CN101300356A - 用于琥珀酸盐之生长关联性生产的方法和生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非天然微生物，它包含编码一种酶(这种酶在其活性降低时与琥珀酸盐之生长关联性生产有关)的一个或多个基因中断，该一个或多个基因中断藉此使该非天然微生物具备了稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产能力。另外，本发明也提供了一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联起来的代谢路径改造，而这组代谢路径改造由以下基因组合中选择的一个或多个基因中断组成：(a)adhE，ldhA；(b)adhE，ldhA，ackA－pta；(c)pfl，ldhA；(d)pfl，ldhA，adhE；(e)ackA－pta，pykF，atpF，sdhA；(f)ackA－pta，pykF，ptsG；或(g)ackA－pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA；或其直系同源基因，其中该微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。本发明还提供了一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA，atpH，sdhB或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(e)ackA－pta，pykF，atpF，sdhA进行编码；或一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(f)ackA－pta，pykF，ptsG进行编码；或另一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(g)ackA－pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA进行编码。这些中断可以是完全的基因中断，而此非天然生物可包括各种原核或真核微生物。本发明也提供了制备能够稳定进行琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物的方法。该方法包括：(a)利用电脑模拟识别在指数增长阶段要求琥珀酸盐生产的一组代谢路径改造；以及(b)在遗传上改变一种微生物以便让其包含一组要求琥珀酸盐生产的代谢路径改造。

Description

用于琥珀酸盐之生长关联性生产的方法和生物

发明背景

此发明总的来说与生物的电脑模拟设计有关，更具体地说，与具有选定基因型(此基因型适用于琥珀酸盐之生长关联性生产)的生物有关。

琥珀酸盐是一种具有巨大商业价值的化合物，可在食品、制药、洗涤剂和聚合物等行业用作商用化学品的前体。由发酵产生的琥珀酸盐每年可提供超过2.7x10⁸千克的工业产品，包括1，4丁二醇和相关产品、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMP)和2-吡咯烷酮，Zeikus et al.，Appl Microbiol Biotechnol，51：545-552(1999)。琥珀酸的基本化学性质与石化产物马来酸/酸酐类似，因此生产成本是阻碍其大量进入广阔市场的唯一因素。琥珀酸盐的生物性生产也是一个绿色工艺，因为在糖发酵过程中必须将温室气体二氧化碳(CO2)固定到琥珀酸盐中。因此，1，4-二酸(琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸盐)属于美国能源部从300多种接受评估的候选产品中选择出的优先进行生物工艺开发的十二种化合物之列。

像琥珀酸盐这样的中央代谢化合物为代谢工程提供了良好的初步目标，因为他们常常在基础代谢中快速合成。能够使用碳水化合物天然生产琥珀酸盐的生物有：Anaerobiospirillumsucciniciproducens，Samuelov et al.，Appl Environ Microbiol，65：2260-63(1999)，Lee et al.，Appl Microbiol Biotechnol，54：23-27(2000)，Lee et al.，Biotechnol Lett，25：111-14(2003)；Actinobacillus succinogenes，Guettler et al.，Int J SystBacteriol，49：207-16(1999)，Urbance et al.，Appl MicrobiolBiotechnol，65：664-70(2004)，以及最近完成基因排序的牛瘤胃细菌Mannheimia succiniciproducens，Lee et al.，BioprocessBiosyst Eng，26：63-7(2003)，Hong et al.，Nat Biotechnol，22：1275-81(2004)，Lee et al.，Appl Microbiol Biotechnol，58：663-8(2002)。另外，有些报道宣称已通过各种代谢工程策略构建了琥珀酸盐产量大幅提高的大肠杆菌(Escherichia coli)株系。这些研究均关注于流向琥珀酸盐之碳通道的增加和辅酶NADH的可用性。例如，PEP羧化酶(ppc)的过表达，Millard et al.，Appl EnvironMicrobiol，62：1808-10(1996)，和Rhizobium etli丙酮酸羧化酶(pyc)的表达，Gokarn et al.，Biotechnol Lett，20：795-798(1998)，已可通过提高进入TCA循环之琥珀酸盐支路的碳通量而在E.coli中相应获得0.30g/g和0.17g/g的琥珀酸盐产量。另外，缺乏乳酸脱氢酶(ldh)和丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)(即NZN111株系)的E.coli变异株系以及E.coli过表达，Stols et al.，Appl Environ Microbiol，63：2695-701(1997)，Hong et al.，Biotechnol Bioeng，74：89-95(2001)或Ascaris suum，Stols et al.，Appl Biochem Biotechnol，63-65：153-8(1997)和苹果酶，已可提高琥珀酸盐产量。NZN111中另外一个自发染色体突变，随后映射到磷酸转移酶系统的ptsG基因，Chatterjee et al.，Appl Environ Microbiol，67：148-54(2001)，产生了厌氧琥珀酸盐产量为1mol/mol葡萄糖(0.66g/g)的AFP111株系，Donnelly et al.，Appl Biochem Biotechnol，70-72：187-98(1998)。NZN111和AFP111株系在R.etli丙酮酸羧化酶存在和不存在情况下的各种属性也在厌氧和双阶段(即先有氧生长再厌氧生产)条件下进行了研究，Vemuri et al.，Appl Environ Microbiol，68：1715-27，18(2002)。Vemuri et al.，J IndMicrobiol Biotechnol，28：325-32(2002)，产量约0.96g/g。其他研究获得了生产琥珀酸盐的E.coli株系，能够有氧生产0.91mol/mol(0.60g/g)，Lin etal.，Metab Eng，(2005)，(已接受发表)，以及厌氧生产1.6mol/mol(1.0g/g)，Sanchez et al.，Metab Eng，7：229-39(2005)。

尽管上述研究和报告宣称开发了某些琥珀酸盐高产细菌株系，但所使用的方法仍存在几个影响其实现商业化的缺点。如下所详述，上述方法产生的株系一般在商业发酵工艺中不稳定，因选择压力倾向于未改变或野生型的父本。

因此，需要某种具有商业有利特点的微生物，这种特点能够将所需产品的生物合成与最佳培养条件专向关联起来。本发明满足了这种需求，也提供了相关优势。

发明摘要

本发明提供了一种非天然微生物，它包含可编码一种酶的一个或多个基因中断(这种酶在其活性降低时与琥珀酸盐之生长关联性生产有关)，因而此一个或多个基因中断可将稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产传递给此非天然微生物。另外，本发明也提供了一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联起来的代谢路径改造，而这组代谢路径改造由以下基因组合中选择的一个或多个基因中断组成：(a)adhE，ldhA；(b)adhE，ldhA，ackA-pta；(c)pfl，ldhA；(d)pfl，ldhA，adhE；(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA；(f)ackA-pta，pykF，ptsG；或(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA；或其直系同源基因，其中该微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。本发明还提供了一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA，atpH，sdhB或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA进行编码；或一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(f)ackA-pta，pykF，ptsG进行编码；或另一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA进行编码。这些中断可以是完全的基因中断，而此非天然生物可包括各种原核或真核微生物。本发明也提供了制备能够稳定进行琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物的方法。此方法包括：(a)利用电脑模拟识别在指数增长阶段要求琥珀酸盐生产的一组代谢路径改造；以及(b)在遗传上改变一种微生物以便让其包含一组要求琥珀酸盐生产的代谢路径改造。

图表的简要说明

图1显示了生物化学生产和细胞生长之间的估计平衡关系。点A和B分别代表野生型和变异型株系的最大生物量方案。请注意，变异型株系呈现的是生长关联性生产。

图2显示了OptKnock的两级优化结构。内圈问题进行了基于具体细胞目标优化的通量分配。然后外圈问题通过限制内圈问题优化可利用的关键反应，而使生物工程目标(例如化合物的超额生产)最大化。

图3显示了四种变异株系与野生型相比相对于生长速率边界的琥珀酸盐产量。假设处于完全的厌氧条件，且基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gDW-hr)。所有的株系均达到外边界，这也与野生型株系相对应，但从左侧开始发散如下：adhE，ldh，pta(第一条发散线，红色)；pfl，ldh，adhE(第二条发散线，绿色)；adhE，ldh(第三条发散线，蓝色)和pfl，ldh(第四条发散线，灰色)。

图4显示了OptKnock程序获得的变异株系(ackA-pta、atpFH、pykA、pykF、dhaKLM、sdhAB)与野生型相比，相对于生长速率边界的琥珀酸盐产量。假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gDW-hr)。对应于从左侧开始线条的株系如下：ackA-pta，atpFH，pykA，pykF，dhaKLM，sdhAB(厌氧、第一条、绿色)；ackA-pta，atpFH，pykA，pykF，dhaKLM，sdhAB(有氧、第二条、红色)；野生型(厌氧、第三条、蓝色)和野生型(有氧、第四条、黑色)

图5显示了OptKnock程序获得的变异株系(ackA-pta、pykA、pykF、ptsG、dhaKLM)与各种非生长相关ATP维持要求的野生型相比，相对于生长速率边界的琥珀酸盐产量。假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gDW-hr)。对应于从左侧开始线条的株系如下：ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(ATPM＝6)(外边界交叉点在y-轴，绿色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(ATPM＝3)(第二条，红色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(ATPM＝0)(第三条，蓝色)和野生型(外边界，黑色)。

图6显示了OptKnock程序获得的变异株系(ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM)在各种加氧速率下相对于生长速率边界的琥珀酸盐产量。强制施加7.6mmol/(gDW-hr)的典型保持能量要求。假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gDW-hr)。对应于从左侧开始线条的株系如下：ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(O2＜2)(第一条、绿色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(O2＜5)(第二条，红色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM(O2＜10)(第三条，蓝色)和pta，ptsG，f6pa，pyk(O2无限制)(外边界，黑色)。

图7显示了OptKnock程序获得的变异株系(ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM，ldh，adhE)在各种加氧速率下相对于生长速率边界的琥珀酸盐产量。强制施加7.6mmol/(gDW-hr)的典型保持能量要求。假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gDW-hr)。对应于从左侧开始线条的株系如下：ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM，adhE，ldh(O2＜2)(第一条、绿色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM adhE，ldh(O2＜5)(第二条，红色)；ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM，adhE，ldh(O2＜10)(第三条，蓝色)和ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM，adhE，ldh(O2无限制)(外边界，黑色)。

图8显示了OptKnock设计琥珀酸盐株系在演化前的表现。(a)株系构建策略。AB1和AB2是中间株系，其特征也可用于评价各株系线路中最终基因敲除的效果。(b)整个试验中各株系的琥珀酸盐质量产量在三个独立培养系中的平均值。

图9显示了株系MG1655和AB3的大约加倍时间，由稀释频率决定，并在整个演化过程中绘制。

图10显示了株系AB3演化中来自Evolugator(设计控制因子)样本的产品概况。菱形(蓝色)指琥珀酸盐；三角(红色)指甲酸盐；圆圈(绿色)指醋酸盐。

图11显示了E.coli株系在微氧培养后相对于总代谢葡萄糖的琥珀酸盐及其他发酵产物的质量(a)和摩尔(b)产量。左柱：野生型MG1655；中柱：未演化的AB3；右柱：演化后的AB3。

