CN101365782A - 重组酵母中的苹果酸生产 - Google Patents
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Abstract
我们公开了一种重组酵母,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区进行功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。我们还公开了通过在含有碳源和二氧化碳源的培养基中培养这种酵母,并从培养基分离苹果酸来生产苹果酸的方法。
Description
发明背景
本发明总地涉及微生物的工业用途。更具体地,它涉及通过酵母生产苹果酸或琥珀酸。
在进行工业加工中使用微生物如酵母已经不知不觉地进行了数千年,并且成为学术调查的课题也有几十年了。酵母如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)已经用来生产许多不同的小分子,包括有机酸。
然而,一种难以用酵母,尤其是啤酒糖酵母产生的有机酸是苹果酸。苹果酸,C4H6O5,是二羧基有机酸,给许多酸的(sour或tart)食物赋予了酸味,例如青苹果和酒。苹果酸可用于食品加工工业,作为酸味源用于各种食品中。在当下,我们并不知道通过酵母可以高产量地生产苹果酸。
发明概述
在一个实施方案中,本发明涉及一种重组酵母,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区进行功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种生产苹果酸或琥珀酸的方法,包括在含有碳源和二氧化碳源的培养基中培养重组酵母;并从该培养基中分离苹果酸或琥珀酸,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。
附图简述
以下的附图形成了本说明书的一部分,并且用来进一步证明本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或多个并结合在此呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
附图1表明了如实施例1所述的葡萄糖和丙酮酸浓度随培养时间的函数变化。
附图2表明了如实施例1所述的苹果酸、甘油和琥珀酸浓度随培养时间的函数变化。
附图3是如实施例1中所述的质粒p426GPDMDH3的图谱。
附图4是如实施例1中所述的质粒pRS2的图谱。
附图5是如实施例1中所述的质粒pRS2ΔMDH3的图谱。
附图6是如实施例1中所述的质粒YEplac112 SpMAE1的图谱。
附图7表明了实施例2、批次A中的起始生物量、葡萄糖消耗量和丙酮酸的产生。
附图8表明了实施例2、批次A中的苹果酸、甘油和琥珀酸的产生。
附图9表明了实施例2、批次B中的起始生物量、葡萄糖消耗量和丙酮酸的产生。
附图10表明了实施例2、批次B中的苹果酸、甘油和琥珀酸的产生。
附图11表明了实施例2、批次C中的起始生物量、葡萄糖消耗量和丙酮酸的产生。
附图12表明了实施例2、批次C中的苹果酸、甘油和琥珀酸的产生。
说明性实施方案的描述
在一个实施方案中,本发明涉及一种重组酵母,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。
本领域中已知的用于工业生产过程的任何酵母都可以被本领域技术人员根据常规实验用于该方法中,而具有本发明公开内容的益处。待转化的酵母可以选自任何已知的酵母属和种。N.J.W.Kreger-vanRij,“The Yeasts”,Vol.1 of Biology of Yeasts,Ch.2中描述了酵母,A.H.Rose和J.S.Harrison编辑,Academic Press,London,1987。在一个实施方案中,酵母属可以是酵母属(Saccharomyces),接合酵母属(Zygosaccharomyces),假丝酵母属(Candida),汉逊酵母属(Hansenula),克鲁维氏酵母属(Kl???uyveromyces),德巴利酵母属(Debaromyces),拿逊酵母属(Nadsonia),油脂酵母(Lipomyces),球拟酵母属(Torulopsis),克勒克氏酵母属(Kloeckera),毕赤氏酵母属(Pichia),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),三角酵母属(Trigonopsis),酒香酵母属(Brettanomyces),隐球酵母属(Cryptococcus),毛孢子菌属(Trichosporon),短梗霉属(Aureobasidium),油脂酵母(Lipomyces),Phaffia,红酵母属(Rhodotorula),子囊菌酵母属(Yarrowia)或许旺氏酵母属(Schwanniomyces),等等。在另一个实施方案中,酵母可以是酵母属,接合酵母属,克鲁维氏酵母属或毕赤氏酵母属。在另一个实施方案中,酵母可以是啤酒糖酵母。啤酒糖酵母是在工业生产过程中常用的酵母,但本发明不限于此。
