KR20130107319A - 유기산 제조에서의 모나스쿠스의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 낮은 pH 에서 높은 유기산 농도에 대해 용인성인 모나스쿠스 균주를 사용하는 유기산 제조 수단 및 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 유기산 제조에서의 사용을 위한 미생물 및 그의 응용에 관한 것이다.
유기산은 식품, 약품 및 직물 산업에서 널리 이용되고, 생체정제에서 중요 화학물 빌딩 블록들 중 하나로 널리 인식되어 있다. 유기산은 또한 생분해성 플라스틱으로 사용되는 중합체의 제조에서 관심대상이다.
수많은 미생물이 호기성 및 혐기성 발효 프로세스에 의해 유기산을 생산할 수 있다. 락토바실러스 (Lactobacillus) 종들은 현재 전분-기재 락트산 제조 공업에서 많이 사용되고 있다. 상기 종들 대부분은 자일로스 및 아라비노스와 같은 오탄당을 발효하는 능력이 부족하다. 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및 락토코코스 락티스 (Lactococcus lactis) 가 오탄당을 락트산으로 발효시킬 수 있긴 하지만, 오탄당은 락트산 생산에는 비효율적인 포스포케토라제 경로를 이용해 대사된다. 실제로, 포스포케토라제 경로에서 자일룰로스 5-포스페이트가 글리세르알데히드 3-포스페이트 및 아세틸-포스페이트로 절단된다. 그러한 경로로는, 아세트산에 대해 2 개의 탄소를 잃기 때문에 락트산의 이론적인 최대 수율이 오탄당 하나 당 1 개로 제한된다 (자일로스 g 당 락트산 0.6 g).
대장균 (E. coli) 과 같은 대부분의 플랫폼 숙주 유기체에서, 높은 역가의 유기산 생산은 비효율적이거나 또는 독성이 있다. 중성 pH 에서의 락트산과 같은 유기산의 생산은 일반적으로 Ca-락테이트의 생산을 초래하는데, 이는 황산을 첨가해 락트산으로 변환시켜야 하며, 그 결과 생성물로서 CaS04 (석고) 가 제공된다. 락트산을 직접 제조하려면, 발효는 낮은 pH (바람직하게는 락트산의 pKa 값인 3.85 보다 한 단위 이상 더 낮은 값) 에서 진행되어야 한다. 그러나, 락트산은 그의 양성자화된 형태에서 멤브레인 퍼텐셜을 파괴하는 짝풀림제로서 작용하기 때문에 미생물에 독이 된다. 유사한 단점이 숙산산 및 푸마르산과 같은 기타 유기산의 제조가 증가될 때에도 주목된다. 따라서, 매우 소수의 미생물들만 낮은 pH 를 용인할 수 있으며, 오직 제한된 수의 유기체들만 저하된 pH 에서 유기산을 용인하므로 유기산 제조에 적합하다.
박테리아 발효의 중요한 단점은 비용이다. 많은 박테리아가 효율적 성장 및 당 대사를 위해 필요로 하는 아미노산 또는 단백질 중 일부를 합성할 수 없기 때문에, 박테리아는 종종 영양물의 다소 복잡한 패키지를 공급받아야 하고, 이는 발효 작업의 직접적인 경비를 증가시킨다. 추가로, 브로쓰의 복잡성이 증가되면 발효 생성물을 쓸만하게 순수한 형태로 회수하는 것이 더욱 어려워지고, 이에 생성물 회수를 위한 작업 및 자본 비용이 증가하게 된다. 또한, 공급 원료로 옥수수를 사용하는 것은 식량 및 사료와 직접 상충하게 된다.
따라서, 락트산 발효 프로세스에 대한 개선된 생물촉매가 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 유기산 제조용의 개선된 미생물을 제공한다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 유전자 조작에 의해 낮은 pH 에서 고농도의 유기산에 대해 매우 용인성이고, 따라서 유기산 제조에 사용하기에 적합한 미생물을 제공한다. 더욱 특별한 구현예에서, 본 발명은 재조합된 균류, 더욱 특별하게는 특정 외인성 및/또는 내생성 유전자가 과발현 및/또는 억제되어 발효가능한 배지에서 배양시 재조합된 균주가 증가된 수준의 유기산을 제공하게 한 모나스쿠스 (Monascus) 속의 종들을 제공한다. 따라서, 본 발명의 재조합된 모나스쿠스 균주는 낮은 pH 에서의 유기산 생산 증대에 이용될 수 있고, 이로써 식품 및 공업적 응용에서의 사용을 위한 유기산의 공급 증대를 제공할 수 있다.
첫번째 국면에서, 본 발명은 미생물, 더욱 특별하게는 모나스쿠스 속의 미생물을 제공하는데, 이는 낮은 pH 에서 고농도의 유기산에 용인성이다. 특별한 구현예에서, 이들은 유기산의 pKa 값보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 증대된 농도의 유기산에 용인성이다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 미생물은 5 미만, 더욱 특별하게는 4 미만, 더욱더 특별하게는 3 미만, 가장 특별하게는 2.8 미만의 pH 에서 락트산과 같은 유기산에 용인성이다. 더욱더 특별한 구현예에서, 이들은 유기산을 50 g/L, 가장 특별하게는 100 g/L 로 함유하는 배지에서 생장가능하고, 특별한 구현예에서 낮은 pH, 더욱 특별하게는 5 미만, 더욱더 특별하게는 4 미만, 더더욱 특별하게는 3 미만, 가장 특별하게는 2.8 미만의 pH 에서 150 내지 175 g/L 까지의 유기산을 포함하는 배지에서 생장한다. 본 발명의 특별한 구현예에서, 모나스쿠스 속에 속하는 종은 모나스쿠스 루버 (Monascus ruber) 이다. 그러한 높은 산 용인성은 이들로 하여금 심지어 혐기성 또는 유사-혐기성 조건 하에서의 유기산의 공업적인 제조에 이용하기에 특히 적합하게 해 준다.
특별한 구현예에서, 상기 미생물들은 유기산 생산을 더욱 증강시키도록 유전자 조작에 의해 개질된다. 특별한 구현예에서, 본 발명의 미생물은 육탄당 및 오탄당 상에서 생장할 수 있고, 상기 당들을 유기산으로 변환시킨다. 더욱더 특별한 구현예에서, 본 발명의 미생물은 50 g/L 이상의 농도, 더욱 특별하게는 70 g/L 이상의 농도, 100 g/L 이상, 200 g/L 이상 또는 그 이상의 농도의 글루코스 및 자일로스 상에서 생장한다.
발명의 특별한 구현예에서 발명의 미생물은 유기산 생산을 증강시키도록 유전자 조작에 의해, 더욱 특별하게는 하기 중 하나 이상에 의해, 개질된다:
a) 유기산의 생산에 관여되는 하나 이상의 재조합된 유전자; 및/또는
b) 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자 및/또는 관심대상의 유기산을 소모하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화.
특별한 구현예에서, 유기산은 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산이다.
더욱더 특별한 구현예에서 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 에탄올의 내생성 생산에 관여되는 유전자의 결실 및/또는 불활성화이다. 더욱 특별하게는 발명에 따른 모나스쿠스 속의 미생물은 피루베이트 디카르복실라아제의 내생성 생산이 불활성화된 미생물이다. 가장 특별하게는, 상기 미생물은 본원에 기재된 바와 같은 내생성 PDC1, PDC2 및 PDC4 유전자 중 하나 이상이 불활성화된 모나스쿠스 속의 미생물이다. 더욱더 특별한 구현예에서, 불활성화 및/또는 결실되는 하나 이상의 내생성 디카르복실라아제 코딩 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5 중 하나 이상에 해당하는 서열이다.
특정한 특이적 구현예에서, 본 발명은 증가된 수준의 락트산, 더욱 특별하게는 L-락트산을 낮은 pH 에서 생산할 수 있는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다. 더욱 특별하게는, L-락트산이 육탄당 및/또는 오탄당으로부터 높은 수율로 생산된다.
특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 미생물은 이종성 또는 외인성 LDH 유전자를 포함한다. 따라서, 특별한 구현예에서, 본 발명은 이종성 또는 외인성 LDH 유전자를 포함하는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주이다. 추가로 특이적인 구현예에서, 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주는 SEQ ID NO: 1 에 의해 인코딩되는 단백질과 80% 이상 일치하는 기능성 단백질을 인코딩하는 이종성 또는 외인성 LDH 유전자를 포함한다.
특정한 특이적 구현예에서, 발명은 증가된 수준의 숙신산 및/또는 푸마르산을 생산할 수 있는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다. 특별한 구현예에서, 발명에 따른 미생물은 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제 유전자, 말레이트 디히드로게나아제 유전자, 푸마라아제 유전자, 푸마레이트 리덕타아제 유전자, 이소시트레이트 리아제 유전자 및/또는 말레이트 합성효소 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 또는 외인성 유전자를 포함한다. 따라서, 특별한 구현예에서, 발명은 이종성 또는 외인성 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제 유전자, 말레이트 디히드로게나아제 유전자, 푸마라아제 유전자, 푸마레이트 리덕타아제 유전자, 이소시트레이트 리아제 유전자 및/또는 말레이트 합성효소 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다.
특정한 특이적 구현예에서, 발명은 증가된 수준의 푸마르산을 생산할 수 있는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공하며, 상기 미생물은 피루베이트 디카르복실라아제 유전자, 말레이트 디히드로게나아제 유전자, 및 푸마라아제 유전자를 과발현한다. 특별한 구현예에서, 모나스쿠스 균주는 막을 통한 수송을 위한 디카르복시산 담체를 인코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 더욱더 특별한 구현예에서, 모나스쿠스 균주는 내생성 피루베이트 디카르복실라아제 유전자 및/또는 말레이트 디히드로게나아제 유전자를 과발현하고, 임의로 외인성 푸마라아제 유전자 및/또는 디카르복시산 담체 유전자를 추가로 발현한다.
본 발명은 추가로 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산과 같은 유기산의 수율이, 관심대상인 유기산 이외의 대사물을 생산하고/하거나 유기산을 소모하는 내생적인 대사 경로에 관여되는 단백질을 인코딩하는 내생적인 모나스쿠스 유전자를 불활성화시켜 증대될 수 있음을 고려한다. 특별한 구현예에서, 관심대상인 유기산 이외의 대사물의 생산이 감소된다. 추가의 특별한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 미생물은 유기산이 소모되는 내생적 경로에 관여되는 유전자 또는 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생적 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함한다.
더욱 특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 균주 모나스쿠스의 미생물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 재조합된 미생물이다: 유기산 생산에 관여되는 외래 유전자를 인코딩하는 재조합된 유전자 및/또는, 유기산이 소모되는 내생적 경로에 관여되는 유전자 및/또는 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생적 경로에 관여되는 효소를 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화.
특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 균주 모나스쿠스의 미생물은, 상기 유기산이 락트산이고, 락트산 디히드로게나아제 (LDH) 를 인코딩하는 재조합된 유전자 및/또는, 내생적 락트산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 락트산 이외의 대사물을 생산하는 내생적 경로에 관여되는 효소를 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 재조합된 미생물이다.
특별한 구현예에서, 발명에 따른 모나스쿠스 균주의 미생물은, 상기 유기산이 숙신산 및/또는 푸마르산이고, 글리옥실레이트 사이클의 효소 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 이소시트레이트 리아제 및 말레이트 합성효소를 인코딩하는 하나 이상 유전자를 인코딩하는 재조합된 유전자 및/또는 내생성 숙신산 및/또는 푸마르산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 숙신산 및/또는 푸마르산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는, 재조합된 미생물이다.
본 발명의 특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주는 추가로 하나 이상의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화를 포함한다.
더욱 특별한 구현예에서, 하나 이상의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 푸마레이트 리덕타아제, 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드 디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합 중에 있다.
더욱더 특별한 구현예에서, 미생물은 락트산을 생산하도록 조작되고, 락테이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 내생적 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 미생물은 시토크롬-의존성 락테이트 디히드로게나아제, 예컨대 시토크롬 B2-의존성 L-락테이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 내생적 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화를 포함한다. 더욱 특별하게는, 조작된 유전자 결실 또는 불활성화가 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 6 의 코딩 서열을 포함하는 유전자의 불활성화이다.
발명의 특별한 구현예는, 상기 유기산은 숙신산 및/또는 푸마르산이고, 하나 이상의 조작된 유전자 또는 불활성화를 추가로 함유하는, 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다.
더욱 특별한 구현예에서, 하나 이상의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh), 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제, 이소시트레이트 디히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합에 있고, 더욱 특별하게는 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 알코올 디히드로게나아제 (adh), 이소시트레이트 디히드로게나아제 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 내생성 유전자에 있다.
특별한 구현예에서, 발명은 상기 유기산은 숙신산이고, 숙시네이트 디히드로게나아제 및/또는 푸마레이트 리덕타아제를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다.
특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 미생물은 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합물로부터 0.5 g/L 이상의 수율로 유기산을 생산할 수 있다. 더욱 특별하게는, 그 수율은 2 g/L 이상, 가장 특별하게는 5 g/L 이상이다. 특별한 구현예에서, 소모된 당의 유기산으로의 변환 수율은 50% 이상이다.
본 발명의 특별한 구현예는 락트산, 예컨대 L-락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산을 육탄당 및/또는 오탄당으로부터 2 g/L 이상의 수율로 생산할 수 있는 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다. 특별한 구현예에서, 에탄올이 부산물로 생성된다.
추가 국면에서, 본 발명은 유기산 및/또는 그로부터 유도되는 산물의 공업적 제조, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 값보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 유기산의 공업적 제조를 위한 본원에서 제공되는 미생물의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 이는 5 미만의 pH, 더욱 특별하게는 약 4 이하의 pH 에서의 유기산의 생산을 의미한다. 물론, 낮은 pH 에서의 유기산에 대한 그들의 용인성의 결과로서, 본원에 기재된 미생물이 이온 염으로의 변환없이 유기산의 고수율 생산에 특히 적합하다. 본원의 문맥에서, 낮은 pH 에서 수율을 증대하여 유기산을 생산할 수 있는 유전자적으로 개질된 균주가 특히 관심대상이 된다. 물론, 본 발명의 미생물들은 제한된 제조 비용에서의 높은 수율을 보장할 수 있다. 따라서, 특별한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유기산을 함유하는 조성물을 높은 수율로 제조하는 방법을 제공한다: (i) 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 미생물을 제공하는 단계, 및 (ii) 유일한 탄소 공급원으로서 육탄당 또는 오탄당 또는 이들의 조합의 존재 하에 2.8 의 pH 에서 상기 미생물을 배양하는 단계. 본 발명의 방법으로 수득되는 조성물은 일부 미생물의 배양에 일반적으로 필요한 유기 영양물질을 오염시키지 않고 낮은 pH 에서 높은 수준의 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산을 포함한다.
특별한 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 높은 수율의 유기산 제조 방법이 제공된다: (i) 낮은 pH 에서 높은 유기산 농도에 용인성이고, 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합으로부터 높은 수율로 유기산을 제공할 수 있도록 개질된 모나스쿠스 속 중 종들의 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 균주를 제공하는 단계, 및 (ii) 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합의 존재 하에 상기 균주를 배양하는 단계. 특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 추가로 유기산을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 특별한 구현예에서, 제조된 유기산이 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산이다. 더욱 특별한 구현예에서, 락트산이 L-락트산이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 유기산 (을 함유하는 조성물) 의 제조 방법은 2 g/L 이상의 유기산 수율을 결과로서 제공한다. 추가로 특별한 구현예에서, 유기산의 역가는 50 내지 100 g/L 이고, 생산성은 1 g/L/hr 이상, 더욱 특별하게는 2 내지 3 g/L/hr 이다.
본 발명은, 오직 설명으로서만 간주되어야 하고 본 발명의 범위를 어떻게든 한정하는 것이 아닌 하기의 도면에 의해 설명된다.
도 1 은 본 발명의 특별한 구현예에 따른 모나스쿠스 균주의 형질전환에 사용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 2 는 본 발명의 특별한 구현예에 따른 벡터 구축을 위한 카셋트-모델의 예시를 도시한다.
도 3 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 모나스쿠스 균주의 형질전환에 사용하기 위한 pCGHT3 형질전환 벡터를 도시한다.
도 4 는 코돈 최적화 Bt-L-LDH 유전자의 서열을 도시한다.
도 5 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 코돈 최적화 LDH 유전자 (소 Bt) 를 가진 형질전환 벡터 pCGHTGBtLT 를 도시한다.
도 6 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 pUR5750 플라스미드 기반의 코돈 최적화 LDH 유전자 (소 Bt) 가 있는 형질전환 벡터 pURGHTGBtLT 를 도시한다.
도 7 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 합성 LDH 유전자의 발현 후 대장균 단백질 추출물에서의 LDH 활성을 도시한다.
도 8a 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 에 대해 HPLC 에 의해 결정되는 바와 같은 배지 중 글루코스 농도를 도시한다.
도 8b 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 에서의 락트산 농도
도 9 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 두 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 의 바이오매스에서의 L-LDH 효소 활성을 도시한다.
도 10 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 글루코스의 소모를 도시한다.
도 11 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 락트산의 생산을 도시한다.
도 12 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 에탄올의 생산. 균주들은 10 ml YEPD 배지에서 3 일간 예비배양했다.
도 13 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형인 LF4 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 14 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형 균주 LF5 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 15 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형 균주 LF6 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 16 은 모나스쿠스 루버 PDC1 오픈 해독틀의 서열을 도시한다.
도 17 은 모나스쿠스 루버 PDC2 오픈 해독틀의 서열을 도시한다.
도 18 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 게네티신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC1 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 19 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 게네티신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC2 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 20 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 제오신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC2 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 21 은 PDC1 유전자 붕괴에 사용되는 벡터 pCH#PDC1 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 22 는 동시적인 PDC1 유전자의 붕괴 및 LDH 유전자의 삽입에 사용되는 벡터 pCL1H#PDC1 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 23 은 PDC1-LDH+ 형질전환체에서 PDC2 유전자를 붕괴하기 위해 사용되는 벡터 pCN#PDC2 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 24 는 모나스쿠스 루버 PDC4 오픈 해독틀의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 5).
도 25 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae) (Sc) 및 모나스쿠스 균주 LF4, LF5, LF6 및 CBS 균주 유래의 단백질 추출물에서의 Cyt-LDH 활성을 도시한다.
도 26 은 모나스쿠스 루버 CYB2 오픈 해독틀의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 2); 게놈 서열 내 추정되는 인트론을 작은 글자로 표시했다.
도 27 은 시토크롬 의존성 L-LDH 을 인코딩하는 모나스쿠스 루버 Mona00569 유전자의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 6).
도 28 은 피루베이트 카르복실라아제를 인코딩하는 모나스쿠스 루버 유전자의 서열 (SEQ ID NO:7) 을 나타낸다.
도 29 는 말레이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 모나스쿠스 루버 유전자의 서열 (SEQ ID NO:8, 도 29) 을 나타낸다.
도 30 은 PDC1 유전자를 붕괴하는 동시에 내생성 피루베이트 카르복실라아제 유전자를 삽입하는데 사용되는 벡터 pCPCH#PDC1 의 도식적 표현을 제공한다.
도 31 은 PDC2 유전자를 붕괴하고 내생성 말레이트 디히드로게나아제 유전자를 삽입하는데 사용되는 벡터 pCMDHN#PDC2 의 도식적 표현을 제공한다.
도 32 는 PDC4 유전자를 붕괴하고 모나스쿠스 루버를 위해 코돈 최적화된 리조푸스 오리재 (Rhizopus oryzae) 푸마라아제 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터 pCNATFUM#PDC4 의 도식적 표현을 제공한다.
도 33 은 코돈 최적화된 리조푸스 오리재 푸마라아제 유전자의 서열을 나타낸다.
도 34 는 모나스쿠스 루버를 위해 코돈 최적화된 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 로부터의 디카르복시산 담체 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터 pCBDAC 의 도식적 표현을 제공한다.
도 35 는 코돈 최적화된 스키조사카로마이세스 폼베 Mae-1 유전자의 서열을 나타낸다.
도 1 은 본 발명의 특별한 구현예에 따른 모나스쿠스 균주의 형질전환에 사용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 2 는 본 발명의 특별한 구현예에 따른 벡터 구축을 위한 카셋트-모델의 예시를 도시한다.
도 3 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 모나스쿠스 균주의 형질전환에 사용하기 위한 pCGHT3 형질전환 벡터를 도시한다.
도 4 는 코돈 최적화 Bt-L-LDH 유전자의 서열을 도시한다.
도 5 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 코돈 최적화 LDH 유전자 (소 Bt) 를 가진 형질전환 벡터 pCGHTGBtLT 를 도시한다.