图12显示了在演化前(左柱)和演化后(右柱)AB3株系的微氧培养后发酵产品的质量比。

发明的详细说明

本发明旨在设计和制备能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的细胞和生物。本发明的一个具体方面是利用基于大肠杆菌(E.coli)代谢电脑模拟定比模型的优化方法，以找出优化琥珀酸盐生产的代谢设计。使用叠代算法的两级编程框架OptKnock来预测共同导致琥珀酸盐之生长关联性生产的多组基因中断。这里描述的结果表明策略性设置的基因缺失组合或基因的功能性中断可显著提高E.coli及其他细胞或生物的琥珀酸盐生产能力。用于电脑模拟设计的琥珀酸盐之生长关联性生产可通过构建具有设计代谢路径基因型的株系而进行确认。这些经代谢设计的细胞或生物也可通过适应性演化而进一步增大琥珀酸盐之生长关联性生产的产量。

具体来说，该发明是一个综合的计算和设计平台，用于开发经代谢路径改造后拥有增强的琥珀酸盐生产特性的微生物株系。由该平台计算部分识别的株系将通过以遗传方法设计预测的代谢路径改造而投入实际生产，这种改造可提高琥珀酸盐的产量。琥珀酸盐的生产与微生物的优化生长相伴，从而在发酵过程中优化了此产物的产量。进一步具体来说，表现出琥珀酸盐之生长关联性生产的株系进一步通过适应性演化而继续增加该产物的生物合成。适应性演化后的琥珀酸盐之生长关联性生产水平也可通过该体系的计算部分进行预测，即在此具体方面，琥珀酸盐生产水平的提高只能在演化后实现。

在这里，“非天然发生”一词在用于指本发明的微生物时，旨在表明该微生物至少有一个在参考物种的野生型株系中一般找不到的基因改变。基因改变可以是基因的缺失或遗传材料的其他功能性中断。

在这里，“微生物”一词旨在描述显微大小的原核或真核细胞或生物。该术语可包括所有种类的细菌和真核生物，例如酵母和真菌。该术语也包含可培养用于生物化学生产的任何物种的细胞培养。

在这里，“生长关联性”一词在用于指生化产物的生产时，旨在表明此生化产物的生物合成是在一种微生物的生长过程中产生的专向产物。

在这里，“代谢路径改造”一词指其天然发生状态被改变的生化反应。代谢路径改造可包括，例如，通过一个或多个基因(此基因会对参与生化反应的酶进行编码)的功能性中断而停止一个生化反应。代谢路径改造的示例组见表1。E.coli中通过这些代谢路径改造及其相应基因改变而导致的具体反应见表2。这些反应中的反应物和产物的示例见表3。

在这里，“琥珀酸盐”一词指在三羧酸循环和各种发酵过程中形成的二羧酸HOOCCH₂CH₂COOH。这里使用的术语“琥珀酸盐”与“琥珀酸”同义。在化学上，“琥珀酸盐”是指琥珀酸的盐或酯。因此，“琥珀酸盐”与“琥珀酸”均指同一化合物，这两种存在形式取决于溶液的pH值。

在这里，“基因中断”一词或其语法上的等效表达是指让编码的基因产物失活的基因改变。此基因改变可以是，例如，整个基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失、导致剪切基因产物的部分基因缺失或者使编码的基因产物失活的各种突变策略。产生基因中断的一种特别有用的方法是完全的基因敲除，因为其可降低或消除本发明非天然微生物中基因逆转的发生。

在这里，“稳定”一词在用于指一种生化产物生长关联性生产时，旨在表明微生物可连续培养五代以上而不丧失生长和生化产物合成之间的关联性。一般来说，稳定的生长关联性生化产物生产将大于10代，特别稳定的生长关联性生化产物生产将大于25代，而更加稳定的生长关联性生化产物生产将大于50代，包括无限。稳定的生长关联性生化产物生产可通过，例如，在一组代谢路径改造中敲除对各反应的催化酶进行编码的基因而实现。生长关联性生化产物生产的稳定性可通过多个缺失而增强，从而显著降低发生各中断反应多次补偿性逆转的可能性。

熟悉行业技术的人应理解这里的代谢路径改造示例是指E.coli基因及其相应的代谢反应。但因大量的生物已经完成基因组排序以及基因组技术的高度发展，熟悉行业技术的人可方便地将这里的教学和指导用于几乎所有其他生物。例如，这里举例的E.coli代谢路径改造可通过在其他物种中进行相同或类似的基因中断而方便地应用到其他物种。这些中断一般可包括物种同源染色体的基因改变，具体来说，可包括直系同源、旁系同源或非直系同源基因的取代。

直系同源基因是通过垂直遗传传递而相关的一个或一组基因，并在不同的生物中基本上负责相同或等同的功能。例如，小鼠和人的环氧化物水解酶可根据水解环氧化物的生物功能而被视为直系同源。基因通过垂直遗传传递而相关(例如，当它们共享的序列相似性足以表明它们同源)，或者通过共同祖先的进化而相关。如果基因三维结构的相似程度(但序列不一定相似)足以在主要序列相似性不可识别的范围内表明他们来自同一个祖先，则也可被认为是直系同源。直系同源的基因可对氨基酸序列相似性在25％到100％之间的蛋白进行编码。编码氨基酸序列相似性低于25％的蛋白的基因，如果其三维结构也显示出相似性，则也可被视为来自垂直遗传传递。丝氨酸蛋白酶家族的成员，包括组织血纤维蛋白溶酶原激酶和弹性蛋白酶，均被视为通过垂直遗传传递来自同一个祖先。

直系同源包括在结构或整体活性上趋异(比如，通过进化)的基因或其编码的基因产物。例如，一个物种所编码的一个基因产物具有两种功能，而在第二个物种中这两个功能由不同的基因编码，这三个基因及其相应的产物即被视为直系同源。对于一种生化产物的生长关联性生产来说，熟悉行业技术的人应理解为了构建非天然微生物，可选择需要中断的具有代谢路径活性的直系同源基因。表现出不同活性的直系同源基因的示例有：不同的活性被分离到两个或多个物种间或单个物种内的不同基因产物上。其具体示例有两种丝氨酸蛋白酶的活性(即弹性蛋白酶蛋白质水解和血纤维蛋白溶酶原蛋白质水解)被分离到不同的大分子上，即血纤维蛋白溶酶原激酶和弹性蛋白酶。第二个示例为支原体5’-3’核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一个物种的DNA聚合酶可被视为来自第二个物种的核酸外切酶或聚合酶或两者的直系同源，反之亦然。

相比之下，旁系同源是通过复制后进化趋异而相关的同源基因，并拥有相似或共同但不等同的功能。旁系同源可来源于或来自同一物种或不同物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶的环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可被视为旁系同源，因为其代表着两个不同的酶，但均起源于一个共同祖先，同时在同一物种内催化不同的反应和具有不同的功能。旁系同源是同一物种内序列明显相似的蛋白质，表明其是同源的，或者均起源于一个共同祖先。旁系同源蛋白质家族包括HipA同源蛋白、荧光素酶基因、多肽酶及其他。

非直系同源基因取代是指来自一个物种的非直系同源基因可取代其他其他物种中相应的基因功能。取代包括(与其他物种中的相关功能相比)能够在原始物种中基本上执行相同或类似的功能。虽然一般来说，非直系同源基因取代被认为是在结构上与编码相应功能的已知基因相关，但结构不太相关却在功能上相似的基因及其相应产物也包含在这里使用的术语含义之中。功能上的相似性要求至少在非直系同源基因的活性位置或绑定区域有一些结构上的相似性(与编码被取代功能的基因相比)。因此，非直系同源基因包括旁系同源或不相关基因。

因此，在能够进行生化产物的生长关联性生产的发明中，在识别和构建非天然微生物时，熟悉行业技术的人应理解将此处提供的教学和指导应用到一个具体物种后，代谢路径改造的识别应包括直系同源基因的识别和中断。在相应微生物中存在编码一个催化相似或基本相似代谢反应酶的旁系同源和/或非直系同源取代基因的范围内，熟悉行业技术的人也可去掉这些在演化上相关的基因以确保酶活性中的任何功能冗余不会绕过设计的代谢路径改造。

直系同源、旁系同源或非直系同源基因取代可通过熟悉行业技术的人所熟知的方法加以确定。检查两种多肽酶的核酸或氨基酸序列就会发现所比较序列之间的同一性和相似性。根据这些相似性，熟悉行业技术的人可确定该相似性是否足以表明这些蛋白是通过共同祖先的演化而相关的。熟悉行业技术的人所熟知的算法，例如Align、BLAST、Clustal W和其他，比较和确定了原始的序列相似性或同一性，也可确定序列中是否存在可以加权或评分的缺口，以及其重要性如何。这些算法也非常普遍，并可类似地用于确定核苷酸序列的相似性或同一性。用于充分确定相关性的参数是根据用于计算统计相似性的已知方法或者在随机多肽中找到相似匹配的几率及该匹配的显著性而计算得到的。两个或多个序列的计算机比较也可在需要时由熟悉行业技术的人进行优化。相关基因产物或蛋白的预期相似程度较高，例如25％到100％的序列同一性。如果扫描大小足够的数据库，无关的蛋白可能拥有与预期概率基本相同的序列同一性(约5％)。相似程度在5％和24％之间的序列并不一定能代表足够的同源性，说明所比较序列相关。在如此大小的数据库下，需要进行额外的统计分析以确定这些匹配的显著性，进而才能确定这些序列的相关性。

使用BLAST算法确定两个或多个序列相关性的示例参数如下。简单来说，氨基酸序列的比较可使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)和以下参数进行：Matrix：0BLOSUM62；gap open：11；gapextension：1；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：3；filter：on。核酸序列的比较可使用BLASTN 2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行：Match：1；mismatch：-2；gap open：5；gap extension：2；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：11；filter：off。熟悉行业技术的人可了解对上述参数进行哪些修改以提高或降低比较的模糊程度，并确定两个或多个序列的相关性。

本发明提供了一种能够进行稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物的方法。该方法包括：(a)利用电脑模拟识别在细胞增长阶段要求琥珀酸盐生产的一组代谢路径改造；以及(b)在遗传上改变一种微生物以便让其包含一组要求琥珀酸盐生产的代谢路径改造。

生物工艺的一个重要考虑因素是使用批次还是连续发酵方法。这两种方法之间有一个区别会影响产物产量，这个区别就是批次方法中除指数增长阶段外还有准备、滞后和平稳阶段。相比之下，连续工艺一直保持在稳定的指数增长状态下，而且如果操作正确，一次可连续运行多月。对于与生长和混合生长相关的产物形成来说，连续工艺的生产能力较高(即稀释率乘以细胞质量)，因为其没有准备、滞后和平稳阶段。例如在以下合理假设下：

Monod动力学(即μ＝μ_m·S/(K_s+S))

μ_m＝1.0hr^-1

最终细胞浓度/初始细胞浓度＝20

t_prep+t_lag+t_stal＝5hr

限制营养的给料浓度＞＞K_S

连续工艺的生产力的提高估计为8倍，Shuler et al，PrenticeHall，Inc.：Upper Saddle River，NJ.，245-247。

尽管在生产力方面连续工艺具有压倒性的优势，在实际生长中因多种原因批次工艺的应用比连续工艺更广。首先，对于非生长相关的产物形成来说(例如青霉素)，批次系统的生产力可显著高于连续工艺，因为后者在非常低的稀释率下运行。其次，生产株系一般进行了基因改变以提高其生化或蛋白产物的生产能力。这些专门化株系的生长速度一般没有其父本快，而使用化学稳定器(处于连续生产模式下的发酵罐)的连续工艺倾向于选择生长速度最快的细胞。含重组DNA或携带点突变(可产生所需超量表型)的细胞容易突变回原始的低产父本。含单个基因缺失的株系也有可能发生补偿性突变而易于恢复成野生型表型。生长较快的细胞一般会在竞争限制性营养时优于高产细胞，从而导致产量明显降低。另一方面，批次工艺由于在每次循环结束时不重新使用细胞，限制了细胞的世代数，从而降低了高产株系逆转回野生型表型的可能性。最后，连续工艺因潜在的工程障碍(比如设备故障和外来生物污染等)而更难长期运行。连续工艺中这些问题的后果也比批次培养中严重得多。