“重组”酵母是含有酵母中非天然存在的核苷酸序列或内源性核酸序列的其他拷贝的酵母,其中将核酸序列通过人为行为引入酵母或其祖细胞中。重组DNA技术是公知的,如Sambrook等,MolecularGenetics:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,它提供了关于本领域已知的和在此讨论的有关各种不同技术的进一步的信息。在这个实施方案中,从具有该基因的生物体中分离出同源和/或异源基因的编码区。生物体可以是细菌、原核生物、真核生物、微生物、真菌、植物或动物。
可以通过任何已知的方法从生物体的细胞中提取出含有编码区的遗传物质。此后,可以通过任何合适的方法分离出编码区。在一种已知的技术中,通过以下步骤分离了编码区,首先,制备基因组DNA文库或cDNA文库,其次,鉴定基因组DNA文库或cDNA文库中的编码区,例如通过用选择是或推测是与编码区至少部分同源的标记核苷酸探针来探测文库,确定该编码区的表达是否赋予了含有该编码区的文库微生物可检测的表型,或通过PCR扩增所需的序列。也可以使用其他用于分离该编码区的已知技术。
“PDC阴性”在此用于描述当使用van Maris,AJ.A.,M.Ah.Luttik,A.A.Winkler,J.P.van Dijken,和J.T.Pronk.2003之前描述的方法时,具有低于0.005微摩尔/分钟mg蛋白质-1丙酮酸脱羧酶活性的酵母。可以将这样的酵母称为“无PDC活性”。Overproduction of Threonine Aldolase Circumvents theBiosynthetic Role of Pyruvate Decarboxylase in Glucose-grownSaccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.69:2094-2099。在此可以将这样的酵母称为“无PDC活性”。
可以通过任何合适的技术来分离或工程化PDC阴性酵母。大的基因多样酵母起始群体可以含有PDC阴性的天然突变体。可以对起始群体进行诱变或基于恒化器的选择。典型的PDC阳性酵母菌株包含(A)至少一个能够在酵母菌株中得到表达的PDC结构基因;(B)至少一个能够在酵母菌株中得到表达的PDC调控基因;(C)PDC结构基因的启动子;和(D)PDC调控基因的启动子。在PDC阴性酵母中,可以将(A)-(D)中的一个或多个(i)突变,(ii)破坏或(iii)缺失。在某些实施方案中,(A)-(D)中的一个或多个的突变、破坏或缺失可以导致丙酮酸脱羧酶活性的缺乏。
在一个实施方案中,PDC阴性酵母是啤酒糖酵母菌株TAM(不具有可检测的丙酮酸脱羧酶活性、C2碳源独立性的、葡萄糖耐受性的“MATapdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52”ura-酵母)。
丙酮酸羧化酶(PYC)可以是能够催化从丙酮酸转变成草酰乙酸的任何酶(EC 6.4.1.1),其中PYC在细胞溶胶中是活性的。在本申请提交时,酶不必在文献中被鉴定为PYC定义之内的丙酮酸羧化酶。可以使用来自任何源生物体的PYC,并且PYC可以是野生型的或从野生型改良的。PYC可以是啤酒糖酵母丙酮酸羧化酶。在一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少75%的同一性。在一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少80%的同一性。在一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少85%的同一性。在一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少90%的同一性。在一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少95%的同一性。在另一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少96%的同一性。在另一个的实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少97%的同一性。在另一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少98%的同一性。在另一个实施方案中,PYC与SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列具有至少99%的同一性。还在另一个实施方案中,PYC具有SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列。