도 6 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 pUR5750 플라스미드 기반의 코돈 최적화 LDH 유전자 (소 Bt) 가 있는 형질전환 벡터 pURGHTGBtLT 를 도시한다.
도 7 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 합성 LDH 유전자의 발현 후 대장균 단백질 추출물에서의 LDH 활성을 도시한다.
도 8a 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 에 대해 HPLC 에 의해 결정되는 바와 같은 배지 중 글루코스 농도를 도시한다.
도 8b 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 에서의 락트산 농도
도 9 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 두 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 및 형질전환되지 않은 모나스쿠스 루버 대조군 LF5 의 바이오매스에서의 L-LDH 효소 활성을 도시한다.
도 10 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 글루코스의 소모를 도시한다.
도 11 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 락트산의 생산을 도시한다.
도 12 형질전환체 및 야생형인 균주 LF4, LF5 및 LF6 에 의한 에탄올의 생산. 균주들은 10 ml YEPD 배지에서 3 일간 예비배양했다.
도 13 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형인 LF4 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 14 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형 균주 LF5 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 15 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 극심한 호기성 및 혐기성 조건 하의 형질전환체 및 야생형 균주 LF6 에 의한 당 (글루코스 또는 자일로스) 소모 및 생성물 (에탄올 및 락트산) 형성을 도시한다.
도 16 은 모나스쿠스 루버 PDC1 오픈 해독틀의 서열을 도시한다.
도 17 은 모나스쿠스 루버 PDC2 오픈 해독틀의 서열을 도시한다.
도 18 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 게네티신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC1 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 19 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 게네티신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC2 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 20 은 본 발명의 특별한 구현예에 따라 제오신 선별을 이용한 모나스쿠스 균주의 PDC2 의 붕괴에 이용될 수 있는 형질전환 벡터의 예시를 도시한다.
도 21 은 PDC1 유전자 붕괴에 사용되는 벡터 pCH#PDC1 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 22 는 동시적인 PDC1 유전자의 붕괴 및 LDH 유전자의 삽입에 사용되는 벡터 pCL1H#PDC1 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 23 은 PDC1-LDH+ 형질전환체에서 PDC2 유전자를 붕괴하기 위해 사용되는 벡터 pCN#PDC2 의 도식적인 대표도를 제공한다.
도 24 는 모나스쿠스 루버 PDC4 오픈 해독틀의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 5).
도 25 는 본 발명의 특별한 구현예에 따라 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae) (Sc) 및 모나스쿠스 균주 LF4, LF5, LF6 및 CBS 균주 유래의 단백질 추출물에서의 Cyt-LDH 활성을 도시한다.
도 26 은 모나스쿠스 루버 CYB2 오픈 해독틀의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 2); 게놈 서열 내 추정되는 인트론을 작은 글자로 표시했다.
도 27 은 시토크롬 의존성 L-LDH 을 인코딩하는 모나스쿠스 루버 Mona00569 유전자의 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 6).
도 28 은 피루베이트 카르복실라아제를 인코딩하는 모나스쿠스 루버 유전자의 서열 (SEQ ID NO:7) 을 나타낸다.
도 29 는 말레이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 모나스쿠스 루버 유전자의 서열 (SEQ ID NO:8, 도 29) 을 나타낸다.
도 30 은 PDC1 유전자를 붕괴하는 동시에 내생성 피루베이트 카르복실라아제 유전자를 삽입하는데 사용되는 벡터 pCPCH#PDC1 의 도식적 표현을 제공한다.
도 31 은 PDC2 유전자를 붕괴하고 내생성 말레이트 디히드로게나아제 유전자를 삽입하는데 사용되는 벡터 pCMDHN#PDC2 의 도식적 표현을 제공한다.
도 32 는 PDC4 유전자를 붕괴하고 모나스쿠스 루버를 위해 코돈 최적화된 리조푸스 오리재 (Rhizopus oryzae) 푸마라아제 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터 pCNATFUM#PDC4 의 도식적 표현을 제공한다.
도 33 은 코돈 최적화된 리조푸스 오리재 푸마라아제 유전자의 서열을 나타낸다.
도 34 는 모나스쿠스 루버를 위해 코돈 최적화된 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 로부터의 디카르복시산 담체 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터 pCBDAC 의 도식적 표현을 제공한다.
도 35 는 코돈 최적화된 스키조사카로마이세스 폼베 Mae-1 유전자의 서열을 나타낸다.
달리 정의되지 않으면, 과학기술용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 추가적인 안내의 수단으로서, 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 용어 정의들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대표 단수는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 대상체를 모두 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함함", "포함하다" 및 "를 포함하여 이루어지는" 는 "망라함", "망라하다" 또는 "함유함" 또는 "함유하다" 와 동의어이고, 포괄적 또는 비제약적이며, 추가적인, 언급되지 않은 구성원, 구성요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 특정 구성요소 또는 단계를 포함하는 것으로 구현예가 언급된다면, 이는 해당 구현예가 본질적으로 언급된 구성요소 또는 단계로 이루어진 것으로도 간주됨을 의미한다.
종점에 의한 수치 범위의 언급은 각 범위 내에 포함되어 있는 모든 수 및 분수들 뿐만 아니라 언급된 종점들도 포함한다.
파라미터, 양, 시간적인 기간 등과 같은 측정가능한 값들을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "약" 은 해당 변량이 개시된 발명에서의 수행에 적절하다면 특정된 값으로부터 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-1 내지 5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-1 % 이하, 더욱더 바람직하게는 +/-0.1 % 이하의 변화를 포함함을 의미한다. 수식어 "약" 이 언급되는 값이 그 자체로 특별히 그리고 바람직하게 개시됨이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 은 두 거대분자들 사이에서, 특히 상동 또는 상이한 분류군으로부터의 두 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이에서의 구조적 유사성을 의미하는데, 여기서 상기 유사성은 공유되는 계통에 기인하는 것이다. 따라서, 용어 "상동성" 은 상기 구조적 유사성을 가진 그러한 관계의 거대분자들임을 의미한다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 본원에 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 서열 일치성은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 최적으로 정렬시키고 (두 단백질 서열의 최적 정렬은 도입된 갭에 대한 임의의 페널티가 적은 페어-스코어의 합을 최대화하는 정렬이고; 바람직하게는 Wilbur 및 Lipman, 1983 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730) 의 정렬 방법을 이용하는 "Clustal" W 와 같은 알고리즘의 전산적인 수행에 의해 실시될 수 있다. 대안적인 방법은 Needleman 및 Wunsch 1970 (J Mol Biol 48: 443-453) 의 알고리즘을 이용하는 "Gap", 또는 Smith 및 Waterman 1981 (J Mol Biol 147: 195-197) 의 알고리즘을 이용하는, 예를 들어 Accelrys 사로부터의 GCG™ v. 11.1.2 패키지에서 이용가능한 바와 같은 "Bestfit" 을 포함한다) 및, 한편으로는 폴리펩티드가 동일한 아미노산 잔기를 포함하는 정렬 내의 위치 갯수 및 다른 한편으로는 두 폴리펩티드가 그들의 서열이 상이한 정렬 내의 위치 갯수를 스코어링하여 결정될 수 있다. 폴리펩티드가 해당 위치에 상이한 아미노산 잔기를 포함하는 경우 (아미노산 치환), 또는 폴리펩티드들 중 하나가 해당 위치에 아미노산 잔기를 포함하지만 나머지 폴리펩티드는 포함하지 않는 경우 또는 그 반대 경우 (아미노산 삽입 또는 결실) 에는 2 개의 폴리펩티드가 정렬 내 주어진 위치에서 그들의 서열이 상이한 것이다. 서열 일치성은 정렬 내 위치들의 총합계 대비 폴리펩티드가 동일한 아미노산 잔기를 포함하는 정렬 내 위치의 비율 (백분율) 로 산출된다. 특별한 구현예에서, 서열 정렬 및 서열 일치성의 결정을 위한 알고리즘은 본래 Altschul 등의 문헌 1990 (J Mol Biol 215: 403-10) 에 기재된 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), 더욱 특별하게는 Tatusova 및 Madden 의 문헌 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250) 에 기재된 "Blast 2 sequences" 알고리즘을 기반으로 한 것, 예컨대 그의 디폴트 셋팅을 이용한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "서열 유사성" 은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 최적으로 정렬 (상기 참조) 하고, 한편으로는 폴리펩티드가 동일 또는 유사한 (즉, 보존적으로 치환된) 아미노산 잔기를 포함하는 정렬 내 위치의 갯수를 스코어링하고, 다른 한편으로는 두 폴리펩티드가 그들의 서열에 있어서 상이한 정렬 내 위치들의 갯수를 스코어링하여 결정될 수 있다. 그밖에, 두 폴리펩티드는 그 폴리펩티드가 해당 위치에서 비보존적 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 폴리펩티드들 중 하나가 해당 위치에서 한 아미노산 잔기를 포함하고 나머지가 그것을 포함하지 않는 경우 또는 그 반대 경우 (아미노산 삽입 또는 결실) 정렬 내 주어진 위치에서 그들의 서열이 상이하다. 서열 유사성은 정렬 내 위치들의 총합 갯수 대비 폴리펩티드가 동일 또는 유사 아미노산 잔기를 포함하는 정렬 내 위치들의 비율 (백분율) 로 산출된다.
본원에 사용된 용어 "유기산" 은 산성 특성을 가진 유기 화합물을 지칭한다. 더욱 특별하게는 본 발명의 문맥에서 유기산 화합물은 락트산 (2-히드록시프로피온산), 숙신산, 퓨란디카르복실산, 푸마르산, 말레산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 아크릴산, 옥살산 및 글루칸산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 맥락에서 유기산 화합물은 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용어 "카르복실산" 은 하나 이상의 카르복실기가 존재함을 특징으로 하는 유기산을 지칭한다. 2 개 이상의 카르복실기가 있는 산이 또한 디카르복실산, 트리카르복실산 등으로 지칭된다. 카르복실산의 예시는 이에 제한됨없이 옥살산 및 말레산 및 숙신산을 포함한다. 본 출원에서 용어 "락트산" 은 유리된 산 또는 염 형태인 2-히드록시프로피온산을 지칭한다. 락트산의 염 형태는 칼슘 카르보네이트 또는 암모늄 히드록시드와 같은 중화제와 상관없이 "락테이트" 로 지칭한다. 본원에 언급된 바와 같이, 락트산은 락트산의 임의의 입체이성질체 형태 (L-락트산 또는 D-락트산) 를 지칭할 수 있다. 용어 락테이트는 락테이트의 임의의 입체이성질체 형태 (L-락테이트 또는 D-락테이트) 를 지칭할 수 있다. 락트산 제조를 언급할 때, 이는 락트산 또는 락테이트의 임의의 단일 입체이성질체 또는 락트산 또는 락테이트의 두 입체이성질체 모두의 혼합물의 제조를 포함한다. 본 발명의 재조합된 균류가 락트산 또는 락테이트의 단일 입체이성질체만을 골라서 제조하는 특별한 구현예에서, 제조되는 락트산 또는 락테이트 입체이성질체는 "키랄적으로 순수" 로 언급된다. 어구 "키랄적으로 순수" 는 락트산 또는 락테이트의 한가지 입체이성질체 형태가 나머지 입체이성질체 형태로 인해 검출가능하게 오염되지 않음을 의미한다 (특정 입체이성질체의 키랄 순도는 99.9% 이상 (또는 이를 초과하거나 또는 동등) 이다).
본 출원에서 용어 "숙신산" 은 자유 산 또는 염 형태의 부탄이산을 언급한다. 숙신산의 염 형태는 중화제에 상관없이 "숙시네이트" 로 언급된다. 본 출원에서 용어 "푸마르산" 은 자유 산 또는 염 형태의 트랜스-부탄이산을 언급한다. 푸마르산의 염 형태는 중화제에 상관없이 "푸마레이트" 로 언급된다.
본 발명에 따른 유기체는 낮은 pH 에서 유기산에 대해 매우 용인성인 것으로 나타났다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "높은 유기산 농도에 대해 용인성" 및 더욱 특별하게는 "높은 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산 농도에 대해 용인성" 은 50g/L 이상의 유기산, 또는 75 g/L 이상, 그러나 잠재적으로는 100 g/L 이상까지, 또는 심지어 150 g/L 이상, 예컨대 175 g/L 또는 200 g/L 까지의 유기산을 함유하는 배지에서 미생물이 성장할 수 있는 능력을 지칭한다. 특별한 구현예에서, 용어 "높은 유기산 농도" 는 유기산의 포화 용액을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "낮은 pH" 는 2.0 내지 5.0, 예컨대 4.0 미만, 더욱 특별하게는 3.0 미만, 더욱더 특별하게는 2.8 이하의 pH 를 지칭한다.
당업자라면, 낮은 pH 의 유기산에 대한 용인성을 언급할 때, 유기산의 pKa 값에 해당하거나 또는 그보다 더 낮은 pH, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 값보다 1.5 단위 더 높은 값 내지 1.5 단위 더 낮은 값의 pH 의 유기산을 용인하는 능력을 특별히 언급할 수 있음을 이해할 것이다. 유기산이 2 개의 pKa 값을 갖는 경우 (2 개의 산성기가 존재함으로 인함), 적절한 pKa 는 최저 pKa 값이다.
본원에 사용된 "락테이트 디히드로게나아제 활성" 은 피루베이트의 락테이트로의 반응을 촉매하는 단백질의 능력을 지칭한다. 락테이트 디히드로게나아제 효소에는 (이에 제한됨없이) Enzyme Commission 번호 EC 1.1.1.27 및 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소가 포함된다.
숙주 유기체, 미생물 또는 세포를 언급할 때 사용되는 용어 "재조합된" 또는 "유전자적으로 개질된" 은 핵산 분자가 도입되거나, 다른 방식으로 유전자적으로 개질되어 있는 그러한 숙주 유기체, 미생물 또는 세포 뿐만 아니라 그러한 숙주 유기체, 미생물 또는 세포의 재조합된 자손들을 포함한다. 여기에는 내생적 유전자 서열이 게놈 내 그의 본래 위치 이외의 위치에 도입되어 있는 유기체 및 내생적 유전자 서열이 개질되거나 또는 결실되어 있는 유기체의 두가지 모두가 포함된다.
숙주 유기체, 미생물 또는 세포에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "재조합체" 는 상기 유기체, 미생물 또는 세포에는 본래 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 여기에는 상기 유기체, 미생물 또는 세포에 대해 외래성인 뉴클레오티드 서열 및 게놈 내 그의 본래 위치 이외의 위치에 도입되어 있고, 내생적 유전자 서열이 개질되어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 특별한 구현예에서 재조합된 유전자의 존재에 대한 언급은 숙주 내에서 상기 유전자의 과발현, 즉 상기 숙주의 유전자 개질의 결과로서 숙주 내에서 상기 유전자의 증가된 발현을 의미한다.
용어 "형질전환" 은 재조합된 핵산과 같은 외래 핵산의 숙주 유기체, 미생물 또는 세포로의 도입 또는 이동을 포함한다. 그렇게 도입된 핵산 또는 결과로 수득한 내생적 핵산의 결실은 바람직하게는 상기 숙주 유기체, 미생물 또는 세포의 추가적인 생장 및 세포 분열 내내 유지된다. 예컨대 이에 제한됨 없이 전자천공, 전자충만, 화학물 형질전환, 리포펙션, 바이러스- 또는 박테리아파지-매개 트랜스펙션 등과 같은 임의의 통상적인 유전자 이동 또는 유전자 개질 방법이 형질전환 수행에 이용될 수 있다. 본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "유전자" 는 코딩 서열, 프로모터 및 숙주 세포에서의 발현에 필요한 임의의 여타 조절 영역을 포함하는 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터" 는 전사 개시 부위 50 bp 상류 이내에 위치하고, 구조 유전자의 전사 시작을 조절하는 비번역 서열을 지칭한다. 일반적으로, 이는 구조 유전자의 전사 개시 코돈에 대해 약 1 내지 1000 bp, 바람직하게는 1 내지 500 bp, 특히 1 내지 100 bp 상류에 (즉, 5') 위치한다. 유사하게, 용어 "터미네이터" 는 구조 유전자의 번역 정지 코돈에 대해 (일반적으로 약 1 내지 1,000 bp, 더욱 일반적으로는 1 내지 500 bp, 특히 1 내지 100 bp 내에) 하류방향에 (즉, 3') 위치하고, 구조 유전자의 전사 종결을 조절하는 비번역 서열을 지칭한다. 프로모터 또는 터미네이터는 구조 유전자의 위치에 대해 게놈 내 그의 위치가 프로모터 또는 터미네이터가 각 경우에 맞도록 그의 전사 조절 기능을 수행하게끔 존재하는 경우 구조 유전자에 대해 "작동적으로 연결" 되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성" 또는 "외인성" 은 고려 중인 유전자 또는 코딩 서열이 숙주에 대해 태생성 (native) 또는 내생성 (endogeneous) 이 아닌 사실을 지칭한다.
용어 "태생성" 또는 "내생성" 은 본원에서 숙주 균주의 야생형 세포의 게놈 내에서 (기능에 영향을 주지 않는 개별-대-개별 돌연변이와는 별개로) 발견되는 유전자 물질 (예를 들어, 유전자, 프로모터 또는 터미네이터) 과 관련하여 사용된다.
"인코딩" 은 핵산 서열 또는 그의 일부분(들)이 의문대상인 유기체의 유전자 코드에 비추어 특별한 아미노산 서열, 예를 들어 원하는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열에 대응함을 의미한다. 예시로, 특별한 폴리펩티드 또는 단백질을 "인코딩" 하는 핵산은 게놈, hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, 재조합 또는 합성 핵산을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 특별한 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 해독틀 (ORF) 를 포함할 수 있다. "오픈 해독틀" 또는 "ORF" 는 자체로 공지된 번역 개시 코돈으로 시작하고, 번역 종결 코돈으로 종결되는 코딩 뉴클레오티드 트리플렛 (코돈) 의 연쇄물로, 틀 내에 번역 종결 코돈을 전혀 포함하지 않고, 잠재적으로 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 것을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 당업계에서 사용되는 "코딩 서열" 과 동의어일 수 있다.
본 발명에 따른 모나스쿠스 미생물은 낮은 pH 에서 높은 유기산 농도에 대한 탁월한 용인성을 갖고 있다. 더욱 특별하게는, 이들은 유기산의 (최소) pKa 값보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 유기산에 용인성이다. 특별한 구현예에서, 미생물들은 모든 유기산에 대해 용인성이다. 가장 특별하게는, 이들은 낮은 pH 에서 높은 농도의 카르복실 유기산에 대해 용인성이다.
본 발명에 따른 미생물의 유기산에 대한 용인성은 이들로 하여금, 이에 제한됨 없이 예컨대 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산과 같은 유기산의 공업적 제조에 사용하기에 특히 적합하도록 해 준다. 공업적 설정에서 실시할 때 제조 동안 극히 높은 농도가 유지되지 않도록 관심대상의 유기산이 추출될 수 있긴 하지만, 그럼에도 불구하고 유기산에 대한 균주의 용인성은 유리할 것이다. 더욱 특별하게는, 균주를 관심 대상의 유기산의 (최저) pKa 값보다 1.5 미만 만큼 더 높은 pH 값에서 균주를 유지할 수 있음이 관심대상이고, 가장 특별하게는 미생물이 관심대상의 유기산의 (최저) pKa 값 미만의 pH 에서 유기산에 용인성인 것에 관심이 있다. 유기산의 pKa 값은 약 3.5 내지 6 사이에서 가변적이다. 예시 유기산, 그들의 pKa 값 및 유기산의 공업적 제조를 위해 유기체가 바람직하게 생장하는 해당 pH 범위의 비제한적 목록이 표 1 에 제공되어 있다.
표 1: 예시 유기산
본 발명에 따른 유기체는 낮은 pH 에서 일정 범위의 유기산에 대해 용인성인 것으로 나타났다. 특별한 구현예에서, 이들은 유기산의 (최저) pKa 값보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 카르복실산에 대해 용인성이다. 특별한 구현예에서, 이중 결합된 CH2 기를 포함하지 않는 유기산에 대한 용인성이 증가된다. 추가의 특별한 구현예에서, 미생물들은 관련 유기산의 pKa 값보다 더 낮은 pH 에서 유기산에 대해 용인성이다. 더욱 특별하게는, 본 발명의 미생물은 3 미만의 pH 에서 락트산에 대한 예외적인 용인성을 갖고 있다.