对于专用化学品和/或蛋白的少量生产来说，连续工艺生产力的提高很少能够超过株系稳定性和可靠性相关的风险。但对于生产琥珀酸盐这样大批量且与细胞生长相关的产物来说，连续工艺生产力的提高与批次工艺相比可获得显著的经济效益。虽然与连续生物工艺相关的工程障碍总会存在，但株系稳定性问题可通过在指数增长阶段运用代谢工程策略而克服，该策略可改变代谢路径以降低或避免负面选择压力以及利于目标产物生产。

有一种计算方法可识别和设计有利于某种产物的生长关联性生产的代谢路径改造，这种方法就是OptKnock计算框架，Burgard et al.，Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)。OptKnock是一个代谢建模和模拟程序，可提供基因敲除策略以产生可超量生产目标产物、并在遗传上稳定的微生物。具体来说，该框架检查一种微生物的完整代谢和/或生化网络以提出强制所需生化产物成为细胞生长专向副产品的基因操控步骤。通过以策略性设置的基因缺失或其他功能性基因中断的方式，将生化生产与细胞生长关联起来，生物反应器中设计株系上的长期生长选择压力会因强制的生长关联性生化生产而导致产量提高。最后当构建基因缺失时，设计株系恢复到其野生型状态的可能性几乎可以忽略，因为OptKnock选择的基因将从细胞的基因组中完全敲除。

简而言之，OptKnock在这里指一种用于为细胞代谢机制建模的计算方法和系统。OptKnock程序与综合特定限制因素到通量平衡分析(FBA)模型中的模型和方法框架相关。这些限制因素可包括定性的动力学信息、定性的调控信息和/或DNA的微阵列试验数据。OptKnock也计算各种代谢问题的解决方案，例如缩小通量平衡模型得出的通量上下限，以及随后检验在添加或敲除基因后代谢网络的产量上限。OptKnock计算框架允许构建模型公式，从而有效查询代谢网络的产量上限，并提供了关于所产生的混合整数线性编程问题的解决方法。此处称为OptKnock的代谢建模和模拟方法见美国专利申请10/043,440(2002年1月10日申请)和国际专利PCT/US02/00660(2002年1月10日申请)。

识别和设计有利于某种产物生长关联性生产的代谢路径改造还有一种计算方法，叫做

代谢建模和模型系统。此计算方法和系统见美国专利申请No.10/173,547(2002年6月14日申请)和国际专利PCT/US03/18838(2002年6月13日申请)。

是一个计算系统，该系统利用电脑模拟产生网络模型，并模拟通过生物系统化学反应的物质、能量或电荷通量以定义一个解决方案空间，其中含该系统中化学反应所有可能的功能，从而确定该生物系统允许活动的范围。此方法被称为基于限制因素建模，因为解决方案空间由限制因素定义，例如所含反应的已知化学计量以及与通过反应的最大通量相关的反应热动力和产能限制因素。这些限制因素定义的空间可在查询后确定该生物系统或其生化功能部分的表型产能和行为。例如凸分析、线性编程和极端路径的计算等分析方法(见Schilling et al.，J.Theor.Biol.203：229-248(2000)；Schillinget al.，Biotech.Bioeng.71：286-306(2000)和Schilling et al.，Biotech.Prog.15：288-295(1999))可用于确定此表型产能。

如上所述，适于本发明的计算程序中使用的一种基于限制因素的方法是通量平衡分析。通量平衡分析是基于稳定状态下的通量平衡，并可按照Varma and Palsson，Biotech.Bioeng.12：994-998(1994)所述进行。通量平衡方法已经应用到反应网络以模拟或预测脂肪细胞代谢(Fell and Small，J.Biochem.138：781-786(1986))、E.coli在ATP最大供应状态下乙酸盐分泌(Majewski and Domach，Biotech.Bioeng.35：732-738(1990))或者酵母乙醇分泌(Vanrolleghem et al.，Biotech.Prog.12：434-448(1996))的系统属性。另外，此方法也可用于模拟或预测E.coli在多种单碳源上的生长以及H.influenzae的代谢(Edwards and Palsson，Proc.Natl.Acad.Sci.97：5528-5533(2000)、Edwards and Palsson，J.Bio.Chem.274：17410-17416(1999)以及Edwards et al.，Nature Biotech.19：125-130(2001))。

一旦定义了解决空间，即可进行分析以确定各种条件下可能的解决方案。此计算方法与生物现实一致，因为生物系统是灵活的，并可以多种方式达到相同的结果。生物系统是通过进化机制而设计的，而进化机制受到所有生物必须面对的基本限制因素的限制。因此，基于限制因素的建模策略蕴含了这些一般现实。另外，由于能够通过紧缩限制因素而对网络模型连续施加进一步限制，导致解决方案空间大小下降，从而提高了可预测的生理性能或表型的精度。

根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人能够应用多种计算框架到代谢建模和模拟中，从而设计和实施生化产物的生长关联性生产。此类代谢建模和模拟方法包括前面列举的计算系统

和OptKnock。为了简要描述此发明，此处描述的方法和株系在建模和模拟方面均参照OptKnock计算框架。熟悉行业技术的人会了解如何将OptKnock中代谢路径改造的识别、设计和实施技术应用到任何业内常用的其他已知代谢建模和模拟计算框架和方法中。

细胞或生物将生化产物的生长与生产专向关联起来的能力，可在用电脑模拟模型计算的典型代谢网络的生化生产限制范围内描述。这些限制可通过将限制基质的摄取率固定到其试验测量值，并且在每个可达到的生长水平计算生化产物的最大和最小生产速率而获得。如图1所示，所需生化产物的生产一般与用于胞内资源的生物量形成有直接竞争关系。在这些情况下，生化产物的生产速率提高必然导致低于最大值的生长速率。设计OptKnock等上述建模和模拟程序建议的敲除，会限制容许的解决方案边界，强制野生型株系代谢行为发生改变，如图1所示。虽然给定株系的实际解决方案边界可能随基质摄取率的增减而扩大或缩小，但每个试验点均在其计算的解决方案边界内。这样的图能够准确预测设计株系与其产量上限的接近程度，同时表明还有多少提高的空间。

OptKnock数学计算框架在这里用于精确定位导致如图1所示的生长关联性生化产物生产的基因敲除。此程序构建在基于限制因素的代谢模型上，而其缩小了细胞系统可在连续施加物理生化限制因素时表现出的可能表型的范围，Price et al.，Nat Rev Microbiol，2：886-97(2004)。如上所述，基于限制因素的模型和模拟已经在业内普遍使用，而且一般会根据网络化学计量激发特定细胞目标的优化以给出可能的通量分布。

简而言之，由N＝{1，...，N}个代谢物集合和M＝{1，...，M}个代谢反应集合组成的、定量为稳定状态代谢网络累计反应通量的最大化细胞目标，可用数学方式表达如下：

最大化v_{cellular objective}

条件为

$\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{S}_{\mathrm{ij}}{v}_j=0,$ $\∀i\∈N$

v_substrate＝v_{substrale_uptake}mmol/gDW-hr

$\∀i\∈\left\{\mathrm{limitingsubstrate}\left(s\right)\right\}$

v_atp≥v_{atp_main}mmol/gDW·hr

v_j≥0，

$\∀j\∈\{\mathrm{irrev}.\mathrm{reactions}\}$

其中Sij是反应j中代谢物i的化学计量系数；v_j是反应j的通量；v_{substrate_uptake}代表限制性基质的假设或测量摄取率；而v_{atp_main}是非生长相关的ATP维持要求。矢量v包括内外通量。在此研究中，细胞目标常被假设为按照生物量形成所要求的比例消耗生物合成前体，Neldhardt，F.C.et al.，2nd ed.1996，Washington，D.C.：ASMPress.2v.(xx，2822，lxxvi)。这些通量的单位一般为1gDW·hr(克干重乘以小时)，而生物量形成一般表达为克产生生物量/gDW·hr或1/hr。

基因敲除以及消除反应的建模首先将二进制变量综合到基于限制因素的框架中，Burgard et al.，Biotechnol Bioeng，74：364-375(2001)、Burgard et al.，Biotechnol Prog，17：791-797(2001)。这些二进制变量

假设反应j活动时值为1，而不活动时值为0。以下限制因素，

$v_{\text{j}}^{\min }\·y_j\≤v_j\≤v_j^{\max }\·y_j,$ $\∀j\∈M$

保证了反应通量v_j仅在变量y_j等于零时被设置为零。另外，当y_j等于1时，v_j可被假设为v_j ^min下限和v_j ^max上限之间的任何值。这里v_j ^min和v_j ^max由根据上述网络限制因素而相应最小化和最大化各反应通量而确定，Mahadevan et al.，Metab Eng，5：264-76(2003)。

优化的基因/反应敲除可通过对一个两级优化问题求解而确定，其中应选择活动反应组(y_j＝1)，所产生网络的优化生长方案将会超量生产感兴趣的化学品。图2以图表方式描绘了此两级优化问题。而在数学上，此两级优化问题可用以下两级混合整数优化问题表达：

最大化v_chemical    (OptKnock)

y_J

v_substrate＝v_{substrate_uptake}

$\∀i\∈\left\{\mathrm{limitingsubstrate}\left(s\right)\right\}$

v_atp≥v_{atp_main}

$v_{\mathrm{biomass}}\≥v_{\mathrm{biomass}}^{t\arg \mathrm{el}}$

$v_j^{\min }\·y_j\≤v_j\≤v_j^{\max }\·y_j,$ $\∀j\∈M$

$\underset{j\∈M^{\mathrm{forward}}}{\mathrm{\Σ}}(1-y_j)=K$

y_j∈{0，1}， $\∀j\∈M$

其中v_chemical代表所需目标产物的生产，例如琥珀酸盐或其他生化产物，而K是允许敲除的数目。请注意，设置K等于0将得到整个网络的最大生物量生产方案，而设置K等于1表明单一基因/反应敲除(y_j＝0)，这样所产生的网络在其最大生物量产量下会采用最大超量生产。最后的限制因素保证了产生的网络达到最低生物量产量。Burgard et al..Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)提供了模型公式和解答步骤的详细说明。含上百个二进制变量的问题可通过CPLEX 8.0，GAMS：The Solver Manuals.2003：GAMS DevelopmentCorporation，通过GAMS，Brooke et al.，GAMS DevelopmentCorporation(1998)，在IBM RS6000-270工作站的建模环境中在几分钟到几小时的时间内解出。OptKnock框架也能够为生化产物的超量生产找出有希望的基因敲除策略，Burgard et al.，Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)、Pharkya et al.，Biotechnol Bioeng，84：887-899(2003)，并建立一个系统框架，以自然融合代谢和专向建模框架内的未来改进。