可以通过使用ClustalW程序及其缺省值进行的序列比对来测定同一性,所述的缺省值即:DNA缺口打开罚分=15.0,DNA缺口延伸罚分=6.66,DNA矩阵=同一性,蛋白质缺口打开罚分=10.0,蛋白质缺口延伸罚分=0.2,蛋白质矩阵=Gonnet。可以根据ClustalW文件描述的程序计算同一性:“对于每一对待比对的序列计算成对的得分。这些得分呈现在结果表中。成对的得分被计算为最佳比对中的完全相同的数目除以所比较的残基的数目(将缺口位置排除在外)。这两个得分最初被计算为百分比同一性得分,并通过除以100并减去1.0转化成距离来获得每个位点的差异数目。我们没有校正这些最初距离中的多个取代。由于与选定的矩阵和缺口无关地计算了成对的得分,所以对于特定的序列对而言,它的值总是相同的。”
需要注意的是,如果编码区编码与从生物体细胞纯化的相同蛋白质的序列基本上相同的蛋白质序列,则认为它是生物体的或来自生物体。
在一个实施方案中,用编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区转化酵母,可替换地或另外地用编码PYC的编码区来转化(EC4.1.1.38)。PEP羧化酶可以是能够催化磷酸烯醇丙酮酸盐转化成草酰乙酸盐的任何酶。在本申请提交时,酶不需要在文献中鉴定为PEP羧化酶定义内的PEP羧化酶。可以使用来自任何源生物体的PEP并且PEP羧化酶可以是野生型的或从野生型修饰的。PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感。已经观察到大肠杆菌PEP羧化酶受到苹果酸的抑制。
苹果酸脱氢酶(MDH)可以是能够催化草酰乙酸转化成苹果酸的任何酶(EC 1.1.1.37),其中MDH在细胞溶胶中是活性的并且在葡萄糖存在时不失活。(术语“苹果酸盐”和“苹果酸”在此可交替使用,除非文中指明了一种特定的离子种类)。在本申请提交时,酶不必在文献中鉴定为MDH定义之内的苹果酸脱氢酶。“在细胞溶胶中是活性的”意思是细胞溶胶中存在的催化活性形式的酶。“在葡萄糖存在时不失活”意思暴露于葡萄糖时,相对于葡萄糖不存在时,酶的催化活性没有降低。可以使用来自任何源生物体的MDH并且MDH可以是野生型的或野生型改良的。在一个实施方案中,MDH可以是啤酒糖酵母MDH1或啤酒糖酵母MDH3。野生型啤酒糖酵母MDH2在细胞溶胶中是活性的,但在葡萄糖存在时不失活。在一个实施方案中,MDH可以是修饰的啤酒糖酵母MDH2,(通过基因工程、翻译后修饰或任何其它本领域公知的方法)修饰,以在细胞溶胶中是活性的,并且在葡萄糖存在时不失活。在一个实施方案中,MDH含有信号序列或能够将NDH靶向酵母细胞溶胶的序列或MDH缺乏信号序列或能够将NDH靶向到细胞溶胶之外的酵母胞内区域的序列。在一个实施方案中,MDH可以是啤酒糖酵母MDH3 Δ SKL,其中已经改变了编码MDH的编码区以缺失通常将MDH3靶向过氧化物酶体的野生型啤酒糖酵母MDH3的羧端SKL残基。在一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少75%的同一性。在一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少80%的同一性。在一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少85%的同一性。在一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少90%的同一性。在一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少95%的同一性。在另一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少96%的同一性。在一个另外的实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少97%的同一性。在另一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少98%的同一性。在另一个实施方案中,MDH与SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列具有至少99%的同一性。在另一个实施方案中,MDH具有SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列。
