙醛辅酶A脱氢酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，乙醛辅酶A脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含乙醛辅酶A脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的乙醛辅酶A脱氢酶和乙醛辅酶A脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含乙醛辅酶A脱氢酶(MHPF)编码序列的表达盒包含允许乙醛辅酶A脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种乙醛辅酶A脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信乙醛辅酶A脱氢酶的过表达可以增强中间代谢物乙醛向乙酰辅酶A的转化。当至少一种乙醛辅酶A脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些优选的实施方案中，所述乙醛辅酶A脱氢酶编码基因是来自大肠杆菌的MHPF基因，如本文实施例中所示和之前讨论的。
在优选的实施方案中，将所述乙醛辅酶A脱氢酶编码基因置于强启动子pTDH3或强启动子pPDC1的控制之下。
说明性地，可以将乙醛辅酶A脱氢酶基因插入在HIS3基因内和/或GNP1基因内和/或TRP1基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。
丙酮酸激酶1的删除或低表达
根据本发明的重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1PYK1的内源性核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶1PYK1的核酸独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下、处于弱启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，丙酮酸激酶1基因的低表达将通过减少由于所生产的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸而导致的其消耗来增加重组酵母的草酰乙酸生产。
丙酮酸激酶1的表达缺失或至少减少，会导致丙酮酸通过另一种途径生产，即通过增加磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化，然后增加草酰乙酸向苹果酸的转化，苹果酸本身以增加的方式被转化为丙酮酸。使用该特定途径生产丙酮酸有利地能够消耗NADH并产生NADPH。
在一些实施方案中，例如可以通过使丙酮酸激酶1基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使丙酮酸激酶1的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达的方法是本领域技术人员众所周知的。
丙酮酸激酶1低表达还包括插入编码不稳定的丙酮酸激酶1的核酸。不稳定的丙酮酸激酶1是丙酮酸激酶1的变体，与亲本丙酮酸激酶1相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的丙酮酸激酶1由降解决定子标记的丙酮酸激酶1蛋白组成。
例如，丙酮酸激酶1基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
苹果酸脱氢酶(MDH3)
苹果酸脱氢酶是本领域已知的催化由草酰乙酸NADH依赖性地形成苹果酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的苹果酸脱氢酶可以称为MDH3。
更具体地，本发明的苹果酸脱氢酶不包含其过氧化物酶体靶向序列。不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，从苹果酸脱氢酶序列中删除该序列使得该酶能够在酵母的细胞质中表达而不被输出至过氧化物酶体。所述删除仅在于通过本领域技术人员众所周知的方法从编码序列中删除三个C-末端氨基酸SKL(丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸)。
用于测量苹果酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。例如可以提及由Sigma出售的名为“苹果酸脱氢酶测定试剂盒”的商业试剂盒，编号为MAK196-1KT。
本说明书中优选的苹果酸脱氢酶是EC号为1.1.1.37的酶。
根据一个优选的实施方案，编码苹果酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些优选的实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码苹果酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与选自由SEQ ID NO：1的参考核酸序列组成的组的核酸具有至少20％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：1的核酸编码源自酿酒酵母的苹果酸脱氢酶，其在本文中也可以统称为MDH3或MDH3.Sc。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化由草酰乙酸NADH依赖性地形成苹果酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少20％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010205，或本文描述的SEQ ID NO.2。
根据另一个特定的实施方案，编码苹果酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少20％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Thecamonas trahens的苹果酸脱氢酶与SEQ ID NO.2的苹果酸脱氢酶具有23％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化由草酰乙酸NADH依赖性地形成苹果酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少20％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中苹果酸脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述苹果酸脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，苹果酸脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，苹果酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，苹果酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的苹果酸脱氢酶编码序列。
在其他实施方案中，苹果酸脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的苹果酸脱氢酶编码序列。
NADP依赖性苹果酸酶(ME3)
NADP依赖性苹果酸酶是在本领域中被描述为用于催化苹果酸转化为丙酮酸同时释放一个NADPH的蛋白质。它也称为NADP依赖性苹果酸脱氢酶(Malate DehydrogenaseNADP dependent)。由拟南芥基因组编码的NADP依赖性苹果酸酶可以称为ME3。
用于测量NADP依赖性苹果酸酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Gerrard-Wheeler等人FEBS Journal276(2009)5665-5677描述的方法。
本说明书中优选的NADP依赖性苹果酸酶是EC号为n°EC 1.1.1.40的酶。
根据一个优选的实施方案，编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自植物和细菌。在一些其他优选的实施方案中，编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸可以是源自拟南芥的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：3的核酸具有至少45％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：3的核酸编码源自拟南芥的NADP依赖性苹果酸酶，其也可以称为ME3。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化苹果酸向丙酮酸转化，同时释放一个NADPH。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少45％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的NADP依赖性苹果酸酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP197960.1，或本文描述的SEQ ID NO.4。
根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少45％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自莱茵衣藻(Chlamydomonas reihnarditii)的NADP依赖性苹果酸酶与SEQ ID NO.4的NADP依赖性苹果酸酶具有48％氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化苹果酸向丙酮酸转化，同时释放一个NADPH的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少45％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中NADP依赖性苹果酸酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述NADP依赖性苹果酸酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制NADP依赖性苹果酸酶的强表达。
在优选的实施方案中，控制NADP依赖性苹果酸酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是本领域中描述为用于催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的蛋白质。由大肠杆菌基因组编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以称为PEPC或PPC。
用于测量磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Bazaes S.等人(2007)The ProteinJournal,26,265-269和J.Van der Werf等人(1997)Arch Microbiol167:332–342描述的方法。/>
本说明书中优选的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是EC号为n°4.1.1.31的酶。
根据一个优选的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自细菌。在一些其他优选的实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是源自大肠杆菌的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：5的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号WP_032179661，或本文描述的SEQ ID NO.6。
根据另一个特定的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自蓝杆藻PCC782(cyanothece sp.PCC782)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶与SEQ ID NO.6的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有29％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的强表达。
在优选的实施方案中，控制磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶是本领域中描述为用于催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的蛋白质。由大肠杆菌基因组编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶可以称为PEPCK。
用于测量磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Bazaes S.等人(2007)The ProteinJournal,26,265-269和J.Van der Werf等人(1997)Arch Microbiol167:332–342描述的方法。
本说明书中优选的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶是EC号为n°4.1.1.49的酶。
根据一个优选的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自细菌。在一些其他优选的实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是源自大肠杆菌的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：7的核酸具有至少20％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸，同时将ADP磷酸化为ATP。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少20％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013023.3，或本文描述的SEQ ID NO.8。
根据另一个特定的实施方案，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少20％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自戈登链球菌(Streptococcus gorgonii)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶与SEQ ID NO.8的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶具有22％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少20％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的强表达。
在优选的实施方案中，控制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。
乙醛辅酶A脱氢酶(MHPF)
乙醛辅酶A脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化乙醛转化为乙酰辅酶A同时释放一个NADH的蛋白质。由大肠杆菌基因组编码的乙醛辅酶A脱氢酶可以称为MHPF。
用于测量乙醛辅酶A脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Fischer等人(2013)Chemi.Biol.Interact.202 70-77描述的方法。
本说明书中优选的乙醛辅酶A脱氢酶是EC号为n°EC 1.2.1.10的酶。
根据一个优选的实施方案，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自细菌。在一些其他优选的实施方案中，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是源自大肠杆菌的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：9的核酸具有至少30％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：9的核酸编码源自大肠杆菌的乙醛辅酶A脱氢酶，其也可以称为MHPF。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化乙醛转化为乙酰辅酶A，同时释放一个NADH。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少30％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自大肠杆菌的乙醛辅酶A脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP414885，或本文描述的SEQ ID NO.10。
根据另一个特定的实施方案，编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少30％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自尼维斯链霉菌(Streptomyces niveiscabiei)的乙醛辅酶A脱氢酶与SEQ ID NO.10的乙醛辅酶A脱氢酶具有32％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化乙醛转化为乙酰辅酶A，同时释放一个NADH的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少30％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中乙醛辅酶A脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述乙醛辅酶A脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制乙醛辅酶A脱氢酶的强表达。
在优选的实施方案中，控制乙醛辅酶A脱氢酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。
丙酮酸激酶1(PYK1)
丙酮酸激酶1是本领域中描述为用于催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的丙酮酸激酶1可以称为PYK1。
用于测量丙酮酸激酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(2004)Biochemistry 43,15230-15245描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸激酶1是EC号为n°2.7.1.40的酶。
根据一个优选的实施方案，编码丙酮酸激酶1的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码丙酮酸激酶1的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码丙酮酸激酶1的核酸可以是SEQ ID NO：11的核酸。SEQ ID NO：11的核酸编码源自酿酒酵母的丙酮酸激酶1，其也可以称为PYK1。
对于来自酿酒酵母的丙酮酸激酶1的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP009362.1，或本文描述的SEQ ID NO.12。
如上所述，本发明中丙酮酸激酶1的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述丙酮酸激酶1的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，丙酮酸激酶1(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
在一个优选的实施方案中，丙酮酸激酶1PYK1独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
优选地，丙酮酸激酶1PYK1没有从本发明的重组酵母中完全删除。
生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的具体实施方案
丙酮酸激酶2的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶2PYK2的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸激酶2PYK2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，丙酮酸激酶2基因的低表达将通过减少由于所生产的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸而导致的其消耗来增加重组酵母的草酰乙酸生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使丙酮酸激酶2基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使丙酮酸激酶2的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
丙酮酸激酶2低表达还包括插入编码不稳定的丙酮酸激酶2的核酸。不稳定的丙酮酸激酶2是丙酮酸激酶2的变体，与亲本丙酮酸激酶2相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的丙酮酸激酶2由降解决定子标记的丙酮酸激酶2蛋白组成。
例如，丙酮酸激酶2基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量丙酮酸激酶2的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(2004)Biochemistry 43,15230-15245描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸激酶2是EC号为n°2.7.1.40的酶。
根据一个优选的实施方案，编码丙酮酸激酶2的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码丙酮酸激酶2的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码丙酮酸激酶2的核酸可以是SEQ ID NO：13的核酸。SEQ ID NO：13的核酸编码源自酵母菌属(Saccharomyces)的丙酮酸激酶2，其也可以称为PYK2。
对于来自酿酒酵母的丙酮酸激酶2的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014992.3，或本文描述的SEQ ID NO.14。
如上所述，本发明中丙酮酸激酶2的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述丙酮酸激酶2的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，丙酮酸激酶2(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
醇脱氢酶1的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶1ADH1的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶1ADH1的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，醇脱氢酶1基因的低表达将通过减少由于所生产的乙醛转化为乙醇而导致的其消耗来提高重组酵母的乙酰辅酶A生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使醇脱氢酶1基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使醇脱氢酶1的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
醇脱氢酶1低表达还包括插入编码不稳定的醇脱氢酶1的核酸。不稳定的醇脱氢酶1是醇脱氢酶1的变体，与亲本醇脱氢酶1相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的醇脱氢酶1由降解决定子标记的醇脱氢酶1蛋白组成。
例如，醇脱氢酶1基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量醇脱氢酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn A.J,Green D.W,HersheyA.D,Gould R.M,Plapp B.V(1987)The Journal of Biological Chemistry262,p3754-3761描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶1是EC号为n°1.1.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码醇脱氢酶1的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码醇脱氢酶1的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码醇脱氢酶1的核酸可以是SEQ ID NO：15的核酸。SEQ ID NO：15的核酸编码源自酵母菌属的醇脱氢酶1，其也可以称为ADH1。
对于来自酿酒酵母的醇脱氢酶1的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014555.1，或参考本文描述的SEQ ID NO.16。
如上所述，本发明中醇脱氢酶1的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述醇脱氢酶1的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，醇脱氢酶1(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
丙酮酸羧化酶1(PYC1)的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶1PYC1的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶1PYC1的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，丙酮酸羧化酶1基因的低表达将通过减少由于所生产的丙酮酸转化为草酰乙酸而导致的其消耗来增加重组酵母的丙酮酸生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使丙酮酸羧化酶1基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使丙酮酸羧化酶1的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
丙酮酸羧化酶1低表达还包括插入编码不稳定的丙酮酸羧化酶1的核酸。不稳定的丙酮酸羧化酶1是丙酮酸羧化酶1的变体，与亲本丙酮酸羧化酶1相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的丙酮酸羧化酶1由降解决定子标记的丙酮酸羧化酶1蛋白组成。
例如，丙酮酸羧化酶1基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量丙酮酸羧化酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Branson、Nezic、Wallace和Atwood(2002)biochemistry(13)4459-66描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸羧化酶1是EC号为n°6.4.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码丙酮酸羧化酶1的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码丙酮酸羧化酶1的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码丙酮酸羧化酶1的核酸可以是SEQ ID NO：17的核酸。SEQ ID NO：17的核酸编码源自酵母菌属的丙酮酸羧化酶1，其也可以称为PYC1。
对于来自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶1的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP011453.1，或本文描述的SEQ ID NO.18。
如上所述，本发明中丙酮酸羧化酶1的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述丙酮酸羧化酶1的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，丙酮酸羧化酶1(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
丙酮酸羧化酶2的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶2PYC2的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码丙酮酸羧化酶2PYC2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，丙酮酸羧化酶2基因的低表达将通过减少由于所生产的丙酮酸转化为草酰乙酸而导致的其消耗来增加重组酵母的丙酮酸生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使丙酮酸羧化酶2基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使丙酮酸羧化酶2的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
丙酮酸羧化酶2低表达还包括插入编码不稳定的丙酮酸羧化酶2的核酸。不稳定的丙酮酸羧化酶2是丙酮酸羧化酶2的变体，与亲本丙酮酸羧化酶2相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的丙酮酸羧化酶2由降解决定子标记的丙酮酸羧化酶2蛋白组成。
例如，丙酮酸羧化酶2基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量丙酮酸羧化酶2的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Branson、Nezic、Wallace和Atwood(2002)Biochemistry(13)4459-66描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸激酶2是EC号为n°6.4.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码丙酮酸羧化酶2的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码丙酮酸羧化酶2的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码丙酮酸羧化酶2的核酸可以是SEQ ID NO：19的核酸。SEQ ID NO：19的核酸编码源自酵母菌属的丙酮酸羧化酶2。
对于来自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶2的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP009777.1，或本文描述的SEQ ID NO.20。
如上所述，本发明中丙酮酸羧化酶2的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述丙酮酸羧化酶2的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，丙酮酸羧化酶2(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
醇脱氢酶3的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶3ADH3的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶3ADH3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，醇脱氢酶3基因的低表达将通过减少由于所生产的乙醛转化为乙醇而导致的其消耗来提高重组酵母的乙酰辅酶A生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使醇脱氢酶3基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使醇脱氢酶3的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
醇脱氢酶3低表达还包括插入编码不稳定的醇脱氢酶3的核酸。不稳定的醇脱氢酶3是醇脱氢酶3的变体，与亲本醇脱氢酶3相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的醇脱氢酶3由降解决定子标记的醇脱氢酶3蛋白组成。