나아가, 본 발명에 따른 유기체가 유기산의 제조를 보장하기 위해 조작될 수 있다는 점이 발견되었다. 더욱 특별하게는, 이들이 단순당을 유기산으로 높은 수율로 발효시키도록 조작될 수 있다. 특별한 구현예에서, 이들 유기체들이 혐기성 또는 유사-혐기성 조건 하에 배양될 수 있다는 사실은 공업적인 제조 방법의 맥락에서 추가적인 장점을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물은 모나스쿠스 속의 종들이다. 놀랍게도 낮은 pH 에서 고농도의 유기산에 대해 용인성인 모나스쿠스 균주들이 발견되었다. 일반적으로, 미생물들은 모나스쿠스 알비둘루스 (Monascus albidulus), 모나스쿠스 아르젠티넨시스 (Monascus argentinensis), 모나스쿠스 아루란티아쿠스 (Monascus aurantiacus), 모나스쿠스 바커리 (Monascus barkery), 모나스쿠스 비스포러스 (Monascus bisporus), 모나스쿠스 에레모필루스 (Monascus eremophilus), 모나스쿠스 플로리다누스 (Monascus floridanus), 모나스쿠스 풀리지노수스 (Monascus fuliginosus), 모나스쿠스 푸메우스 (Monascus fumeus), 모나스쿠스 카올리앙 (Monascus kaoliang), 모나스쿠스 루니스포라스 (Monascus lunisporas), 모나스쿠스 뮤코로이데스 (Monascus mucoroides), 모나스쿠스 올레이 (Monascus olei), 모나스쿠스 팔렌스 (Monascus pallens), 모나스쿠스 팍시이 (Monascus paxii), 모나스쿠스 필로수스 (Monascus pilosus), 모나스쿠스 푸비게루스 (Monascus pubigerus), 모나스쿠스 푸르푸레우스 (Monascus purpureus), 모나스쿠스 루버 (Monascus ruber), 모나스쿠스 루브로펑타투스 (Monascus rubropunctatus), 모나스쿠스 루틸루스 (Monascus rutilus), 모나스쿠스 상귀네우스 (Monascus sanguineus), 모나스쿠스 세로루베스센스 (Monascus serorubescens) 및 모나스쿠스 비트레우스 (Monascus vitreus) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 종들 중의 균주를 나타낸다. 본 발명의 특별한 구현예에서, 본 발명의 미생물들은 모나스쿠스 루버 종의 균주이다.
본 발명에 따른 예시 균주는 본원에서 LF4, LF5 및 LF6 로도 지칭하는데, 네덜란드에 있는 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) 에 기탁되었으며, 각각 수탁 번호 CBS 127564, CBS 127565 및 CBS 127566 를 부여받았다.
특별한 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 모나스쿠스 계통의 미생물에 관한 것이고, 이는 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합과 같은 단순당으로부터 유기산 수율, 더욱 특별하게는 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산과 같은 유기산의 제조를 개선시키도록 유전자적으로 조작된다. 이는 상호 배제적인 것이 아닌 상이한 방법들로 달성될 수 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 고려되는 유전자 조작 기법은 관심대상의 유기산 생산에 관여되는 효소를 인코딩하는 (외인성) 유전자의 발현으로 유기산 생산을 증가시키는 것을 목적으로 한다.
특별한 구현예에서, 관심대상의 유기산은 락트산이다. 더욱 특별하게는, (외인성) 락테이트 디히드로게나아제 유전자의 과발현이 고려된다. 락테이트 디히드로게나아제는 당의 락트산으로의 변환에서의 최종 단계를 촉매함으로써, 피루베이트를 락테이트로 변환시킨다. 따라서, LDH 유전자의 증대된 발현 및/또는 활성이 락트산 수율의 증가를 보장하게 된다. 따라서, 특별한 구현예에서, 본 발명은 그의 게놈에 통합되어 있는 하나 이상의 기능성 락테이트 디히드로게나아제 (LDH) 유전자를 포함하는 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주를 제공한다. 특별한 구현예에서, LDH 유전자는 이종성 또는 외인성 LDH 코딩 서열을 포함한다.
외인성 LDH 유전자의 도입으로 인해 개질된 모나스쿠스 균주가 증가된 양의 L- 및/또는 D- 락트산 입체이성질체를 제공할 수 있게 된다. 본 발명의 특정한 특별한 구현예에 따르면, 모나스쿠스 계통의 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 미생물이 하나 이상의 외인성 L-LDH 유전자를 포함 (또는 독보적으로 함유) 하고 (외인성 D-LDH 유전자는 포함하지 않음), 이로써 유기체는 광학적으로 또는 키랄적으로 순수한 L-락트산을 제공한다. 대안적으로, 키랄적으로 순수한 D-락트산이 외인성 D-LDH 유전자의 도입에 의해 고려대상이 될 수 있다. 본 발명의 특이적 구현예에서, 모나스쿠스 계통의 본 발명의 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 유기체가 하나 이상의 외인성 L-LDH 코딩 서열 및 하나 이상의 외인성 D-LDH 코딩 서열을 포함하여, 재조합된 균주가 L- 및 D-락트산의 라세미 혼합물을 제공한다.
본 발명의 맥락에서 사용된 외인성 LDH 유전자는 락테이트 디히드로게나아제 효소 또는 그의 활성 절편, 즉 락테이트 디히드로게나아제 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 특별한 구현예에서, 외인성 LDH 유전자 또는 코딩 서열은 모나스쿠스에서 개선된 발현을 위해 유전자적으로 개질된 (예를 들어, 코돈이 변경됨) 또다른 유기체로부터 유도되는 유전자 또는 코딩 서열이다.
본 발명의 맥락에서, 적합한 LDH 유전자에는 박테리아, 균류, 효모 또는 포유류 공급원으로부터 수득되는 것이 포함된다. 특이적인 L-LDH 유전자의 예시는 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 이젤 (L. easel), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 페디오코코스 아시딜락티시 (Pediococcus acidilactici), 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae) 및 소 또는 돼지와 같은 포유류 공급원으로부터 수득되는 것이다. 특히, 소 (Bos taurus) 이다. 구체적인 D-LDH 유전자의 예시는 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 존슨니이 (L. johnsonii), 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus), 락토바실러스 델브루엑키이 (L. delbrueckii), 락토바실러스 플란타룸 (L. plantarum), 락토바실러스 펜토수스 (L. pentosus) 및 페디오코코스 아시딜락티시로부터 수득되는 것이다. 아미노산 수준에서 상기 유전자들에서 코딩 서열에 70% 이상 일치성 스코어를 갖고, 기능성 단백질을 인코딩하는 기능성 코딩 서열이 적합하다. 임의의 상기 공급원들로부터 수득되는 태생적 유전자가 필요한 경우 또는 다른 목적으로 돌연변이유발에 적용되어 일반적인 진핵성 개시 코돈 (ATG) 으로 출발하는 코딩 서열을 제공할 수 있다. 특별한 구현예에 따르면, L-LDH 유전자는 락토바실러스 헬베티쿠스로부터 수득된 것이거나, 또는 그와 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 일치성을 가진 것이다. 추가적인 특이적인 구현예에 따르면, L-LDH 유전자는 바실러스 메가테리움으로부터 수득된 것이거나, 또는 그 유전자에 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 일치성 스코어를 갖는 것이다. 추가의 특정한 특별한 구현예에 따르면, L-LDH 유전자는 소로부터 수득된 것이거나, 또는 그 유전자에 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 일치성 스코어를 갖는 것이다. 특별한 구현예에서, D-LDH 유전자는 락토바실러스 헥베티쿠스로부터 수득되는 것이거나, 또는 그 유전자와 80%, 85%, 90% 이상, 또는 특별하게는 95% 이상 일치성 스코어를 가진 것으로부터 수득된다.
특히 적합한 LDH 코딩 서열에는 SEQ ID NO: 1 로 식별되는 서열과 80%, 85% 또는 95% 이상의 일치성 스코어를 가진 아미노산 서열을 가진 효소를 인코딩하는 것이 포함된다. 특히 적합한 LDH 유전자는 또한 SEQ ID NO: 1 로 인코딩되는 단백질 서열에 대해 80%, 85% 또는 95% 이상의 일치성 스코어를 가진 단백질 서열을 가진 기능성 효소를 인코딩하는 것을 포함하고; 특별한 구현예에서 적합한 LDH 유전자는 SEQ ID NO: 1 의 서열에 80%, 85% 또는 95% 이상의 일치성 스코어를 갖거나 또는 SEQ ID NO: 1 에 일치하는 서열을 가진 기능성 효소를 인코딩하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주는 관심대상의 유기산 생산에 관여되는 효소를 인코딩하는 단일 외인성 유전자 또는 다중 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 재조합된 균주는 단일 외인성 LDH 유전자 또는 다중 외인성 LDH 유전자, 예컨대 1 내지 10 개의 외인성 LDH 유전자, 특히 1 내지 5 개의 외인성 LDH 유전자를 포함할 수 있다. 형질전환된 균주가 다중 외인성 LDH 유전자를 포함하는 경우, 개별 유전자는 동일 유전자의 카피일 수 있거나, 또는 두가지 이상의 상이한 LDH 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH 유전자의 다중 카피는 단일 좌에 통합될 수 있거나 (이에 이들은 서로 근접하게 됨), 또는 숙주 균주의 게놈 내의 여러 좌에 통합될 수 있다.
특별한 구현예에서, 관심대상의 유기산은 숙신산 및/또는 푸마르산이다. 더욱 특별하게는, (외래) 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제, 피루베이트 카르복실라아제, 말레이트 디히드로게나아제, 푸마라아제 및/또는 푸마레이트 리덕타아제로부터 선택되는 하나 이상 유전자의 과발현 및/또는 말산 효소의 과발현이 고려된다. 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제는 글루코스신합성의 대사 경로에서 사용되는 리아제 패밀리의 효소이다. 그것은 옥살로아세테이트를 포스포에놀피루베이트 및 이산화탄소로 변환시킨다. 대부분의 글루코스신합성 반응은 해당 효소를 반대 방향으로 사용하지만, 피루베이트 키나아제 효소는 비가역적이다.
본 발명의 특별한 구현예에 따르면, PEP 카르복시키나아제는 발효가능한 탄소 공급원 또는 글리세롤의 존재시 혐기성 또는 산소 제한 조건 하에 활성이다. 발효가능한 탄소 공급원은 글루코스, 프룩토오스, 갈락토오스, 라피노오스, 아라비노오스, 또는 자일로스일 수 있다. PEP 로부터 OAA 로의 변환을 촉진하는 PEP 카르복시키나아제가 CO2 를 고정시키고 에너지를 ATP 형태로 생성하므로, 모나스쿠스가 본 발명에 따른 PEP 카르복시키나아제를 포함하는 것이 유리하다는 것이 밝혀졌다. 특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 유기산 용인성 모나스쿠스 균주는 PEP 카르복시키나아제 활성을 갖는 효소를 포함하고, 이 경우 상기 효소는 이종성 효소이고, 바람직하게는 이종성 효소는 박테리움에서 유래하고, 더욱 바람직하게는 PEP 카르복시키나아제 활성을 갖는 효소는 대장균 (Escherichia coli), 만헤이미아 종 (Mannheimia sp.), 악티노바실루스 종 (Actinobacillus sp.), 또는 혐기성-스피릴룸 종 (spirillum sp.), 더욱 바람직하게는 만헤이미아 숙시니시프로듀센 (Mannheimia succiniproducens), 악티노바실루스 숙시노겐, 또는 아내로바이오스피릴룸 숙시니시프로듀센 (Anaerobiospirillum succiniproducens) 에서 유래한다.
PEP 카르복시키나아제 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 유사하게 또는 그에 더하여, 본 발명에 따른 미생물은 푸마르산 및/또는 숙신산을 향하는 증가된 플럭스 (flux) 를 초래하는 미생물 내의 반응을 촉진하는 동종유래 및/또는 이종성 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 추가로 유전자 개질 또는 형질전환될 수 있다.
더욱더 특별한 구현예에서, 숙신 및/또는 푸마르산의 합성에 관여되는 내생성 효소가 과발현된다. 효소 피루베이트 카르복실라아제 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 피루베이트 키나아제의 작용을 효과적으로 역전시키는 대안적 경로를 제공한다. 이들 유전자의 증가된 발현 및/또는 활성은 따라서 숙신산 수율의 증가를 보장한다. 더욱 특별하게는, 본 발명자들은 OAA 로부터 말산으로의 변환을 촉진하는 피루베이트 카르복실라아제 및 말레이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 내생성 모나스쿠스 서열을 동정했다. 따라서 특별한 구현예에서, 발명에 따른 모나스쿠스 균주는 각각 SEQ ID NO: 7 및 8 에 의해 인코딩되는 피루베이트 디카르복실라아제 및 말레이트 디히드로게나아제를 과발현한다.
말산 효소는 피루베이트의 말레이트를 통한 숙신산으로의 변환을 촉진한다; 푸마레이트 리덕타아제는 푸마르산을 숙신산으로 변환시킨다; 푸마라아제는 말산의 푸마르산으로의 변환을 촉진한다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 내생성 또는 외인성 유전자의 도입은 개질된 모나스쿠스 균주가 증가된 양의 숙신 및/또는 푸마르산을 생산할 수 있게 한다.
기타 유기산의 생산에 요구되는 추가의 효소가 통상의 기술자에게 알려져 있다.
관심의 효소를 인코딩하는 재조합된 코딩 서열은 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 터미네이터 (둘다 개질된 균류 세포 내에서 기능적임) 의 전사 제어 하에 놓여진다.
프로모터 및 터미네이터 서열은 모나스쿠스 숙주 균주에 태생적이거나 또는 세포에 외인성일 수 있다. 유용한 프로모터 및 터미네이터 서열에는, 특히 외인성 유전자의 삽입이 균주 게놈의 특이적 부위에서 표적화되는 경우, 숙주 균주에 태생적인 프로모터 및 터미네이터의 기능적 부분과 비교해 그의 기능적 부분에서 각각 매우 일치하는 (즉, 90% 이상, 특히 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 일치성 스코어를 가짐) 것을 포함한다.
특별한 구현예에서, 프로모터가 균류 유전자에 태생적인 프로모터에 대해 90%, 95% 또는 99% 이상의 일치성 스코어를 갖는다. 더욱 특별하게는, 프로모터는 모나스쿠스 숙주 균주에 태생적인 유전자에 대해 프로모터와 비교시 90%, 95% 또는 99% 이상의 일치성 스코어를 갖는다. 특별한 구현예에서, 터미네이터가 균류에 태생적인 유전자에 대해 터미네이터와 비교시 90%, 95% 또는 99% 이상의 일치성 스코어를 갖는다. 터미네이터는 모나스쿠스 숙주 균주에 태생적인 유전자에 대해 터미네이터와 90%, 95% 또는 99% 이상의 일치성 스코어를 가질 수 있다. (숙주 균주에 대해) 태생적 프로모터 및 터미네이터의 이용은 그의 각각의 상류 및 하류 측면 영역과 함께 재조합된 유전자의 숙주 균주 게놈의 특이적 좌로의 표적화된 통합 및 재조합된 유전자 및 또다른 태생적 유전자의 결실의 동시적인 통합을 가능케 할 수 있다. LDH 코딩 서열과 같은 상이한 외인성 코딩 서열을 상이한 유형의 프로모터 및/또는 터미네이터의 제어 하에 위치시킬 수 있다.
재조합된 유전자는 숙주 균주의 게놈에 무작위로 통합될 수 있거나, 또는 하나 이상의 표적화된 위치에 삽입될 수 있다. 표적화된 위치의 예시에는 바람직하게 결실 또는 붕괴된 유전자의 좌를 포함한다.
본 발명의 발명자들은 추가로 숙주에 내생성인 대사물의 생산을 제한하고/하거나 관심대상의 유기산의 내생적 소모를 줄여 본 발명에 따른 모나스쿠스 계통의 미생물에서 유기산 생산을 증가시키는 것을 고려한다. 확실히, 이는 숙주에 의한 물질 및 에너지의 낭비를 막을 뿐 아니라, 숙주로 하여금 재조합된 유전자의 도입에 의해 창출된 관심대상의 효소의 생산 경로에 완전히 의존하도록 만든다.
모나스쿠스와 같은 균류에서, 락트산은 산소의 존재 하에 소모된다. 이는 시토크롬 의존성 락테이트 디히드로게나아제에 의해 보장된다. 따라서, 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 특별한 구현예에 따르면, 미생물은 락트산의 내생적 소모를 감소시키기 위해 개질된다. 더욱 특별하게는, 이는 내생성 LDH 유전자의 발현을 감소시켜 보장된다. 이는 호기성 조건 하에 락트산 수율을 증가시킨다.
따라서, 특별한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물이 하나 이상의 불활성화된 내생성 시토크롬-의존성 LDH 유전자를 갖는다. 본 발명의 발명자들은 모나스쿠스 루버 유래의 내생성 LDH 유전자를 동정 및 특징분석했다. 특별한 구현예에서, 내생성 LDH 는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6 의 코딩 서열을 포함한다. 본원 하기에 상세히 기재된 바와 같이, 모나스쿠스 루버의 내생성 LDH 유전자의 코딩, 논-코딩 및/또는 조절 서열로부터 유도되는 뉴클레오티드 서열이 모나스쿠스에서의 LDH 의 발현 방지 또는 감소에 이용될 수 있다.
추가로 특별한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 사용된 유전자 조작 기법은 관심대상의 유기산 이외의 대사물의 내생적 생산 감소를 목표로 한다. 더욱 특별하게는, 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산 이외의 대사물, 예컨대 에탄올의 생산에 관여되는 효소 활성이 불활성화되거나 또는 억제된 것을 특징으로 하는 재조합된 미생물이 제공된다.
본 문맥에서, "불활성화하다" 는 유전자의 코딩 영역 전부 또는 일부가 제거되거나 (결실), 또는 유전자 또는 그의 프로모터 및/또는 터미네이터 영역이 개질되어 (예컨대, 결실, 삽입 또는 돌연변이에 의함), 해당 유전자가 더이상 활성 효소를 제공하지 않거나 또는 심하게 감소된 활성을 가진 효소를 제공함을 의미한다. 불활성화는 추가로 예컨대 안티센스, 삼중나선 및 리보자입 접근과 같은 당업자에게 공지된 모든 것에 의한 침묵 (silencing) 을 포함한다.
특별한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 유전자적으로 개질되거나 또는 재조합된 모나스쿠스 균주가 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를, 더욱 특별하게는 에탄올 제공 경로에 관여되는 효소를 인코딩하는 내생성 유전자 중에 포함한다. 그러한 구현예에서, 하나 이상의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화는 예를 들어 에탄올 제공 경로 또는 숙주 균주에서 관심대상의 유기산 이외의 대사물 생산에 관여되는 효소를 인코딩하는 내생성 유전자, 예컨대 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 푸마레이트 리덕타아제, 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드 디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh), 락테이트 2-모노옥시게나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자들의 임의의 조합에서 있을 수 있다. 더욱 특별한 구현예에서, 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc) 를 인코딩하는 내생성 유전자 중에 있을 수 있다. 피루베이트 디카르복실라아제는 알코올 경로에서 첫번째 단계를 촉매한다. 따라서, 실질적으로 감소된 피루베이트 디카르복실라아제 (PDC) 활성을 가진 미생물이 특히 고려된다. 용어 "감소된 피루베이트 디카르복실라아제 활성" 은 세포에서의 효소 농도 감소 (발현에 영향을 주는 하나 이상의 유전자 개질의 결과임) 및/또는 효소의 특이적 촉매 활성의 감소 또는 소실 (활성에 영향을 주는 하나 이상의 유전자 개질의 결과임) 을 의미한다.
특별한 구현예에서, 본 발명은 피루베이트 디카르복실라아제 활성이 영에 접근하거나, 또는 야생형 균주에서의 정상 피루베이트 디카르복실라아제 활성에 비해 감소되어 있는 모나스쿠스 계통의 미생물을 제공한다. 따라서, 특별한 구현예에서 본 발명의 균주에서의 피루베이트 디카르복실라아제 활성은 예를 들어 야생형 균주에서 검출가능한 피루베이트 디카르복실라아제 활성보다 60% 이상 더, 바람직하게는 80% 이상 더, 더욱더 바람직하게는 90% 이상 더 낮다.
본 발명의 특별한 구현예에 따르면, 해당 균주에 의한 에탄올 제공이 영에 가깝거나 또는 적어도 야생형 균주에서의 배경 에탄올 제공에 비해 감소되는 특징을 가진 균주가 제공된다. 따라서, 특별한 구현예에서, 본 발명의 균주에서의 에탄올 제공이 예를 들어 상응하는 야생형 균주에서의 에탄올 제공보다 60% 이상 더, 바람직하게는 80% 이상 더, 더욱더 바람직하게는 90% 이상 더 낮다.