苹果酸转运蛋白(MAE)可以是能够将苹果酸从酵母细胞溶胶穿过细胞膜转运至细胞外间隙中的任何蛋白质。在本申请提交时,酶蛋白质不必在文献中鉴定为MAE定义之内的苹果酸转运蛋白。可以使用来自任何源生物体的MAE并且MAE可以是野生型的或从野生型改良的。MAE可以是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)SpMAE1。在一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少75%的同一性。在一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少80%的同一性。在一个实施方案中,MAE与SEQ IDNO:3中给出的氨基酸序列具有至少85%的同一性。在一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少90%的同一性。在一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少95%的同一性。在另一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少96%的同一性。在另一个实施方案中,MAE与SEQID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少97%的同一性。在另一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少98%的同一性。再一个实施方案中,MAE与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列具有至少99%的同一性。在另一个实施方案中,MAE具有SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。
优选,将编码所需酶的编码区以这样的方式引入酵母中,使得在酵母中产生所需的酶,并具有实质性的功能。在此将这样的酵母称为“功能转化的”。
一旦从生物体的核酸中提取或用化学方法合成出编码酶或蛋白质的编码区,就可以用来转化至酵母中并在酵母中表达。至少,这涉及编码区插入载体中并可与载体上发现的并且在酵母中有活性的启动子操作地连接。可以使用任何载体(整合的,染色体的或游离的)。
可以使用任何在靶宿主(同源的或异源的;组成型的,诱导型的或阻遏型的)中有活性的启动子。该插入可以包括使用限制性内切酶以在所需的位点“打开”载体,在该位点与启动子可操作地连接是可能的,随后将编码区与预期位点连接。如果需要,在插入载体之前,可以准备编码区,用于靶生物体中。这可以包括改变编码区中所用的密码子以更完全地匹配靶生物体的密码子使用;改变编码区中的可影响编码区的转录或翻译或编码区的mRNA转录物稳定性的序列;或添加或除去编码信号肽的部分(由编码区编码的蛋白质的区域,其可以指导蛋白质至特定的位置(例如,细胞器,细胞或细胞器的膜,或胞外分泌)),以及本领域已知的其他可能的制备。
无论编码区是否得到了修饰,当将编码区插入载体时,它便与酵母中有活性的启动子可操作地连接。众所周知,启动子是可以指导邻近编码区转录的DNA序列。如所述的,所述启动子可以是组成型的、诱导型的或阻遏型的。组成型启动子持续地指导邻近编码区的转录。可以通过将合适的诱导性分子添加至培养基中来诱导诱导型启动子,这将由该启动子的特性来决定。可以通过将合适的阻遏分子添加至培养基中来抑制阻遏型启动子,这将由该启动子的特性来决定。在一个实施方案中,启动子是组成型的。例如,在另外的实施方案中,组成型启动子是啤酒糖酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子。对于另一个实例,在另一个进一步的实施方案中,启动子可以是啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(同工酶3)THD3启动子。
如果需要,可以使用终止区。示例性终止区是啤酒糖酵母CYC1。