例如，醇脱氢酶3基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量醇脱氢酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn A.J,Green D.W,HersheyA.D,Gould R.M,Plapp B.V(1987)The Journal of Biological Chemistry262,p3754-3761描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶3是EC号为n°1.1.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码醇脱氢酶3的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码醇脱氢酶3的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码醇脱氢酶3的核酸可以是SEQ ID NO：21的核酸。SEQ ID NO：21的核酸编码源自酵母菌属的醇脱氢酶3，其也可以称为ADH3。
对于来自酿酒酵母的醇脱氢酶3的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013800.1，或本文描述的SEQ ID NO.22。
如上所述，本发明中醇脱氢酶3的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述醇脱氢酶3的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，醇脱氢酶3(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
醇脱氢酶4的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶4ADH4的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶4ADH4的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，醇脱氢酶4基因的低表达将通过减少由于所生产的乙醛转化为乙醇而导致的其消耗来提高重组酵母的乙酰辅酶A生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使醇脱氢酶4基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使醇脱氢酶4的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
醇脱氢酶4低表达还包括插入编码不稳定的醇脱氢酶4的核酸。不稳定的醇脱氢酶4是醇脱氢酶4的变体，与亲本醇脱氢酶4相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的醇脱氢酶4由降解决定子标记的醇脱氢酶4蛋白组成。
例如，醇脱氢酶4基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量醇脱氢酶4的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn A.J,Green D.W,HersheyA.D,Gould R.M,Plapp B.V(1987)The Journal of Biological Chemistry262,p3754-3761描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶4是EC号为n°1.1.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码醇脱氢酶4的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码醇脱氢酶4的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码醇脱氢酶4的核酸可以是SEQ ID NO：23的核酸。SEQ ID NO：23的核酸编码源自酵母菌属的醇脱氢酶4，其也可以称为ADH4。
对于来自酿酒酵母的醇脱氢酶4的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP011258.2，或本文描述的SEQ ID NO.24。
如上所述，本发明中醇脱氢酶4的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述醇脱氢酶4的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，醇脱氢酶4(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
醇脱氢酶5的删除或低表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，重组酵母被进一步定义为在其基因组中：
(i)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶5ADH5的核酸已被删除，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码醇脱氢酶5ADH5的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，醇脱氢酶5基因的低表达将通过减少由于所生产的乙醛转化为乙醇而导致的其消耗来提高重组酵母的乙酰辅酶A生产。
在一些实施方案中，例如可以通过使醇脱氢酶5基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使醇脱氢酶5的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
醇脱氢酶5低表达还包括插入编码不稳定的醇脱氢酶5的核酸。不稳定的醇脱氢酶5是ADH5的变体，与亲本醇脱氢酶5相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的醇脱氢酶5由降解决定子标记的醇脱氢酶5蛋白组成。
例如，醇脱氢酶5基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
如提交的实施例中所示，它也可以被包含目的基因的盒中断。
用于测量醇脱氢酶5的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn A.J,Green D.W,HersheyA.D,Gould R.M,Plapp B.V(1987)The Journal of Biological Chemistry262,p3754-3761描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶5是EC号为n°1.1.1.1的酶。
根据一个优选的实施方案，编码醇脱氢酶5的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码醇脱氢酶5的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据一个特定的实施方案，编码醇脱氢酶5的核酸可以是SEQ ID NO：25的核酸。SEQ ID NO：25的核酸编码源自酵母菌属的醇脱氢酶5，其也可以称为ADH5。
对于来自酿酒酵母的醇脱氢酶5的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP009703.3，或本文描述的SEQ ID NO.26。
如上所述，本发明中醇脱氢酶5的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述醇脱氢酶5的核酸序列的5'和3'位置。
如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，醇脱氢酶5(a)被完全或部分删除，和/或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；处于弱启动子的控制之下；和/或处于不稳定的形式。
目标化合物的输出
在根据本发明的重组酵母的其他实施方案中，可以通过(i)编码酵母通透酶的基因的低表达，通过(ii)编码氨基酸输出蛋白的基因的过表达，或通过(iii)编码酵母通透酶的基因的低表达以及编码氨基酸输出蛋白的基因的过表达两者，来提高所生产的草酰乙酸衍生物向酵母细胞外的输出。
通透酶编码基因的低表达
如下所述，在根据本发明的重组酵母中可能低表达的通透酶编码基因涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3和MUP1。
AGP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶(general amino acid permease)1。对于AGP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号(access number)NP_009905。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178671。
AGP3是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶3。对于AGP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_116600。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179912。
BAP3是来自酿酒酵母的缬氨酸氨基酸通透酶。对于BAP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010331。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180354。
BAP2是来自酿酒酵母的Leu/Val/Ile氨基酸通透酶。对于BAP2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009624。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178416。
GAP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶。对于GAP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012965.3。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179829。
GNP1是来自酿酒酵母的高亲和力谷氨酰胺通透酶。对于GNP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010796。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180816。
MUP3是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011827。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179116。
MUP1是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011569。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181184。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为其一个或多个编码通透酶的基因低表达，所述通透酶涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3和MUP1通透酶。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任何通透酶基因的低表达将增加所生产的草酰乙酸衍生物向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。
关于通透酶，这些基因中的一种或多种的低表达涵盖它们的表达的完全抑制，例如通过中断或删除所述一种或多种通透酶基因。
在一些实施方案中，例如可以通过使通透酶编码基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使通透酶编码基因的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于通透酶基因，低表达还涵盖插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸或插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸，或两者。
不稳定的通透酶是通透酶的变体，与亲本通透酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的通透酶由降解决定子标记的通透酶蛋白组成。
如实施例中所示，AGP3基因、BAP3基因、GAP1基因、GNP1基因和MUP3基因可以被loxP中断并因此被删除。
氨基酸输出蛋白编码基因的过表达
如下所述，在根据本发明的重组酵母中可能过表达的输出蛋白编码基因涵盖AQR1和TPO1。
AQR1是来自酿酒酵母的转运蛋白。对于AQR1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014334。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182903。
TPO1是来自酿酒酵母的多胺转运蛋白。对于TPO1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013072。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181848。
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含所述转运蛋白编码序列的表达盒而获得的。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，转运蛋白编码基因的过表达将增加所生产的草酰乙酸衍生物向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。
在一些实施方案中，转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含转运蛋白基因编码序列的表达盒而获得的。在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在一些其他实施方案中，在酵母基因组的选定位置插入一个拷贝的转运蛋白编码基因。在这些其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在优选的实施方案中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因AQR1置于强启动子pTEF3的控制之下。
说明性地，可以将AQR1基因插入在HOM3基因内。
在优选的实施方案中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因_TPO1置于强诱导型或抑制型启动子pSAM4或强组成型启动子pTEF1的控制之下。
可以使用TPO1-1代替TPO1。TPO1-1是人工等位基因，其中赖氨酸10、49、86、143、144和145被精氨酸替代。
发明人认为，这些修饰保护TPO1免于通过泛素-蛋白酶体途径被降解，从而使其稳定。
说明性地，可以将TPO1基因插入MAE1基因内和/或TRP1基因内。
生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的其他实施方案
根据本发明的重组酵母的一些实施方案，可以通过如下方法进一步提高草酰乙酸衍生物的生产：将所述重组酵母置于一定条件下，该条件导致在所述草酰乙酸衍生物的生物合成途径中草酰乙酸下游的中间体的生产进一步增加。
可以通过在酵母基因组中引入另外的遗传修饰来将所述重组酵母置于一定条件下，该条件导致在所述草酰乙酸衍生物的生物合成途径中草酰乙酸下游的中间体的生产增加。
本发明人发现，通过向生产草酰乙酸衍生物的重组酵母中引入另外的遗传变化(下文描述的那些)，可以最佳地提高草酰乙酸衍生物的生产。
生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的最先的其他实施方案
根据本发明的生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的这些最先的其他实施方案，为了提高甲硫氨酸的生产和/或甲硫氨酸衍生物的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。
甲硫氨酸衍生物可以例如选自由以下组成的组：2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)和2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)。
根据这些实施方案，引入遗传改变以便：
(A)使至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸过表达和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)将至少一种编码天冬氨酸激酶HOM3的核酸置于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和
(C)(i)使(a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸和/或至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸，和(b)至少一种编码甲硫氨酸合酶MET17的核酸过表达和/或将其置于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或(ii)使(a)至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸，和(b)至少一种编码胱硫醚γ-合酶CGS1(其具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性)的核酸过表达和/或将其置于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码天冬氨酸转氨酶AAT2的核酸可以任选地过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码谷氨酸脱氢酶GDH(其将氧代-戊二酸(oxo-glutarate)转化为谷氨酸)的核酸可以任选地过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码高丝氨酸脱氢酶HOM6的核酸也可以任选地过表达。
根据这些实施方案，本发明的重组酵母的基因组可以任选地进一步独立地使得：(i)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的内源性核酸被删除，或(ii)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据第一个实施方案，本发明的重组酵母的基因组可以任选地进一步独立地使得：(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的内源性核酸被删除，或(ii)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据第二个实施方案，本发明的重组酵母的基因组可以任选地进一步独立地使得：(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8的核酸被删除，和/或(ii)至少一种、优选所有编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据该第二个实施方案，本发明的重组酵母的基因组可以任选地进一步以苯丙酮酸脱羧酶基因(ARO10)的低表达为特征。
此外，根据该实施方案，本发明的重组酵母的基因组可以任选地进一步以不表达2-羟酸脱氢酶(2-hydroxyacide dehydrogenase)基因(KDH)为特征，或者使得至少一种编码2-羟酸脱氢酶(KDH)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码胱硫醚γ裂解酶CYS3的核酸可以独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据这些实施方案，至少一种编码胱硫醚β合酶CYS4的核酸可以独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据这些实施方案，至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸可以任选地独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
天冬氨酸半醛脱氢酶
天冬氨酸-半醛脱氢酶是本领域已知能够催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化、NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸-半醛脱氢酶可以称为HOM2。
用于测量天冬氨酸-半醛脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
本说明书中优选的天冬氨酸-半醛脱氢酶是EC号为1.2.1.11的酶。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010442。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001180465.3。
天冬氨酸激酶
天冬氨酸激酶是本领域中描述为用于在ATP的存在下催化L-天冬氨酸向4-磷酸-L-天冬氨酸的转化的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸激酶可以称为HOM3。
用于测量天冬氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Stadtman等人(1961,J Biol Chem,Vol.236(7):2033-2038)描述的方法。
本说明书中优选的天冬氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.2.4的酶。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010972。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001178943.1。
高丝氨酸-O-乙酰基转移酶
高丝氨酸O-乙酰基转移酶是在本领域中被描述为用于催化乙酰辅酶A和L-高丝氨酸向CoA和O-乙酰基-L-高丝氨酸之间的反应的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸O-乙酰基转移酶可以称为MET2。源自谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶通常被称为METX。
用于测量高丝氨酸O-乙酰基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Shuzo Yamagata(1987,The Journalof Bacteriology,Vol.169(8):3458-3463)描述的方法。
本说明书中优选的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶是EC号为n°EC 2.3.1.31的酶。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014122。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001183115.1。
甲硫氨酸合酶
甲硫氨酸合酶是在本领域中被描述为用于在甲硫醇的存在下催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为甲硫氨酸和乙酸的蛋白质。甲硫氨酸合酶在本领域中还被描述为用于催化OAH转化为高半胱氨酸或催化O-乙酰丝氨酸(OAS)转化为半胱氨酸。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶可以称为MET17。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶在本领域中也可以称为MET25或MET15。
用于测量甲硫氨酸合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ravanel(1995,Archives ofBiochemistry and Biophysics,Vol.316:572-584)描述的方法。
本说明书中优选的甲硫氨酸合酶是EC号为n°2.5.1.49的酶。
对于来自酿酒酵母的甲硫氨酸合酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013406。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001182191.1。
高丝氨酸激酶
高丝氨酸激酶是在本领域中被描述为用于催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化成为L-高丝氨酸磷酸酯的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸激酶可以称为THR1。
用于测量高丝氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Mannhaupt和Feldmann(1990,Eur JBiochem,Vol.191:115-122)描述的方法。
本说明书中优选的高丝氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.1.39的酶。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP011890。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001179155.1。
胱硫醚γ合酶
胱硫醚γ合酶1酶是在本领域中被描述为用于催化由高丝氨酸酯和L-半胱氨酸通过γ-置换反应形成L-胱硫醚的蛋白质。由拟南芥基因组编码的胱硫醚γ合酶1可以称为CGS1。
用于测量胱硫醚γ合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Loizeau等人(2007,PlantPhysiology,Vol.145:491-503)描述的方法。
本说明书中优选的胱硫醚γ合酶1是EC号为n°EC 2.5.1.48的酶。
对于来自拟南芥的胱硫醚γ合酶1的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP186761。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_110977.3。
天冬氨酸转氨酶
天冬氨酸转氨酶(也称为天冬氨酸氨基转移酶)是在本领域中被描述为用于催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸转氨酶可以称为AAT2。
用于测量天冬氨酸转氨酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Yagi等人(1982,Biochem,VOl.92:35-43)中描述的方法。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸转氨酶AAT2的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013127。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001181914.1。
谷氨酸脱氢酶
谷氨酸脱氢酶(也称为NAD特异性谷氨酸脱氢酶)是在本领域中被描述为用于催化2-氧代戊二酸的转化以产生L-谷氨酸的蛋白质。因此，谷氨酸脱氢酶是特异性地参与涉及在NADH存在下将2-氧代戊二酸转化为L-谷氨酸的化学反应的酶。
用于测量谷氨酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Noor和Punekar(2005,Microbiology,Vol.151:1409-1419)中描述的方法。
在优选的实施方案中，所述谷氨酸脱氢酶编码基因编码利用NADH而非NADPH的谷氨酸脱氢酶，并且更特别地是来自尖尾内旋纤毛虫(Entodinium caudatum)的GDH基因(GDH.eCa)。
本说明书中优选的谷氨酸脱氢酶可以特别是EC号为n°EC 1.4.1.2的酶。
对于来自尖尾内旋纤毛虫的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AAF15393。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号AF109176。
高丝氨酸脱氢酶
高丝氨酸脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化在NAD或NADP的存在下L-高丝氨酸向L-天冬氨酸4-半醛的转化的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸脱氢酶可以称为HOM6。
用于测量高丝氨酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Calnyanto等人(2006,Microbiology,Vol.152:105-112)描述的方法。
本说明书中优选的高丝氨酸脱氢酶是EC号为n°1.1.1.3的酶。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP012673。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001181797.3。
S-腺苷甲硫氨酸合酶
SAM1是来自酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合酶1。对于SAM1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010790。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180810。
SAM2是来自酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合酶2。对于SAM1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013281。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_00118082067。
芳香族氨基转移酶I
ARO8是来自酿酒酵母的芳香族氨基转移酶I。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181067.1。对于ARO8的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011313.1。
用于测量芳香族氨基转移酶I的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因
BAT2是来自酿酒酵母的胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181806.1。对于BAT2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012682.1。
用于测量胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
苯丙酮酸脱羧酶
ARO10是来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180688.3。
对于ARO10的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010668.3。
2-羟酸脱氢酶
KDH是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的2-羟酸脱氢酶。对于核酸序列，可以参考酶学委员会(Enzyme Commission)编号E.C.1.1.1.145。
对于KDH的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号WP_011835036.1.，和/或参考UniProt数据库中的登录号WP_010905887.1。
胱硫醚γ裂解酶
CYS3是来自酿酒酵母的胱硫醚γ裂解酶。对于CYS3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009390。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178157。
胱硫醚β合酶
CYS4是来自酿酒酵母的胱硫醚β合酶。对于CYS4的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011671。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181284。
生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的其次的其他实施方案
根据本发明的生产草酰乙酸衍生物的重组酵母的这些其次的其他实施方案，为了提高苏氨酸的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。
根据这些实施方案，引入遗传改变以便：