上述两级OptKnock问题的任何解答都将提供一组需要中断的代谢反应。消除此组内的各反应或代谢路径改造会让琥珀酸盐成为生物生长阶段中的专向产物。因为反应是已知的，所以两级OptKnock问题的解答将提供相关的一个或多个基因，以编码催化反应组内各个反应的一个或多个酶。反应组及其编码各反应酶的相应基因的识别一般来说是一个自动化程序，可通过各反应与反应数据库的关系来完成，反应数据库中包含酶和编码基因的关系。

一旦识别后，为了进行琥珀酸盐的生长关联性生产而需要中断的反应组，将在目标细胞或生物中通过对至少一个编码该组内各代谢反应的基因进行功能性中断而得到实施。如上所述，对反应组进行功能性中断的一个非常有用的方法是敲除各编码基因。但在某些情况下，通过其他基因畸变中断反应也是有利的，例如对专向因子的专向区域(如启动子或顺式绑定区域)的突变、敲除，或者在多个位置中的任意位置切断编码序列。后面列出的畸变会导致基因组部分敲除，有时可能很有用，例如在要求快速评估琥珀酸盐是否按预期关联时或遗传逆转不太可能发生时。

为了找出上述两级OptKnock问题的其他高产方案，以进一步中断更多的反应组或进行代谢路径改造，从而实现琥珀酸盐或其他生化产物的生长关联性生产，可实施一个叫做整数切割的优化方法。此方法通过在每次重复时添加一个叫做整数切割的额外限制因素而迭代解答上述OptKnock问题。整数切割限制因素可有效地防止解答步骤选择以前迭代中发现的将产物的生物合成和生长专向关联起来的反应组。例如，如果一个以前发现的生长关联性代谢路径改造指定对反应1、2和3进行中断，那么以下限制因素可防止在随后的解答中同时考虑相同的反应：y₁+y₂+y₃＞＝1。整数切割方法已在业内普遍使用，参考文献见Burgard et al.，Biotechnol Prog，17：791-797(2001)。虽然这里介绍的所有方法都是关于与OptKnock计算框架联合(用于代谢建模和模拟)的结合使用，但在迭代计算分析中降低冗余的整数切割方法也可与业内普遍使用的其他计算框架结合使用，例如SimPheny。

上述形式的限制因素排除了对较大反应组的识别(包括以前识别的反应组)。例如，在进一步迭代中使用上述整数切割方法将排除对指定反应1、2和3进行中断的四重反应组的识别，因为这些反应先前已经被识别。为了保证识别可能导致某产物进行生长关联性生产的所有反应组，对此整数切割方法做了修改。

简而言之，修改后的整数切割方法从“零”迭代开始，其计算了所需生化产物在野生型网络的优化生长条件下的最大产量。此计算与K等于0的OptKnock解答相对应。接下来，考虑单个敲除并引进两个参数集objstore_iter和ystore_{iter_j}以在每次迭代计算iter中分别储存目标函数(v_Chemical)和反应开关信息(y_j)。随后在每次叠代中为OptKnock公式添加以下限制因素。

$v_{\mathrm{chemical}}\≥{\mathrm{objstore}}_{\mathrm{iter}}+\mathrm{\ϵ}-M\·{\mathrm{\Σ}}_{\mathrm{jeystor}{e}_{\mathrm{iter},j}=0}{y}_j$

在上述公式中，ε和M分别是一个较小和较大的数。一般来说，ε可设置为0.01左右，而M可设置为1000左右，但也可使用小于和/或大于这两个数值的数。M保证了限制因素可以只绑定以前识别的敲除策略，而ε保证了向以前识别的策略中增加敲除必须能在优化生长条件下的生化产物生产中提高至少一个ε。此方法在单个敲除策略不能基于野生型株系提高产量时变为双敲除。然后当双敲除策略不能基于野生型株系提高产量时考虑三敲除，以此类推。最终的结果是一个排序列表，代表优化生长下所需的生化生产，其敲除策略有所不同，相互间至少相差一个缺失。在被中断时，此优化程序以及各种反应组的识别可导致生化产物的生长关联性生产，下面的示例中将会进行详细介绍。以下示例进一步解释了琥珀酸盐的生长关联性生产。但根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人应理解此处列举的方法和代谢工程设计同样可适用于细胞或微生物生长与任何生化产物的专向关联。

在使用上面介绍(并将在下面进一步举例说明)的方法后，即可利用本发明的方法构建细胞和生物，将目标生化产物的生产与经设计具有已识别基因改变的细胞或生物的生长专向关联起来。在这方面，已识别代谢路径改造可将琥珀酸盐的生产与微生物生长专向关联。使用已识别代谢路径改造构建的微生物株系可在指数增长阶段产生较高水平的琥珀酸盐。这些株系有利于连续发酵工艺中琥珀酸盐的商业生产，同时不受上述负面选择压力的影响。

因此，本发明的方法提供了一组通过从OptKnock或SimPheny选择的电脑模拟方法识别的代谢路径改造。这组代谢路径改造可包括一个或多个代谢反应的功能性中断，例如由基因缺失导致的中断。代谢路径改造可从表1中进行选择。

另外提供了一种能够进行稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物的方法。该方法包括：(a)利用电脑模拟识别在指数增长阶段要求琥珀酸盐生产的一组代谢路径改造；以及(b)在遗传上改变一种微生物以便让其包含一组要求琥珀酸盐生产的代谢路径改造，以及培养经基因改造的微生物。培养可包括在要求琥珀酸盐生产的条件下适应性地演化经基因改造的微生物。本发明的方法适用于细菌、酵母和真菌，以及多种其他细胞和微生物。细菌可包括E.coli、A.succiniciproducens、A.succinogenes、M.succiniciproducens和R.etli。

另提供了使用本发明的方法制备的一种微生物。另外，本发明提供了一种非天然微生物，它由一个或多个基因中断组成(此基因中断可对与琥珀酸盐之生长关联性生产相关的酶进行编码)，并表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。本发明中的非天然微生物在其基因中包含可编码一种酶的一个或多个基因中断(这种酶在其活性降低时将琥珀酸盐的生产与微生物生长专向关联起来)，因而此一个或多个基因中断将稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产传递到此非天然微生物中。

非天然微生物具有表1中列出的代谢路径改造中包含的一个或多个基因中断。而一个或多个基因中断可为基因缺失。本发明的非天然微生物可从具有表1中所列之有代谢路径改造的多个微生物中选择。本发明的非天然微生物包括细菌、酵母、真菌或多种适于发酵工艺的其他微生物。适用的细菌包括E.coli、A.succiniciproducens、A.succinogenes、M.succiniciproducens、R.etli、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Gluconobacter oxydans、Zymomonasmobilis、Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Streptomyces coelicolor、Clostridium acetobutylicum、Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida。适用的真菌包括Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Aspergillusterreus、Aspergillus niger和Pichia pastoris。

此处列举的能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的微生物具有E.coli的遗传背景。不过，因为现在有550多个物种(其中一半以上均在NCBI等公共数据库中提供)的完整基因组序列可用，包括395种微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和动物的基因组，所以识别一个或多个基因的替代物种的同源基因，包括直系同源、旁系同源和非直系同源基因取代，以及生物间基因改造的互换等，已经成为常规技术，并广为人知。相应地，对于E.coli等具体生物进行此处说明的支持琥珀酸盐之生长关联性生产的代谢路径改造也可适用于其他微生物，包括原核和真核生物。根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人会了解如何将以一种微生物为例的代谢路径改造同样应用到其他生物。

例如，琥珀酸盐的生产可通过敲除或功能性去除一个或多个对催化ADHEr反应的酶进行编码的基因和一个或多个对催化LDH_D反应的酶进行编码的基因，而与E.coli的指数增长相关联。如表2所示，对催化adhE反应的酶进行编码的E.coli基因是adhE或b1241。另外，表2中给出了对催化LDH_D反应的酶进行编码的两个E.coli基因。这两个LDH_D相关基因是b2133和b1380。b1380的常用名是ldhA。b2133基因是ldhA的直系同源基因。为了制备能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的经代谢设计的E.coli株系，必须功能性中断对催化ADHEr和LDH_D反应的至少一个酶进行编码的基因。这样的中断可通过敲除b1241基因(adhE)和b1380基因(ldhA)中的任何一个、其直系同源b2133或者同时敲除b1241和b2133而完成。对于E.coli以外的细胞或生物中的琥珀酸盐之生长关联性生产，可功能性中断感兴趣物种内对ADHEr和LDH_D相当反应的催化酶进行编码的基因。对于那些具有类似代谢路径的生物，这样的中断可通过敲除b1241和b2133或b1380基因之一的同源基因而完成。如上所述，这些同源基因可包括直系同源和/或非直系同源基因取代。在某些情况下，例如当感兴趣物种中存在替代代谢路径时，可通过敲除一个催化类似但不同的代谢反应(其可取代上述反应)的旁系同源而完成功能性中断。因为不同的生物间的代谢网络存在某些差异，所以熟悉行业技术的人应理解不同生物间需要中断的实际基因可能不同。但在这里的教学和指导下，熟悉行业技术的人也应理解本发明的方法可用于所有微生物，以识别生物间的同源代谢路径改造，并构建一个能够增强琥珀酸盐的生物合成与生长关联性的感兴趣生物。

此处将通过代谢反应、反应物或其产物的一般描述，或与所述代谢反应、反应物或产物相关的一个或多个基因的特定描述，来介绍此发明。除非另外明确说明，否则熟悉行业技术的人应理解对反应的描述也构成了对该反应物和产物的描述。同样，除非在此另外明确说明，否则对反应物或产物的描述也构成对该反应的描述，而且对任何代谢成分的描述也构成对催化所描述反应、反应物或产物的酶进行编码的一个或多个基因的描述。同样，在代谢生物化学、酶学和基因组的已知领域内，此处对基因的描述也构成对相应编码的酶和其催化的反应以及该反应的反应物和产物的描述。如前文及下文的详细描述，表1、2和3中给出了示例反应、反应命名法、反应物、产物、辅酶以及对琥珀酸盐之生长关联性生产中催化相关反应的酶进行编码的基因。

本发明提供了能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的微生物。琥珀酸盐的生产通过以遗传方式改变细胞的代谢路径而与微生物的指数增长阶段专向关联。该基因改变使得琥珀酸盐成为生长阶段的一种专向产物。表1中给出了在指数增长中提高琥珀酸盐生物合成水平的多组代谢路径改造或转变。一组内的各个改造与应当被功能性中断的代谢反应相对应。各组内所有反应的功能性中断可导致琥珀酸盐在生长阶段中通过设计株系进行专向生产。表1中给出了上述改造的相应反应，而表2中给出了E.coli中可能对这些改造进行编码的一个或多个基因。表3给出了表2的反应中描述的反应物、辅酶和产物的完整生化名称。

例如，对于表1中给出的各个株系，每行中均显示了可为琥珀酸盐之生长关联性生产而进行的代谢路径改造。这些改造包括对一到六个或更多反应的功能性中断。具体来说，表1中给出了187个具有非天然代谢基因型的株系。与野生型株系相比，这些非天然改造均可在适当培养条件下在微生物的指数增长中导致琥珀酸盐产量的提高。适当的条件包括下面示例中进一步详细说明的条件，例如特定的碳源或反应物可用性和/或适应性演化。