包括与启动子可操作地连接的编码区的载体可以是质粒、粘粒或酵母人工染色体,以及其它本领域已知的适合在酵母中使用的。除了与启动子可操作地连接的编码区外,载体还可以包括其它遗传元件。例如,如果不希望将载体整合至酵母基因组中,则该载体可以包括复制起点,它使得该载体可以转到含有该载体的酵母的子代细胞中。如果需要将载体整合至酵母基因组中,则该载体可以包括与在酵母基因组中发现的序列同源的序列,并且还可以包含能够促进整合的编码区。为了确定哪些酵母细胞被转化了,载体可以包括可选择的标记或可筛选的标记,这给酵母提供了可以与未转化的酵母区分开来的表型,例如,它存活于包含对未转化酵母是致命的抗菌素的培养基上或它将培养基的成分代谢成未转化酵母不能代谢的产物,以及其他的表型。此外,载体可以包括其他遗传元件,如限制性内切核酸酶位点和通常在载体中发现的其他成分。
在制备其编码区与启动子可操作地连接的载体后,可以用该载体转化酵母(即,可以将该载体引入酵母群体的至少一个细胞中)。酵母转化的技术是公知的,并且包括电穿孔、微粒轰击和LiAc/ssDNA/PEG方法等。然后可以通过使用载体上的可选择或可筛选标记来检测转化的酵母细胞。应当注意的是短语“转化的酵母”具有与如上定义的“重组酵母”基本上相同的含义。转化的酵母可以是在转化技术中接受载体的酵母,或可以是这种酵母的子代。
关于PYC,MDH和MAE,按照遗传密码的丰余性,具有本发明公开内容的益处的本领域技术人员可以了解,可能存在大量潜在的编码区,其将编码特定的PYC序列、MDH序列或MAE序列。SEQ ID NO:4给出了典型的PYC编码区;SEQ ID NO:5给出了典型的MDH编码区;以及SEQ ID NO:6给出了典型的MAE编码区。编码所需蛋白质序列的任何编码区都可以根据常规实验来使用。本领域技术人员将理解,特定的密码子(“偏倚的密码子”)可以在酵母中具有比不同的丰余密码子更大的相应tRNA库,并且因此可以允许在酵母中更快的蛋白质翻译。
本领域技术人员同样了解,各种调控序列,如启动子和增强子,以及本领域已知的其他序列,可以作为功能转化酵母的制备和使用的常规实验的物质。
本发明不限于植物、酵母或其他生物体中产生苹果酸中间产物或苹果酸的已知途径的酶。
在另一个实施方案中,本发明涉及生产苹果酸或琥珀酸的方法,包括在含有碳源和二氧化碳源的培养基中培养重组酵母,并从培养基中分离苹果酸或琥珀酸,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区进行功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。
酵母及其编码区如上所述。
获得重组酵母后,可以在培养基中培养该酵母。其中可以培养该酵母的培养基可以是本领域已知适于该目的的任何培养基。培养技术和培养基是本领域公知的。在一个实施方案中,可以通过在合适容器中的含水发酵来进行培养。酵母发酵的典型容器的实例包括摇瓶或生物反应器。
培养基可以包括碳源,如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、或植物物质的水解产物等。在一个实施方案中,培养基还可以包括有机或无机分子的氮源。在另外的实施方案中,培养基还可以包括以下成分,如氨基酸;嘌呤;嘧啶;玉米浆;酵母提取物;蛋白质水解物;水溶性维生素,如复合维生素B;或无机盐,如Ca、Mg、Na、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的氯化物、盐酸盐、磷酸盐,或硫酸盐等。还可以包括本领域普通技术人员已知的可用于酵母培养或发酵的其他成分。可以将培养基缓冲或不需要缓冲。
二氧化碳源可以是气体二氧化碳(将其引入培养基上的顶空或通过培养基喷射)或碳酸盐(例如,碳酸钙)。
在发酵过程中,酵母将碳源内在化并通过许多步骤转变成苹果酸。MAE的表达使得因此产生的苹果酸由酵母分泌至培养基中。通常,部分量的碳源转变成为琥珀酸以及部分量的琥珀酸由酵母分泌至培养基中。
示例性的培养基是含有50g/L CaCO3和1g/L尿素的矿物质培养基。
在培养进行了足够长时间以在培养基中产生所需浓度的苹果酸或琥珀酸后,可以将苹果酸或琥珀酸分离。在此提到有机酸所用的“分离”意思是通过从酵母或培养基的至少一种其他成分(另一种有机酸或不在该类中的化合物)中分离出来而达到更纯的状态。在一个实施方案中,分离的有机酸具有至少约95%的纯度,如至少约99%的纯度。
为了分离培养基中累积的苹果酸,分离可以包括通过公知技术从培养基中纯化苹果酸,如使用离子交换树脂、活性炭、微滤、超滤、纳滤、液-液提取、结晶作用或色谱法等。
可以用同样的方法进行琥珀酸的分离。
我们已经观察到,在含有50g/L CaCO3和1g/L尿素的矿物质培养基中培养本发明的重组酵母可以导致培养基中苹果酸(作为酸)的水平为至少1g/L。在一个实施方案中,导致培养基中苹果酸(作为酸)的水平为至少10g/L。在另外的实施方案中,导致在培养基中苹果酸(作为酸)的水平为至少30g/L。
如果酵母在培养步骤过程中在培养基中累积了苹果酸,优选使苹果酸的浓度稳定或使其增加。