(A)使至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸过表达和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)使至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸过表达和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(C)使至少一种编码苏氨酸合酶THR4的核酸过表达和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和
(D)(i)将至少一种编码天冬氨酸激酶HOM3的核酸置于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或
(ii)使至少一种编码天冬氨酸激酶AK的核酸过表达和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码天冬氨酸转氨酶AAT2的核酸可以任选地过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码谷氨酸脱氢酶GDH(其将氧代-戊二酸转化为谷氨酸)的核酸可以任选地过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，至少一种编码高丝氨酸脱氢酶HOM6的核酸也可以任选地过表达。
根据这些实施方案，(a)可以删除至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的内源性核酸，或(b)可以使至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据这些实施方案，(a)可以删除至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶MET17的内源性核酸，或(b)可以使至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶MET17的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
根据这些实施方案，至少一种编码可能的转运蛋白(probable transporter)AQR1的核酸可以任选地过表达。
苏氨酸合酶THR4
苏氨酸合酶是在本领域中被描述为用于催化O-磷酸-L-高丝氨酸被H2O依赖性地脱磷酸为L-苏氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的苏氨酸合酶可以称为THR4。
用于测量苏氨酸合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Schildkraut和Greer Journal ofBacteriology,(1973),Vol.115,p.777-785描述的方法。
本说明书中优选的苏氨酸合酶是EC号为n°EC 4.2.3.1的酶。
对于来自酿酒酵母的苏氨酸合酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009982.1。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001178767.1。
天冬氨酸激酶AK
天冬氨酸激酶是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的蛋白质。由枯草芽孢杆菌基因组编码的天冬氨酸激酶可以称为AK。
用于测量天冬氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识，并且与先前针对天冬氨酸激酶所指定的方法相同。
对于来自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP_389558.2。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NC_000964.3。
可能的转运蛋白AQR1
AQR1是来自酿酒酵母的转运蛋白。对于AQR1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014334。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182903。
启动子
如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的调控序列。
如本说明书中所公开的，多种启动子可用于目的编码序列的期望表达，包括(i)组成型强启动子(在本文中也称为强启动子)，(ii)组成型弱启动子(在本文中也称为弱启动子)和(iii)诱导型或抑制型启动子。酵母启动子及其在不同培养基中的相对活性的列表可见于Keren等人(2013)Molecular Systems Biology 9:701。
允许给定基因的组成型过表达的启动子可见于文献(Velculescu等人(1997)Cell88,243-251)。
在本发明中更特别感兴趣的强启动子可以选自由以下组成的组：
·pTDH3(SEQ ID N°27)，
·pENO2(SEQ ID N°28)，
·pTEF KI(SEQ ID N°29)，
·pTEF3(SEQ ID N°30)，
·pTEF1(SEQ ID N°31)，
·pADH1(SEQ ID N°32)，
·pGMP1(SEQ ID N°33)，
·pFBA1(SEQ ID N°34)，
·pPDC1(SEQ ID N°35)，
·pCCW12(SEQ ID N°36)，以及
·pGK1(SEQ ID N°37)。
根据一个特定的实施方案，根据本发明的强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。
在本发明中更特别感兴趣的弱启动子可以选自由以下组成的组：
·pURA3(SEQ ID N°39)，
·pRPLA1(SEQ ID N°40)
·pNUP57(SEQ ID N°119)，和
·pGAP1(SEQ ID N°120)。
根据一个具体的实施方案，根据本发明的弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。
如前所述，诱导型或抑制型启动子是其活性受是否存在生物或非生物因子以及所述因子的量所控制的启动子。因此，对于某些启动子，当给定因子的量增加或被增加时，它们的活性将特别地被诱导并因此增加，因此，当所述因子的量降低或被降低时，这些相同启动子的活性可以被抑制并因此降低。包含诱导型或抑制型启动子的本发明的重组酵母的培养基中所述因子的量可以由本领域技术人员确定并控制。
例如，增加包含pSAM4启动子的本发明重组酵母的培养基中甲硫氨酸的量将诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中甲硫氨酸的量将会抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。
在另一个实例中，增加包含pCTR1启动子的本发明重组酵母的培养基中铜的量将抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中铜的量将会诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。
因此，以下启动子在本文中称为“诱导型或抑制型启动子”。
根据第一个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：
·pSAM4-甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°41)，
·pCUP1-1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°42)，
·pCUP1.cgla–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°43)，
·pCUP1.sba–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°44)，
·pACU1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°45)，
·pACU2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°46)，
·pACU3p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°47)，
·pACU4p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°48)，
·pACU5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°49)，
·pACU6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°50)，
·pACU7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°51)，
·pACU8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°52)，
·pACU9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°53)，
·pACU10p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°54)，
·pACU11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°55)，
·pACU12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°56)，
·pACU13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°57)，
·pACU14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°58)，
·pACU15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°59)，
·pGAL/CUP1p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°60)，
·pCRS5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°61)，和
·pCHA1–苏氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°62)。
根据该实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以特别地独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。
因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜或苏氨酸的存在来诱导这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜或苏氨酸的量减少时，它们的活性降低，即，被抑制。
根据第二个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用葡萄糖诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子和可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：
·pCTR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°63)，
·pCTR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°64)，
·pCUR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°65)，
·pCUR2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°66)，
·pCUR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°67)，
·pCUR4–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°68)，
·pCUR5p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°69)，
·pCUR6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°70)，
·pCUR7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°71)，
·pCUR8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°72)，
·pCUR9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°73)，
·pCUR10–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°74)，
·pCUR11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°75)，
·pCUR12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°76)，
·pCUR13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°77)，
·pCUR14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°78)，
·pCUR15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°79)，
·pCUR16–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°70)，
·pCUR17–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°81)，
·pLYS1–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°82)，
·pLYS4–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°83)，
·pLYS9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°84)，
·pLYR1p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°85)，
·pLYR2p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°86)，
·pLYR3p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°87)，
·pLYR4p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°88)，
·pLYR5p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°89)，
·pLYR6p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°90)，
·pLYR7p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°91)，
·pLYR8–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°92)，
·pLYR9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°93)，
·pLYR10–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°94)，
·pLYR11–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°95)，
·pMET17–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°96)，
·pMET6–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°97)，
·pMET14–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°98)，
·pMET3–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°99)，
·pSAM1–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°100)，
·pSAM2–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°101)，
·pMDH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°38)，
·pJEN1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°121)，
·pICL1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°122)，
·pADH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°123)，和
·pMLS1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°124)。
根据该实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。
因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的存在来抑制这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的量减少时它们的活性增加，即被诱导。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用葡萄糖诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、pCHA1、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。
更具体地，所述启动子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：27至101和119至124具有至少80％同一性的序列。
也可以使用如Blazeck&Alper(2013)Biotechnol.J.8 46-58中描述的合成型启动子。
本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以源自来自酵母纲的任何生物，并且特别地可以独立地源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)、Saccharomyces castelii、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castelii)、解脂假丝酵母(Yarrowia lipolitica)和产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)。
本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以优选源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、Saccharomyces castelii、贝酵母、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母和乳酸克鲁维酵母。
终止子
如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的转录终止子序列。
所述转录终止子(相同或不同)可见于文献Yamanishi等人(2013)ACS syntheticbiology 2,337-347。
在本发明中更特别感兴趣的终止子可以选自由以下组成的组：
·tTDH2，来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶2的基因(TDH2基因＝序列SEQ IDN°102)，
·tCYC1(＝序列SEQ ID N°103)，
·tTDH3(＝序列SEQ ID N°104)，和
·tADH1，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH1基因＝序列SEQ ID N°105)，
·tADH2，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH2基因＝序列SEQ ID N°106)，
·tTPI1来自编码磷酸甘油醛异构酶(Triose Phosphate Isomerase)的基因(TPI1基因＝序列SEQ ID N°107)，
·tMET17，来自编码O-乙酰基高丝氨酸-O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserine-O-acetyl serine sulfhydrylase)的基因(Met17基因＝序列SEQ ID N°108)，
·tENO2，来自编码烯醇酶II的基因(ENO2基因＝序列SEQ ID N°109)，
·tMET3(＝序列SEQ ID N°110)，和
·tPGK1，来自编码3-磷酸甘油酸激酶的基因(PGK1基因＝序列SEQ ID N°111)，
·tDIT1(＝序列SEQ ID N°112)
·tRPL3(＝序列SEQ ID N°113)
·tRPL41B(＝序列SEQ ID N°114)
·tRPL15A(＝序列SEQ ID N°115)
·tIDP1(＝序列SEQ ID N°116)。
更具体地，所述终止子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：102至118具有至少80％同一性的序列。
重组酵母
通常，与细菌相比，酵母可以快速生长并且可以以更高的密度培养，并且在工业环境中不需要无菌环境。此外，与细菌细胞相比，酵母细胞可以更容易地从培养基中分离出来，从而大大简化了产物提取和纯化的过程。
优选地，本发明的酵母可以选自由以下组成的组：酵母菌属、念珠菌属、阿舒囊霉属(Ashbya)、德克拉酵母属(Dekkera)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、德巴利酵母属(Debaryomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、路德酵母属(Lodderomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Zigosaccharomyces、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属、酒香酵母属(Brettanomycces)、隐球菌属(Cryptococcus)和马拉色菌属(Malassezia)。特别地，本发明的酵母可以选自由以下组成的组：酵母菌属、毕赤酵母属、念珠菌属或耶氏酵母属。
在一个特定的实施方案中，酵母可以是Crabtree阳性酵母，其选自由以下组成的组：酵母菌属、德克拉酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、有孢酵母属、Zigosaccharomyces和酒香酵母属。
更优选地，酵母可以选自由以下组成的组：酿酒酵母、布拉迪酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、贝酵母、Candida sorensis、Zigosaccharomyces bailii、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera brucelensis)、中间型德克酵母(Dekkera intermedia)、卡斯酒香酵母(Brettanomycces custersii)、中间型酒香酵母(Brettanomycces intermedius)、嗜热克鲁维酵母(Kluyveromycesthemotolerens)、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)和光滑有孢圆酵母(Torulasporaglabrata)。
特别地，酵母可以选自由以下组成的组：酿酒酵母、布拉迪酵母、道格拉氏酵母、贝酵母和Candida sorensis。
更优选地，重组酵母可以属于酵母菌属，并且优选地是酿酒酵母物种。
如上所述，根据本发明的重组酵母具有丙酮酸脱羧酶活性，该活性通过插入至少一种选自本说明书中公开的DNA构建体而被降低。
被实施以在基因内插入特定DNA构建体的方法属于本领域技术人员的常识。在下文的实施例中更详细地描述了相关方法。
培养条件
本发明还涉及重组酵母(例如如上定义的)在生产草酰乙酸衍生物中的用途。
本发明还涉及草酰乙酸衍生物的生产方法，其包括以下步骤：
-提供如前所述的重组微生物，在含有碳源的培养基中培养所述重组微生物，和
-回收草酰乙酸衍生物。
通常，本发明的微生物在合适的培养基中在约20℃至约37℃范围内的温度下，优选在范围为27至34℃的温度下生长。
当根据本发明的重组酵母属于酿酒酵母物种时，在合适的培养基中温度可以有利地在27至34℃的范围内。
适合酵母的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如肉汤，其包括酵母氮碱、硫酸铵和右旋糖作为碳/能源，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖的对于最快生长而言最佳比例的混合物。也可以使用其他限定的或合成的生长培养基，并且微生物或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的合适的培养基。
术语“合适的培养基”是以上定义的。
用于根据本发明的重组酵母的已知培养基的实例是本领域技术人员已知的，并且在以下出版物中给出：D.Burke等人,Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000)。
用于发酵的合适的pH范围可以在pH 3.0至pH 7.5之间，其中优选pH 4.5至pH 6.5作为初始条件。
发酵可以在需氧条件或微需氧条件下进行。
发酵培养基中产物的量可以使用本领域已知的多种方法来确定，例如高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。
本方法可以采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭的体系，其中培养基的组成在发酵开始时就设定好了，并且在发酵过程中不会发生人为改变。因此，在发酵开始时，用所需的一种或多种生物接种培养基，并且在不向该体系中添加任何物质的情况下能够发生发酵。然而，通常，“分批”发酵是就添加碳源而言的分批，并且经常尝试控制诸如温度、pH和氧浓度之类的因素。在分批体系中，该体系的代谢物和生物质组成一直在变化直至发酵停止。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进入高生长对数期，最后进入稳定期，在稳定期生长速率降低或停止。如果不进行处理，稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常负责最终产物或中间体的大量生产。
本发明中也可以使用补料分批体系(Fed-Batch system)。补料分批体系与典型的分批体系类似，不同之处在于，随着发酵的进行，以增量方式添加碳源底物。当分解代谢物阻抑(例如葡萄糖阻抑)易于抑制细胞的代谢并且希望培养基中底物的量有限时，补料分批体系是有用的。补料分批体系中实际底物浓度的测量很困难，因此是根据可测量因素(例如pH值、溶氧量和废弃(如C02)的分压)的变化进行估算的。
发酵是本领域常见且公知的，并且实例可见于Sunderland等人，(1992)，其通过引用并入本文。尽管本发明以分批模式进行，但是可以预期该方法将适用于连续发酵。
连续发酵是一种开放体系，其中向生物反应器中连续添加确定的发酵培养基，并同时去除等量的条件培养基以进行流程。连续发酵通常使培养物保持恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。例如，一种方法将使限制性营养物质例如碳源或氮水平保持在恒定速率，并允许所有其他参数发生变化。在其他体系中，可以连续改变影响生长的许多因素，而使细胞浓度(通过培养基浊度测量)保持恒定。连续体系力争维持稳态生长条件，因此由于培养基被抽出而导致的细胞损失必须与发酵中的细胞生长速率相平衡。为连续发酵过程调节营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域众所周知的。
预期可以使用分批、补料分批或连续方法实施本发明，并且任何已知的发酵方式将是合适的。另外，预期可以将细胞固定在作为全细胞催化剂的基质上，并使其经受发酵条件以进行生产。
为了仍然改善草酰乙酸衍生物的生产，一个特定的实施方案可以由以下构成：在合适的培养基(例如如上提到的)中培养重组酵母细胞，其中所述培养基包含最适量的碳源，特别是葡萄糖。
优选地，仅在整个培养期间的一部分期间在这种最佳培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在培养开始后10小时或更长时间，涵盖在培养开始后11、12、13、14、15或16小时或更长时间，将酵母细胞在所述最佳培养基中孵育。
优选地，在培养开始后5小时至15小时的时间段内，包括6小时至10小时，例如8小时，将细胞在这样的最佳培养基中培养。
在优选的实施方案中，所述最佳培养基中包含的碳源由葡萄糖组成。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含12％w/w或更多的葡萄糖，包括15％w/w或更多的葡萄糖。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含至多40％w/w的葡萄糖，其包含至多35％w/w的葡萄糖。
因此，在上述优选实施方案中，根据本发明的用于生产草酰乙酸衍生物的方法还可以在步骤(a)和(c)之间包括中间步骤(b)，该中间步骤(b)由以下构成：在所述最佳培养基中培养所述酵母细胞。
草酰乙酸衍生物的纯化
根据本发明的一个特定方面，草酰乙酸衍生物的发酵生产包括从培养基中分离草酰乙酸衍生物的步骤。从培养基中回收草酰乙酸衍生物是本领域技术人员的常规工作。可以通过本领域众所周知的多种技术来实现，包括但不限于蒸馏、气体汽提(gas-stripping)、渗透蒸发(pervaporation)、选择性沉淀或液体萃取。本领域的专家知晓如何根据待分离材料的特性来调整各种技术的参数。
作为本发明的微生物模型的酵母被保留，因为合成的草酰乙酸衍生物被完全输出到细胞外，从而简化了纯化过程。
合成的草酰乙酸衍生物可以通过蒸馏收集。蒸馏可以涉及不同于培养基的任选组分，以便通过形成共沸物(特别是与水)来促进草酰乙酸衍生物的分离。该任选组分是有机溶剂，例如环己烷、戊烷、丁醇、苯、甲苯、三氯乙烯、辛烷、二乙醚或其混合物。
用选自氦气、氩气、二氧化碳、氢气、氮气或其混合物的汽提气体进行气体汽提。
用有机溶剂作为疏水相(例如戊烷、己烷、庚烷或十二烷)进行液体萃取。
草酰乙酸衍生物
根据本发明的草酰乙酸衍生物是可以由微生物(特别是酵母)在生物合成途径上游使用草酰乙酸作为底物或共底物所产生的、被本发明的生产草酰乙酸的微生物中(特别是本发明的生产草酰乙酸的酵母中)天然和/或人工存在的至少一种酶修饰后的化合物。
这种草酰乙酸衍生物的实例可以例如选自由以下组成的组：甲硫氨酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)、2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)、苏氨酸和2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)、赖氨酸、异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸和乙基-高丝氨酸。
在整篇说明书(包括权利要求书)中，除非另有说明，否则表述“包含”应理解为与“包含至少一种”同义。
除非另有说明，否则术语“在...与...之间”和“从...至...的范围”应理解为包括界限值。
下面的实施例和附图是通过举例说明的方式提出的，而不是暗示对本发明的限制。
实施例
实施例1：制备根据本发明的重组酿酒酵母菌株的方案
下文实施的所有重组酿酒酵母菌株均是使用标准酵母分子遗传学方法(D.Burke、D.Dawson、T.Stearns CSHL Press的Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000))从标准菌株构建的。
利用酵母有效重组具有序列同源性的游离DNA末端的能力，将下述基因簇同时整合到重组酵母中。
另外，为了更好地理解以下基因型；
-ade2、his3、leu2、trp1和ura3是营养缺陷型标记基因。
-小写字母表示所考虑的基因是无活性的，大写字母表示活性基因。
-基因名称后的“::”：是指该基因被随后的内容中断(如果插入了多个基因，则将它们标注在方括号[]中)。基因的中断伴随编码序列的整体缺失，但保留了启动子。因此，后面有“::”的基因是无活性的，并以小写字母表示。如果未指定，则插入的基因的转录受被破坏的基因的启动子控制。
-“基因.Kl”是指该基因源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
更特别地，待克隆的编码序列是人工合成的。对于异源序列(非酵母的)，对核酸序列进行修饰以获得使用酵母密码子用法的同义编码序列。使用限制酶和经典克隆技术，将每个合成序列克隆在转录启动子和转录终止子之间。每个启动子序列的前面是与上游基因的终止子序列同源的50至200个核苷酸序列。类似地，每个基因(包含启动子-编码序列-终止子的基因)的终止子的后面是与紧随其后的基因同源的序列。因此，每个待整合的单元与单元上游和单元下游都有50-200个核苷酸重叠。对于第一个单元，启动子的前面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。类似地，对于最后一个单元，终止子的后面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。