따라서, 본 발명의 특별한 구현예에 따르면, 상기 유기산이 락트산이고, 하기 중 하나 이상을 포함하는 미생물이 제공된다:
a) LDH 를 인코딩하는 재조합된 유전자; 및
b) 내생성 락트산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 락트산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화. 더욱 특별하게는, 상기 미생물은 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 푸마레이트 리덕타아제, 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드디히드로게나아제, , 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합 내에 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함한다. 그리고 더욱 특별하게는, 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh) 및/또는 L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh) 를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함한다.
본 발명의 또다른 특별한 구현예에 따르면, 상기 유기산은 숙신산 및/또는 푸마르산이고, 하기 중 하나 이상을 포함하는 미생물이 제공된다:
a) 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제, 말레이트 디히드로게나아제, 푸마라아제 및/또는 푸마레이트 리덕타아제를 인코딩하는 재조합된 유전자 및/또는 글리옥실레이트 주기의 효소 예컨대 이소시트레이트 리아제 및 말레이트 합성효소를 인코딩하는 하나 이상의 재조합된 유전자; 및
b) 내생성 숙신산 및/또는 푸마르산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 숙신산 및/또는 푸마르산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화. 더욱 특별하게는, 상기 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh), 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제, 이소시트레이트 디히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합 내에 있다. 더욱 특별하게는 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 알코올 디히드로게나아제 (adh), 이소시트레이트 디히드로게나아제 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 있다.
특별하게는, 본 발명에 따른 미생물은 알코올 디히드로게나아제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자가 기능적이 아닌 미생물이다. 기능적이 아닌 알코올 디히드로게나아제 유전자는 본원에서 알코올 디히드로게나아제를 인코딩하는 모든 유전자가 기능적인 미생물과 비교시 감소된 알코올 디히드로게나아제 활성을 포함하는 미생물을 기술할 때 사용된다. 유전자는 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 돌연변이, 붕괴, 또는 결실에 의해 기능적이 아니게 될 수 있다. 특별하게는, 미생물은 알코올 디히드로게나아제를 인코딩하는, 하나 이상 유전자 adhl 및/또는 adh2 가 불활성화된 균류 예컨대 모나스쿠스이다.
특별하게는, 본 발명에 따른 미생물은 기능적이 아닌 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 기능적이 아닌 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제 유전자는 본원에서, 예를 들어 미생물과 비교시 감소된 글리세롤 형성을 초래하는, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 유전자의 돌연변이, 붕괴, 또는 결실에 의해, 감소된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제 활성을 포함하는 미생물을 기술할 때 사용된다. 놀랍게도, 감소된 알코올 디히드로게나아제 활성 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제 활성을 포함하는 미생물이 증가된 숙신산 생산을 초래한다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 더욱더 특별한 구현예에 따르면, 상기 유기산은 숙신산이고, 숙시네이트 디히드로게나아제 및/또는 푸마레이트 리덕타아제를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 미생물이 제공된다. 특별한 구현예에서 본 발명에 따른 재조합된 미생물은 기능적이 아닌 숙시네이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 기능적이 아닌 숙시네이트 디히드로게나아제는 본원에서 야생형 세포와 비교시 증가된 숙신산 형성을 초래하는, 숙시네이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 붕괴, 또는 결실에 의한, 감소된 숙시네이트 디히드로게나아제 활성을 포함하는 미생물을 기술할 때 사용된다.
특별한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 유전자적으로 개질된 모나스쿠스 균주가 오탄당 소모, 더욱 특별하게는 자일로스 소모를 개선하기 위해 개질된다. 이는 상이한 방법들로 달성될 수 있다. 특별한 구현예에서, 이는 유기체에 자일로스 이소머라제를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하여 달성된다. 그러한 핵산은 상이한 기원, 더욱 특별하게는 원핵생물, 가장 특별하게는 호기성 균류 유래일 수 있다. 특별한 구현예에서, 자일로스 이소머라제는 피로마이세스 속 (Pyromyces sp.), 클로스트리디움 (Clostridium) 또는 푸소박테리움 (Fusobacterium) 또는 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 또는 실라마이세스 (Cyllamyces) 로부터 기원한다. 적합한 자일로스 이소머라제의 예시는 당업계에 공지되어 있고, 이에 제한됨없이 피로마이세스 속 유래의 자일로스 이소머라제를 포함한다. 발현되는 경우, 자일로스 이소머라제를 인코딩하는 서열은 모나스쿠스에게 자일로스를 자일룰로스로 변환시키는 능력을 부여하며, 상기 자일룰로스는 관심대상의 유기산 제공에서 모나스쿠스에 의해 추가로 대사될 수 있다. 따라서, 모나스쿠스는 탄소 공급원으로서의 자일로스 상에서 성장할 수 있고, 더욱 특별하게는 자일로스를 탄소 공급원으로 하거나, 특별한 구현예에서 자일로스를 유일한 탄소 공급원으로 하여 관심대상의 유기산을 제공할 수 있다.
추가의 특별한 구현예에서, 재조합된 모나스쿠스 균주는 유기체에 자일로스 리덕타아제 및/또는 자일리톨 디히드로게나아제를 인코딩하는 핵산 서열을 도입함으로써 개질된다. 그러한 핵산은 상이한 기원, 더욱 특별하게는 진핵생물, 가장 특별하게는 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis) 기원의 것일 수 있다. 발현되는 경우, 자일로스 리덕타아제를 인코딩하는 서열은 모나스쿠스에게 자일루로스 유래의 유기산을 제공할 수 있는 능력을 부여한다.
숙주 균주의 유전자 개질은 적절한 벡터의 고안 및 구축 및 그러한 벡터를 가진 숙주 균주의 형질전환을 통해 하나 이상의 단계에서 달성된다. 전기영동 및/또는 화학물 (예컨대, 칼슘 클로라이드- 또는 리튬 아세테이트-기재) 형질전환 방법 또는 당업계에 공지된 아그로바데리움 투메파시엔스 (Agrobaderium tumefaciens)-중재 형질전환 방법이 이용될 수 있다. 벡터는 특별한 제한 효소로 절단되거나 또는 원형 DNA 로서 사용될 수 있다. 숙주 균주의 유전자 개질에 사용되는 벡터는 숙주 균주의 게놈에 통합할 수 있는 한 임의의 벡터일 수 있다. 본 발명의 벡터는 선별된 숙주 균주에서 클로닝 벡터로 또는 발현 벡터로 작동가능하다. 수많은 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 적합한 벡터의 선발은 선택하기 나름이다. 벡터는 예를 들어 pUR5750 형질전환 벡터, pCGHT3 형질전환 벡터 등일 수 있다.
일반적으로, 관심대상의 코딩 서열 및 관련된 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함하는 벡터가 준비된다. 벡터는 선형화 또는 분절화를 위한 다양한 유형의 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 벡터는 추가로 백본 부분 (예컨대, 대장균에서의 증식을 위함) 을 포함할 수 있고, 이들 중 다수는 시판하여 입수가능한 효모 또는 박테리아 벡터로부터 편리하게 수득된다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별 마커 유전자 카셋트를 포함한다. "선별 마커 유전자" 는 선별 배양 배지에서 형질전환된 세포의 생존 및/또는 생장에 필요한 단백질을 인코딩하는 것이다. 전형적인 선별 마커 유전자는, (a) 제오신 (스트렙토알로테이쿠스 힌두스타누스 (Streptoalloteichus hindustanus) 유래의 sh ble 유전자), 게네티신, 멜라비아제 (MEL5), 히그로마이신 (대장균 유래의 아미노글리코시드 항생제 내성 유전자), 앰피실린, 테트라싸이클린 또는 카나마이신 (Tn903 의 카나마이신 내성 유전자) 과 같은 항생제 또는 여타 독소에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하는 단백질을 인코딩한다. 영양요구성 결핍의 두가지 대표적인 예시는 아미노산 류신 결핍 (예를 들어, LEU2 유전자) 또는 우라실 결핍 (예를 들어, URA3 유전자) 이다. 오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라아제 네거티브 (ura3-) 인 세포는 우라실이 없는 배지에서는 생장하지 못한다. 따라서, 기능성 UBA3 유전자는 우라실 결핍을 가진 세포 상에서 마커로 이용될 수 있고, 성공적인 형질전환체는 우라실이 결핍된 배지 상에서 선별될 수 있다. 기능성 URA3 유전자로 형질전환된 세포들만 그 배지에서 우라실을 합성할 수 있고, 생장할 수 있다. 야생형 균주가 우라실 결핍을 갖고 있지 않는다면 (예를 들어, 아이리스 오리엔탈리스 (I. orientalis) 의 경우), URA3 을 균주용 선별 마커로 URA3 을 사용하기 위해서는 결핍이 있는 영양요구성 돌연변이를 만들어야만 한다. 그것을 달성하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
바람직한 선별 마커는 제오신 내성 유전자, G418 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자를 포함한다. 선별 마커 카셋트는 일반적으로 추가로 선별 마커 유전자에 작동적으로 연결되어 있고 숙주 모나스쿠스 균주에서 작동가능한 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함한다.
성공적인 형질전환체는 마커 유전자에 의해 부여되는 속성의 장점을 취하거나, 또는 삽입된 유전자에 의해 부여되는 여타 특징 (예컨대, 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산 제공 능력, 에탄올 제공 불능, 또는 특정 기질 상에서 생장하는 능력) 에 의해 공지된 방법으로 선별될 수 있다. 스크리닝은 PCR 또는 서던 분석으로 수행되어 원하는 삽입 및 결실이 위치되었는지 확인하고, 카피 수를 확인하고, 유전자의 숙주 균주의 게놈으로의 통합 지점을 확인할 수 있다. 삽입된 유전자에 의해 인코딩되는 효소의 활성 및/또는 결실된 유전자에 의해 인코딩되는 효소의 활성 결핍은 공지된 검정 방법을 이용해 확인될 수 있다.
본원에서 고려되는 결실 또는 불활성화는 유전자 조작 방법, 강제적 진화 (forced evolution) 또는 돌연변이 유발 및/또는 선별 또는 스크리닝에 의해 달성될 수 있다. 당연히, 당업계의 현재 통용 기법이 유전자의 불활성화, 결실 또는 치환에 이용될 수 있다. 그러한 분자적 기법은 이에 제한됨 없이 하기를 포함한다:
(i) 안티센스 RNA, 리보자임 및 삼중 DNA 형성을 포함하는 자연적인 유전자 침묵 방법 기반의 유전자 불활성화 기법,
(ii) 비복제성 플라스미드를 이용한 단일 교차법 및 비복제성 플라스미드 또는 이중-교차 염색체 통합이 가능한 선형화된 DNA 절편을 이용한 유전자 불활성화 (Finchham, 1989, Microbiological Reviews, 53: 148-170; Archer 등, 2006, Basic Biotechnology: 95-126) 와 같은 단일 유전자 돌연변이를 위한 기법, 및
(iii) 이에 제한됨 없이, 하기와 같은 동일 균주에서의 다중적인 표시되지 않은 돌연변이를 위한 기법:
(a) 분리성의 매우 안정한 돌연변이를 제공하는, 통합성 플라스미드의 동종 재조합을 통한 이중 교차 통합에 의한 표적 유전자의 항생제 내성 유전자에 의한 결실 및 치환;
(b) 동일 균주에서의 다중적인 표시되지 않은 돌연변이의 구축 방법의 반복적 이용을 가능케 하는, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 Flp 리콤비나아제 시스템을 이용한 항생제 내성 유전자의 제거, 및
(c) 5-플루오로우라실을 카운터 선별가능 마커로 이용하게 하고 이중 교차 통합체의 포지티브 선별을 가능케 하는, upp 유전자가 결실되고, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 균주의 생성.
특별한 구현예에서, 내생적 유전자의 결실 또는 붕괴가 Oliveira 등의 문헌 (2008) (Appl Microbiol Biotechnol 80, 917-924) 에 기재된 방법에 따라 수행된다.
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본 발명의 특별한 비제한적 구현예에서, 내생성 유전자의 결실 또는 붕괴는, 숙주 균주의 하나의 내생성 유전자의 5' 및 3' 측면 부분 (flanking portion) 사이에 삽입된, 하나 이상의 기능성 구조적 유전자, 특별하게는 관심대상의 유기산의 생산에 관여되는 효소를 인코딩하는 유전자, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 LDH 유전자의 도입을 포함할 수 있다. 기능성 유전자는 바람직하게는 구조적 유전자에 작동적으로 연결된 기능성 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함한다. 이러한 접근법은 내생성 유전자의 결실 및 기능성 외인성 또는 이종성 유전자의 삽입을 동시에 허용한다. 벡터는 구조적 유전자 대신에 또는 그에 더하여 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 다시, 선택 마커 유전자는 벡터 상에서 표적화되는 내생성 유전자(들)의 5' 및 3' 측면 부분 사이에 위치하고, 기능성 내생성 유전자의 유전자좌 내에 삽입되게 된다. 선택 마커 유전자의 사용은 성공적 형질전환체의 선택 수단을 도입하는 이점을 갖는다. 그러나, 결과적인 기능성 특징에 기초하여 성공적 형질전환체를 선택할 수도 있다. 예를 들어, 결실 및 도입된 유전자에 따라, 관심대상의 유기산을 고농도로 생산하는, 특정 빌딩 블록으로 생장하는 능력의 감소 또는 소멸 또는 에탄올과 같은 특정 대사물을 생산하는 그들의 능력의 감소에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 국면은 하기 단계를 포함하는, 높은 수율로 유기산을 생산하는 미생물을 수득하는 방법을 제공한다:
a) 낮은 pH 에서 유기산에 높은 용인성을 갖는 모나스쿠스 속의 미생물을 수득하는 단계;
b) 유기산의 증가된 생산 및/또는 대사물의 내생성 생산의 감소를 보장하는 하나 이상 재조합된 핵산 서열로 미생물을 형질전환시키는 단계; 및
c) 높은 수율 유기산 생산 능력이 있는 미생물을 선택하는 단계.
낮은 pH 에서 유기산에 높은 용인성을 갖는 미생물을 동정하는 단계는 고농도의 유기산을 함유하는 배지에서 미생물을 선택함으로써 실시될 수 있다.
더욱 특별하게는 선택은 관련 유기산의 (최저) pKa 값보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 유기산을 함유하는 배지에서의 선택에 의해 실시된다. 특별한 구현예에서 pH 는 관련 pKa 값보다 1 단위 미만 만큼 더 높다. 더욱더 특별한 구현예에서 pH 는 pKa 값보다 낮다.
특별한 구현예에서, 미생물은 유기산을 50 g/L, 가장 특별하게는 100 g/L 로 함유하는 배지에서 선택되고, 특별한 구현예에서 미생물은 유기산을 150 ~ 175 g/L 까지 함유하는 배지에서 선택된다.
특별한 구현예에서, 유기산은 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산이고, pH 는 3.8 미만, 더욱 특별하게는 3 미만이다.
놀랍게도 본 발명자들은 낮은 pH 에서, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 미만인 pH 에서, 높은 유기산 농도, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나 높은 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산 농도에 대해 용인성인 모나스쿠스 계통의 미생물이 동정될 수 있음을 발견했다. 더욱 특별하게는 3.0 미만의 pH 에서 증가된 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산 농도에 대해 용인성인 모나스쿠스 계통의 미생물이 동정될 수 있음을 발견했다.
미생물의 형질전환 단계는 위에 상세히 기재되어 있다. 위에 상술된 바와 같이, 유기산 생산 수율을 증가시키는 상이한 유전자 개질이 구상된다.
높은 수율 유기산 생산 능력이 있는 미생물을 선택하는 단계는 당업자에게 알려진 선택 단계이고, 본원의 실시예에서 LDH 에 대해 기재된 것과 같은 방법에 의해 관심대상의 유기산의 생산에 관여되는 효소의 활성을 측정하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로 또는 대안적으로 발명에 따른 방법에서, 선택 단계는 감소된 에탄올 생산, 감소된 유기산 소모 등에 기초할 수 있다.
추가의 국면에서, 본 발명은, 더욱 특별하게는 높은 수율로, 유기산을 생산하는 방법을 제공한다. 실제로, 유기산의 높은 수율 생산은 수많은 공업 응용의 관점에서 유익하다. 본 발명의 방법은 산미료, 향미료, pH 완충제, 또는 보존제와 같은 식품 또는 사료 첨가제로서의 유기산의 생산에서, 약품 및 화장품에서의 사용에서 및 세제 및 중합체의 생산에서 유익하다. 예를 들어 락트산 중합체는 석유계 플라스틱과 유사한 특성을 갖지만, 생분해성이고 환경 친화적이라는 이점을 갖는다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다 : 낮은 pH 에서 고농도의 유기산에 대해 용인성인 모나스쿠스 계통의 미생물을 수득하는 단계, 그것을 유전자 개질하여 유기산의 수율을 증가시키는 단계 및 그와 같이 수득된 미생물을 5 미만, 더욱 특별하게는 4 미만의 pH 에서, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 특정 기질 또는 화학적 빌딩 블록의 존재 하에 배양하는 단계.
특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 낮은 pH 에서, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 유기산에 대해 용인성인 모나스쿠스 계통의 균주를 수득하는 단계; (ii) 상기 균주를 개질하여 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합으로부터 높은 수율로 관심대상의 유기산을 생산하는 능력을 갖도록 하는 단계; 및 (ii) 상기 균주를 적합한 기질의 존재 하에, 더욱 특별하게는 유기산의 pKa 보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서, 가장 특별하게는 5 미만, 가장 특별하게는 4 미만의 pH 에서 배양하는 단계.
본 발명의 방법의 특별한 구현예에서, 생산된 유기산은 카르복시산, 더더욱 특별하게는 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산이다. 가장 특별하게는, 생산된 유기산은 L-락트산이다.
모나스쿠스 계통의 유기산에 대해 용인성인 미생물을 수득하는 방법 및 상기 유기체를 개질하여 유기산 생산 수율을 증가시키는 방법이 위에 기재되어 있고, 실시예 부분에 설명되어 있다.
발명의 방법의 특별한 구현예에서, 모나스쿠스 계통의 미생물 또는 균주는 형질전환된 균주에 의해 발효가능한 당을 포함하는 배지에서 배양된다. 당은 육탄당 당 예컨대 글루코스, 글리칸 또는 글루코스의 기타 중합체, 글루코스 올리고머 예컨대 말토오스, 말토트리오스 및 이소말토트리오스, 파노오스, 프룩토오스, 및 프룩토오스 올리고머일 수 있다. 특별한 구현예에서, 미생물은 오탄당을 발효하는 능력을 갖도록 개질되고, 배지는 오탄당 예컨대 자일로스, 자일란 또는 자일로스의 기타 올리고머를 포함한다. 특별한 구현예에서, 유기체는 육탄당 및 오탄당의 조합으로 배양된다.
당은 헤미셀룰로스 또는 셀룰로스-함유 바이오매스의 가수분해물일 수 있다. 특별한 구현예에서, 미생물은 바이오매스가 단량체로 붕괴되는 것을 보장하도록 개질된다 (예를 들어, 셀룰라아제 유전자의 발현). 따라서, 특별한 구현예에서, 기질은 당 올리고머 또는 중합체 예컨대 셀룰로스, 헤미셀룰로스 또는 펙틴을 포함한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 기질이 발효가능한 단량체로 붕괴되는 것을 보장하도록 효소가 배양 배지에 첨가될 수 있다.
발명의 특별한 구현예에서, 배지는 5 g/L (당량) 이상, 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 30 g/L 이상, 더욱 특별하게는 40 g/L 이상, 더더욱 특별하게는 50 g/L 이상의 글루코스를 함유한다. 더욱더 특별한 구현예에서, 배지는 100 g/L 이상, 더욱 특별하게는 200 g/L 이상의 글루코스를 포함한다.
배지는, 무기 질소 공급원 예컨대 암모니아 또는 암모늄 염 등, 및 미네랄 등을 포함하는, 특별한 모나스쿠스 균주에 의해 요구되는 추가의 영양소를 임의로 함유할 수 있다.
그러나, 더욱 특별한 구현예에서, 배지는 오탄당 또는 육탄당 당을 유일한 탄소 공급원으로서 포함하는 완전 미네랄 배지이다. 본 발명의 균주가 이러한 단순 배지에서 생장하는 능력은 배양 비용을 크게 감소시키고 생산된 유기산의 정제를 단순화시킨다. 기타 생장 조건, 예컨대 온도, 세포 밀도 등은 발명에 중요하다고 여겨지지 않고, 일반적으로 경제적 프로세스를 제공하도록 선택된다. 생장 시기 및 생산 시기 각각 동안의 온도는 배지의 동결 온도 초과 ~ 약 50℃ 일 수 있다. 특별하게는 생산 시기 동안의, 바람직한 온도는 약 30 ~ 45℃ 이다. 발명의 방법의 배양 단계는 호기성으로, 미량호기성으로 또는 혐기성으로 실시될 수 있다. 프로세스 동안 산소가 첨가되지 않으나 생산 프로세스의 시작시 배지에 용해된 산소가 존재하는, 유사-혐기성 조건 또는 산소 제한 조건이 사용될 수도 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 혐기성 또는 산소-제한 조건 하에 당을 유기산으로 변환시키는 능력을 나타내는 모나스쿠스 계통의 미생물 (균주) 의 배양을 포함한다.