根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人应理解若要中断一个酶催化反应，必须中断反应涉及的一个或多个酶的催化活性。中断可通过多种方式进行，例如敲除一个编码基因或在一个或多个编码基因序列中进行基因改造。以中断为目标的编码基因可以是一个、一些或所有对催化反应中的酶进行编码的基因。例如，对于目标催化中涉及的一个酶，可通过降低或毁坏编码基因产物催化活性的基因改造而完成中断。同样，当一个酶是多聚(杂聚)时，可通过降低或毁坏编码基因产物的一个或所有亚基的功能而完成中断。活性的破坏可通过丧失一个或多个亚基的绑定活性(用于形成有活性肽)、或通过毁坏多聚肽的催化亚基，或者通过这两种方式而完成。多聚蛋白关联和活性的其他功能也可作为中断本发明中一个代谢反应的目标。这些功能已被熟悉行业技术的人了解。另外，可以按照本发明中断一条多肽或多聚肽的部分或全部功能，以降低或破坏本发明中的反应或代谢路径改造涉及的一个或多个酶的催化活性。同样，也可中断本发明中的反应或代谢路径改造涉及的部分或所有酶，只要目标反应被毁坏。

根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人也应理解一个酶催化反应可通过去掉或消除由一个共同基因和/或该基因的一个或多个直系同源基因(表现出相似或基本相同的活性)进行编码的反应而予以中断。去掉共同基因及所有直系同源基因可导致目标反应所有催化活性的完全破坏。但是，中断共同基因或一个或多个直系同源基因可导致目标反应的催化活性的下降，已经足以促进生长与琥珀酸盐生物合成的关联。这里的示例是为多个代谢路径改造进行催化活性编码的共同基因及其直系同源基因。熟悉行业技术的人应理解中断编码目标代谢反应催化酶的部分或全部基因可使用本发明的方法进行，并可综合到本发明的非天然微生物中以实现琥珀酸盐的生长关联性生产。

因此，本发明进一步提供了一种非天然微生物，它具有一组将琥珀酸盐生产与所述微生物的生长专向关联的代谢路径改造。这组代谢路径改造包括中断对催化一组反应中各反应的酶进行编码的一个或多个基因，而这些反应组包括：

(a)ADHEr(adhE)，LDH_D(ldhA)

(b)ADHEr(adhE)，LDH_D(ldhA)，PTAr(ackA-pta)

(c)PFL(pfl)，LDH_D(ldhA)

(d)PFL(pfl)，LDH_D(ldhA)，ADHEr(adhE)

(e)PTAr(ackA-pta)，PYK(pykA，pykF)，ATPS4r(atp)，SUCDli(sdh)

(f)PTAr(ackA-pta)，PYK(pykA，pykF)，GLCpts(ptsG)，或

(g)PTAr(ackA-pta)，PYK(pykA，pykF)，GLCpts(ptsG)，ADHEr(adhE)，LDH_D(ldhA)，

这里介绍的微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。圆括号内是对负责催化指定反应的酶进行编码的基因的常用名称。经代谢路径改造(e)PTAr，PYK，ATPS4r，SUCDli；(f)PTAr，PYK，GLCpts；或(g)PTAr，PYK，GLCpts，ADHEr，LDH_D的非天然微生物可进一步包括中断至少一个对催化反应DHAPT(dha)的酶进行编码的基因。请注意，pykA和pykF是对可能进行PYK反应的不同酶进行编码的基因。因此，必须至少去除pykA和pykF中的一个(也可能同时去掉两个)才能防止PYK解除琥珀酸盐生产和细胞生长的关联。另外，反应PFL、ATPS4r、SUCDli和DHAPT由多个基因编码的蛋白复合体催化。敲除pfl、atp、sdh或dha基因簇中的一个或一组基因，足以中断ATPS4r、SUCDli或DHAPT反应。

简而言之，对于上述举例的基因及其与多聚肽中同源亚基的关系、其直系同源，以及其基因编码产物催化的反应来说，ADHr是由单个基因b1241(adhE)编码的酶催化的。LDH_D是由单个基因b1380(ldhA)的产物所编码，而其直系同源基因是b2133。PFL的活性要求四个基因b0902、0903、b3952和b3951(合称pfl)编码的酶亚基。而b3114是b0903的直系同源基因。PTAr是由单个基因b2297(ackA-pta)的产物所编码，而其直系同源基因是b2458。PYK由两个不同的直系同源基因的产物所编码，即：b1854(pykA)和b1676(pykF)。这两个基因均在E.coli中具有活性。SUCDli的活性要求四个基因b0721、b0722、b0723和b0724(合称sdh)编码的酶亚基。ATPS4r由九个基因b3731-b3739编码的多亚基酶催化，其合称atp。DHAPT的活性要求五个基因b1198、b1199、b1200、b2415和b2416(合称dha)编码的酶亚基。GLCpts的活性要求九个基因编码的酶亚基：b2415、b2416、b2417、b1817、b1818、b1819、b1101、b0679和b1621(合称ptsG)。因为反应ATPS4r、SUCDli、PFL和DHAPT是由多个基因编码的蛋白聚合体催化的，所以相应敲除atp、sdh、pfl或dha基因簇中的一个或一组基因，足以中断这些反应。在其他情况下，将根据文献中的信息选择负责E.coli中主要反应活性的基因。

相应的，本发明也提供了一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联起来的代谢路径改造，而这组代谢路径改造由以下基因组合中选择的一个或多个基因中断组成：(a)adhE，ldhA；(b)adhE，ldhA，ackA-pta；(c)pfl，ldhA；(d)pfl，ldhA，adhE；(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA；(f)ackA-pta，pykF，ptsG；或(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA；或其直系同源基因，其中该微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。本发明还提供了一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA，atpH，sdhB或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA进行编码；或一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(f)ackA-pta，pykF，ptsG进行编码；或另一种非天然微生物，其基因可对进一步包括pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA进行编码。

本发明的非天然微生物可用于琥珀酸盐之生长关联性生产中。基本上任何数量的琥珀酸盐，包括商业产量，均可使用本发明的生长关联性琥珀酸盐生产方法来合成。因为本发明的微生物将琥珀酸盐和生长专向关联起来，所以连续或接近连续的生长工艺对于琥珀酸盐的生物合成非常有用。这些连续和/或接近连续的生长工艺如前所述，并将在下面的示例中举例说明。微生物的连续和/或接近连续生长工艺也已在业内普通使用。简而言之，连续和/或接近连续的生长工艺涉及维持微生物的指数增长或对数增长阶段。其步骤包括使用Evolugator^TM(Evolugate LLC，Gainesville，FL)演化设备等仪器、发酵反应器及类似设备。另外，也可使用摇瓶发酵和在微氧条件下生产等技术。根据这里提供的教学和指导，熟悉行业技术的人应理解可以使用各种不同工艺和/或设备、在各种不同条件下、采用各种不同设置，使用微生物进行琥珀酸盐的生长关联性生产。

一般来说，琥珀酸盐的连续和/或接近连续生产将包括在充足的营养和培养基上培养本发明中用于琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物，以维持和/或接近维持指数生长期的生长。例如：在这些条件下的连续培养可包括1、2、3、4、5、6或7天或更长时间。另外，连续培养还可包括1、2、3、4或5周或更多周，最多可为数月。应当理解，连续和/或接近连续的培养条件也可包括这些示例期间之间的所有时间间隔。

可以在上述连续和/或接近连续培养期间的任何时间点收获或分离琥珀酸盐。如下面的示例中所述，微生物在连续和/或接近连续生长阶段中的时间越长，相应按比例产生的琥珀酸盐的数量就越多。

因此，本发明提供了一种与微生物生长关联的琥珀酸盐生产方法。该方法包括：(a)在数量充足的营养和培养基中，在指数生长期培养一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联的代谢路径改造，而该组代谢路径改造包括从以下基因组合中选择的一个或多个基因中断：

(1)adhE，ldhA

(2)adhE，ldhA，ackA-pta

(3)pfl，ldhA

(4)pfl，ldhA，adhE

(5)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA

(6)ackA-pta，pykF，ptsG，或

(7)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA，

或其直系同源基因，其中该微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产；以及(b)分离此非天然微生物产生的琥珀酸盐。对代谢路径改造(5)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA进行编码的基因可进一步包含从pykA、atpH、sdhB或dhaKLM中选择的至少一个基因的中断。对代谢路径改造(6)ackA-pta、pykF、ptsG进行编码的基因可进一步包含从pykA或dhaKLM中选择的至少一个基因的中断。对代谢路径改造(7)ackA-pta、pykF、ptsG、adhE、ldhA进行编码的基因可进一步包含从pykA或dhaKLM中选择的至少一个基因的中断。

应当理解，这里提供的本发明的定义中也包含没有实质性影响本发明各种具体方法活性的改造。相应地，以下示例旨在描述当前发明，但并不局限于此。

示例I

能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的微生物

此例中描述了前述方法识别的代谢工程策略。总的来说，已经识别了一百多种策略。下面的表1-3(示例后)给出了已识别的可进行琥珀酸盐之生长关联性生产的代谢路径改造详细列表，其中描述了OptKnock识别的反应敲除组合(表1)、对应于表1中给出的各反应的化学计量和基因(表2)，以及对应于表2中缩写的代谢物名称的列表(表3)。对展示此处所描述方法特别有用的设计被分为三个类别：(1)直观设计(低风险)；(2)非直观有氧设计(中风险)；(3)非直观厌氧设计(高风险)。根据不同的策略，在10mmol/gDW/hr的基础葡萄糖摄取率下检验有氧或厌氧条件。每个设计的解答边界可通过在各个可行的生长速率下分别最大化和最小化琥珀酸盐的生产而获得。解答边界的最右端对应于“优化生长”方案，其与最大生物量产量同义。因为系统为线性，如果葡萄糖摄取率与规定的基础值不同，则应按比例缩放结果。下面也进一步描述了被识别为琥珀酸盐之生长关联性生产的株系构建和培养程序。

直观设计

图3中描述了通过OptKnock技术识别的四个直观株系设计的生化生产限制。这些边界假设为存在大量二氧化碳的厌氧条件。与评估这些株系相关的风险被视为是最小的，因为其中三个(即除了pfl、ldh、adhE以外的所有株系)已由其他人构建。但这三个特别构建的株系均未显示出能够进行增长的生长关联性琥珀酸盐生产，也未显示出能够进行稳定的生长关联性琥珀酸盐生产。另外，这三个特别构建的株系均未发生这里描述的适应性演化以进一步增强生长关联性琥珀酸盐生产。因此，本发明的株系adhE，ldh；adhE，ldh，pta和pfl，ldh与以前构建的株系完全不同。