提供了以下的定义,以助于本领域技术人员理解本发明的详细说
明。
术语“超过背景水平的苹果酸累积”指的是使用在此所述的方法测定的超过不可检测水平的苹果酸的累积。
“扩增”指的是通过无论什么方法,增加所需核酸分子的拷贝数或增加酶的活性。
“密码子”指的是确定特定氨基酸的三个核苷酸的序列。
“DNA连接酶”指的是共价连接双链DNA的两个部分的酶。
“电穿孔”指的是使用短暂的高电压DC负荷穿透宿主细胞,使它们吸收染色体外DNA从而将外源DNA引入细胞的方法。
“核酸内切酶”指的是在内部位置水解双链DNA的酶。
术语“表达”指的是产生相应mRNA的基因转录以及产生相应基因产物的mRNA翻译,产物即肽、多肽或蛋白质。
短语“功能上连接的”或“可操作地连接的”指的是启动子或启动子区域和编码或结构序列位于可以由启动子或启动子区域指导编码或结构序列转录的方向和距离上。
术语“基因”指的是染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA或其它编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子的DNA,以及涉及表达调控的编码序列的侧翼片段。
术语“基因组”包括宿主细胞内的染色体和质粒。因此,引入宿主细胞的本发明的编码DNA可以是染色体整合的或质粒定位的。
“异源DNA”指的是来自不同于受体细胞来源的DNA。
“同源DNA”指的是来自与受体细胞相同来源的DNA。
“杂交”指的是核苷酸的一条链通过碱基配连接互补链的能力。当两条核酸链中的互补序列彼此结合时,产生了杂交。
术语“培养基”指的是酵母的化学环境,其包括酵母或重组酵母生产所需的任何成分以及一种或多种用于抗坏血酸生产的前体。酵母生长的成分和用于抗坏血酸生产的前体可以相同或不同。
“可读框(ORF)”指的是编码肽、多肽或蛋白质的DNA或RNA片段。
“质粒”指的是环状的、染色体外的、可复制的DNA片段。
“聚合酶链反应(PCR)”指的是形成一个核酸序列的多个拷贝的酶技术。通过在两个扩增子之间穿梭DNA聚合酶来制备DNA序列的拷贝。该扩增方法的基础是变性,然后再退火,接着延伸的温度变化的多个循环,以在位于侧翼扩增子之间的片段中形成新的DNA链。
术语“启动子”或“启动子区域”指的是通常在编码序列的上游(5’)找到的DNA序列,其通过在正确的位点提供用于RNA聚合酶的识别位点和/或启动转录需要的其他因子,通过控制信使RNA(mRNA)的产生来控制编码序列的表达。
“重组细胞”或“转化细胞”是在细胞中含有非天然存在的核酸序列或附加的内源核酸序列拷贝的细胞,其中通过人为行为将核酸序列引入细胞中或其祖细胞中。
术语“重组载体”或“重组DNA或RNA构建体”指的是得自任何来源、能够基因组整合或自主复制、包含其中已经以功能上可操作的方式连接了一个或多个序列的核酸分子的任何物质,如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列。这样的重组构建体或载体能够将用于选定的基因产物的5′调控序列或启动子区域和DNA序列引入细胞中,以这样的方式使得DNA序列转录成功能性mRNA,其可以得到翻译或未翻译,并因此得到表达。
“限制性内切酶”指的是识别双链DNA中的特定核苷酸序列并分裂两条链的酶;也称为限制性核酸内切酶。分裂通常发生在限制性酶切位点或其附近。
“可选择标记”指的是如下的核酸序列,其表达给予了帮助鉴定含有核酸序列的细胞的表型。可选择标记包括给予毒性化学物质抗性(例如,氨苄青霉素、卡那霉素)或补充营养缺陷(例如尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸)的那些。
“可筛选标记”指的是如下的核酸序列,其表达给予了视觉上可区分的特征(例如,变色、荧光)。
“转录”指的是从DNA模板产生RNA拷贝的过程。
“转化”指的是将外源核酸序列(例如,载体、质粒或重组核酸分子)引入细胞中的过程,其中将外源核酸整合至染色体中或能够自主复制。经受转化的细胞,或该细胞的子代是“转化的”或“重组的”。如果外源核酸包括编码所需蛋白质的编码区,同时在转化酵母中产生所需的蛋白质并且基本上是功能性的,这样的转化酵母是“在功能上转化的”。
“翻译”指的是从信使RNA产生蛋白质。
术语“产率”指的是产生的苹果酸量(摩尔或重量/体积)除以消耗的碳源量(摩尔或重量/体积),再乘以100。
酶的“单位”指的是酶活性并表示转化的底物微摩尔量/mg总细胞蛋白/分钟。
“载体”指的是携带核酸序列进入宿主细胞的DNA或RNA分子(例如质粒、粘粒、噬菌体、酵母人工染色体或病毒等)。可以将载体或其一部分插入宿主细胞的染色体组中。