발명의 이러한 국면에 따른 방법의 배양 단계는 연속적으로, 회분식으로, 또는 그들의 임의의 조합으로 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 수단 및 방법에 의해 수득되는 유기산의 수율은 사용되는 배양 조건에 의존할 것이다.
특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 유기산의 생산 방법은 0.5 g/L 이상, 특별하게는 2 g/L 이상, 더욱 특별하게는 4 g/L 이상, 더더욱 특별하게는 50 g/L 이상, 가장 특별하게는 50-100 g/L 인 유기산의 수율을 초래한다. 더욱더 특별한 구현예에서 생산 수율은 약 2-3 g/L/hour 이다.
특별한 구현예에서 본 발명의 미생물은 소모되는 글루코스의 50% 이상, 더욱 특별하게는 60% 이상, 더더욱 특별하게는 75%, 가장 특별하게는 95% 이상, 및 100% 이하를 변환시키는 능력이 있다. 실제로, 본 발명의 방법의 특별한 구현예에서 수득되는 수율은 0.5g/g 당 이상, 더욱 특별하게는 0.6g/g 당 이상이나, 0.95g/g 당 이하일 수 있다.
추가의 구현예에서, 발명은 위에 상술된 단계에 더하여 관심대상의 유기산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 유기산의 생산 방법을 제공한다. 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 배양 배지로부터의 유기산의 회수는 탄소 공급원으로서 오직 당을 함유하는 미네랄 배지에서 유기체가 생장할 수 있다는 사실 때문에 크게 단순화된다. 적합한 정제는 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 예컨대 추출, 이온 교환 수지, 전기투석, 나노여과 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1 : 고도의 유기산 용인성 균주로서 3 가지 모나스쿠스 루버 균주 LF4, LF5 및 LF6 의 단리
낮은 pH, 증가하는 락트산 농도 및 다양한 농도의 글루코스 및 자일로스 농도의 배지에서 인큐베이션하여 토양 및 옥수수-및-밀 사일리지로부터 균주를 단리했다.
40 C 에서 pH 2.8 에서 50 g/l 글루코스, 50 g/l 자일로스 및 100 g/l 락트산 함유 DSMZ402 배지에서 인큐베이션하여 하나의 균주 (LF4) 를 단리했다.
LF4 에 대해 기재된 바와 같이, 그러나 pH 2.4 에서 또다른 균주 (LF5) 를 단리했다.
pH 2.8 및 32 C 에서 25 g/l 자일로스 및 150 g/l 락트산 함유 DSMZ402 배지에서 인큐베이션하여 세번째 균주 (LF6) 를 단리했다.
모나스쿠스 계통, 더욱 특별하게는 모나스쿠스 루버의 이들 3 가지 균주는 높은 락트산 농도 (150 g/L 이하) 의 존재 하에 낮은 pH (2-3) 에서 생장할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
락트산 용인성 균주 LF4, LF5 및 LF6 은 2010 년 7 월 21 일자에 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek (Bomseweilanden 9, 6708 WG Wageningen, Nederland) 의 Food & Biobased Research 부서에 의해 부다페스트 조약 하에 기탁물로서 기탁되었고, 각각 수탁 번호 CBS 127564, CBS 127565 및 CBS 127566 을 부여받았다.
실시예 2: 선택 마커 유전자에 의한 안정적 형질전환
재료 및 방법
a) 형질전환
모나스쿠스 루버의 유전자 개질에 대한 대부분의 프로토콜은 CaCl2 및 폴리에틸렌 글리콜의 병용 또는 전기천공법을 이용한 원형질체의 형질전환을 수반한다. 그러나 이들 방법은 종종 낮은 형질전환 효율 및 낮은 유사분열 안정성을 가졌다. DNA 의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 통합을 사용하는 효율이 높은 형질전환 방법이 M. ruber (Yang 2008) 에서 보고되었다. 본 발명자들은 본 발명자들의 모나스쿠스 루버 균주 LF4, LF5 및 LF6 및 2 가지 선택된 CBS 균주 CBS 135.60 및 CBS 503.70 에 이러한 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 시스템을 사용했다.
de Groot et.al, 1998 에 의해 기재된 바이너리 벡터 pUR 5750 을 함유하는 아그로박테리움 균주를 Plant Research International, WUR 로부터 입수했다. 이들을 카나마이신 (100 ㎍/ml) 을 보충한 최소 배지에서 48 h 동안 30 ℃ 에서 생장시켰다. 세포 (OD600~1.0) 를 아세토시린곤 (AS) 이 없는 유도 배지로 세정하고, 28℃ 에서 6h 동안 AS 와 함께 또는 AS 없이 생장시켰다. AS 를 T-DNA 이동 및 균력의 유도에 사용했다. 배양 10 일 후 PDA 플레이트로부터 모나스쿠스 루버 (107 포자/ml) 의 분생포자를 수집했다. 분생자가 형질전환되었을 때, 동등 부피의 분생자를 동등 부피의 아그로박테리움 투메파시엔스와 혼합하고, AS 의 존재 및 부재 하에 유도 배지 위에 놓인 나일론 필터에서 플레이팅 아웃 (plate out) 했다. 플레이트를 4 일 동안 25℃ 에서 인큐베이션했다. 그 후 필터를 아그로박테리움 세포를 사멸하기 위한 200 ㎍/ml 세포탁심 및 형질전환체를 선택하기 위한 100 ㎍/ml 하이그로마이신을 함유하는 YM-배지로 이동시켰다.
10-14 일 후 빠르게 생장하는 균류 콜로니를 새로운 YM 플레이트 + 하이그로마이신 및 세포탁심으로 이동시켰다. 5 일의 생장 후 콜로니의 가장자리를 다시 새로운 YM 플레이트 + 하이그로마이신 및 세포탁심으로 이동시켰다.
이러한 절차의 적용 결과 선택된 모나스쿠스 균주 각각에 대한 하이그로마이신 저항성 형질전환체를 초래한다 (참고, 표 2).
표 2. 모나스쿠스 루버 균주 1 개 당 형질전환체의 개수
b) 형질전환체의 안정성
본 발명자들이 다루었던 형질전환체의 첫번째 특성은 유전적 안정성이다. 이와 관련하여, 유전자 개질된 균주의 하기 2 가지 특색이 중요하다:
(i) 표적 유전자가 게놈 내에 통합되어야 하고,
(ii) 유전자는 항생제의 선택압이 없더라도 제자리에 그대로 있고 활성이어야 한다.
형질전환체 중 벡터 DNA 의 존재를 먼저 PCR 에 의해 밝혔다.
7 개의 형질전환체 (5 개의 LF4 형질전환체 및 2 개의 CBS 503.70 형질전환체) 및 3 개의 야생형 균주 (LF4, CBS 503.70 및 CBS 135.60) 로부터 DNA 를 단리하고, 하이그로마이신 유전자를 보여줄 수 있는 DNA 프라이머를 이용하는 PCR 에 적용했다.
형질전환체의 DNA 는 대조군 벡터 DNA 로부터의 것과 동일한 크기의 PCR 절편을 분명히 산출하지만, 야생형 균주는 이러한 PCR 절편을 보이지 않는다. 이는 형질전환체 중 하이그로마이신 유전자의 존재를 보여준다.
모나스쿠스 루버 형질전환체로부터의 게놈 DNA 중 벡터 DNA 의 통합을 규명하기 위해 서던 블롯 분석을 실시했다. 제한 효소에 의한 소화 전 및 후에 게놈 DNA 를 블롯팅했다. 블롯을 하이그로마이신 유전자의 존재를 보여주는 프로브와 혼성화했다. 게놈 DNA 가 있는 레인에서 블롯 위의 신호는 게놈 DNA 의 위치와 일치하는데, 이는 게놈 중 하이그로마이신 유전자의 통합을 의미한다. 소화된 DNA 가 있는 레인에서 신호는 상이한 위치 (= 상이한 DNA 절편) 에서 보이는데, 이는 하이그로마이신 유전자의 무작위 통합을 의미한다.
결론으로서, 본 발명자들은 모나스쿠스 루버 균주에서 벡터 DNA 의 무작위 게놈 통합을 규명했다. 항생제의 선택압 없이 형질전환체의 안정성을 시험하기 위해, 균주를 PDA (감자 덱스트로스 아가) 플레이트에서 생장시켰다. 대략 14 일 동안의 생장 후 배양물의 바깥 가장자리의 일부를 다시 하이그로마이신이 없는 새로운 PDA 플레이트로 이동시켰다. 이러한 프로세스를 3 회 반복했다. 마지막으로 배양물의 바깥 가장자리의 일부를 하이그로마이신이 있는 새로운 PDA 플레이트로 이동시켜, 균주가 이러한 항생제의 존재시에도 생장할 수 있었는지 여부를 확인했다.
이러한 절차 후 선택 플레이트에서도 생장할 수 있는 형질전환체의 개수를 기록했다 (표 3).
표 3. 하이그로마이신 저항성의 안정성에 대해 스크리닝된 모나스쿠스 루버 형질전환체.
두번째 접근법은 항생제 선택 없이 3 회 이동 후 플레이트로부터 포자를 수집하고, 하이그로마이신의 존재 및 부재 하에 PDA 플레이트 (선택 플레이트) 에 포자를 스프레딩한 후 출현하는 콜로니의 개수를 비교하는 것이었다. 포자를 균사체 절편에 의한 오염을 최소화하기 위해 글라스 울을 통해 여과했다. 하이그로마이신 유전자가 소실 또는 불활성화되는 경우, 선택 플레이트 위의 콜로니의 개수가 감소된다.
모든 균주를 이용한 시험에서 선택 및 비-선택 플레이트 위의 콜로니의 개수가 감소되지 않았다. 결론으로서, 모나스쿠스 루버 형질전환체에서 도입된 유전자의 불안정성 또는 불활성화에 대한 증거가 존재하지 않는다.
비-선택 플레이트로의 순차적 이동 및 그 후 배지에서 선택압 없이 생장 후에, 마지막 시험으로서 이전에 기재된 서던 블롯 실험을 27 개의 트랜스제닉 균주로 반복했다.
이러한 서던 블롯으로, 비-선택 배지에서 생장 후 모나스쿠스 루버 형질전환체의 게놈 중 하이그로마이신 유전자의 존재를 확인했다.
c) 형질전환 벡터의 구축
예를 들어 복수의 유전자를 도입하고/거나 유전자의 도입과 녹아웃 (knock out) 사건을 조합하도록 모나스쿠스 루버 균주에 순차적 형질전환을 실시할 수 있기 위해, 본 발명자들은 다른 선택 마커가 있는 형질전환 벡터를 구축하기로 결정했다.
이전 단락에 기재된 형질전환에 사용된 벡터는 pUR5750 플라스미드이다. 도 1 은 이러한 플라스미드의 맵을 보여준다 ("RB" = 오른쪽 경계; "LB" = 왼쪽 경계; "Hpt" = 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자).
형질전환 동안 RB (오른쪽 경계) 와 LB (왼쪽 경계) 사이의 DNA 부분이 균류 게놈 내로 이동된다. 이러한 부분에 Hpt 유전자가 위치한다. gpd-프로모터 및 trpC-터미네이터의 조절 하의, 이러한 유전자의 활성은 형질전환체에서 하이그로마이신 저항성을 초래한다. 이러한 벡터 중 프로모터, 유전자 및 터미네이터의 클로닝 및 교환을 촉진하기 위해 본 발명자들은 카세트 모델을 고안했다. 도 2 에 나타난 바와 같이, 이러한 클로닝 전략으로 본 발명자들은 벡터 중 프로모터, 터미네이터 및 유전자를 교환할 뿐만 아니라, 2 개의 유전자 카세트를 일렬로 조합할 수 있다.
Hpt 는 본 발명자들이 이미 사용했던 하이그로마이신 저항성을 제공하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다. Ble 는 플레오마이신 또는 제오신 저항성을 제공하는 블레오마이신 유전자이다. Nptll 는 네오마이신 (G418) 저항성을 제공하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.
pUR5750 형질전환 벡터는 대형 벡터이고, 부가적 유전자가 삽입될 때 훨씬 커질 것이므로 (참고, 도 2), 본 발명자들은 모나스쿠스 루버의 형질전환에 이러한 벡터의 더 짧은 형태를 또한 사용하기로 결심했다. 일반적으로 더 작은 벡터는 구축 및 형질전환 실험 동안 더 용이하게 취급될 수 있다고 추정된다.
이러한 더 작은 벡터는 pUR5750 의 유도체이고, pCB301 (Xiang et al. 1999) 로 부호화된다. pUR5750 의 기본 서열의 원래의 기능인, 식물 형질전환에 필수적인 전형적 DNA 요소를 이러한 플라스미드로부터 제거하여 3574 bp 벡터를 남겼다. 도 3 은 pCGHT3 으로 호칭되는 Hpt 카세트를 함유하는 pCB301 을 보여준다 ("RB" = 오른쪽 경계; "LB" = 왼쪽 경계; "Hpt" = 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자). 이러한 벡터는 크기가 원래의 Hpt 벡터의 절반이다.
선택 마커 예컨대 Ble 또는 Nptll 유전자를 사용할 수 있기 위해 본 발명자들은 먼저 균류 형질전환 시스템에서 주로 사용되는 농도의 제오신 또는 G418 을 함유하는 배지에서 모나스쿠스 루버가 생장하는 능력이 없음을 확인했다. 모나스쿠스 루버 균주 LF4 및 LF6 으로부터의 분생자 및 포자는 600 ㎍/ml 제오신 또는 200 ㎍/ml G418 을 함유하는 PDA 플레이트에서 생장할 수 없었다.
2 가지 기본 벡터 및 3 가지 선택 마커를 사용하여 6 가지 벡터를 제조했다 (표 4).
표 4. 제조된 벡터 구축물
d) 6 가지 새로 구축된 벡터에 의한 형질전환
모나스쿠스 루버 균주 LF5 로부터의 분생자 및 자낭포자의 혼합물을 앞서 기재한 바와 같은 6 가지 벡터로 형질전환시켰다. 동시배양 단계 후 과다성장하는 분생자 및 자낭포자가 있는 필터를 선택 플레이트로 이동시켰다.
선택 플레이트는 아그로박테리움 세포를 사멸하기 위한 200 μΜ 세포탁심 및 형질전환체를 선택하기 위한 100 ㎍/ml 하이그로마이신, 또는 200 ㎍/ml 제오신, 또는 200 ㎍/ml 게네티신이 있는 YM-배지를 함유한다.
대략 12 일 후 최초로 생장하는 콜로니가 선택 플레이트에서 보이기 시작했다.
표 5 는 형질전환체의 점수를 보여준다.
표 5. LF5 분생자로부터 수득된 형질전환체.
콜로니를 적당한 항생제가 있는 PDA 플레이트로 이동시키고, 충분한 생장 후 항생제를 함유하는 액체 배지 (YPD) 에서의 생장을 위한 접종원으로서 사용했다. 4 일 후 균사체를 수확하고, DNA 를 단리했다.
모나스쿠스 루버 LF5 형질전환체로부터의 게놈 중 선택 마커 유전자의 통합을 규명하기 위해, 다수의 형질전환체에 2 회의 PCR 분석을 실시했다. 단리된 DNA 중 선택 마커의 존재를 보여줄 첫번째 분석은 마커 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 이다. 살아 남았을 수 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 박테리아에서 비롯된, 오염된 벡터 DNA 의 존재를 배제하는 두번째 PCR 분석은 아그로박테리움 투메파시엔스 GPD (글리세르알데히드 포스페이트 디히드로게나아제) 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 실시했다.
결론으로서 카세트 전략에 따라 구축한 Hpt 및 Nptll 벡터가 모나스쿠스 루버의 형질전환에 효과적임이 밝혀졌다. 더 작은 pCB301 기반 벡터를 사용하는 경우 pUR5750 기반 벡터를 사용하는 경우보다 더 많은 형질전환체를 초래하는 것으로 보인다. PCR 분석은 모나스쿠스 루버의 게놈 중 선택 마커 유전자의 통합을 보여주고, 또한 아그로박테리움 투메파시엔스 박테리아가 세포탁심에 의해 효율적으로 사멸되었음을 보여준다.
실시예 3: 락트산 생산 모나스쿠스의 생성.
a) 벡터 구축
모나스쿠스 루버 균주의 게놈 중에 소 (Bos taurus) LDH 유전자의 하나 이상의 카피를 도입하기 위한, 가장 간단한 접근법은 앞서 기재된 바와 같은 카세트 중에 코돈 최적화된 소 LDH 유전자를 도입하는 것이다. LDH 유전자의 발현을 추진하는 프로모터 및 터미네이터 서열은 선택 마커 유전자를 추진하는 것과 동일할 것이다.
코돈 최적화를 위해 본 발명자들은 먼저 모나스쿠스의 코돈 용법을 분석했다. 모나스쿠스 루버로부터 오직 2 개의 유전자가 입수가능하므로 본 발명자들은 모나스쿠스 필로수스 및 모나스쿠스 푸르푸레우스의 코돈 용법을 모나스쿠스 루버 유전자의 코돈 용법과 비교했다. 3 가지 종은 밀접한 유연관계성을 가지며, 3 가지 모나스쿠스 종의 코돈 선호도 사이에 큰 유사성을 발견했다.
코돈 용법에 기초하여 본 발명자들은 선택된 모나스쿠스 루버 균주에서의 발현을 위한 최적화된 소 LDH 유전자를 고안할 수 있었고 (SEQ ID NO: 1 및 도 4), 그러한 유전자를 Genscript Corporation 가 합성하게 했다. 이러한 유전자를 수득한 후, 그것을 구축된 두 가지 유형의 Hpt 벡터로 클로닝하고 시험했다. 프로모터-LDH-터미네이터 카세트의 삽입을 제외하고는 원래의 벡터가 변하지 않는 이점을 갖는 도 2 에 나타난 카세트 전략에 따라 클로닝을 실시했다. 이는 pCB301 플라스미드 기반 벡터 pCGHTGBtLT (도 5) 및 pUR5750 플라스미드 기반 pURGHTGBtLT (도 6) 를 결과물로 제공한다.
b) 대장균에서의 Bt-LDH 유전자의 클로닝 및 발현.
모나스쿠스 루버의 형질전환에 사용된 합성 LDH 유전자의 정확한 해독 및 활성을 확인하기 위해, 유전자를 대장균 발현 벡터로 클로닝했다. 사용된 발현 벡터는 아라비노오스 유도 후 단백질을 발현할 InVitrogen pBAD102 벡터이다.
LDH 는 대장균에서 고도로 발현되었으나, 부분적으로 가용성인 것으로 밝혀졌다.
가용성 대장균 단백질을 사용하여 LDH 효소 활성을 분석했다.
btLDH 에 의해 촉진되는 반응은 다음과 같다:
(L)-락테이트 + NAD(+) <=> 피루베이트 + NADH
활성 검정에서 과잉의 피루베이트 및 NADH 를 첨가하여, 활성은 340 nM 에서 분광광도계로 측정될 수 있는 NADH 에서 NAD 로의 변환으로 반영된다.
양성 대조군으로서 Sigma-Aldrich 로부터 수득된 LDH 효소를 사용했다.
반응 속도를 NADH 의 산화로부터 초래되는 340 nm 에서의 흡광도의 감소에 의해 확인했다. 1 단위은 명시된 조건 하에, 25℃ 및 pH 7.3 에서 1 분 당 1 마이크로몰의 NADH 의 산화를 야기한다.
0.2 M Tris·HCl 완충액을 제조했다. LDH 효소를 사용 전에 희석하여 Tris 완충액 중 0.02-0.04 ΔΑ/분 의 속도를 수득하고, 차갑게 유지했다.
2.8 mL Tris·HCl, 0.2 M pH 7.3 및 0.1 mL 6.6 mM NADH 의 반응 혼합물을 제조했다.
배경 NADH 변환을 모니터링하기 위해, 기질의 첨가 및 비첨가 하에 LDH 활성을 측정했다.
대장균에서의 합성 LDH 의 발현 및 활성의 분석은 합성 유전자가 정확한 Mw 및 LDH 활성을 갖는 단백질을 인코딩함을 보여준다. 시간에 따른 이들 대장균 균주에 의한 글루코스 및 락토오스 생산이 도 7 에 나타나 있다 ("Coli-LDH 1, 2, 및 3" 은 발현된 합성 LDH 단백질이 존재하는 3 가지 독립적 대장균 추출물에 해당한다; "Coli-대조군" 은 상이한 단백질을 발현하는 대장균 추출물이다).
c) LDH 벡터에 의한 모나스쿠스 루버의 형질전환.