然后从质粒构建体PCR扩增每个单元，得到具有重叠序列的线性DNA的X单元。为了选择重组事件，该基因中的至少一个是营养缺陷型标记。将所有线性片段同时转化到酵母中，并针对与所用标记相关的营养缺陷型选择重组酵母。然后通过PCR和测序验证序列的完整性。
实施例2：生产草酰乙酸衍生物的比较例
A.首先，获得了两种根据本发明的重组菌株：YA2679-28和YA2687-142。
相应地，这两种菌株如下：
YA2679-28:MAT-α,gnp1::[LEU2.Kl,pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-tRPL3,pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[LEU2.Kl,pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-4],sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPI1]x9,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1.Sc]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At-tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3.Sc]x11
YA2687-142:MAT-α,gnp1::[LEU2.Kl,pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-tRPL3,pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[LEU2.Kl,pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-6],sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPI1]。
PYK1-4和PYK1-6是PYK1的不稳定形式，其根据N-端规则去稳定化，这是本领域技术人员熟知的(Gibbs等人(2014)Trends in Cell Biology,10,603-610)。
PEPCK-1是一种通过甘氨酸修饰2位氨基酸精氨酸而稳定化的PEPCK形式。使两种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和MeSNa lg/L中生长48小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
虽然未重组的相应酵母无法生产可检测量的甲硫氨酸，但菌株YA2679-28在24小时内生产了2g.L-1的甲硫氨酸，菌株YA2687-142在相同的时间内生产了2.2g.L-1的甲硫氨酸。
B.还测定了下文示出的本发明的另外两种重组菌株的甲硫氨酸。
菌株YA3984-2:MAT-α,gap1::HIS5.Sp-loxP,gnp1::[RS-pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPI1]x4,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
菌株YA4178:MAT-a,gap1::loxP,gnp1::[pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPI1]x10,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
PYK1-7是带有降解决定子标记的PYK1人工等位基因。
使这两种菌株在25ml的2％酵母提取物、10％葡萄糖，50mM尿素和500μM Cu(SO4)中生长7小时，然后加入终浓度为500μM的Cu(SO4)2，并缓慢(0.25ml/h)加入4ml的CH3SNa(23g/l)。在25h30小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
虽然未重组的相应酵母无法生产可检测量的甲硫氨酸，但菌株YA3984-2在25h 30内生产了1.32g.L-1的甲硫氨酸，菌株YA4178在相同的时间内生产了1.26g.L-1的甲硫氨酸。
C.如下获得了根据本发明的另外两种重组菌株，并分析了其乙基-高丝氨酸的生产：
DA1303-1:MAT-a/MAT-α,GAP1/gap1::HIS5.Sp-loxP,gnp1::[LEU2.Kl-RS-pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3]/gnp1::[LEU2.Kl-RS-pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3/his3,leu2/leu2,LYP1/lyp1::[pCUP1-1-HOM3.Sc-tDIT1-lyp1]x13,mup3::[LEU2.Kl-RS-pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2]/mup3::[LEU2.Kl-RS-pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP]/pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-NCE103-tRPL15A-pCUP1-1-MET2-tMET17-sam3]x15/sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A,pACU6-METX.Cg-tTPI1-sam3]x4,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5/trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.AttRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A]x4/ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
MDH3-1是MDH3的人工等位基因，其中最后三个氨基酸(SKL)已被删除。NCE103是内源酵母基因，其可催化CO2水合生成碳酸氢根。
YA3604-38:MAT-a,gnp1::[LEU2.Kl-RS-ADH2-AAT2-MDH3-1-PEPCK-1.Ec-MHPF.Ec-ME3.At-MHPF.Ec-ME3.At-MHPF.Ec-ME3.At-MHPF.Ec-ME3.At],his3,leu2,lyp1::[pCUP1-1-HOM3.Sc-tDIT1-lyp1]x12,mup3::[LEU2.Kl-RS-pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A,pACU6-METX.Cg-tTPI1-sam3]x3,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
使这两种菌株在2％酵母提取物、8％葡萄糖、0.65mM组氨酸、1.5mM腺嘌呤、0.9mM尿嘧啶、0.5mM色氨酸、7.5mM亮氨酸、50mM(NH4)2SO4和500μM CuSO4中生长7小时，然后加入500μM CuSO4并使酵母生长18小时。
然后按照制造商的建议，使用来自Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中乙基-高丝氨酸的含量。
虽然未重组的相应酵母无法产生可检测量的乙基-高丝氨酸，但菌株DA1303在25小时内生产了1.6g.L-1的乙基-高丝氨酸，菌株YA3604-38在相同的时间内生产了1.7g.L-1的乙基-高丝氨酸。
序列表
<110> 安迪苏法国联合股份有限公司
<120> 增强型代谢物生产酵母
<130> PR74668
<150> EP17305907
<151> 2017-07-11
<160> 124
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1023
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 苹果酸脱氢酶 (MDH3)
<220>
<223> 苹果酸脱氢酶 (MDH3)
<400> 1
atggtcaaag tcgcaattct tggcgcttct ggtggcgtgg gacaaccgct atcattactg 60
ctaaaattaa gcccttacgt ttccgagctg gcgttgtacg atatccgagc tgcggaaggc 120
attggtaagg atttatctca catcaacacc aactcaagtt gtgtcggtta tgataaggat 180
agtattgaga acaccttgtc aaatgctcag gtggtgctaa taccggctgg tgttcccaga 240
aagcccggtt taactagaga tgatttgttc aagatgaacg ccggtattgt caaaagcctg 300
gtaaccgctg ttggaaagtt cgcaccaaat gcgaggattt tagtcatttc aaaccctgta 360
aacagtttgg tccctattgc tgtggaaact ttgaagaaaa tgggtaagtt caaacctgga 420
aacgttatgg gtgtgacgaa ccttgacctg gtacgtgcag aaaccttttt ggtagattat 480
ttgatgctaa aaaaccccaa aattggacaa gaacaagaca aaactacaat gcacagaaag 540
gtcactgtta ttgggggtca ttcaggggaa accattatcc caataatcac cgacaaatcg 600
ctggtatttc aacttgataa gcagtacgag cacttcattc atagggtcca gttcggaggt 660
gatgaaattg tcaaagctaa acagggcgcc ggttccgcca cgttgtccat ggcgttcgcg 720
ggggccaagt ttgctgaaga agttttgagg agcttccata atgagaaacc agaaacggag 780
tcactttccg cattcgttta tttaccaggc ttaaaaaacg gtaagaaagc gcagcaatta 840
gttggcgaca actctattga gtatttttcc ttgccaattg ttttgagaaa tggtagcgta 900
gtatccatcg ataccagtgt tctggaaaaa ctgtctccga gagaggaaca actcgttaat 960
actgcggtca aagagctacg caagaatatt gaaaaaggca agagtttcat cctagactct 1020
taa 1023
<210> 2
<211> 340
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 苹果酸脱氢酶 (MDH3)
<220>
<223> 苹果酸脱氢酶 (MDH3)
<400> 2
Met Val Lys Val Ala Ile Leu Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly Gln Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Val Ser Glu Leu Ala Leu
20 25 30
Tyr Asp Ile Arg Ala Ala Glu Gly Ile Gly Lys Asp Leu Ser His Ile
35 40 45
Asn Thr Asn Ser Ser Cys Val Gly Tyr Asp Lys Asp Ser Ile Glu Asn
50 55 60
Thr Leu Ser Asn Ala Gln Val Val Leu Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg
65 70 75 80
Lys Pro Gly Leu Thr Arg Asp Asp Leu Phe Lys Met Asn Ala Gly Ile
85 90 95
Val Lys Ser Leu Val Thr Ala Val Gly Lys Phe Ala Pro Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Leu Val Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Leu Val Pro Ile Ala Val
115 120 125
Glu Thr Leu Lys Lys Met Gly Lys Phe Lys Pro Gly Asn Val Met Gly
130 135 140
Val Thr Asn Leu Asp Leu Val Arg Ala Glu Thr Phe Leu Val Asp Tyr
145 150 155 160
Leu Met Leu Lys Asn Pro Lys Ile Gly Gln Glu Gln Asp Lys Thr Thr
165 170 175
Met His Arg Lys Val Thr Val Ile Gly Gly His Ser Gly Glu Thr Ile
180 185 190
Ile Pro Ile Ile Thr Asp Lys Ser Leu Val Phe Gln Leu Asp Lys Gln
195 200 205
Tyr Glu His Phe Ile His Arg Val Gln Phe Gly Gly Asp Glu Ile Val
210 215 220
Lys Ala Lys Gln Gly Ala Gly Ser Ala Thr Leu Ser Met Ala Phe Ala
225 230 235 240
Gly Ala Lys Phe Ala Glu Glu Val Leu Arg Ser Phe His Asn Glu Lys
245 250 255
Pro Glu Thr Glu Ser Leu Ser Ala Phe Val Tyr Leu Pro Gly Leu Lys
260 265 270
Asn Gly Lys Lys Ala Gln Gln Leu Val Gly Asp Asn Ser Ile Glu Tyr
275 280 285
Phe Ser Leu Pro Ile Val Leu Arg Asn Gly Ser Val Val Ser Ile Asp
290 295 300
Thr Ser Val Leu Glu Lys Leu Ser Pro Arg Glu Glu Gln Leu Val Asn
305 310 315 320
Thr Ala Val Lys Glu Leu Arg Lys Asn Ile Glu Lys Gly Lys Ser Phe
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Ile Leu Asp Ser
340
<210> 3
<211> 1767
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<223> NADP依赖性苹果酸酶 (ME3)
<220>
<223> NADP依赖性苹果酸酶 (ME3)
<400> 3
atggggacta atcaaaccca aataagtgat gaatacgtaa ctggtaactc atcaggggta 60
ggaggaggaa tatctgatgt gtacggcgaa gactctgcca cactcgatca attggttact 120
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gtcgtactct cccaggatgt acaggaacgt aaggttatgc ataatttaag gcagtatacc 300
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tataagttgt tgatcgacaa tgttgaggag ttgttacccg ttgtctacac gccgacggtt 420
ggcgaggcgt gccaaaaata tggttccatc tacagacgcc cacaggggtt atatatttca 480
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<210> 4
<211> 588
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<223> NADP依赖性苹果酸酶 (ME3)
<220>
<223> NADP依赖性苹果酸酶 (ME3)
<400> 4
Met Gly Thr Asn Gln Thr Gln Ile Ser Asp Glu Tyr Val Thr Gly Asn
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Ser Ser Gly Val Gly Gly Gly Ile Ser Asp Val Tyr Gly Glu Asp Ser
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165 170 175
Arg Gly Ile Gln Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly
180 185 190
Leu Gly Asp Leu Gly Cys Gln Gly Met Gly Ile Pro Val Gly Lys Leu
195 200 205
Ser Leu Tyr Thr Ala Leu Gly Gly Ile Arg Pro Ser Ala Cys Leu Pro
210 215 220
Ile Thr Ile Asp Val Gly Thr Asn Asn Glu Lys Leu Leu Asn Asn Glu
225 230 235 240
Phe Tyr Ile Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ala Asn Gly Glu Glu Tyr Ala
245 250 255
Glu Phe Leu Gln Glu Phe Met Cys Ala Val Lys Gln Asn Tyr Gly Glu
260 265 270
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275 280 285
Leu Leu Ser Lys Tyr Cys Ser Ser His Leu Val Phe Asn Asp Asp Ile
290 295 300
Gln Gly Thr Ala Ser Val Val Leu Ala Gly Leu Ile Ala Ala Gln Lys
305 310 315 320
Val Leu Gly Lys Ser Leu Ala Asp His Thr Phe Leu Phe Leu Gly Ala
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PPC/PEPC)
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PPC/PEPC)
<400> 5
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PPC/PEPC)
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PPC/PEPC)
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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK)
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK)
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ggtgatgttg ccgttttctt tggtttatct ggtactggta agactacctt gtctactgat 780
cctaagagaa gattgatcgg tgatgatgaa catggttggg atgatgatgg tgtttttaac 840
tttgaaggtg gttgttacgc caagaccatc aagttgtcta aagaagctga accagaaatc 900
tacaacgcca ttagaagaga tgctttgttg gaaaacgtta ccgttagaga agatggtact 960
atcgatttcg atgatggttc taagactgaa aacaccagag tttcttaccc aatctaccac 1020
attgataaca tcgttaagcc tgtttctaaa gctggtcatg ctaccaaggt tattttcttg 1080
actgctgatg cttttggtgt tttgccacca gtttctagat taactgctga tcaaacccaa 1140
taccacttct tgtctggttt tactgctaaa ttggcaggta ctgaaagagg tattactgaa 1200
cctactccaa ctttctctgc ttgttttggt gctgcttttt tgtcattgca tccaactcaa 1260
tacgctgaag ttttggtcaa gagaatgcaa gctgctggtg ctcaagctta tttggttaat 1320
actggttgga atggtacagg taaaagaatc tccattaagg ataccagagc cattattgat 1380
gccatcttga atggttcttt ggataacgct gaaactttca ccttgccaat gttcaatttg 1440
gctattccaa ctgaattgcc aggtgttgac accaagattt tagatccaag aaacacttac 1500
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taa 1623
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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK)
<220>
<223> 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK)
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Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly
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385 390 395 400
Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu
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His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala
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Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys
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Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn
450 455 460
Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu
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Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro
485 490 495
Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr
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Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro
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<211> 951
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 乙醛辅酶A脱氢酶 (MHPF)
<220>
<223> 乙醛辅酶A脱氢酶 (MHPF)
<400> 9
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<223> 乙醛辅酶A脱氢酶 (MHPF)
<220>
<223> 乙醛辅酶A脱氢酶 (MHPF)
<400> 10
Met Ser Lys Arg Lys Val Ala Ile Ile Gly Ser Gly Asn Ile Gly Thr
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Asp Leu Met Ile Lys Ile Leu Arg His Gly Gln His Leu Glu Met Ala
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Val Met Val Gly Ile Asp Pro Gln Ser Asp Gly Leu Ala Arg Ala Arg
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Gly Ala His Val Lys Asn Asp Ala Ala Leu Arg Glu Ala Lys Pro Asp
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 丙酮酸激酶 1 (PYK1)
<220>
<223> 丙酮酸激酶 1 (PYK1)
<400> 11
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<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 丙酮酸激酶 1 (PYK1)
<220>
<223> 丙酮酸激酶 1 (PYK1)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 丙酮酸激酶 2 (PYK2)
<220>
<223> 丙酮酸激酶 2 (PYK2)
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<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 丙酮酸激酶 2 (PYK2)
<220>
<223> 丙酮酸激酶 2 (PYK2)
<400> 14
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Ser Ile Arg Lys Ala Leu Gly Ser Glu Gly Gln Asp Ile Lys Ile Ile
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355 360 365
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370 375 380
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<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶1 (ADH1)
<220>
<223> 醇脱氢酶1 (ADH1)
<400> 15
atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60
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<210> 16
<211> 348
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶1 (ADH1)
<220>
<223> 醇脱氢酶1 (ADH1)
<400> 16
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
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Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
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35 40 45
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Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
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195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
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325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 17
<211> 3537
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 丙酮酸羧化酶1 (PYC1)
<220>
<223> 丙酮酸羧化酶1 (PYC1)
<400> 17
atgtcgcaaa gaaaattcgc cggcttgaga gataacttca atctcttggg tgaaaagaac 60
aaaatattgg tggctaatag aggagaaatt ccaatcagaa tttttcgtac cgctcatgaa 120
ctgtctatgc agacggtagc tatatattct catgaagatc gtctttcaac gcacaaacaa 180
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caaaatagac actatttcat tgaaattaat ccaagaatcc aagtggaaca taccatcaca 960
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<223> 丙酮酸羧化酶1 (PYC1)
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taa 3543
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<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
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<223> 丙酮酸羧化酶2 (PYC2)
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980 985 990
Ile Asp Glu Cys Asp Val Ala Ser Tyr Asn Met Tyr Pro Arg Val Tyr
995 1000 1005
Glu Asp Phe Gln Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Leu Ser Val Leu
1010 1015 1020
Pro Thr Lys Asn Phe Leu Ala Pro Ala Glu Pro Asp Glu Glu Ile Glu
1025 1030 1035 1040
Val Thr Ile Glu Gln Gly Lys Thr Leu Ile Ile Lys Leu Gln Ala Val
1045 1050 1055
Gly Asp Leu Asn Lys Lys Thr Gly Gln Arg Glu Val Tyr Phe Glu Leu
1060 1065 1070
Asn Gly Glu Leu Arg Lys Ile Arg Val Ala Asp Lys Ser Gln Asn Ile
1075 1080 1085
Gln Ser Val Ala Lys Pro Lys Ala Asp Val His Asp Thr His Gln Ile
1090 1095 1100
Gly Ala Pro Met Ala Gly Val Ile Ile Glu Val Lys Val His Lys Gly
1105 1110 1115 1120
Ser Leu Val Lys Lys Gly Glu Ser Ile Ala Val Leu Ser Ala Met Lys
1125 1130 1135
Met Glu Met Val Val Ser Ser Pro Ala Asp Gly Gln Val Lys Asp Val
1140 1145 1150
Phe Ile Lys Asp Gly Glu Ser Val Asp Ala Ser Asp Leu Leu Val Val
1155 1160 1165
Leu Glu Glu Glu Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Lys
1170 1175 1180
<210> 21
<211> 1128
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶3 (ADH3)
<220>
<223> 醇脱氢酶3 (ADH3)