以下简要介绍建议的设计。表4显示了对应于每个建议变异株系的最大生长模拟的交换通量。

adhE，ldhA(蓝色)-此变异株系在Sanchez et al.，Metab Eng，7：229-39(2005)和Sanchez et al.，Biotechnol Prog，21：358-65(2005)中提及，并被称为SBS110MG。最终生产株系中表达了杂合的pyc。这些作者报告含控制质粒(无pyc)的双变异株系的琥珀酸盐产量仅为0.2mol/mol。含pyc质粒后，产量增加到1.3mol/mol。演化后的预期产量为0.9mol/mol。

adhE，ldhA，pta(红色)-这些缺失存在于最好的厌氧生产株系中，见Sanchez et al.，Metab Eng，7：229-39(2005)。实际的生产株系也含有pyc质粒及另一个缺失iclR，即抑制乙醛酸支路的专向基因。模拟结果显示乙醛酸支路的重要性极低。pyc的过表达最有可能是发现1.6mol/mol高产量的原因。根据电脑模拟分析，三缺失变异株系在适应性演化后的产量预期为0.9mol/mol，显著低于以前观察到的1.6mol/mol，Sanchez et al.，Metab Eng，7：229-39(2005)。

pfl，ldhA(灰色)-pfl，ldhA株系曾见于Donnelly et al.，Appl Biochem Biotechnol，70-72：187-98(1998)和原始的OptKnock文献中，Burgard et al.，Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)。此株系叫做NZN111，不能发酵葡萄糖，但在ptsG中的自发突变最终使其能够发酵葡萄糖。Hong和Lee，Hong et al.，Biotechnol Bioeng，74：89-95(2001)，在NZN111中过度表达了苹果酸酶，并获得了30-40％的琥珀酸盐产量。使用NZN111或任何其他pfl、ldh变异株系的演化试验非常有用，因为在终点的琥珀酸盐生产应是很小的。

pfl，ldhA，adhE(绿色)-此变异株系由原始OptKnock文章提出，Burgard et al.，Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)。此株系在演化终点应有~1.2mol/mol的葡萄糖产量，其中琥珀酸盐和乙酸盐是主要产物。此株系也很令人感兴趣，因为它在演化终点的琥珀酸盐产量最高。pfl缺失是不直观的，因为甲酸盐的生产被普遍认为是还原等价物的来源，从而利于琥珀酸盐的形成。而化学计量模型对此给出了不同结果，因为甲酸盐脱氢酶在模拟中不能厌氧工作。从含SBS110MG(ldhA、adhE变异株系)的pyc中敲除fdhF(甲酸盐脱氢酶)可让琥珀酸盐的产量从1.2下降到0.9mol/mol，Sanchez etal.，Biotechnol Prog，21：358-65(2005)。

表4：优化生长模拟的交换通量，假设处于厌氧条件且基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gD·Whr)。正值表示生产，负值表示消耗。所有化学物质的摩尔产量可通过用基础葡萄糖摄取率(即10)去除表内数值而获得。

非直观有氧设计

此株系设计对于有氧条件下琥珀酸盐的生长关联性形成来说需要六个敲除(即ackA-pta，pykA，pykF，atpFH，sdhAB，dhaKLM)。这些敲除禁用的反应包括PTAr、PYK、ATPS4r、SUCDli和DHAPT。株系设计的生化生产限制如图4所示，而优化生长模拟结果见表5。请注意，这些敲除可导致最大理论琥珀酸盐产量的下降。然而，此设计特别有用，因为它允许敲除atpFH以便进一步辨别有氧生化生产。

敲除dhaKLM的理由是当反应F6PA(f6p<->dha+g3p)和DHAPT(dha+pep->dhap+pyr)包含在模拟中时会占用大量的通量。这些反应提供了转换pep到丙酮酸盐的一种方式，而这对琥珀酸盐的形成来说是不利的。这条路径从能量方面看是现实的，因为pep是一个高能化合物。另外，负责催化这两个反应的酶也已识别，Schurmann et al.，JBiol Chem，276：11055-61(2001)；Gutknecht et al.，Embo J，20：2480-6(2001)。虽然这些酶不太可能处理完整的糖酵解通量，最保守的方法是通过敲除dhaKLM而保证这些通量无效应。在实际操作中，此敲除有可能必要，也可能不必要。模拟结果也显示ptsG可作为dhaKLM的替代而被去除，但同时具有ptsG和atpFH缺失的株系可能因其完全依赖于已糖激酶摄取葡萄糖而在生长方面遇到困难。

表5：优化生长模拟的交换通量，假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gD·Whr)。正值表示生产，负值表示消耗。所有化学物质的摩尔产量可通过用基础葡萄糖摄取率(即10)去除表内数值而获得。

非直观厌氧设计

此株系设计对于厌氧条件下琥珀酸盐的生长关联性形成来说需要五个敲除(即ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM)。这些敲除禁用的反应包括PTAr、PYK、GLCpts和DHAPT。同样，DHAPT敲除(即dhaKLM)在实际操作中可选择进行。此敲除组合预期会导致显著的代谢路径改变，例如强制依赖于丙酮酸盐的非典型来源(例如脱氧酮糖酸(ED)途径、丝氨酸脱氨酶、苹果酸酶等)。此设计表现出一些缺点，因为ptsG、pykA、pykF变异株系在生长于葡萄糖基础培养基上时可能无法生存，Ponce et al.，J Bacteriol，177：5719-22(1995)。模拟结果与此发现相反，并表明依赖葡萄糖有氧生长时可能获得高产量。此结果表明如果预期pykA、pykF、ptsG变异株系生长困难，可使用演化策略以增强株系对缺失的调整。

在厌氧条件下，模拟结果发现在假设葡萄糖摄取率为10mmol/gDW/hr时，此株系不能达到标准的7.6mmol/gDW/hr的非生长相关ATP维持要求。图5给出了放松ATP维持要求对计算的解答边界的影响。这里表明如果此五点变异株系能厌氧生长(即通过生长选择压力强制细胞放松对维持能量的要求)，优化生长必然伴随着琥珀酸盐的极高产量。

因此，此设计有着远远大于其风险的巨大高产潜力。另外，可通过引进无效循环而将此株系的表现推进到图5中描绘的解答边界左上部分标明的近理论值琥珀酸盐产量。表6显示了假设无能量维持要求和厌氧条件下的最大生长模拟的交换通量。

表6：优化厌氧生长模拟的交换通量，假设基础葡萄糖摄取率为10mmol/(gD·Whr)且非生长相关维持要求为零。正值表示生产，负值表示消耗。所有化学物质的摩尔产量可通过用基础葡萄糖摄取率(即10)去除表内数值而获得。

在新构建株系能够存活于有氧环境但不能存活于厌氧条件的特定情况下，可使用包括降低通气率在内的演化策略。图6给出了逐渐降低氧摄取率对于琥珀酸盐生产限制的影响。请注意，降低通气会产生一个逐渐接近最大理论琥珀酸盐产量(左上)的优化生长点。琥珀酸盐形成与细胞生长的更紧密关联可通过额外敲除adhE和ldh而取得，如图7所示。这些基因分别催化ADHEr和LDH_D反应。另外，有氧和厌氧条件下含或不含adhE、dhaKLM、ldh缺失的株系的指示活力进一步表明可使用包括有氧生长阶段(黑线)然后是限氧生产阶段(彩色线条)在内的双阶段发酵策略。

生长关联性琥珀酸盐株系的制备和验证

为了确认本发明方法的计算预测，必须构建、演化和测试株系。在一到六周之间的生长调控阶段，一般约为三周，用于较复杂的设计。稍简单的设计可在相应的较短时间内调控。

株系构建：E.coli K-12 MG1655用作引入敲除的野生型参考株系。基因敲除在受体株系中逐个进行，允许几个缺失进行累积。此敲除方法可完全去除目标基因，从而避免了构建的变异株系逆转回野生型的可能性。在一项研究中，为琥珀酸盐之生长关联性生产构建和分析了四个预测的非直观设计中的两个。这两个株系可在最多进行三个敲除后构建：(1)pfl，ldhA和(2)pfl，ldhA，adhE。对其他研究来说，构建了四个常用敲除：ackA-pta，pykA，pykF，dhaKLM。在另一项研究中，额外敲除了atpFH和sdhAB，而在另一项替代研究中也额外敲除了ptsG。对于非直观设计的确认性测试，最多集成了七个敲除。总的来说，对于所有预期非直观株系和研究的构建，最多进行了十个敲除。

适应性演化：适应性演化程序涉及通过在细胞到达平稳阶段前将连续传代批次培养系放入新鲜培养基，而让细胞一直处于延长的指数增长状态。简而言之，即在稀释和放入新鲜培养基(即含2g/L碳源的M9基础培养基)前允许细胞达到指数中期生长(A₆₀₀＝0.5)。此过程可重复，允许每次培养重复约500代。培养样本在演化过程中每天采集一次，用液氮冷冻并记录其光学密度。表7总结了各演化要求的条件。演化重复三次(即合计18个演化培养系)，这是因为之前观察到的演化模式有差异，Donnelly et al.，Appl Biochem Biotechnol70-72：187-98(1998)；Vemuri et al.，Appl Environ Microbiol68：1715-27(2002)，有可能导致一个株系的生产特性显著高于其他株系。适应性演化程序最多可进行两个月或以上。适应性演化程序也可低于两个月，这取决于株系设计等因素。

表7：各演化的所需条件。演化将重复三次。

验证：在整个演化过程中，每十天对生长速率(GR)、基质摄取率(SUR)及氧摄取率(OUR，如为有氧)采样一次。前一培养批次过夜生长并用于接种新鲜批次培养，在指数增长期进行测量。GR通过用分光光度计(A₆₀₀和A₄₂₀)测量光学密度而确定，SUR通过使用HPLC监控碳源随时间的消耗率而确定，而OUR通过使用极谱法溶解氧探针在呼吸计中测量溶解氧的消耗而确定。琥珀酸盐和副产物生产由HPLC或酶分析法量化。三个重复中每个演化株系的测量以十天的间隔进行。测试可与演化同时进行。

株系稳定性的评估：OptKnock方法背后的生长关联性生化产物生产的概念导致遗传上稳定的超产株系的诞生。将具有最佳琥珀酸盐生产特性和至少符合模型预测的株系在恒化器内生长一个月以确认其的长期稳定性。恒化器培养使用M9基础培养基在1.3L的台式发酵罐(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中进行，其工作容积约为600mL。碳源浓度可进行调整以获得对应于A₆₀₀＝1.0的细胞密度，而稀释率设置为最大生长速率的约80％以避免洗空。有氧生长时使用无菌空气，而溶解氧含量通过调整通气率保持在＞95％的饱和度。如果OptKnock建议厌氧生长环境，则反应釜中将连续喷入氮/CO2混合气体以保证DO水平低于可检测水平。CO₂也以培养基中碳酸氢钠(NaHCO₃)的形式提供。代谢行为按上述步骤每周分析一次。

结论

这里所述的是OptKnock方法在生成有用基因敲除目标中的应用。多点敲除策略在列举后用于建立琥珀酸盐生产和E.coli生长之间的关联关系。此方法适用于E.coli以外的多种细胞和微生物，也可利用OptKnock以外的代谢建模和模拟系统。这里也介绍了两个相对直观的厌氧设计(下面的3和4)、一个非直观有氧设计(5)和一个非直观厌氧设计(6)的构建和验证。这些程序也包括对适应性演化能力的详细评估，以确认增强各生物催化剂的生产特性。具体来说，在被识别为能够进行生长关联性琥珀酸盐生产的株系中，选择了七个能导致琥珀酸盐的生物合成与生长相关联的株系：

为试验验证选择的敲除策略：

(1)adhE，ldhA

(2)adhE，ldhA，ackA-pta

(3)pfl，ldhA

(4)pfl，ldhA，adhE

(5)ackA-pta，pykA，pykF，atpFH，sdhAB，dhaKLM

(6)ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM

(7)ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM，adhE，ldhA

这里的分析也表明演化方法可改善所有建议株系的琥珀酸盐生产特性。这里的分析结果也表明上述具体株系中的几个株系在不具备列出的全部代谢路径改造时，仍可进行琥珀酸盐之生长关联性生产。因此，以下列表给出了各设计要求的最低基因敲除组合：