모나스쿠스 루버 균주 LF4, LF5 또는 LF6 로부터의 분생자 및 자낭포자의 혼합물을 LDH 벡터 pCGHTGBtLT 및 pURGHTGBtLT 에 의한 형질전환에 사용했다. 따라서 총 6 회의 형질전환을 실시했다. 이전에 기재된 형질전환 절차 및 하이그로마이신 함유 플레이트에서의 선택을 적용한 후 오직 3 가지 LF5 형질전환체가 수득되었다.
1 가지 형질전환체는 pCGHTGBtLT 벡터 (LF5-t1), 2 가지 형질전환체는 pURGHTGBtLT 벡터 (LF5-t2, LF5-t5) 의 사용 결과 제공되었다.
d) 모나스쿠스 루버 LF5-T1 및 LF5-T2-LDH 형질전환체의 분석
첫번째 실험에서, 2 가지 형질전환체 LF5-T1 및 LF5-T2 를 분석했다.
LF5-T1 을 pCGHTGBtLT 로, LF5-T2 를 pURGHTGBtLT 로 형질전환시켰다.
LDH 효소 활성 및 가능한 L-락테이트 생산을 분석하기 위해 2 가지 형질전환체 및 wt-LF5 균주를 S.c. 배지 + 50 g/L 글루코스 pH 6.0 에서 생장시켰다.
24, 48, 및 72 시간의 배양 후 각각의 배양물로부터 배지 및 바이오매스 샘플을 취했다.
(i) 글루코스 소모 및 락테이트 생산
도 8a 및 8b 는 모든 배양물에서 글루코스 소모를 분명히 보여주지만, LF5-T2 로부터의 배지에서는 락트산의 농도가 시간에 따라 증가하는 것으로 탐지된다 (숫자 24, 48 및 72 는 24, 48 및 72 시간 동안 생장한 2 개의 별개의 배양물로부터의 샘플을 나타낸다; "M" 은 배지에 해당한다). LF5-T2 는 대략 8 g/L 글루코스를 소모했고, 대략 1.5 ~ 2 g/L 의 락트산을 생산했으며, 이는 0.18 ~ 0.25 g/g 의 수율에 도달했음을 나타낸다. 최대 이론적인 수율은 1.00 g/g 이다.
(ii) 효소적 분석
HPLC 분석은 L- 및 D-락트산 사이를 구별하지 않으므로, 다수의 샘플을 효소적 방법에 의해 분석했다. L-락트산 분석 키트 (Megazyme) 는 LF5-T2 샘플 중 L-락트산의 존재를 확인했다 (도 9).
수확된 바이오매스 샘플을 액체 질소 중에서 동결시키고, 막자사발 및 막자를 사용하여 빻았다. 동결된 분말을 완충액 (0.2 M Tris·HCl, pH 7.3) 중에서 해동시키고, 단백질을 볼텍싱 (vortexing) 에 의해 추출했다. 원심분리 후 상청액을 이전 단락에 기재된 단백질 분석 및 LDH-효소 활성 분석에 적용했다.
이러한 분석은 LF5-T2 형질전환체 중 L-LDH 활성의 존재를 분명히 보여줬지만, 대조군에서는 활성이 발견되지 않았다 (도 9).
(iii) 서던 블롯 분석
혼성화를 LDH 유전자를 사용하여 실시했다. 서던 블롯 분석은 비 선택 배지에서의 생장 후 모나스쿠스 루버 형질전환체 t2 의 게놈 중 LDH 유전자의 단일 통합을 확인한다.
형질전환체 t1 은 LDH 유전자를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다. 하이그로마이신 유전자를 이용하는 두번째 서던 분석은 둘다의 형질전환체 중 하이그로마이신 유전자의 통합을 보여준다. 이는 형질전환체 t1 에서, 양쪽 경계 사이에 유전자 카세트, LDH 및 하이그로마이신이 완전히 통합되지 않았음을 나타낸다.
(iv) 결론
선택 마커 및 합성 LDH 유전자의 조합으로 구축된 형질전환 벡터를 사용하여 27 가지 모나스쿠스 루버 형질전환체가 수득되었다. 하나의 형질전환체, LF5-T2 는 글루코스 배지에서 생장되었을 때 락트산의 생산을 보인다.
락트산 생산, L-LDH 활성 및 서던 블롯은 본 발명자들이 이러한 모나스쿠스 루버 LF5-T2 형질전환체의 게놈 중에 L-LDH 인코딩 이종성 유전자를 그것이 발현되고 대사적으로 활성이게 하는 방식으로 삽입했다는 결론을 지지한다.
e) 모나스쿠스 루버 LF4-, LF5-, 및 LF6-LDH 형질전환체의 분석
다음 실험에서, 총 35 개의 형질전환체, 즉 4 개의 LF4, 16 개의 LF5 및 15 개의 LF6 을 분석했다. 균주를 10 ml YEPD 배지에서 3 일 동안 예비배양했다. 바이오매스를 pH 2.8 에서 10 g/L 글루코스를 함유하는 Sc 배지에서 세정하고, 동일한 조성의 15 ml 의 Sc 배지에서 배양했다. 균주에 의한 글루코스 소모가 도 10 에 도시되어 있다. 이들 형질전환체 중 19 개 (54%), 즉 LF4 에서 유래하는 2 개, LF5 에서 유래하는 12 개 및 LF6 에서 유래하는 5 개가 글루코스로부터 락트산을 생산했다 (도 11). 양성 실험에서, 최대 이론적인 수율의 5-33% 에 해당하는 0.5 ~ 3.3 g/L 범위의 다양한 양의 락트산이 발견되었다 (도 ). 에탄올이 부산물로서 형성되었고, 그것의 농도는 락트산 농도와 반비례 관계에 있었다 (도 12).
각각의 균주 중 2 개의 형질전환체를 선택했으며 (4t3, 4t4, 5t2, 5t21, 6t4, 6t5), 하나는 최고 락트산 생산을 하는 것이고, 하나는 최저 에탄올 생산을 하는 것이었다. 그 후 균주를 진탕 플라스크 내에서 (글루코스 또는 자일로스 (둘다 10 g/L) 로), 하기 2 가지 상이한 통기 조건 하에 배양했다: 호기성 및 엄격한 산소 제한.
호기성 조건 하에, 균주를 진탕 플라스크 내에서 10 ml YEPD 로 3 일 동안 예비배양했다. 그 후 배양물을 pH 2.8 의 25 ml Sc 배지로 2 회 세정했다. 바이오매스를 10 ml 의 동일한 배지에서 삼각형 자기 교반 막대를 사용하여 균질화했다. 750 마이크로리터를 사용하여 10 g/L 의 글루코스 또는 자일로스를 함유하는 15 ml 의 Sc 배지, pH 2.8 를 접종했다 (도 13-15).
대안적으로, 엄격한 산소 제한 조건 하에, 엄격한 산소 제한, 거의 혐기성 조건을 형성하기 위한 바이시클 튜브 밸브 (bicycle tube valve) 가 구비된, 알루미늄 뚜껑이 있는 부틸 고무 마개로 닫힌 병 내에서 배양을 실시했다. 진탕 플라스크 내에서 10 ml YEPD 로 3 일 동안 예비배양했다. 그 후 배양물을 pH 2.8 의 25 ml S.c 배지로 2 회 세정했다. 바이오매스를 10 ml 의 동일한 배지에서 삼각형 자기 교반 막대를 사용하여 균질화했다. 750 마이크로리터를 사용하여 10 g/L 의 글루코스 또는 자일로스를 함유하는 15 ml 의 Sc 배지, pH 2.8 을 접종했다.
호기성 배양 (도 13-15 의 왼쪽 패널) 에서 글루코스로부터 약간의 락트산이 생산되었다 (대략 0.5-1 g/L). 글루코스가 완전히 소모된 후에 락트산이 소모되었다. 에탄올은 형성되지 않았다. 엄격한 산소 제한 조건 하에 (도 13-15 의 오른쪽 패널) 락트산 농도는 2.0 ~ 3.3 g/L 였고, 에탄올은 0.5 ~ 1.0 g/L 의 다양한 농도로 생산되었다.
실시예 4: 에탄올 생산의 방지에 의한 락트산 수율의 추가의 개선.
a) 서열 상동성을 사용하는 피루베이트 디카르복실라아제 유전자의 동정
락트산 수율을 추가로 개선하기 위해 한편으로는 락트산 이외의 생성물의 생산을 감소시키고 다른 한편으로는 모나스쿠스에 의한 락트산의 대사를 감소시키는 유전자 녹-아웃 시스템을 구상했다. 더욱 특별하게는, 알코올의 생산을 방지하기 위해, 피루베이트 디카르복실라아제 (EC 4.1.1.1) 를 인코딩하는 사카로미세스 세레비시애 PDC1 유전자의 모나스쿠스 루버 상동체를 인코딩하는 유전자에 기초하는 녹-아웃 시스템을 구상했다.
모나스쿠스 루버는 산소-제한 조건 하에 에탄올을 생산한다. 피루베이트로부터 에탄올 및 락트산 둘다가 생산되므로, 락트산의 수율을 감소시키는 에탄올의 생산은 방지되어야 한다.
사카로미세스 세레비시애 PDC1 유전자를 쿼리 (query) 로서 사용하는 BLAST 로 본 발명자들은 PDC 인코딩 유전자를 나타낼 수 있는 아스페르질루스 니게르 게놈 내의 여러 상동체를 발견했다. 아스페르질루스 니게르는 모나스쿠스와의 밀접한 관계 때문에 사용했다. 이들 서열에 기초하여 본 발명자들은 모나스쿠스 루버 PDC 의 일부를 클로닝할 수 있기 위해 축퇴된 PCR 프라이머를 고안했다.
모나스쿠스 루버 균주 LF6 으로부터의 RNA 에 대한 RT-PCR 은 2 가지 1.3 kB DNA 절편을 제공했고, 이것을 플라스미드로 클로닝했다. 이들 클로닝된 PCR 절편의 서열분석으로 아스페르질루스 니게르 PDC 상동체에 대한 높은 상동성 및 사카로미세스 세레비시애 PDC1 유전자에 대한 충분한 상동성을 갖는 2 개의 오픈 해독틀의 존재를 확인하여, 본 발명자들이 모나스쿠스 루버의 2 가지 PDC1 유사체를 클로닝했다는 결론을 내렸다.
모나스쿠스 루버 PDC 유전자 PDC1 및 PDC2 에 대한 오픈 해독틀이 SEQ ID NO:3 및 4 (및 도 16 및 17) 로서 제공되어 있다.
b) 유전자 녹-아웃 벡터의 구축.
i) PDC 유전자의 녹-아웃
PCR 을 사용하여, PDC1 및 PDC2 유전자의 5' 및 3' 절반을 단리했고, 적합한 제한 자리를 말단에 첨가했다. 그 후 5' 절반을 벡터 pCGNT1 및 pCGBT2 의 프로모터-마커-터미네이터 카세트의 5' (및 오른쪽 경계 서열의 3') 에서 클로닝한다. 이들 벡터는, HPT 유전자 대신 NPTII 및 BLE 유전자를 선택 마커로서 사용하는 점을 제외하고는, 이전에 기재된 벡터 pCGHT3 과 동일하다. 마찬가지로, 상응하는 3' 절반을 프로모터-마커-터미네이터 카세트의 3' (및 오른쪽 경계 서열의 5') 에서 클로닝한다. 이러한 방식으로, 하기 3 개의 벡터가 생성된다:
1. 게네티신 선택을 사용하는 PDC1 의 붕괴를 위한 pPDC1::NPT (도 18)
2. 게네티신 선택을 사용하는 PDC2 의 붕괴를 위한 pPDC2::NPT (도 19)
3. 제오신 선택을 사용하는 PDC2 의 붕괴를 위한 pPDC2::BLE (도 20)
이들 벡터를 사전에 구축된 PDC1::NPT 붕괴체에서 사용한다.
ii) 조합된 녹아웃 및 유전자 삽입
표적 유전자의 붕괴 및 또다른 유전자의 도입을 동시에 가능하게 하는 벡터를 구축했다. 벡터 중 긴 서열 (stretch) 의 DNA 의 존재로 인한 두번째 라운드의 형질전환에서의 원치 않는 재조합을 최소화하기 위해 그리고 벡터 구축 동안 클로닝 효율을 증가시키기 위해 신규한 벡터에서 프로모터 및 터미네이터 서열의 크기를 감소시켰다. PCR 을 사용하여 GPD 프로모터의 크기를 2208 bp 에서 538 bp 로 감소시켰고, TrpC 터미네이터의 크기를 763 bp 에서 278 bp 로 감소시켰다. 이들은 벡터 pCH#PDC1 및 벡터 pCL1H#PDC1 (참고, 도 21 및 22) 이다. pCH#PDC1 벡터는 하이그로마이신 선택을 사용하는 PDC1 의 피괴에 사용한다. pCL1H#PDC1 벡터는 하이그로마이신 선택을 사용하는 PDC1 의 붕괴 및 LDH 의 도입에 사용한다. 이들 벡터로부터 초래되는 형질전환체는 붕괴된 PDC1 유전자 및 붕괴된 PDC1 유전자 + 삽입된 LDH 유전자를 각각 갖는다. 게네티신 선택을 사용하여 PDC2 유전자를 붕괴하는 벡터 pCN#PDC2 를 구축했다 (도 23).
c) 녹아웃 형질전환체의 생성
i) PDC 유전자의 녹-아웃
LF6 LDH 형질전환체 t4 및 t5 로부터 수득된 포자를 녹아웃 벡터 pPDC1::NPT 또는 pPDC2::NPT 에 의한 형질전환 실험에서 사용한다. G418 (게네티신) 로 선택 후 균주 및 벡터의 각각의 조합은 50-80 개의 게네티신 저항성 콜로니를 초래한다. 유전자 특이적 프라이머를 이용하는 PCR 에 의해 40 개의 형질전환체 (20 개의 LF6t4 + pPDC2::NPT 형질전환체 및 20 개의 LF6t5 + pPDC2::NPT 형질전환체) 의 DNA 를 NPTII 유전자의 존재 및 PDC2 유전자의 붕괴에 대해 시험한다. 녹아웃 벡터에 의한 PDC2 유전자의 붕괴가 관찰된다.
ii) 조합된 녹아웃 및 유전자 삽입
본 발명자들의 표준 절차에 따라, 40℃ 에서 야생형 균주 LF6 으로부터 수집된, 포자를 벡터 pCH#PDC1 및 pCL1H#PDC1 를 사용하여 형질전환시켰다. 하이그로마이신을 함유하는 선택 플레이트에서의 10 일의 생장 후 생장하는 콜로니가 관찰되었고, 그들 중 20 개를 새로운 하이그로마이신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 PDC1 유전자 녹아웃에 대해 시험했다.
PCR 분석은 pCH#PDC1 로부터의 형질전환체 20 개 중 1 개 및 pCL1#PDC1 로부터의 형질전환체 20 개 중 3 개에서 PDC1 유전자가 붕괴되었음을 보여준다 (표 6).
표 6. 구축물 당 형질전환체의 개수
벡터 pCN#PDC2 를 사용하여 형질전환 라운드 1 로부터의 PDC1 녹아웃 균주로부터의 포자를 형질전환시켰다. 게네티신을 함유하는 선택 플레이트에서의 10 일의 생장 후 여러 개의 생장하는 콜로니가 관찰되었고, 그들 중 40 개를 새로운 게네티신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 PDC2 유전자 녹아웃에 대해 시험했다.
균주 LF6KL19 는 PDC1 및 PDC2 의 이중 녹아웃임이 확인되었고, 재조합 LDH 유전자를 함유한다.
d) 형질전환체의 분석
균주 LF6KL19 를 pH 2.8 의 2L 에를렌마이어 내에서 50 g/l 글루코스 및 1 g/l Junlon 을 함유하는 300 ml Sc 배지에서 예비배양했다. 초기 포자 농도는 1 x105 포자/ml 였다. 인큐베이션 온도는 30 또는 35 ℃ 였고, 교반 속도는 75 rpm 으로 설정했다. 30 ℃ 에서 16.1 g/l 글루코스가 소모되었고, 14.4 g/l 락트산이 생산되었고, 35 ℃ 에서 18.8 g/l 의 글루코스가 소모되었고, 18.6 g/l 락트산이 생산되었으며, 이는 실제 수율이 0.9 ~ 1.0 g/g 이었음을 시사한다. 이들 조건 하에 또한 최고 생산성이 수득되었다: 0.15 g/l/h.
e) 게놈 및 전사체 (transcriptome) 분석
상이한 생장 기질로 생장하는, 모나스쿠스 루버 LF6 의 게놈 및 모나스쿠스 루버 LF6 및 모나스쿠스 루버 LF6KL19 의 전사체 (이중 PDC 녹-아웃, 소 LDH 의 도입된 카피) 를 서열분석하고, 자동화된 주석달기 (annotation) 절차에 의해 게놈에서 알코올 생산에 관여되는 관련 유전자를 동정했다. RNA 서열 데이타를 사용하여 이들 유전자의 구축을 개선했다. 게놈에서 에탄올의 형성에 관여되는 많은 추정 유전자를 동정했다: 피루베이트 디카르복실라아제 (PDC) 에 대해 7 개 및 알코올 디히드로게나아제에 대해 12 개. 3 개의 추정 PDC 유전자는 게놈 내에서 서로 인접해 있었고, NA 서열 데이타의 분석은 이들 3 개의 추정 PDC 유전자가 하나의 단일 유전자에 속함을 보여줬다. PDC2 생성물 (SEQ ID NO:2) 은 이러한 유전자의 해독된 서열의 일부와 일치했다.
PDC1 생성물은 Mona10180 의 추정 PDC 유전자 생성물의 일부와 일치했다. PDC1 및 PDC2 를 인코딩하는 유전자는 둘다 모든 상황에서 고도로 발현되었다. 이들 외에도, 또한 또다른 PDC 유전자 (Mona07809 또는 PDC4, SEQ ID NO: 5, 도 24) 가 모든 상황에서 전사되었고 모나스쿠스 루버의 게놈으로부터 제거되어 에탄올의 생산을 감소시킬 수 있었다.
실시예 4: 내생성 락트산 대사의 방지에 의한 락트산 수율의 추가의 개선.
a) 모나스쿠스 루버 중 Cyt-LDH 활성 분석
문헌으로부터 균류 및 효모 락트산이 (시토크롬)L-락테이트 디히드로게나아제에 의해 대사된다는 것이 알려져 있다. 그러므로 본 발명자들은 먼저 락트산으로 생장하는 모나스쿠스 루버 균주를 이러한 효소 활성에 대해 분석했다. 모나스쿠스 루버 균주를 2% 효모 추출물, 탄소 공급원으로서 5% 글루코스 또는 2% 락트산으로 보충된 1 % 펩톤 배지로 생장시켰다. 대조군으로서 사카로미세스 세레비시애를 동일한 조건 하에 생장시켰다 (Lodi and Guiard, 1991). 바이오매스를 24 시간의 생장 후 수확했다. 수확된 바이오매스 샘플을 액체 질소 중에서 동결시키고, 막자사발 및 막자를 사용하여 빻았다. 동결된 분말을 완충액 (0.067 M 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 0.001 M EDTA 함유) 중에서 해동시키고, 단백질을 볼텍싱에 의해 추출했다. 원심분리 후 상청액을 단백질 분석 및 cyt-LDH-효소 활성 분석에 적용했다.
페리시안화 칼륨의 감소 속도를 분광광도계로 420 nm 에서 확인한다. 검정 전에, 효소를 0.067 M 포스페이트 완충액, pH 7.4 (0.001 M EDTA 함유) 중에 용해시켜 속도 0.02-0.04 ΔΑ/분 을 수득한다.
2.0 ml 의 0.1 M 나트륨 파이로포스페이트, 0.5 ml 의 0.5 M DL 나트륨 락테이트, 0.3 ml 의 0.01 M EDTA, 및 0.1 ml 의 페리시안화 칼륨의 혼합물을 제조하고 미량역가 플레이트 내로 파이펫팅했다. 10-20 ㎕ 의 적당히 희석된 샘플을 첨가하고, AA420/분 을 기록했다.