<400> 21
atgttgagaa cgtcaacatt gttcaccagg cgtgtccaac caagcctatt ttctagaaac 60
attcttagat tgcaatccac agctgcaatc cctaagactc aaaaaggtgt catcttttat 120
gagaataagg ggaagctgca ttacaaagat atccctgtcc ccgagcctaa gccaaatgaa 180
attttaatca acgttaaata ttctggtgta tgtcacaccg atttacatgc ttggcacggc 240
gattggccat tacctgttaa actaccatta gtaggtggtc atgaaggtgc tggtgtagtt 300
gtcaaactag gttccaatgt caagggctgg aaagtcggtg atttagcagg tatcaaatgg 360
ctgaacggtt cttgtatgac atgcgaattc tgtgaatcag gtcatgaatc aaattgtcca 420
gatgctgatt tatctggtta cactcatgat ggttctttcc aacaatttgc gaccgctgat 480
gctattcaag ccgccaaaat tcaacagggt accgacttgg ccgaagtagc cccaatatta 540
tgtgctggtg ttactgtata taaagcacta aaagaggcag acttgaaagc tggtgactgg 600
gttgccatct ctggtgctgc aggtggcttg ggttccttgg ccgttcaata tgcaactgcg 660
atgggttaca gagttctagg tattgatgca ggtgaggaaa aggaaaaact tttcaagaaa 720
ttggggggtg aagtattcat cgactttact aaaacaaaga atatggtttc tgacattcaa 780
gaagctacca aaggtggccc tcatggtgtc attaacgttt ccgtttctga agccgctatt 840
tctctatcta cggaatatgt tagaccatgt ggtaccgtcg ttttggttgg tttgcccgct 900
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tcttatgttg gtaacagagc tgatacgaga gaagccttag acttctttag cagaggtttg 1020
atcaaatcac caatcaaaat tgttggatta tctgaattac caaaggttta tgacttgatg 1080
gaaaagggca agattttggg tagatacgtc gtcgatacta gtaaataa 1128
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<211> 375
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶3 (ADH3)
<220>
<223> 醇脱氢酶3 (ADH3)
<400> 22
Met Leu Arg Thr Ser Thr Leu Phe Thr Arg Arg Val Gln Pro Ser Leu
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Phe Ser Arg Asn Ile Leu Arg Leu Gln Ser Thr Ala Ala Ile Pro Lys
20 25 30
Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Lys Gly Lys Leu His Tyr
35 40 45
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50 55 60
Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp His Gly
65 70 75 80
Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly
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Gly Asp Leu Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Thr Cys
115 120 125
Glu Phe Cys Glu Ser Gly His Glu Ser Asn Cys Pro Asp Ala Asp Leu
130 135 140
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Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ile Gln Gln Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val
165 170 175
Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Glu
180 185 190
Ala Asp Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly
195 200 205
Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Thr Ala Met Gly Tyr Arg
210 215 220
Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys Leu Phe Lys Lys
225 230 235 240
Leu Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys Thr Lys Asn Met Val
245 250 255
Ser Asp Ile Gln Glu Ala Thr Lys Gly Gly Pro His Gly Val Ile Asn
260 265 270
Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Ser Leu Ser Thr Glu Tyr Val Arg
275 280 285
Pro Cys Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro Ala Asn Ala Tyr Val
290 295 300
Lys Ser Glu Val Phe Ser His Val Val Lys Ser Ile Asn Ile Lys Gly
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Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu Ala Leu Asp Phe Phe
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Leu Pro Lys Val Tyr Asp Leu Met Glu Lys Gly Lys Ile Leu Gly Arg
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<210> 23
<211> 1149
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶4 (ADH4)
<220>
<223> 醇脱氢酶4 (ADH4)
<400> 23
atgtcttccg ttactgggtt ttacattcca ccaatctctt tctttggtga aggtgcttta 60
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agaactgaca tgtgttacgc tgaatacttg gcaggtatgg ctttcaacaa tgcttctcta 780
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<211> 382
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶4 (ADH4)
<220>
<223> 醇脱氢酶4 (ADH4)
<400> 24
Met Ser Ser Val Thr Gly Phe Tyr Ile Pro Pro Ile Ser Phe Phe Gly
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asn Glu Ser Leu Val Ala Ala Tyr Lys Asp Gly Lys Asp Lys Lys Ala
225 230 235 240
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245 250 255
Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Leu Ala His Gln Leu Gly Gly
260 265 270
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Leu Lys Glu Leu Gly Val Lys Thr Glu Asp Phe Glu Ile Leu Ala Glu
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶5 (ADH5)
<220>
<223> 醇脱氢酶5 (ADH5)
<400> 25
atgccttcgc aagtcattcc tgaaaaacaa aaggctattg tcttttatga gacagatgga 60
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atattcatcg atttcacgga agaaaaagac attgttggtg ctataataaa ggccactaat 720
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<211> 351
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 醇脱氢酶5 (ADH5)
<220>
<223> 醇脱氢酶5 (ADH5)
<400> 26
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195 200 205
Ala Lys Arg Lys Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gly Glu Ile Phe Ile Asp
210 215 220
Phe Thr Glu Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Ile Ile Lys Ala Thr Asn
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile
245 250 255
Glu Ala Ser Thr Arg Tyr Cys Arg Pro Asn Gly Thr Val Val Leu Val
260 265 270
Gly Met Pro Ala His Ala Tyr Cys Asn Ser Asp Val Phe Asn Gln Val
275 280 285
Val Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Cys Val Gly Asn Arg Ala Asp
290 295 300
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305 310 315 320
Ile His Leu Ala Gly Leu Ser Asp Val Pro Glu Ile Phe Ala Lys Met
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Glu Lys Gly Glu Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Glu Thr Ser Lys
340 345 350
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pTDH3
<220>
<223> pTDH3
<400> 27
ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 60
tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 120
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ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 360
aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 420
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cataaacaaa caaa 554
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pENO2
<220>
<223> pENO2
<400> 28
cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac 60
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tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact 300
atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat 360
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aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt 480
tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca 540
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> pTEF Kl
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gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa 240
aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta 300
ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg 360
tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa 419
<210> 30
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pTEF3
<220>
<223> pTEF3
<400> 30
ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60
atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120
ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180
cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240
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<210> 31
<211> 383
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pTEF1
<220>
<223> pTEF1
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pADH1
<220>
<223> pADH1
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gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt 240
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<211> 549
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGPM 1" <223> "pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
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gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata 60
tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg 120
tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc 180
ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg 240
gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag 300
ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg 360
agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa 420
agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat 480
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attacaata 549
<210> 34
<211> 650
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pFBA1
<220>
<223> pFBA1
<400> 34
acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct 60
tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa 120
tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg 180
ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct 240
ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac 300
tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg 360
ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat 420
caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt 480
aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa 540
agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc 600
ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 650
<210> 35
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pPDC1" <223> "pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<400> 35
ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 60
cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 120
cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 180
taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 240
ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 300
tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 360
ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 420
tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 480
ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 540
aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 600
gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 660
tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 700
<210> 36
<211> 998
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCCW12" <223> "pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<400> 36
aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60
aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120
tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180
aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240
gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300
ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360
agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420
agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480
gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540
cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600
aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660
agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720
cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780
cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840
ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900
ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960
attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998
<210> 37
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGK1" <223> "pGK1
<220>
<223> pGK1
<220>
<223> pGK1
<400> 37
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700
<210> 38
<211> 913
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMDH2" <223> "pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<400> 38
ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca 60
cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct 120
ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat 180
catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg 240
cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta 300
tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc 360
atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa 420
tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc 480
cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat 540
tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg 600
gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt 660
ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc 720
gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat 780
tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt 840
cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa 900
aagttatagt aac 913
<210> 39
<211> 406
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pURA3" <223> "pURA3
<220>
<223> pURA3
<220>
<223> pURA3
<400> 39
ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat 60
gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt 120
atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc 180
ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg 240
aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact 300
tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt 360
aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc 406
<210> 40
<211> 535
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pRPLA1" <223> "pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<400> 40
tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc 60
tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt 120
agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt 180
ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta 240
tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta 300
catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt 360
ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt 420
gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt 480
ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa 535
<210> 41
<211> 400
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pSAM4" <223> "pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<400> 41
agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga 60
attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc 120
ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga 180
gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag 240
tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt 300
gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg 360
aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa 400
<210> 42
<211> 505
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCUP1-1" <223> "pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<400> 42
cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg 60
acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt 120
attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca 180
ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg 240
tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc 300
gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa 360
tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct 420
tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca 480
atcaatcaat caatcatcac ataaa 505
<210> 43
<211> 500
<212> DNA
<213> 光滑念珠菌（Candida glabrata）
<220>
<223> pCUP1.Cgla" <223> "pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<400> 43
cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg 60
gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc 120
aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt 180
ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag 240
aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata 300
gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag 360
ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga 420
aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta 480
gtattttgct ttagttgtta 500
<210> 44
<211> 425