包括以下的实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当意识到下列实施例中所公开的技术体现了本发明人发现的能很好地实施本发明的技术,并且因此认为是实施本发明的优选方式。然而,本领域技术人员根据本发明的公开内容应当意识到在所公开的具体实施方案中可以进行许多变化,并且仍然获得相似或类似的结果,而没有脱离本发明的精神和范围。
实施例1
以啤酒糖酵母菌株TAM(MATa pdc1(-6,-2)::loxPpdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52(PDC阴性))开始构建两个酵母菌株,用编码丙酮酸羧化酶(PYC)、苹果酸脱氢酶(MDH)和苹果酸转运蛋白(MAE)的基因转化。
因为TAM菌株只具有一个营养缺陷型标记,我们破坏了TRP1基因座,以能够引入超过一个的带有营养缺陷型标记的质粒,形成RWB961(MATa pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP mutx uraS-52 trp1::Kanlox)。
我们所用的MDH和PYC基因已经事先克隆至质粒p426GPDMDH3中(2μ带有URA3标记的质粒,在啤酒糖酵母THD3启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子之间含有MDH3ΔSKL基因,图3)和 中pRS2(2μ带有URA3标记的质粒,含有啤酒糖酵母PYC2基因,图4)。
将携带粟酒裂殖酵母MAE的PTDH3-SpMAE1盒再克隆至YEplac1 12(2μ,TRP1)和YIplac204(整合,TRP1)中,形成YEplac112SpMAE1(附图6)和YIplac204SpMAE1(未显示)。
制备PYC和MDH载体:pRS2MDH3 Δ SKL(2μ,URA3,PYC2,MDH3ΔSKL)(图5)。
用pRS2MDH3 Δ SKL和YEplac112SpMAE1(菌株1)或pRS2MDH3 ΔSKL和YIplac204SpMAE1(菌株2)转化RWB961。菌株1和菌株2都超表达PYC2和MDH3ASKL,但是具有不同水平的MAE1表达,假定的表达水平与质粒拷贝数成比例,对于YEplac112SpMAE1(基于2μ的)约为10-40/细胞,对于YIplac204SpMAE1(整合的)约为1-2/细胞。
在菌株1和菌株2分离后,将每个菌株0.04g/L或0.4g/L引入含有100mL矿物质培养基、50g/L CaCO3和1g/L尿素的500ml摇瓶中。将摇瓶在200rpm下摇动,持续每个实验的时间。再不同的时间分离每个培养基的样品,并测定葡萄糖、丙酮酸、甘油、琥珀酸和苹果酸的浓度。在约90-160hr后,观察到约250mM的胞外苹果酸浓度。结果在图1-2中给出。
结果表明了以下的酵母代谢途径的改变使得重组酵母高水平地累积胞外苹果酸:
1、指导丙酮酸流向丙酮酸羧化酶(通过降低PDC活性)
2、通过超表达PYC增加通过丙酮酸羧化酶的流量。
3、引入细胞溶胶中高苹果酸脱氢酶活性以捕获由PYC形成的草酰乙酸盐。
4、引入异源苹果酸转运体以促进苹果酸的输出。
图2还表明了在上述苹果酸盐产生的同时,产生了约50mM浓度的胞外琥珀酸。
实施例2
使用如实施例1中所述的超表达PYC2的TAM菌株、细胞溶质MDH3和粟酒裂殖酵母MAE1转运体(YEplac112SpMAE1)研究了二氧化碳对发酵罐系统中苹果酸生产的影响。进行了三个发酵罐实验:
A:完全需氧条件下的分批培养。
B:使用70%/20%/10%的N2/O2/CO2混合物的完全需氧条件下的分批培养。
C:使用65%/20%/15%的N2/O2/CO2混合物的完全需氧条件下的分批培养。
实验方案
培养基
根据Verduyn等(Yeast 8:501-517,1992),矿物质培养基含有100g葡萄糖、3g KH2PO4、0.5g MgSO2.7H2O和1ml微量元素溶液/升软化水。将培养基在110℃热灭菌20分钟后,每升中加入1ml根据Verduyn等(Yeast 8:501-517,1992)过滤灭菌的维生素和含有1g尿素的溶液。还进行了每升添加0.2ml消泡剂(BDH)。没有加入CaCO3。
发酵罐培养
以1升的操作体积在生物反应器中进行发酵罐培养(ApplikonDependable Instruments,Schiedam,荷兰)。通过用2M氢氧化钾滴定,将pH自动控制在pH5.0。使用Pt100-传感器测量维持在30℃的温度,并通过加热指状物中的循环水来控制。使用两个rushton叶轮将搅拌器的速率保持恒定在800rpm。对于需氧条件,使用Brooks5876质流控制器(Brooks BV,Veenendaal,The Netherlands),维持0.51.分钟-1的空气流,以保持溶解氧浓度在大气压力时超过空气饱和量的60%。