上述设计要求的最低敲除组合：

(1)adhE，ldhA

(2)adhE，ldhA，ackA-pta

(3)pfl，ldhA

(4)pfl，ldhA，adhE

(5)ackA-pta，pykF，atp，sdh

(6)ackA-pta，pykF，ptsG

(7)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA

其中sdh和atp代表能够从E.coli中分别消除琥珀酸盐脱氢酶(SUCDli)和ATP合酶(ATPS4r)活性的任何缺失。这里介绍的综合计算和设计平台一般适用于任何化学计量模型生物，而这里提供的教学和指导可以让熟悉行业技术的人设计和实施用于代谢路径改造的多组基因操控，以便进行任何生化产物的生长关联性生产。

示例II

能够进行琥珀酸盐之生长关联性生产的微生物

此示例介绍了示例I中描述的两个利用电脑模拟设计的株系之构建和表现，这两个株系可用于琥珀酸盐之生长关联性生产。

下面介绍的方法用于构建和识别含两个前述株系设计的生物。简而言之，株系AB3含adhE、pflA和ldhA的缺失，而第二个株系AB4含ackA-pta、dhaKLM、ptsG、pykA和pykF的缺失，如前所述。

演化前的株系特征辨别

第一个设计包括pfl、ldh和adhE的同时敲除。图3将建议的pfl、ldh和adhE三变异株系在各可行生长速率下通过分别最大化和最小化琥珀酸盐产量而获得的理论生产上下限与野生型株系进行了比较。由绿色和黑色线条包围的区域表示E.coli在理论上可以取得的琥珀酸盐和生物量生产速率。生产上下限的最右端对应于“优化生长”方案，其与最大生物量产量同义。因为系统的线性，如果葡萄糖摄取率与规定的基础值不同，则应按比例缩放结果。如示例I中所述，对于pfl、ldh和adhE三变异株系来说，预测其完全厌氧发酵是可行的，并可在优化生长状态下获得1.2mol/mol的琥珀酸盐摩尔产量。需要注意的是，预计琥珀酸盐的生产在此株系中与细胞生长紧密关联，而在生长速率高于通过电脑模拟预测的最大值25％时即可出现非零的琥珀酸盐生产。最后，最大理论琥珀酸盐产量不受敲除的影响，因此该设计策略不会负面影响此株系的进一步代谢工程。

第二个由OptKnock得出的株系设计对于厌氧条件下琥珀酸盐的生长关联性形成来说需要五个敲除(即ackA-pta，pykA，pykF，ptsG，dhaKLM)。如示例I中所述，此敲除组合预期会导致显著的代谢路径改变，例如强制依赖于丙酮酸盐的非典型来源(例如脱氧酮糖酸(ED)途径、丝氨酸脱氨酶、苹果酸酶等)。

简而言之，这些株系在构建时，将E.coli K-12 MG1655用作进行敲除的野生型株系。基因敲除在受体株系中逐个进行，允许几个缺失进行累积。这些株系通过Datsenko和Wanner的λRed重组酶系统使用同源重组技术综合框架内缺失而构建，Datsenko et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.，6640-6645(2000)。每次敲除后未保留任何抗药性标记，使得在目标株系中可累积多个突变。另外，目标基因的完全去除避免了构建的变异株系逆转回野生型的可能。第一个株系使用pfl、ldh和adhE缺失构建，而第二个株系在ackA-pta、pykA、pykF、dhaKLM和ptsG处有缺失。图8a简要介绍了构建这些株系的策略。

株系表现可通过对演化前后所有株系的摇瓶发酵实验而量化。厌氧条件可通过首先用氮气喷射培养基然后用隔膜和螺纹盖密封而获得。对于观察到生长无需厌氧的株系，可在隔膜上开一个小孔有限通气以建立微氧环境。所有的试验均使用加入了2g/L葡萄糖和20mMNaHCO₃、而且pH为7.0的M9基础培养基(6.78g/L Na₂HPO₄，3.0g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH₄CI，1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂)进行。前一培养批次过夜生长并用于接种新鲜批次培养，在指数增长期进行测量。生长速率通过使用分光光度计(600nm)测量光学密度而确定，而葡萄糖摄取率通过监控碳源随时间的消耗而确定。琥珀酸盐、副产物和残余的葡萄糖通过带HPX-087柱(BioRad)的HPLC(Shimadzu)、用于葡萄糖和乙醇的折光率检测器以及用于有机酸的紫外线检测器来量化，Lin et al.，Biotechnol.Bioeng.，775-779(2005)。每个株系建立三个培养系，而报告的所有测量值均为这三个培养系的平均值。

野生型和设计株系的表现在演化前确定，以便为适应性演化程序的实施建立可以量化的结论。表8给出了此分析的结果。请注意，此研究中构建的多个株系均进行了摇瓶特性实验，包括中间株系AB1和AB2(参见图8a)。

表8：设计株系消耗的葡萄糖量、形成的生物量、产生的发酵产物以及生长速率。所有数据均为3个独立培养系的平均值，并标明了95％的置信区间。N.D.：未定。

设计株系表现出比野生型较慢的生长速率和改变的发酵特性。AB1和AB3不能在严格的厌氧条件下明显生长，因此如前所述在微氧条件下生长。此观察结果与NZN111的文献报道一致，Stols et al.，ApplEnviron Microbiol，63：2695-701(1997)，Hong et al.，BiotechnolBioeng，74：89-95(2001)，Stols et al.，ApplBiochem Biotechnol，63-65：153-8(1997)，而其基因型与AB1相同。这些株系看起来在丙酮酸处出现瓶颈，因为表现出此代谢副产物含量较高。

adhE缺失显著降低了AB3消耗的葡萄糖数量，但也没有产生可获得较高琥珀酸盐产量的乙醇。AB2和AB4株系的摇瓶特性表明其在完全厌氧生长中的琥珀酸盐产量与野生型MG1655相比高出4和10倍(图8b)，尽管突变对生长速率和最终生物量浓度有相当的影响。

株系的适应性演化

新构建变异株系观测到的生长低于之前模型分析的预测值，所以这些株系继续使用Evolugator^TM设备演化。简而言之，对野生型和这两个设计株系进行了适应性演化。适应性演化程序由Evolugate，LLC(Gainesville，FL)使用Evolugator^TM演化设备进行。此设备通过在细胞到达平稳阶段前将连续传代批次培养系放入新鲜培养基，而让细胞一直处于延长的指数增长状态。通过自动化的光学密度测量和液体处理，Evolugator可大量高速依次转移培养液，从而达到一个用于细胞适应性演化的恒化器的效率。但与在单个容器内维持细胞的恒化器相比，该设备工作时在管道卷的细分区域内从一个“反应釜”移动到下一个，从而消除了对壁生长的任何选择。培养样本在演化过程中每天采集一次，用液氮冷冻并记录其光学密度。

虽然AB3的厌氧生长在实验室中可以忽略，但在此条件下生长的能力可通过在演化过程头几天内逐渐降低氧供给而发展出来。作为证明E.coli能够厌氧演化的对照试验，野生型MG1655也在Evolugator中培养了15天。由每天要求的稀释次数估计的预计加倍时间，从2.2hr^-1下降到0.9hr^-1，如图9a所示。为了进一步辨别生长的提高，培养了原始和演化后(EVG09)株系的三个培养系。野生型株系的生长速率是0.351±0.002hr^-1，而EVG09的是0.521±0.049hr^-1。在观察到其生长明显比野生型株系提高后，AB3株系随后进一步演化，导致加倍时间的类似下降，如图9b所示。这两个株系都观察到加倍时间的明显下降。

进一步的株系特征辨别

演化后AB3的特征采用摇瓶发酵方法进行总结，与其演化前前体采用的方法相同。完全的厌氧生长对于此株系来说并不显著，表明Evolugator^TM生长环境不是完全厌氧的。但来自设备样品的产物特性显示，AB3株系产生了大量的发酵产物，表明其演化远非完全有氧，很可能是微氧的(图10)。这些结果表明在Evolugator^TM中花费的时间有助于缓解未演化AB3株系中存在的丙酮酸盐瓶颈，因为丙酮酸盐的含量在演化结束时降低至零。丙酮酸盐分泌为该生物带来很少的优势，因为与产生乙醇、乳酸盐或琥珀酸盐不同，并没有重新生成NAD>。另外，与产生乙酸盐不同的是，没有生成任何能量。

工业发酵很少在完全厌氧条件下进行。因此，演化后的AB3株系的特性进一步在微氧生长条件下总结。图11显示了这些生长条件下的产品特性，与其未演化的父本相比显示了更高的琥珀酸盐形成的趋势。图12显示了琥珀酸盐在发酵产物中的质量百分比随着丙酮酸盐和乙酸盐分别下降约50％和40％而增加四倍。琥珀酸盐的最终摩尔产量是1.1mol/mol葡萄糖，这与利用模型为此演化后琥珀酸盐株系预测的产量1.2mol/mol葡萄糖非常接近(参见前面的描述和图3，变异株系的最右端边界)。与直接从Evolugator采样相比，仍有明显的丙酮酸盐累积，虽然比未演化的AB3株系要少。此结果表明设备中存在的O₂可能比微氧摇瓶中更多。可通过更长的演化时间，特别是在改善的厌氧条件下，降低或消除丙酮酸盐瓶颈。电脑模拟预测指出该生物在进行细胞生长优化后具有2摩尔琥珀酸盐比1摩尔乙酸盐的发酵特性，株系特性数据进一步证实可取得预期的株系产量。

结论

此示例显示了示例I中描述的两个E.coli株系的构建和表现特性，这两个株系是通过用于琥珀酸盐之生长关联性生产的OptKnock计算框架，运用电脑模拟方法设计的。第一个株系AB3含adhE、pflA和ldhA的缺失，而第二个株系AB4含ackA-pta、dhaKLM、ptsG、pykA和pykF的缺失。这些株系以及在其构建过程中制备的父株系AB1和AB2，与其中引入缺失的野生型E.coli MG1655株系相比，表现出更高的琥珀酸盐产量。实际上，AB4株系的琥珀酸盐产量与野生型株系相比增加了近十倍。

野生型E.coli MG1655株系和AB3也使用Evolugator^TM技术进行了适应性演化以提高其生长速率。对于野生型株系来说，演化程序在厌氧条件下提高生长速率近50％，但正如预期的那样，并未显著影响最终的产物特性。对于AB3株系，生长速率和琥珀酸盐产量均在演化后提高，而副产物丙酮酸盐的分泌显著下降。此研究进一步证实OptKnock计算方法可识别导致E.coli中琥珀酸盐产量提高的基因缺失组合。另外，此研究进一步说明适应性演化方法可用于推动用OptKnock所设计株系的表现，使之更接近通过计算预测的高产基因型。