<212> DNA
<213> 贝酵母（Saccharomyces bayanus）
<220>
<223> pCUP1.Sba" <223> "pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<400> 44
agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60
tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120
acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180
tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240
tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300
aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360
tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420
ataaa 425
<210> 45
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU1" <223> "pACU1
<220>
<223> pACU1
<220>
<223> pACU1
<400> 45
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 540
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 600
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 660
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 720
tctattaccc ccatccatac a 741
<210> 46
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU2" <223> "pACU2
<220>
<223> pACU2
<220>
<223> pACU2
<400> 46
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg 360
tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg 420
ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg 480
gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac 540
tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg 600
atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc 660
ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca 720
gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 757
<210> 47
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU3p" <223> "pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<400> 47
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180
attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240
gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480
caaggagaaa aaactata 498
<210> 48
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU4p" <223> "pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<400> 48
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480
caaggagaaa aaactata 498
<210> 49
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU5" <223> "pACU5
<220>
<223> pACU5
<220>
<223> pACU5
<400> 49
ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa 60
ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa 120
tcaatttcct acctgaatct aaaattcccg gaattcgaaa aagacatttt tgctgtcagt 180
cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt 240
ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgaat tccgagcaga tccgccaggc 300
gtgtatatat agcgtggatg gccaggcaac tttagtgctg acacatacag gcatatatat 360
atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct 420
tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat 480
tactatactt ctatagacac acaaacacaa atacacacac taaattaata 530
<210> 50
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU6" <223> "pACU6
<220>
<223> pACU6
<220>
<223> pACU6
<400> 50
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600
ctaccaacga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840
tacaattcta ttacccccat ccataca 867
<210> 51
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU7" <223> "pACU7
<220>
<223> pACU7
<220>
<223> pACU7
<400> 51
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600
tctttttcga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840
tacaattcta ttacccccat ccataca 867
<210> 52
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU8" <223> "pACU8
<220>
<223> pACU8
<220>
<223> pACU8
<400> 52
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600
ctaccaacga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc 660
tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa 720
aaaagactac caacgaattc gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc 780
ttttgctggc atttcttcca gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc 840
cagcaaaaaa gactaccaac gaattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119
<210> 53
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU9" <223> "pACU9
<220>
<223> pACU9
<220>
<223> pACU9
<400> 53
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa 240
gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc tggcatttct tccagaagca 300
aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa aaaagactac caacgaattc 360
gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc ttttgctggc atttcttcca 420
gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc cagcaaaaaa gactaccaac 480
gaattcgggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat 540
ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta 600
agaatttttg aaaattcaat ataa 624
<210> 54
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU10p" <223> "pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<400> 54
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca 300
gcggaaaaga cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg 360
acagtgactg acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac 420
ggttcagcgg aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat 480
ctcttgacag tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc 540
tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa 600
aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tccaattcgg atgataatgc 660
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 720
attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 780
tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 840
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 876
<210> 55
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU11" <223> "pACU11
<220>
<223> pACU11
<220>
<223> pACU11
<400> 55
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180
aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact 240
ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt 300
agtttctttg gttgtattga tcatttggtt catcgtggtt cattaatttt ttttctccat 360
tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat 420
gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga 480
ttgttaaaaa cgtatttata gcaaacgcaa ttgtaattaa ttcttatttt gtatcttttc 540
ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac 600
accaagcaac taatactata acatacaata ata 633
<210> 56
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU12" <223> "pACU12
<220>
<223> pACU12
<220>
<223> pACU12
<400> 56
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600
tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840
acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU13" <223> "pACU13
<220>
<223> pACU13
<220>
<223> pACU13
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ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600
tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840
acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg 900
aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat ctcttgacag 960
tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt 1020
cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct 1080
tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga 1140
acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga 1200
atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg tctttttcca attctaatta agttagtcaa 1260
ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct 1320
tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc 1380
tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt 1440
cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 1497
<210> 58
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU14" <223> "pACU14
<220>
<223> pACU14
<220>
<223> pACU14
<400> 58
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180
aaaaagacta ccaacgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg tcaagagatt 240
cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt 300
ccagcaaaaa agactaccaa cgaattcgaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa 360
gagattcttt tgctggcatt tcttccagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga 420
accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac 480
tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc 540
cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga 600
agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag 660
catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca 720
ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg 780
aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta 840
tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt 900
cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt 960
cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a 1011
<210> 59
<211> 398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU15" <223> "pACU15
<220>
<223> pACU15
<220>
<223> pACU15
<400> 59
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt 240
agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc gctctttttg cttctggaag 300
aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc 360
gggctcttta catttccaca acatataagt aagattag 398
<210> 60
<211> 428
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGAL/CUP1p" <223> "pGAL/CUP1p
<220>
<223> pGAL/CUP1p
<220>
<223> pGAL/CUP1p
<400> 60
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180
attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240
gttccagcaa aaaagactac caacgcaata tggattgtca gaatcatata aaagagaagc 300
aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat 360
atagaagtca tcgaaataga tattaagaaa aacaaactgt acaatcaatc aatcaatcat 420
cacataaa 428
<210> 61
<211> 518
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCRS5" <223> "pCRS5
<220>
<223> pCRS5
<220>
<223> pCRS5
<400> 61
gtggacgaaa agacataact gcagaagtac agctgccttt atttcttgtg gtcatttatt 60
gcttttattt tcaagtcaga tatacaagaa aatcaaatcc catcgtcaac gtcacgtata 120
aacgattaat ttacagtaat accatactct accaacatta ttttagtccg acgttcagtc 180
ctgtaggtgt tccaaatcct tctggcattg acttctgtgc agaaaccctt caaaatgagt 240
tccactttac gtcagatcgc ataacaaccg gtcatatatt tttttctttt gctaaacccc 300
ctactgcaag cacttttaag aaaaagaaca ataaatgcgt ctttattgct gtgtggaagt 360
gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc 420
aagcggggcc tatataagaa gggcgcacat cgtcccccct aagaatagcg aagcgatatt 480
acactgaaca ctacaatgtc aaatagtact caataaat 518
<210> 62
<211> 510
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCHA1" <223> "pCHA1
<220>
<223> pCHA1
<220>
<223> pCHA1
<400> 62
gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt 60
aaaagcctct ccgtgatatc ctctagggct tgggttgcca ttaatcgatg tgtccttgtt 120
tccttatgcg agctgtttct tatctatctt atggtcccat tctttactgc actgtttaca 180
ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat 240
caccgcgaac ggaaactaat gagtcctctg cgcggagaca tgattccgca tgggcggctc 300
ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt 360
atcaaattgt ttgcgatgag ataagataaa agggacaata tgaggaggaa cacaggtata 420
taaatatcgc caaataaaag gaaaatgttt atacagtttt ctctttttta agtgctggat 480
agacaagaga caggaaaatt aaccagcgag 510
<210> 63
<211> 601
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCTR1" <223> "pCTR1
<220>
<223> pCTR1
<220>
<223> pCTR1
<400> 63
caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat 60
tttgaaccgt attttgctcg ttccagcctt tccacgtttt tgttatctaa gcaacttggc 120
acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt 180
attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc 240
tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat 300
ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat 360
gttgtattgt catctcgaca gggtcttgta tgttttattc ctcttatgat tagttcacat 420
tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat 480
aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat 540
tacatttgtt ggaagaatcg aatagaaaat aaaaaaaagt gtattatatt tgacattcaa 600
a 601
<210> 64
<211> 522
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCTR3" <223> "pCTR3
<220>
<223> pCTR3
<220>
<223> pCTR3
<400> 64
gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt 60
cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa 120
ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg 180
agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc 240
aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag 300
attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa 360
tattattgcc ttattaaaaa tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca 420
cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga 480
gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag 522
<210> 65
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR1" <223> "pCUR1
<220>
<223> pCUR1
<220>
<223> pCUR1
<400> 65
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420
tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa taaccgaagt 480
gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata agatatatat 540
aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct ctcttgtctt 600
ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt 660
acccccatcc ataca 675
<210> 66
<211> 674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR2" <223> "pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<400> 66
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt 360
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420
ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 480
tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 540
aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 600
tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 660
cccccatcca taca 674
<210> 67
<211> 794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR3" <223> "pCUR3
<220>
<223> pCUR3
<220>
<223> pCUR3
<400> 67
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
taggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 480
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 540
ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 600
tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 660
aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 720
tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 780
cccccatcca taca 794
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> pCUR4
<400> 68
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 480
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ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga 660
aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt 720
taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat 780
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> pCUR5p
<220>
<223> pCUR5p
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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 180
caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 240
caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg 300
gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag 360
ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa 420
atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag 480
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> pCUR6
<220>
<223> pCUR6
<400> 70
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 360
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agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg 780
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<211> 803
<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<223> pCUR7
<400> 71
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 360
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 420
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 480
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 540
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accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 660
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 720
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<212> DNA