도 25 는 단백질 샘플 중 cyt-LDH 활성을 보여준다. "Gluc" 는 글루코스 함유 배지에서의 생장을 의미하고, "Lact" 는 탄소 공급원으로서의 L-락트산 함유 배지에서의 생장을 의미한다. Cyt-LDH 활성이 모든 시험된 모나스쿠스 루버 균주에서 존재하고, 탄소 공급원으로서의 L-락트산으로의 생장에 의해 유도된다.
b) 서열 상동성에 기초하는 CYB2 유전자의 모나스쿠스 루버 상동체의 단리
사카로미세스 세레비시애 CYB2 유전자를 쿼리로서 사용하는 BLAST 로 본 발명자들은 cyt-LDH 인코딩 유전자를 나타낼 수 있는 아스페르질루스 니게르 게놈 내의 여러 상동체를 발견했다. 아스페르질루스 니게르는 모나스쿠스와의 밀접한 관계 때문에 사용했다. 이들 서열에 기초하여 본 발명자들은 모나스쿠스 루버 cyt-LDH 의 일부를 클로닝할 수 있기 위해 축퇴된 PCR 프라이머를 고안했다.
모나스쿠스 루버 균주 LF6 으로부터의 게놈 DNA 에 대한 PCR 은 1 kB DNA 절편을 초래했고, 이것을 플라스미드로 클로닝했다. 이러한 클로닝된 PCR 절편의 서열분석으로 아스페르질루스 니게르 CYB2 상동체에 대한 높은 상동성 및 사카로미세스 세레비시애 CYB2 유전자에 대한 충분한 상동성을 갖는 오픈 해독틀의 존재를 확인하여, 본 발명자들이 모나스쿠스 루버의 CYB2 유사체를 클로닝했다는 결론을 내렸다. 모나스쿠스 루버 CYB2 유전자에 대한 오픈 해독틀이 SEQ ID NO:2 (및 도 26) 로서 제공되어 있다; 게놈 서열 내의 추정 인트론이 소문자로 표시되어 있다.
c) 락트산 대사의 게놈 및 전사체 분석
상이한 생장 기질로 생장하는 모나스쿠스 루버 LF6 의 게놈 및 모나스쿠스 루버 LF6 및 모나스쿠스 루버 KL19 의 전사체 (이중 PDC 녹-아웃, 소 LDH 의 도입된 카피) 를 서열분석하고, 자동화된 주석달기 절차에 의해 게놈에서 락트산 대사에 관여되는 관련 유전자를 동정했다. RNA 서열 데이타를 사용하여 이들 유전자의 구축을 개선했다.
락트산 디히드로게나아제를 인코딩하는 여러 유전자가 락트산의 이성질체 둘다에 대해 예측되었다. L-락트산에 대해, 4 개의 시토크롬 의존성 LDH 의 유전자, 즉 Mona 02475 (부분적으로 SEQ ID NO:2 에 해당함), Mona 00569, Mona05565 및 Mona06119 이 예측되었다. Mona00569 이 가장 활성임이 발견되었고 락트산의 존재시 고도로 상향 조절되었으므로, 이것은 가장 명백한 제거 후보이다. 이러한 유전자의 서열이 SEQ ID No: 6 (도 27) 에 제시되어 있다.
모나스쿠스 루버는 또한 D-락트산을 기질로서 사용하는 시토크롬 의존성 LDH 에 대한 여러 추정 유전자를 함유하는 것으로 발견되었다. 다시, 하나의 유전자 (Mona05697) 가 가장 활성인 유전자였다. Mona05697 의 발현은 락트산의 원치않는 D-이성질체의 소모만 초래할 것이므로, 이러한 유전자를 제거할 필요는 없을 것이다.
실시예 5: 푸마르산 생산 모나스쿠스 균주의 생성
a) 푸마르산 생산에 관여되는 내생성 모나스쿠스 유전자의 동정
모나스쿠스 루버 LF6 의 게놈을 푸마레이트의 생산에 관여되는 효소를 인코딩하는 서열의 존재에 대해 분석했다. 모나스쿠스 루버는 피루베이트 카르복실라아제를 인코딩하는 유전자 (SEQ ID NO:7, 도 28) 및 말레이트 디히드로게나아제를 인코딩하는 유전자 (SEQ ID NO:8, 도 29) 를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 유기산 용인성 모나스쿠스 균주에서의 푸마르산 생산을 위해 이들 서열을 선택했다.
b) 벡터 구축.
벡터를 상기 방법론을 사용하여 구축한다. 하기 벡터를 생성한다:
- pCPCH#PDC1 (도 30), 하이그로마이신 선택, PDC1 녹아웃, 모나스쿠스 LF6 피루베이트 카르복실라아제 유전자의 도입.
- pCMDHN#PDC2 (도 31), 게네티신 선택, PDC2 녹아웃, 모나스쿠스 LF6 말레이트 디히드로게나아제 유전자 (SEQ ID NO: 8) 의 도입
- pCNATFUM#PDC4 (도 32), 노르세오트리신 선택, PDC4 녹아웃, 모나스쿠스 루버에 코돈 최적화된 리조푸스 오리재 푸마라아제 유전자 (SEQ ID NO: 9, 도 33) 의 도입
- pCBDAC (도 34), 제오신 선택, 모나스쿠스 루버에 코돈 최적화된 스키조사카로마이세스 폼베로부터의 디카르복시산 담체 유전자 Mae-1 (SEQ ID NO: 10, 도 35) 의 도입.
c) 조합된 PDC 녹-아웃 및 푸마레이트 경로 삽입.
위에 기재된 표준 절차에 따라, 벡터 pCPCH#PDC1, pCMDHN#PDC2, pCNATFUM#PDC4, 및 pCBDAC 를 사용하여 40℃ 에서 모나스쿠스 균주로부터 수집된 포자를 순차적으로 형질전환시킨다.
야생형 균주 LF6 으로부터의 첫번째 포자를 벡터 pCPCH#PDC1 로 형질전환시킨다.
하이그로마이신을 함유하는 선택 플레이트에서의 10 일의 생장 후 생장하는 콜로니가 관찰되고, 그들 중 20 개를 새로운 하이그로마이신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 PDC1 유전자 녹아웃 (ko) 및 피루베이트 카르복실라아제 유전자 삽입에 대해 시험했다. 이는 LF6-(PDC1 ko +PC) 를 초래한다.
LF6-(PDC1 ko +PC) 형질전환체로부터 수득된 포자를 pCMDHN#PDC2 벡터에 의한 형질전환에 사용한다. G418 (게네티신) 을 함유하는 선택 플레이트에서의 선택 후 생장하는 콜로니가 관찰되고, 그들 중 20 개를 새로운 게네티신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 PDC2 유전자 녹아웃 및 말레이트 디히드로게나아제 유전자 삽입에 대해 시험한다. 이는 LF6-(PDC1/2 ko +PC+MD) 를 초래한다.
LF6-(PDC1 /2 ko +PC +MD) 형질전환체로부터 수득된 포자를 pCNATFUM#PDC4 벡터에 의한 형질전환에 사용한다. 노르세오트리신을 함유하는 선택 플레이트에서의 선택 후 생장하는 콜로니가 관찰되고, 그들 중 20 개를 새로운 노르세오트리신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 PDC4 유전자 녹아웃 및 푸마라아제 유전자 삽입에 대해 시험한다. 이는 LF6-(PDC1/2/4 ko +PC+MD+FU) 를 초래한다.
LF6-(PDC1/2/4 ko +PC +MD+FU) 형질전환체로부터 수득된 포자를 pCBDAC 벡터벡터에 의한 형질전환에 사용한다. 제오신을 함유하는 선택 플레이트에서의 선택 후 생장하는 콜로니가 관찰되고, 그들 중 20 개를 새로운 제오신 함유 플레이트로 이동시키고, PCR 에 의해 디카르복시산 담체 유전자 삽입에 대해 시험한다. 이는 LF6-(PDC1/2/4 ko +PC+MD+FU+DAC) = LF6-1-PMFD#PDC 를 초래한다.
이러한 순서의 형질전환은 균주 LF6-1-PMFD#PDC 를 초래하며, 이는 PDC1, 2 및 4 녹아웃임이 확인되었고, 구성 프로모터 터미네이터 조합의 제어 하에 동종유래 피루베이트 카르복실라아제 유전자, 동종유래 말레이트 디히드로게나아제, 이종성 푸마라아제 유전자 및 이종성 디카르복시산 담체 유전자를 모두 함유한다.
<110> Total S.A.
<120> Use of Monascus in organic acid production
<130> TOTAL-138-PCT
<150> EP-A-10290583.3
<151> 2010-10-28
<150> US61/407747
<151> 2010-10-28
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized bovine LDH sequence
<220>
<221> intron
<222> (503)..(566)
<400> 1
atggcaaccc tgaaggacca gcttatccaa aacctgctca aggaagaaca cgtcccccaa 60
aacaagatta ctatcgtcgg agtcggtgcc gttggaatgg cctgcgctat ctccattctg 120
atgaaggacc tcgcagatga ggtggcgctc gtcgacgtta tggaggataa gctcaagggt 180
gaaatgatgg accttcagca tggatcgctt ttcttgcgca cacccaagat cgtcagcggc 240
aaggattaca acgttacagc aaattcccgc cttgtgatca ttactgcagg cgcgcgtcag 300
caagagggtg aatcgagact gaacctcgtc caaaggaacg ttaatatctt caagttcatc 360
atccccaaca ttgtcaagta ctccccaaat tgtaagctgc tcgtcgtttc taatccggtt 420
gacatcctca cttatgtggc ctggaagatt tctggcttcc ctaagaaccg agttatcggc 480
tcgggttgca atcttgatag cgctcgattt cggtatctta tgggagagag attgggcgtc 540
catcccctgt cctgtcacgg ctggatcttg ggagaacacg gcgactcctc tgtgccagtc 600
tggtcgggtg tcaacgtggc cggagtcagc cttaagaatt tgcatccgga gttgggcacc 660
gacgccgata aggaacagtg gaaggctgtc cacaagcaag tggtcgactc cgcatacgag 720
gttatcaagc tgaagggata tacctcctgg gcgattggcc tctctgtggc cgatcttgct 780
gaaagcatca tgaagaactt gcgccgtgtc catcctatct ccacgatgat taagggtctg 840
tacggaatta aggaagacgt gtttttgtct gtcccctgca tcctgggcca gaatggtatt 900
tcggatgttg tgaaggtcac cctcacgcac gaggaagagg cttgcttgaa gaagtcggcg 960
gacactctct ggggcatcca aaaggaactc caattttaa 999
<210> 2
<211> 1015
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<220>
<221> intron
<222> (503)..(566)
<400> 2
aagtatgcgg ggcaggatgc cacaaaggcc tattctgaag ttcacactcc gagccttatc 60
aaatggaatt tatccccaga caagctcaag ggcactctcg gccaatccac tattgacgat 120
gaatggatga aaccaccgcc aaatgagagc gacaaagttg ttttagagaa cgagaaaccg 180
ccgctgcata tgctgataaa ctcgcacgat ttcgaagtcg tagcttccaa gactgcaagt 240
aagaagacct gggccttcta ttccagcgct gcaacggacc tcatcacccg tgatgccaat 300
aagtcatgct ttgaccggat atggttccga ccccgggtac tgaggaatgt gcgtaccgtc 360
aaaacgcgca cgaagatcct cggggttgac agcagtctcc cacttttcgt gagtccagca 420
gctatggcta agctcattca cccagatggt gagtgtgcca tagcaagggc atgtgcaaat 480
aagggtatca ttcaaggtgt acgttcattg cagattcgaa cacttcccgt tctagttgca 540
accttcttaa catcaatgtc ggataggtgt cgaataactc atcattccca atcgaagagc 600
tccgggaggc ggcaccgtct ggaaatttta ttttccagtt atatgtgaat cgggatcgag 660
agaaatctgc ggaactactc cgcaggtgct cagctaaccc gaacatcaag gccatcttcg 720
tgaccgttga cgcagcctgg cccggtaaac gtgaggcaga cgaacgagtc aaagcggatg 780
agagcctgac agtccccatg tccccatcga caacacgcaa cgacaaaaag gggggcgggc 840
tcgggcgcgt tatggctggg ttcatcgacc cggggctcac ctgggaagat ctggcctggg 900
tgcgacaaca tacccatctc cccgtttgtc tgaagggaat tatgtccgca gacgatgcca 960
ttctagccat gaaattggga ctagatggca tcctgctctg caaccacggc ggccg 1015
<210> 3
<211> 1307
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 3
tgggtgggya aytgyaatga rctgaatgct ggttackccg ccgatggcta cgctcgtatc 60
aagggtatct ctgccctgat caccactttc ggtgtcggtg agctctctgc cgccaacgcc 120
atcgccggtt cctactcgga rcgggtgccc gttgtccaca ttgtcggtga gcccagcacg 180
gcatcccaga acaaccgcca gcttctgcac cacaccctcg gaaacggtga cttcgatgtc 240
ttcgagaaga tcttcgccaa gatctctact tccgtcgtta agattagaga ccccgccaat 300
gccgccacca tgatcgacca cgttctccgg gaatgtgtta tccagagccg ccccgtctac 360
atcggtctgc cctctgatat ggttaccaag aaggttgagg gagcccgcct gaagaccccc 420
atcgacctgt ccctccccga gaaccccaag gagaaggagg actacgtcgt cagcgtcgtt 480
ctcaagtatc tgcacgctgc caagaaccct gtcatcctcg tcgatgccgg tgtcaaccgc 540
cacaatgccc aggctgaggt gcacgagctg atcaagaagt ctggaatccc caccttcatc 600
acccccatgg gcaagggcgg tgttgacgaa accctcccca actacggcgg tgtctacgcc 660
ggtaccggtt ccaacagggg cgtccgcgag cgtgtcgagg aatctgacct catcctgaac 720
atcggacctc tccagtccga cttcaacacc accggcttct cctaccgcac cagccagctc 780
aacaccatcg agttcgaccg cgacagcgtc caggtccgct actcctacta ccccgacatc 840
cagcttaagg gagttctcca gaacctcatc gccaccatgg gcgaactcaa catcgagcct 900
ggcccgaccc cctccaacgc cctccccgcc aacggcgttg accacgaaac tgcagagatc 960
acccacgaat ggctctggcc catggtcggc aactggctcc gcgaaggtga tgttgtcctc 1020
actgaaaccg gtaccgccaa cttcggtatc tgggaaaccc gcttccccaa gaacgttcag 1080
gccatctccc aggtcctctg gggttccatc ggttactccg tcggtgcctg cttgggtgct 1140
gctctcgccg ctcgggaact tggcgacaac cgtgtcctac tcttcgtcgg tgatggtagc 1200
ttycagatga ccgcccagga gatcagcact atgatccgtc agggattgaa gcctattgtc 1260
ttcgtcatct gcaacaacgg ctacacmatc garmgctaca tccacgg 1307
<210> 4
<211> 1287
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 4
ctgaacgccg sctacgccgc cgacggatay gctcgtgtca atggaatcgc tgccttggtt 60
actactttcg gtgtaggaga gctgtcagca gtgaacgcca ttgcgggagc ctactcagag 120
tatgtaccca tcgttcacat tgttggccaa ccaaatacaa ggtcacagag agatggaatg 180
ctgttgcatc atacgttggg caacggcgac tttgatgtct ttaccaagat gagtgcttcc 240
atttcgtgcg ctgttgcaaa gttgaacgac ccccatgaag ctgcaacgct catcgaccac 300
gccattcggg aatgctggat tcgcagcaga ccggtgtaca tcaccctccc tacagacatc 360
gtcacgaaga aagtcgaagg tgaaaggctg aagaccccaa ttgacctgac aatgccagag 420
aatgaagcag aaagggaaga ttacgtggtg gatgttgttt tgaaatacct gcaagccgcg 480
aaaaacccag tcattctagt tgacgcatgc gcaatccgtc acagggtcct ggacgaggta 540
catgaccttg ttaaggcttc tggcttgcca acctttgtga ccccaatggg caaaggagca 600
gtggacgaga ctcatccaaa ttatggtggt gtgtatgctg gagatgggtc taataccggc 660
gtccgtgaag ttgttgaagc ttccgacctt attctgagca ttggcgccat taaatccgat 720
ttcaatactg ccggcttcac ataccgcatc ggccaactta acacgatcga cttccatagt 780
accttcgtgc gagtgaggta ttcggagtac ccgaacacaa acatgaaggg tgttctaagg 840
aagatcatcc agaaaatggg ccccctcagc aagacgccta ttccaaagac tatcaacaag 900
gttccagaac atatcaaagc ttctggtgac acgcggatta ctcatgcttg gttgtggccg 960
acagtcggac agtggctgca gccggaggat gttgtcgtca ctgagactgg aactgcaaac 1020
tttggaatct gggaaaccag gttcccacac ggtgtcacgg ctataagcca agtcctctgg 1080
ggaagcattg ggtacacggt tggagcatgt caaggcgccg cactagctgc aaaggagata 1140
ggcaaccgtc gcactgtact ttttgttggc gatggcagtt tccagcttac cgcgcaggaa 1200
gtgagcacca tgctcagaaa taagctgaac ccgatcattt ttgtgatctg taacgaaggg 1260
tayacratcg agcgctacat ccatggc 1287
<210> 5
<211> 1680
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 5
atgaccactg tcggaagcta cctcgcagaa aggctctccc aaattggcat cgagcgccac 60
ttcgtcgtcc caggcgacta caacctcatc ctcctcgaca aactccaaca acaccccaaa 120
ctcgacgaaa tcaactgcac aaatgaacta aactgctcca tggccgcaga aggctacgcc 180
cgcgcaaaag gcgtagccgc ctgcgtcgtg acgttcagcg tcggcgcatt ctccgcattc 240
aacggcatcg gcagcgcata cggtgagaat ctccctgtca tcctcatctc cggttcccct 300
aataccaacg atcttggctc gtcgcatttg ctgcatcata cgatcggtac gcataatttt 360
gactaccagc ttgagatggc gaaaaatatc acctgctgtg ctgttgcgat tcgtcgtgcc 420
tcggatgcgc cgcggttgat cgacgaggct attcgcaccg cacttcgggc gcggaaacca 480
gcgtatattg agattcctac gaacctctcg ggccagccgt gttccctgcc cggaccggcg 540
tcggggattc tcaagccgga tacgagtgat attgatactc ttgcggaagc gctgaaggca 600
gccaacgact tcctctctac ccggaacaag gtgtccttac tggttggccc taaggttcgc 660
gcagcaggcg ctgaacatgc cgtgatccat cttgctcaag ccctgggatg cgcggtggcc 720
gtgctaccca gtgccaaatc gttcttcccg gagactcatc cgcagttcgt gggtgtatac 780
tggggcgaag tgagcacgaa gggcgcgaat gctatcgtcg actggtccga tacccttatt 840
tgcgtgggga cggtttacac cgactacagc accgttggat ggacggggct acccgaagca 900
gccagtctga ccattgacct ggaccatgtc agtttccctg gatccgatta caaccagatc 960
catatgctgg agttcgtggc aggactggcg aagctggtga agaagaaccc cctgacactc 1020
gtcgaatata accgtctgca accagaccct ctcgttcaca cgccatctcc gccggatcaa 1080
cgactgagcc ggcgagaaat gcagtaccag atcagccagt tcctgacgcg caacacgacg 1140
gtcgttgtgg acacgggcga ctcgtggttc aacgggatgc agatggacct tccggacgga 1200
gtgagatttg aggttgagat gcaatgggga cacatcggat ggtccgttcc agcagcactg 1260
ggtctggccg ccgcaaaccc cgagcgacag atagtcgtca tggtaggcga tgggtcgttc 1320
cagatgacgg gccacgaggt gtcaaatatg actcgattag ggctaccgat tatcatcttc 1380
ctgatcaaca atgacgggta cacaatcgaa gtcgagatcc acgatggcat ctacaacaac 1440
atcaagaact gggattacgg cgcgttcgtc gagtcgttca atgccaagga gggacatggg 1500
aaggggtatc gtgttaccac ggcgggggaa atgcacaggg ccattgaggc ggcgaagaag 1560
aataaacagg ggccaacact aatcgagtgt gatattgatc gcgatgattg cagtaaggag 1620
ttgatcagtt gggggcatta tgtggctgct gcgaatggca agcctcctgt tgccaggtga 1680
1680
<210> 6
<211> 1655
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 6
atgtctcaac ctaagcttac cggcgctgat atcgccaaac acaattccaa ggactcgtgc 60
tgggtcattg tccacgggaa agcatacgat gtcacggact tcctgccagg tattgattga 120
cccccctgtc cgggaattcc gagatgctgc ctgcgttcat tgaatactga tttgcatgaa 180
tttgatcaat tatagaacat cccggtggcc agaagattat cctgaagtat gccggcagag 240
atgccacgga agaattcgag cccatccacc ccccggatac cctggacaag tacctcgaca 300
agtcaaagca cttgggcgag gtcgacatgg ccactgtcgc acacgacgag aaggctgtcg 360
atcccgagga gacggctcgc caggaaagaa tcaagctcat gccatcgttg caatcctgct 420
acaatctgat ggactttgaa tccgtggcgc agcaggtcat gaagaagact gcgtgggcat 480
actactcaag tggtgctgat gatgaaatcg tatgaccata tctggatttc tcgttccctt 540
tgcagcacat actgacttgc gtctgttcac agaccctgcg agaaaaccac actgccttcc 600
ataagatctg gttccggccg cgagtcctag tcgacgtgga acatgtcgac tactctacga 660
ccatgctggg aaccaaggtc tccgctccct tctatgtgac ggccacagcc ctgggcaaac 720
tgggacaccc cgagggtgag gtcgttctca cccgttcctc ctaccgtcac aacgtcatcc 780
agatgattcc cacgctcgcc tcgtgctcct ttgacgagat tattgacgcc cgccaaggcg 840
atcaggtcca gtggctgcag ctctacgtca acaagaaccg cgatatcacc aagcgcattg 900
tgcaacatgc cgaagcccgc ggctgcaagg gcctcttcat caccgtcgac gccccgcaat 960
taggtcgtcg agagaaagac atgcgctcca agttctccga cgagggctcc aacgtccaga 1020
aagaagaggg tgaggagaac gtcgaccgct ctcagggtgc cgcccgtgct atctcctcgt 1080
tcatcgaccc cgccctctcc tggaaggata tcccctggtt ccaatccatc acgaagatgc 1140
ccatcgtcct gaagggtgtg cagtgcgtcg aagacgtttt ccgtgctatc gaagccggag 1200
tccagggtgt tgtgctgtcc aatcacggtg gccgtcagct cgagttcgca ccatcggctg 1260
tcgagcttct ggccgaggtt atgcctgcgc tgcgccagcg cggcttggag aacagcatcg 1320