表1：为增强E.coli中琥珀酸盐生产而作为去除目标的反应组合。前七个组合已在本文中明确说明。

^*每10mmol葡萄糖的预测琥珀酸盐mmol数

^&每10mmol葡萄糖的预测gDW生物量

反应可通过敲除附表2中显示的适当基因而去除。

ACKr、F6PA、MTHFC、PGL和SUCD4可分别与PTAr、DHAPT、MTHFD、G6PDHy和SUCDli一起去除或作为其替代而去除。

#任何列出反应敲除的组合(即至少一个、最多全部)都可能达到所需效果。

⁺解答假设没有非生长相关的维持要求。所有其他模拟假设非生长相关的维持要求为7.6mmol/gDW/hr。

表2：负责催化作为去除目标之反应的已知E.coli基因

^*与缩写对应的代谢物名称见附表3。

^&OptKnock识别需要从一个生物中去除的反应，以增强生化产物的生产。所列基因敲除的任何组合(即至少一个、最多全部)都可能达到保证相应反应在E.coli中无功能的所需效果。去除目标反应的最实际试验策略必须依据具体情况而定。

文中使用的常用基因名称在相应数字基因名称后的圆括号内给出。

表3：对应于附表2中缩写的代谢物名称

代谢物缩写	区室	代谢物名称
			10fthf	胞质	10-甲酰四氢叶酸盐
13dpg	胞质	3-磷-D-甘油磷酸盐
			2dmmq8	胞质	2-二甲基甲萘醌8
2dmmql8	胞质	2-二甲基甲萘醌醇8
			2h3opp	胞质	2-羟基-3-氧丙酮酸盐

2pg	胞质	D-甘油酸2-磷酸盐
			3pg	胞质	3-磷-D-甘油酸盐
6pgc	胞质	6-磷-D-葡糖酸盐
			6pgl	胞质	6-磷-D-葡糖酸-1，5-内酯
ac	胞质	醋酸盐
			ac[e]	胞外	醋酸盐
accoa	胞质	乙酰基辅酶A
			actp	胞质	乙酰基磷酸盐
adp	胞质	ADP
			akg	胞质	2-酮戊二酸
atp	胞质	ATP
			cbp	胞质	氨甲酰磷酸盐
co2	胞质	CO2
			coa	胞质	辅酶A
dha	胞质	二羟基丙酮
			dhap	胞质	磷酸二羟基丙酮
dhor-S	胞质	(S)-二羟基乳清酸盐
			e4p	胞质	D-赤藓糖4-磷酸盐
etoh	胞质	乙醇
			etoh[e]	胞外	乙醇
f6p	胞质	D-果糖6-磷酸盐
			fad	胞质	FAD
fadh2	胞质	FADH2
			fdp	胞质	D-果糖1，6-二磷酸盐
fgam	胞质	N12-甲酸基-N 1-(5-磷-D-核糖基)甘氨酰胺
			for	胞质	甲酸盐
for[e]	胞外	甲酸盐
			fum	胞质	延胡索酸盐
fum[e]	胞外	延胡索酸盐
			g3p	胞质	3-磷酸甘油醛
g6p	胞质	D-葡萄糖6-磷酸盐
			gar	胞质	N1-(5-磷-D-核糖基)甘氨酰胺
glc-D[e]	胞外	D-葡萄糖
			glu-L	胞质	L-谷氨酸盐
glx	胞质	二羟乙酸盐
			gly	胞质	甘氨酸
glyclt	胞质	乙醇酸盐
			glyclt[e]	胞外	乙醇酸盐
glyc-R	胞质	(R)-甘油酸盐
			h	胞质	H+
h[e]	胞外	H+
			h2o	胞质	H2O
hom-L	胞质	L-高丝氨酸
			lac-D	胞质	D-乳酸盐
Lac-D[e]	胞外	D-乳酸盐
			mal-L	胞质	L-苹果酸盐
tnethf	胞质	5，10-甲叉亚甲基四氢叶酸
			mlthf	胞质	5，10-亚甲基四氢叶酸
nad	胞质	烟碱腺嘌呤二核苷酸
			nadh	胞质	烟碱腺嘌呤二核苷酸-还原后
nadp	胞质	烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸盐

nadph	胞质	烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸盐-还原后
			nh4	胞质	铵
o2	胞质	O2
			oaa	胞质	丁酮二酸盐
orn-L	胞质	L-鸟氨酸
			orot	胞质	乳清酸盐
pep	胞质	磷酸烯醇丙酮酸盐
			phom	胞质	O-磷-L-高丝氨酸
pi	胞质	磷酸盐
			pi[e]	胞外	磷酸盐
ppa	胞质	丙酸盐
			ppcoa	胞质	丙酰基辅酶A
ptrc	胞质	腐胺
			pyr	胞质	丙酮酸盐
pyr[e]	胞外	丙酮酸盐
			r5p	胞质	α-D-核糖5-磷酸盐
ru5p-D	胞质	D-核酮糖5-磷酸盐
			s7p	胞质	景天庚酮糖7-磷酸盐
succ	胞质	琥珀酸盐
			succ[e]	胞外	琥珀酸盐
succoa	胞质	琥珀酰辅酶A
			thf	胞质	5，6，7，8-四氢叶酸
thr-L	胞质	L-苏氨酸
			ubq8	胞质	泛醌-8
ubq8h2	胞质	泛醇-8
			xu5p-D	胞质	D-木酮糖5-磷酸盐

在本申请中，以插入语的形式引用了各种文献。为了更充分地说明此发明的技术状态，本申请以引用方式纳入这些完整公开的文献。

虽然描述此发明时参考的是上述公开的实施例，但熟悉技术的人应理解前面介绍的具体示例和研究只是针对此发明的说明。应当理解在不背离此发明精神的前提下，可以做出各种修改。相应地，此发明仅受以下权利要求约束。

Claims (30)

1.非天然微生物中包含一个或多个基因中断，而此基因中断发生在对一种酶进行编码的基因中，这种酶会在其活性被上述基因中断降低时，将琥珀酸盐的生产与微生物生长专向关联起来，因而此基因中断可以将稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产传递给此非天然微生物。

2.对于第1条权利要求中的非天然微生物，其上述一个或多个基因中断包括表1中列出的代谢路径改造。

3.对于第1条权利要求中的非天然微生物，其上述一个或多个基因中断包括上述一个或多个基因的缺失。

4.对于第1条权利要求中的非天然微生物，其中的非天然微生物选自经表1中所列之代谢路径改造的微生物组。

5.对于第1条权利要求中的非天然微生物，其微生物可包括细菌、酵母或真菌。

6.对于第5条权利要求中的非天然微生物，上述细菌可以是E.coli，A.succiniciproducens，A.succinogenes，M.succiniciproducens，R.etli，Bacillus subtilis，Cotynebacterium glutamicum，Gluconobacter oxydans，Zymomonasmobilis，Lactococcus lactis，Lactobacillus plantarum，Streptomyces coelicolor，Clostridium acetobutylicum，Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida中的一种。

7.对于第5条权利要求中的非天然微生物，上述酵母可以是Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe，Kluyveromyces lactis，Klvyveromyces marxianus，Aspergillusterreus，Aspergillus niger和Pichiapastoris中的一种。

8.一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联起来的代谢路径改造，而这组代谢路径改造由以下基因组合中选择的一个或多个基因中断组成：

(a)adhE，ldhA

(b)adhE，ldhA，ackA-pta

(c)pfl，ldhA

(d)pfl，ldhA，adhE

(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA

(f)ackA-pta，pykF，ptsG，或

(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA，

或其直系同源基因，其中上述微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产。

9.对于第8条权利要求中的非天然微生物，其基因可对进一步包含pykA、atpH、sdhB或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(e)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA进行编码。

10.对于第8条权利要求中的非天然微生物，其基因可对进一步包含pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(f)ackA-pta，pykF，ptsG进行编码。

11.对于第8条权利要求中的非天然微生物，其基因可对进一步包含pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(g)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA进行编码。

12.对于第8条权利要求中的非天然微生物，上述一个或多个基因的中断包含基因的缺失。

13.对于第8条权利要求中的非天然微生物，其微生物可包括细菌、酵母或真菌。

14.对于第13条权利要求中的非天然微生物，上述细菌可以是E.coli，A.succiniciproducens，A.succinogenes，M.succiniciproducens，R.etli，Bacillus subtilis，Cotynebacterium glutamicum，Gluconobacter oxydans，Zymomonasmobilis，Lactococcus lactis，Lactobacillus plantarum，Streptomyces coelicolor，Clostridium acetobutylicum，Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida中的一种。

15.对于第13条权利要求中的非天然微生物，上述酵母可以是Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe，Kluyveromyces lactis，Klvyveromyces marxianus，Aspergillusterreus，Aspergillus niger和Pichiapastoris中的一种。

16.制备能够稳定进行琥珀酸盐之生长关联性生产的非天然微生物的方法，由以下部分组成：

(a)利用电脑模拟识别在指数增长阶段要求琥珀酸盐生产的一组代谢路径改造；以及

(b)在遗传上改变一种微生物以便让其包含一组要求琥珀酸盐生产的代谢路径改造。

17.对于第16条权利要求的方法来说，其代谢路径改造组由OptKnock或SimPheny选择的电脑模拟方法识别。

18.对于第16条权利要求的方法来说，其代谢路径改造组包含对一个或多个代谢反应的功能性中断。

19.对于第18条权利要求的方法来说，其代谢路径改造组通过基因敲除中断。

20.对于第18条权利要求的方法来说，其非天然微生物包括一种具有从表1中所列代谢路径改造组中选择的代谢路径改造的微生物。

21.对于第16条权利要求的方法来说，进一步包括培养上述经遗传改造的微生物。

22.对于第21条权利要求的方法来说，在要求琥珀酸盐生产的条件下进一步包括适应性演化上述经遗传改造的微生物。

23.对于第16条权利要求的方法来说，其非天然微生物可包括细菌、酵母或真菌。

24.对于第23条权利要求中的方法来说，上述细菌可以是E.coli，A.succiniciproducens，A.succinogenes，M.succiniciproducens，R.etli，Bacillus subtilis，Cotynebacterium glutamicum，Gluconobacter oxydans，Zymomonasmobilis，Lactococcus lactis，Lactobacillus plantarum，Streptomyces coelicolor，Clostridium acetobutylicum，Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida中的一种。

25.对于第23条权利要求中的非天然微生物，上述酵母可以是Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe，Kluyveromyces lactis，Klvyveromyces marxianus，Aspergillusterreus，Aspergillus niger和Pichiapastoris中的一种。

26.微生物可使用第16或22条权利要求中的方法制备。

27.与微生物生长关联生产琥珀酸盐的方法：

(a)在数量充足的营养和培养基中，在指数增长阶段培养一种非天然微生物，它包含一组将琥珀酸盐生产与微生物生长专向关联的代谢路径改造，而该组代谢路径改造包括从以下基因组合中选择的一个或多个基因中断：

(1)adhE，ldhA

(2)adhE，ldhA，ackA-pta

(3)pfl，ldhA

(4)pfl，ldhA，adhE

(5)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA

(6)ackA-pta，pykF，ptsG，或

(7)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA，

或其直系同源基因，其中上述微生物表现出稳定的琥珀酸盐之生长关联性生产；以及

(b)分离上述非天然微生物产生的琥珀酸盐。

28.对于第27条权利要求的方法来说，其基因可对进一步包含pykA、atpH、sdhB或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(5)ackA-pta，pykF，atpF，sdhA进行编码。

29.对于第27条权利要求的方法来说，其基因可对进一步包含pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(6)ackA-pta，pykF，ptsG进行编码。

30.对于第27条权利要求的方法来说，其基因可对进一步包含pykA或dhaKLM中至少一个基因中断的代谢路径改造(7)ackA-pta，pykF，ptsG，adhE，ldhA进行编码。

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