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<223> pCUR8
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
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tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 420
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> pCUR9
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
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caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840
ctttttacaa caaatataaa aca 863
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> pCUR10
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
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tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
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tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR13" <223> "pCUR13
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<223> pCUR13
<220>
<223> pCUR13
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gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
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aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840
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cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR15" <223> "pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<400> 79
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 420
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 600
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 660
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 720
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 780
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 840
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 900
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 960
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 1020
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR16" <223> "pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<400> 80
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180
cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc 240
acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat 300
atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct 360
ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc 420
tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa 480
gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa 540
aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt 600
gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc 660
aactaatact ataacataca ataata 686
<210> 81
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR17" <223> "pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<400> 81
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 240
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 300
cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca 360
tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc 420
tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt 480
ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca 540
agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta 600
aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct 660
tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag 720
caactaatac tataacatac aataata 747
<210> 82
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pLYS1" <223> "pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<400> 82
gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat 60
gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta 120
tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa 180
tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat 240
actaagtcga tgagtcaaaa aagactctta tacatttata cattttgcat tattattttt 300
tttttccagc ggaatttgga attccgctct caaccgccaa aattcccctg cgatttcagc 360
gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct 420
tccctgacgg aaactggtat tttaggaggc ataccataag ataacaacga aaacgcttta 480
tttttcacac aaccgcaaaa 500
<210> 83
<211> 650
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pLYS4" <223> "pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<400> 83
ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc 60
actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga 120
tacaacagca ccaaacaccg aaaagaatag ccaaagctgt cctctggtgt tggaaaaact 180
ggaaaaaacg caactgcgtt ggctgctacg gtgaaaaatt ttcctatgac ttttttcact 240
gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca 300
atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt 360
cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc 420
agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac 480
acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc 540
tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac 600
tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag 650
<210> 84
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pLYS9" <223> "pLYS9
<220>
<223> pLYS9
<220>
<223> pLYS9
<400> 84
acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg 60
atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca 120
actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac 180
cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt 240
agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag 300
tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag 360
atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa 420
attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt 480
aacgtattat atattttaat 500
<210> 85
<211> 494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR1p" <223> "pLYR1p
<220>
<223> pLYR1p
<220>
<223> pLYR1p
<400> 85
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300
ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360
aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420
caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480
gagaaaaaac tata 494
<210> 86
<211> 494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR2p" <223> "pLYR2p
<220>
<223> pLYR2p
<220>
<223> pLYR2p
<400> 86
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240
tttcgattcc agagtatgag gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300
ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360
aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420
caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480
gagaaaaaac tata 494
<210> 87
<211> 616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR3p" <223> "pLYR3p
<220>
<223> pLYR3p
<220>
<223> pLYR3p
<400> 87
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300
ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360
tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600
aggagaaaaa actata 616
<210> 88
<211> 616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR4p" <223> "pLYR4p
<220>
<223> pLYR4p
<220>
<223> pLYR4p
<400> 88
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600
aggagaaaaa actata 616
<210> 89
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR5p" <223> "pLYR5p
<220>
<223> pLYR5p
<220>
<223> pLYR5p
<400> 89
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420
aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480
ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 540
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 600
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 660
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 720
caaggagaaa aaactata 738
<210> 90
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR6p" <223> "pLYR6p
<220>
<223> pLYR6p
<220>
<223> pLYR6p
<400> 90
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attgctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300
ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360
tatcagcaat agatgataga aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa 420
aattcgcttt gtagtgaaaa ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga 480
attatcagca atagatgata gaaacaattg ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga 540
aaaattcgct ttgtagtgaa aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg 600
gaattatcag caatagatga tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg 660
gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa 720
tggaattatc agcaatagat gatagaaaga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt 780
tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc 840
aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa caattcggat gataatgcga ttagtttttt 900
agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 960
ataaatggaa aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt 1020
acttcttatt caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 1080
taacgtcaag gagaaaaaac tata 1104
<210> 91
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR7p" <223> "pLYR7p
<220>
<223> pLYR7p
<220>
<223> pLYR7p
<400> 91
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attgtttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420
aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480
ggaatttcga ttccagagta tgagcaattg tttctatcat ctattgctga taattccatt 540
ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca 600
acggaatttc gattccagag tatgaggaat tctttctatc atctattgct gataattcca 660
ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag cgaatttttc 720
caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg ctgataattc 780
cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt 840
tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag caattgtttc tatcatctat tgctgataat 900
tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt 960
tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata 1020
attccattgg aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa 1080
tttttccaac ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc tttctatcat ctattgctga 1140
taattccatt ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg 1200
aatttttcca acggaatttc gattccagag tatgagcaat tgtttctatc atctattgct 1260
gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag 1320
cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg 1380
ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa 1440
agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat 1500
tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac 1560
aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg agcaattcgg atgataatgc 1620
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 1680
attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 1740
tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 1800
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 1836
<210> 92
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR8" <223> "pLYR8
<220>
<223> pLYR8
<220>
<223> pLYR8
<400> 92
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420
atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480
attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540
agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600
gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660
aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720
aacaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900
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<210> 93
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR9" <223> "pLYR9
<220>
<223> pLYR9
<220>
<223> pLYR9
<400> 93
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420
ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480
attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540
atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600
gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660
acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720
agcaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960
tctattaccc ccatccatac a 981
<210> 94
<211> 1225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR10" <223> "pLYR10
<220>
<223> pLYR10
<220>
<223> pLYR10
<400> 94
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420
ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480
attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540
atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600
gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660
acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720
aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg aaattctcaa taccctttat 780
tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac ggaatttcga ttccagagta 840
tgaggaattc tttctatcat ctattgctga taattccatt ggaaattctc aatacccttt 900
attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca acggaatttc gattccagag 960
tatgagcaat tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa 1020
taaccgaagt gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata 1080
agatatatat aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct 1140
ctcttgtctt ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata 1200
caattctatt acccccatcc ataca 1225
<210> 95
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pLYR11" <223> "pLYR11
<220>
<223> pLYR11
<220>
<223> pLYR11
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ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420
atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480
attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540
agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600
gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660
aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720
aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa aattcgcttt gtagtgaaaa 780
ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga attatcagca atagatgata 840
gaaagaattc ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga aaaattcgct ttgtagtgaa 900
aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg gaattatcag caatagatga 960
tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg 1020
aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat 1080
gatagaaaca attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 1140
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 1200
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 1260
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 1320
tacaattcta ttacccccat ccataca 1347
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<211> 686
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMET17" <223> "pMET17
<220>
<223> pMET17
<220>
<223> pMET17
<400> 96
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgagg 360
tcacatgatc gcaaaatggc aaatggcacg tgaagctgtc gatattgggg aactgtggtg 420
gttggcaaat gactaattaa gttagtcaag gcgccatcct catgaaaact gtgtaacata 480
ataaccgaag tgtcgaaaag gtggcacctt gtccaattga acacgctcga tgaaaaaaat 540
aagatatata taaggttaag taaagcgtct gttagaaagg aagtttttcc tttttcttgc 600
tctcttgtct tttcatctac tatttccttc gtgtaataca gggtcgtcag atacatagat 660
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pMET6
<220>
<223> pMET6
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ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt 60
gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt 120
agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc atggcagctc 180
tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg ctcaattgag 240
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agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat aagtgataga 360
tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc 420
ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa gaaacaaaat 480
accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 510
<210> 98
<211> 508
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pMET14
<220>
<223> pMET14
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cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat 60