aggtgtacat cgacggtggc atccgcagag gcactgatat cgtcaaggcg ctctgccttg 1380
gcgcccaggg cgtggggatt ggtcgtcctt tcctgtacgc catgtcggcg tacggccagg 1440
ccggtgtcga caaggccatg cagcttctca aggatgagat ggagatgaac atgagactca 1500
tcggagccac taaggtctcc gagctgagcc ccagcctcgt cgatacccgc ggtcttcttg 1560
gtggtcacca cgctcctgtt ccgtccgaca cgctgggcat gaaggcgtac gatgcgctcc 1620
aggctccgcg gttcaacgaa aagtcgaagt tgtag 1655
<210> 7
<211> 3654
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 7
atggctgccg tcgccaatgg ctccgccgcc aacggcgccc ttcaccacga cgagcacgat 60
gaccaccatg cacaccaccg cgactcggtc caccgccgtt tgcgggccaa ttccaccatc 120
atgcactttc aaaagatcct ggtcgccaat cgtggtgaaa tccccatccg tatcttccgt 180
accgcccacg agctgtctct gcagaccgtg gccattttct cctacgagga ccgtctgtcc 240
atgcaccgtc agaaggccga cgaggcctac cagattggcc atcggggcca atacactccg 300
gtcggcgcct atctcgccat tgacgagatc atcaagattg ccctggaaca cgacgttcac 360
ctgatccacc ctggctatgg ctttctgtcc gagaatgccg aattcgcccg caaggtcgag 420
gaggccggca tgatcttcat tggtcccacc ccggagacca tcgagagcct tggcgacaag 480
gtttcggctc gagaactagc ccttcgtgct gacgtgcccg tcgttcctgg cactgacggt 540
cccgtggaac gctacgagga ggtcaaggcc ttcaccgaca agtatggctt ccccgtcatt 600
atcaaggccg ccttcggtgg tggcggtcgt ggtatgcgtg ttgtgcgcgg cgaagccgag 660
ctgcgtgact cactcgagcg tgccacttcc gaggccaagt cggccttcgg caacggcact 720
gtctttgtcg agcgcttcct cgacaagccc aagcacatcg aggttcagct cctgggtgac 780
aaccacggca acatcatcca cctgttcgag cgtgactgct ccgtccagcg tcgtcaccag 840
aaggtcgtcg agattgcccc cgccaaggag ctgccctctg acgtccgcga ccgcatcttg 900
gccgatgccg tgaagctggc caagaccgcc cgttaccgca acgccggtac cgcggagttc 960
ctggttgacc agcagaaccg ccactacttt attgagatca acccccgtat ccaggtcgag 1020
cacaccatca ccgaggagat caccggcatc gatatcgttg ccgcgcagat tcagatcgcc 1080
gctggtgcca ccctcgagca gctgggcctt actcaggagc gcatctccgc ccgtggcttc 1140
gccatccagt gccgtatcac cacagaagac cccgccaagg gcttctctcc agacaccggc 1200
cgcattgaag tctaccgttc ctccggtggc aatggcgtgc gtctggacgg tggtaatggc 1260
ttcgcgggtg ctaccatcac ccctcactat gactccatgt tggtcaagtg tacttgccgt 1320
ggttccacat acgagatcgc gcgccgcaag atgctgcgtg ccctggtcga attccgcatc 1380
cgcggtgtca agaccaacat tcccttcctg gcctcgctgc tgagtcaccc gactttcatc 1440
gacggcaact gctggaccac cttcatcgac gacacccccg aactgttcgc cctcgtgggc 1500
agccagaatc gtgcccagaa attgctggcc taccttggtg acgtcgctgt caacggaagc 1560
agcatcaagg gccaagttgg cgagcccaag ttcaagggcg aaatcatccg tcctacgttg 1620
ctggatgacg ctggcaagcc cctcgatgtc tccgaaccct gcaccaaggg ctggaaggag 1680
atcatcgata aagaaggccc cgatgccttt gcaaaggccg tccgtgccta caagggttgc 1740
cttatcatgg ataccacctg gcgtgatgcc caccagtccc tgctggcgac ccgtgtccgt 1800
acgatcgaca tgctgaacat tgctcacgag accagccacg ccctctccaa cgcctacagt 1860
ctggaatgct ggggaggtgc caccttcgat gtggccatgc gcttccttta cgaggaccca 1920
tgggaccgtc tgcgcaagtt ccgcaaggct gttcccaaca tccccttcca gatgctgctc 1980
cgtggcgcca acggtgtcgc atactcttcc ctccccgaca atgctattta ccacttctgc 2040
aagcaggcta agaagtacgg agtcgacatc ttccgtgtct ttgacgctct aaatgatata 2100
aatcagctcg aggtcggaat caaggccgtc aaggctgcgg gtggtgttgt cgaggccacc 2160
gtctgctaca gcggtgacat gttgaacccc aagaagaagt acaacctgca gtactacctt 2220
gatctggttg acaagattgt caagctcggc acccatgttc tgggtatcaa ggatatggct 2280
ggtgttctca agccccaggc agcccgcatc ctcatcggct ccatccgctc tcggtacccc 2340
gacctgccca ttcacgtcca cacccacgat tccgcgggta ctggtgtcgc gtccatggtc 2400
gcttgcgctc aggctggtgc cgacgccgtt gatgcggcca ccgatagctt gtccggcatg 2460
acttcccagc ccagcatcgg cgccatcctg gcctcgctgg agggcaccga gcatgatcct 2520
aaactcaacc tctcccacgt gagagccctc gacagctact gggcccagtt gcggttgttg 2580
tactcgcctt tcgaggccgg actgactggc cccgatcccg aggtctacga gcatgagatc 2640
cccggcggtc aattgaccaa cctgatcttc caggccagcc agctcgggtt gggtcagcag 2700
tgggccgaga ccaagaaggc gtacgaactg gccaacgatc tgttgggtga catcgtcaag 2760
gtcaccccaa cttccaaggt cgtgggtgac ttggctcagt tcatggtctc caacaaactc 2820
tcgcctcagg atgtcattga ccgtgcgggt gaactcgatt tccccggctc cgttctggag 2880
ttccttgagg gtcttatggg tcagccgtac ggtggattcc cagagccact gcgctccagg 2940
gccctgcgga accgccgcaa gcttgacaag cgtcctggtc tcttcctgga gccgctcgac 3000
ctggccaaga tcaagaacga tatccgcgag aagtggggtt ccgccaccga gtgcgatgtt 3060
gctagctacg ccatgtaccc caaggtcttt gaggactaca agaaattcgt acagaaatac 3120
ggtgatctct ccgtgttgcc cacccagtac ttcctgtcca ggccggagat cggcgaggaa 3180
ttccacgtgg aactcgagaa gggtaaggtc ctgatcctga agttactggc gatcggcccc 3240
ctctcggaac agaagggcca gcgtgaggtc ttctacgagg tcaacggtga agtgcgtcag 3300
gtcaccattg acgacaagaa cgcttctgtt gagaatacta cgcgcgccaa ggccgacccg 3360
caggacagca gccaagtcgg agcgcccatg agcggtgttg tggttgagat ccgcgtccat 3420
gatggacatg atgtcaagaa gggtgaccca attgctgtac tcagcgccat gaagatggta 3480
agcatcttgc acttccagtc tccttttctc tcctcattgg agaacgagta ctaacaattc 3540
tcataggaaa tggttatctc cgctcctcat agtggaaagg tatccggcat gctcgtccgg 3600
gaaggagact cggtcgacgg tcaggatctt atctgcaaga tatccaaggc ttag 3654
<210> 8
<211> 1065
<212> DNA
<213> Monascus ruber
<400> 8
atggaacagt caaaggaaag attatatgtc acctcttcca atgcaaagag cttcacagaa 60
tccatattaa cagccaatgg cactccaccg gaccatgctt caatcgtggc caatagtcta 120
gtcctcgccg atctacgagg cgtagacacc cacggaatca accgtattcc atcttatatg 180
gagagaatcc gacaaggtgt gctggatgca gcagcaatcc cgacgataac tcagatcacc 240
cccgtcgtcg cgcaagtcga tggcaagaac gggttcgggt tcgtagcggc gcataagggg 300
atggcgcgtg ctattgaaat ggctcaggaa tttggaattg gctttgtatc agtgaaacac 360
tcgaatcatt tcggtatgtc tgcgtgggtc gtccaacagg cattggatgc cgggatgatg 420
agtctggtgt ttacgaactc atctcctgcc ctgccggtct ggggcgggaa ggagaaactc 480
atgggcgtgt cacctattgc atgtggagct ccagctggac gtgaaaggcc atttattttg 540
gacatggcac cgtccatcgc tgcgaggggg aagatatata aagccgctcg ccgtggggag 600
aagatccccc cagactgggc tctggatgct gaagggaagc ctactgaaaa tccagagaaa 660
gcactcaaag gtgtcatgct tcccatgggt ggcccgaagg ggtcggccct tgctatcatg 720
atggatgtct tctccggagt gttgtctggt tctgcatttg ccgggcatgt aaccaatccg 780
tacgatccgt cgcggccagc agacgtggga cattttctga ttgctttgaa accagatctg 840
ttcatagatc ttgaggattt caagaaccgg atggattatc tctatcaacg agttgtcggg 900
tcagaaagga tggctggtgt ggagagaata tattatccgg gcgaaatcga gcagatgata 960
catgagaaaa gattgcagac aggaattccg tacgtccagg cagagattga cgctctgaat 1020
aatgaggcag agaaggctgg gactggaaag attattacct cgtaa 1065
<210> 9
<211> 1314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mae-1 gene codon optimized for Monascus ruber
<400> 9
atgggtgagc tcaaggagat cctcaagcag cgctaccacg agctcctcga ctggaacgtc 60
aaggcccccc acgtccccct ctcccagcgc ctcaagcact tcacctggtc ctggttcgcc 120
tgcaccatgg ccaccggtgg tgtcggtctc atcatcggtt ccttcccctt ccgcttctac 180
ggtctcaaca ccatcggtaa gatcgtctac atcctccaga tcttcctctt ctccctcttc 240
ggttcctgca tgctcttccg cttcatcaag tacccctcca ccatcaagga ctcctggaac 300
caccacctcg agaagctctt catcgccacc tgcctcctct ccatctccac cttcatcgac 360
atgctcgcca tctacgccta ccccgacacc ggtgagtgga tggtctgggt catccgcatc 420
ctctactaca tctacgtcgc cgtctccttc atctactgcg tcatggcctt cttcaccatc 480
ttcaacaacc acgtctacac catcgagacc gcctcccccg cctggatcct ccccatcttc 540
ccccccatga tctgcggtgt catcgccggt gccgtcaact ccacccagcc cgcccaccag 600
ctcaagaaca tggtcatctt cggtatcctc ttccagggtc tcggtttctg ggtctacctc 660
ctcctcttcg ccgtcaacgt cctccgcttc ttcaccgtcg gtctcgccaa gccccaggac 720
cgccccggta tgttcatgtt cgtcggtccc cccgccttct ccggtctcgc cctcatcaac 780
atcgcccgcg gtgccatggg ttcccgcccc tacatcttcg tcggtgccaa ctcctccgag 840
tacctcggtt tcgtctccac cttcatggcc atcttcatct ggggtctcgc cgcctggtgc 900
tactgcctcg ccatggtctc cttcctcgcc ggtttcttca cccgcgcccc cctcaagttc 960
gcctgcggtt ggttcgcctt catcttcccc aacgtcggtt tcgtcaactg caccatcgag 1020
atcggtaaga tgatcgactc caaggccttc cagatgttcg gtcacatcat cggtgtcatc 1080
ctctgcatcc agtggatcct cctcatgtac ctcatggtcc gcgccttcct cgtcaacgac 1140
ctctgctacc ccggtaagga cgaggacgcc cacccccccc ccaagcccaa caccggtgtc 1200
ctcaacccca ccttcccccc cgagaaggcc cccgcctccc tcgagaaggt cgacacccac 1260
gtcacctcca ccggtggtga gtccgacccc ccctcctccg agcacgagtc cgtc 1314
<210> 10
<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fum-1 gene of Rhizopus oryzae optimized for Monascus ruber
<400> 10
atgaacaact ccccccgcct cttctcctcc gcctccgccg ccctccagaa gttccgcgcc 60
gagcgcgaca ccttcggtga cctccaggtc cccgccgacc gctactgggg tgcccagacc 120
cagcgctccc tccagaactt cgacatcggt ggtcccaccg agcgcatgcc cgagcccctc 180
atccgcgcct tcggtgtcct caagaaggcc gccgccaccg tcaacatgac ctacggtctc 240
gaccccaagg tcggtgaggc catccagaag gccgccgacg aggtcatcga cggttccctc 300
atcgaccact tccccctcgt cgtctggcag accggttccg gtacccagac caagatgaac 360
gtcaacgagg tcatctccaa ccgcgccatc gagctcctcg gtggtgagct cggttccaag 420
gcccccgtcc accccaacga ccacgtcaac atgtcccagt cctccaacga caccttcccc 480
accgccatgc acgtcgccgc cgtcgtcgag atccacggtc gcctcatccc cgccctcacc 540
accctccgcg acgccctcca ggccaagtcc gccgagttcg agcacatcat caagatcggt 600
cgcacccacc tccaggacgc cacccccctc accctcggtc aggagttctc cggttacacc 660
cagcagctca cctacggtat cgcccgcgtc cagggtaccc tcgagcgcct ctacaacctc 720
gcccagggtg gtaccgccgt cggtaccggt ctcaacaccc gcaagggttt cgacgccaag 780
gtcgccgagg ccatcgcctc catcaccggt ctccccttca agaccgcccc caacaagttc 840
gaggccctcg ccgcccacga cgccctcgtc gaggcccacg gtgccctcaa caccgtcgcc 900
tgctccctca tgaagatcgc caacgacatc cgctacctcg gttccggtcc ccgctgcggt 960
ctcggtgagc tctccctccc cgagaacgag cccggttcct ccatcatgcc cggtaaggtc 1020
aaccccaccc agtgcgaggc catgaccatg gtctgcgccc aggtcatggg taacaacacc 1080
gccatctccg tcgccggttc caacggtcag ttcgagctca acgtcttcaa gcccgtcatg 1140
atcaagaacc tcatccagtc catccgcctc atctccgacg cctccatctc cttcaccaag 1200
aactgcgtcg tcggtatcga ggccaacgag aagaagatct cctccatcat gaacgagtcc 1260
ctcatgctcg tcaccgccct caacccccac atcggttacg acaaggccgc caagtgcgcc 1320
aagaaggccc acaaggaggg taccaccctc aaggaggccg ccctctccct cggttacctc 1380
acctccgagg agttcgacca gtgggtccgc cccgaggaca tgatctccgc caaggac 1437
Claims (21)
- 하기 단계를 포함하는, 유기산을 포함하는 조성물의 제조 방법:
(i) 5.0 미만의 pH 에서 50 g/L 이상의 유기산 농도에 대해 용인성인, 상기 유기산의 증가된 생산을 위해 유전자적으로 개질된, 모나스쿠스 (Monascus) 속의 미생물을 제공하는 단계; 및
(ii) 유일한 탄소 공급원으로서 육탄당 또는 오탄당 또는 그들의 조합의 존재 하에 유기산의 pKa 값 보다 1.5 단위 미만 만큼 더 높은 pH 에서 상기 미생물을 배양하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 3.0 미만의 pH 에서 50 g/L 이상의 유기산 농도에 대해 용인성인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미생물이 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
a) 상기 유기산의 생산에 관여되는 하나 이상의 재조합된 유전자; 및/또는
b) 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자 및/또는 관심대상의 유기산을 소모하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 에탄올의 내생성 생산에 관여되는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 미생물이 내생성 PDC1, PDC2 및/또는 PDC4 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기산이 락트산, 숙신산 및/또는 푸마르산인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 유기산이 락트산이고, 상기 모나스쿠스 균주가 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
a) L-LDH 를 인코딩하는 재조합된 유전자; 및
b) 내생성 D-락트산 생산 또는 L-락트산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 락트산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화. - 제 7 항에 있어서, L-LDH 를 인코딩하는 상기 재조합된 유전자가 이종성 또는 외인성 LDH 유전자인 방법.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 모나스쿠스 균주가 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 푸마레이트 리덕타아제, 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합 내에 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 방법.
- 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모나스쿠스 균주가 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh) 및/또는 L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh) 를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 유기산이 숙신산 및/또는 푸마르산이고, 상기 미생물이 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
a) 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나아제 유전자, 말레이트 디히드로게나아제 유전자, 푸마라아제 유전자, 푸마레이트 리덕타아제 유전자, 이소시트레이트 리아제 유전자 및/또는 말레이트 합성효소 유전자로부터 선택되는 하나 이상 이종성 또는 외인성 유전자; 및/또는
b) 내생성 숙신산 및/또는 푸마르산 소모 경로에 관여되는 유전자 또는 숙신산 및/또는 푸마르산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 경로에 관여되는 생성물을 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화. - 제 11 항에 있어서, 상기 유기산이 푸마르산이고, 상기 미생물이 피루베이트 디카르복실라아제 유전자, 말레이트 디히드로게나아제 유전자, 및 푸마라아제 유전자로부터 선택되는 하나 이상 이종성 유전자를 포함하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 미생물이 피루베이트 디카르복실라아제 (pdc), 알코올 디히드로게나아제 (adh), 아세트알데히드디히드로게나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc), D-락테이트 디히드로게나아제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나아제 (l-ldh), 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나아제, 이소시트레이트 디히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 하나 이상 유전자 및 상기 유전자의 임의의 조합 내에 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기산이 숙신산이고, 상기 미생물이 숙시네이트 디히드로게나아제 또는 푸마레이트 리덕타아제를 인코딩하는 내생성 유전자 내에 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화를 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기산이 육탄당 또는 오탄당 또는 육탄당 및 오탄당의 조합으로부터 0.5 g/L 이상의 수율로 생산되는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 수율이 2 g/L 이상인 방법.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 모나스쿠스 속 내의 종이 모나스쿠스 루버 (Monascus ruber) 인 방법.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 방법을 포함하고, 배양 배지로부터 유기산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 정제된 유기산의 제조 방법.
- 5.0 미만의 pH 에서 50 g/L 이상의 유기산 농도에 대해 용인성인, 상기 유기산의 증가된 생산을 위해 유전자적으로 개질된, 단리된 모나스쿠스 속의 미생물.
- 제 19 항에 있어서, 3.0 미만의 pH 에서 50 g/L 이상의 유기산 농도에 대해 용인성인 미생물.
- 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 미생물:
a) 상기 유기산의 생산에 관여되는 하나 이상의 재조합된 유전자; 및/또는
b) 관심대상의 유기산 이외의 대사물을 생산하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자 및/또는 관심대상의 유기산을 소모하는 내생성 대사 경로에 관여되는 유전자의 하나 이상의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화.
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