gtagcagata actctgcact tctagaatca ttccactacg acatttggct catcaccagc 120
tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc 180
tttcatttcg gcgtgatggt acggcaccca cggttcctta cattattctc gaaaaatagc 240
tgcacgcttt tccaggaata aaagaccgtg ccactaattt cacgtgatca atatatttac 300
aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac 360
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tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga 480
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<210> 99
<211> 552
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMET3" <223> "pMET3
<220>
<223> pMET3
<220>
<223> pMET3
<400> 99
aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt 60
agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg 120
acacacttgt agcgccaacg cgcatcctac ggattgctga cagaaaaaaa ggtcacgtga 180
ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca 240
ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300
cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360
cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420
aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480
gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540
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<210> 100
<211> 363
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
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<220>
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gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60
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aat 363
<210> 101
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pSAM2" <223> "pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<400> 101
gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa 60
ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat 120
cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac 180
gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata 240
ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat 300
cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat 360
aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc 420
ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac 480
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<210> 102
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> tTDH2
<220>
<223> tTHD2
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cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300
<210> 103
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> tCYC1
<220>
<223> tCYC1
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cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180
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<210> 104
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tTDH3" <223> "tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<400> 104
gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60
tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120
tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> tADH2
<220>
<223> tADH2
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t 301
<210> 107
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> tTPI1
<220>
<223> tTPI1
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gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60
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<210> 108
<211> 299
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> tMET17
<220>
<223> tMET17
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gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60
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tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180
gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tENO2" <223> "tENO2
<220>
<223> tENO2
<220>
<223> tENO2
<400> 109
ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60
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ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac 240
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tcttc 305
<210> 110
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tMET3" <223> "tMET3
<220>
<223> tMET3
<220>
<223> tMET3
<400> 110
tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat 60
aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag 120
aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa 180
acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt 240
attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc 300
<210> 111
<211> 301
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tPGK1" <223> "tPGK1
<220>
<223> tPGK1
<220>
<223> tPGK1
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attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60
gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120
ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180
taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240
tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300
a 301
<210> 112
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tDIT1" <223> "tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<400> 112
taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60
cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120
atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180
tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240
caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300
<210> 113
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL3" <223> "tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<400> 113
gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60
aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120
gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180
tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240
ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300
<210> 114
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL41B" <223> "tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<400> 114
gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt 60
tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa 120
tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta 180
ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt 240
tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct 300
<210> 115
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL15A" <223> "tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<400> 115
gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60
actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120
tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc 180
cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg 240
gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca 300
<210> 116
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tIDP1" <223> "tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<400> 116
tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta 60
gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat 120
atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg 180
gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta 240
gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt 300
<210> 117
<211> 1089
<212> DNA
<213> 乳酸克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）
<220>
<223> Leu2" <223> "Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 117
atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60
gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120
catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180
ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240
ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300
tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360
aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420
tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480
agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540
ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600
agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660
ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720
attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780
ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840
ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900
gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960
agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020
ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080
ttggcttaa 1089
<210> 118
<211> 362
<212> PRT
<213> 乳酸克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）
<220>
<223> Leu2 " <223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 118
Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu
1 5 10 15
Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg
20 25 30
Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala
35 40 45
Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser
50 55 60
Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp
65 70 75 80
Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys
85 90 95
Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp
100 105 110
Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr
115 120 125
Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu
130 135 140
Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr
145 150 155 160
Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala
165 170 175
Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn
180 185 190
Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile
195 200 205
Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser
210 215 220
Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val
245 250 255
Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu
260 265 270
Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser
275 280 285
Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu
290 295 300
Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly
305 310 315 320
Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg
325 330 335
Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala
340 345 350
Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala
355 360
<210> 119
<211> 499
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pNUP57
<220>
<223> pNUP57
<400> 119
tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60
gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120
cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180
agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240
atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300
tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360
aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420
atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480
ttgttgacca attgatcac 499
<210> 120
<211> 451
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGAP1
<220>
<223> pGAP1
<400> 120
cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60
ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120
ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180
ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240
tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300
tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360
aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420
agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451
<210> 121
<211> 998
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pJEN1
<220>
<223> pJEN1
<400> 121
aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60
gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120
gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180
tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240
aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300
tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360
gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420
aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480
tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540
ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600
atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660
agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720
tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780
ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840
caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900
tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960
gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998
<210> 122
<211> 450
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pICL1
<220>
<223> pICL1
<400> 122
ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60
ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120
aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180
atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240
gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300
ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360
tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420
tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450
<210> 123
<211> 598
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pADH2
<220>
<223> pADH2
<400> 123
tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60
gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120
atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180
taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240
acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300
accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420
atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480
ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540
atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598
<210> 124
<211> 793
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMLS1
<220>
<223> pMLS1
<400> 124
tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60
gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120
tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180
agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240
cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300
gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360
gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420
ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480
atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540
tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600
tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660
aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720
tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780
aagaattaag aaa 793

Claims (8)

1.一种选自酿酒酵母物种的重组酵母，在其基因组中：
（A）（i）由SEQ ID NO: 1的核酸序列组成的编码苹果酸脱氢酶的核酸序列过表达，并且
（ii）所述编码苹果酸脱氢酶的核酸序列不包含其过氧化物酶体靶向序列；
（B）由SEQ ID NO: 3的核酸序列组成的编码NADP依赖性苹果酸酶的核酸序列过表达；
（C）由SEQ ID NO: 7的核酸序列组成的编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核酸序列过表达；
（D）由SEQ ID NO: 9的核酸序列组成的编码乙醛辅酶A脱氢酶的核酸序列过表达；并且
（E）编码丙酮酸激酶1的核酸序列为SEQ ID NO: 11的核酸已被删除。
2.根据权利要求1所述的重组酵母，其中过表达是通过实施强启动子实现的，并且其中所述强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。
3.生产至少一种草酰乙酸衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）在培养基中培养如权利要求1至2中任一项定义的重组酵母；和
（b）从所述培养基中回收草酰乙酸衍生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种草酰乙酸衍生物选自由以下组成的组：甲硫氨酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸（HMB）、2-酮基-4-甲硫基丁酸（KMB）、苏氨酸、2,4-二羟基丁酸（2,4-BDH）、赖氨酸、异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸和乙基-高丝氨酸。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述培养基包含至少一种碳源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述碳源选自由葡萄糖和蔗糖组成的组。
7.如权利要求1至2中任一项定义的重组酵母用于生产至少一种草酰乙酸衍生物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述至少一种草酰乙酸衍生物选自由以下组成的组：甲硫氨酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸（HMB）、2-酮基-4-甲硫基丁酸（KMB）、苏氨酸、2,4-二羟基丁酸（2,4-BDH）、赖氨酸、异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸和乙基-高丝氨酸。
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