在批次B和C中,通过混合增压气体79% N2+21% O2和含有79%CO2+21% O2的气体混合物(Hoekloos,Schiedam,荷兰)达到提高的10%或15%二氧化碳浓度,同时维持良好的氧合作用。用增压气体将所需的通过Brooks质流控制器补给的10%或15% CO2百分比补足至0.5L/min的固定总流速。
使用在线数据采集&控制系统(MFCS/Win,Sartorius BBISystems)持续监控pH、DOT和KOH/H2SO4进料。
废气分析
发酵罐培养的废气在冷凝器中冷却(2℃)并且用Perma Pure干燥器(型号PD-625-12P)干燥。用Rosemount NGA 2000气体分析器测定氧气和二氧化碳浓度。用Saga数字流量计(Ion Science,Cambridge)测定废气流速。按照van Urk等(1988,Yeast 8:501-517)所述的计算二氧化碳产物和氧气消耗的比速率。
样品制备
在冰上收集用于生物量、底物和产物分析的样品。将发酵液样品和无细胞样品(通过在10.000xg离心10分钟来制备)储藏在-20℃,用于以后的分析。
代谢产物的测定
HPLC测定
使用装备有连接Waters 2487 UV分光光度检测器和Waters 2410折射率检测器的HPX-87H Aminex离子排斥柱(300 X 7.8mm,BioRad)(60℃,0.6ml/min 5mM H2SO4)的Waters HPLC 2690系统同时测定糖、有机酸和多元醇。
酶代谢产物测定
为了验证HPLC测定和/或排除分离错误,用酶试剂盒测定L-苹果酸(Boehringer-Mannheim,目录No.0 139 068)。
干重的测定
通过在0.45μm的滤器上(Gelman Sciences)过滤5ml的培养物来测定培养物中酵母的干重。必要时,将样品稀释至5-10g.1-1的终浓度。在使用之前,将滤器保存在80℃的保温箱中至少24小时,以测定它们在使用前的干重。样品中的酵母细胞被留在滤器上,并用10ml软化水冲洗。然后将带有细胞的滤器在微波炉(AmanaRaderrange,1500瓦特)中在50%容量下干燥20分钟。冷却2分钟后称重带有细胞的干燥滤器。通过从带有细胞的滤器的重量减去滤器的重量来计算干重。
光密度(OD660)的测定
用分光光度计Novaspec II(Amersham Pharmasia Biotech,Buckinghamshire,UK)在660nm在4ml比色皿中测定酵母培养物的吸光度。必要时,将样品稀释至产生0.1-0.3的光密度。
批次A:充分通气的21% O2(+79% N2)
图7和8显示了随时间的代谢产物形成。显示了每菌株一个代表性批次实验的结果。重复实验基本上产生了相同的结果。图7表示起始生物量(矩形)、葡萄糖消耗量(三角形)和丙酮酸的产生(星形)。图8表示苹果酸(正方形)、甘油(上半圆形)和琥珀酸(八角形)的产生。如图8中所示,酵母在24小时后产生约25mM的苹果酸,在48小时后产生约20mM的琥珀酸。
批次B:10% CO2+21 % O2(+69 % N2)
图9和10显示了随时间的代谢产物形成。图9表示起始生物量(矩形)、葡萄糖消耗量(三角形)和丙酮酸的产生(星形)。图10表示苹果酸(正方形)、甘油(上半圆形)和琥珀酸(八角形)的产生。如图10中所示的,酵母在24小时后产生约100mM的苹果酸,在96小时后产生约150mM的苹果酸,以及在96小时后产生约60mM的琥珀酸。
批次C:15 % CO2+21 % O2(+64 % N2)
图11和12显示了随时间的代谢产物形成。图11表示起始生物量(矩形)、葡萄糖消耗量(三角形)和丙酮酸的产生(星形)。图12表示苹果酸(正方形)、甘油(上半圆形)和琥珀酸(八角形)的产生。如图10中所示,酵母在24小时后产生约45mM的苹果酸,在96小时后产生约100mM的苹果酸,以及在96小时后产生约60mM的琥珀酸。
根据本发明的公开内容,不需要过度的实验就可以制成和进行在此公开的和要求的所有组合物和方法。尽管已经依照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法,但本领域技术人员清楚可以对在此所述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的次序进行改变,而不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地,将清楚化学和生理上都相关的某些活性剂可以替代在此所述的活性剂,同时获得相同或相似的结果。认为所有这些本领域技术人员显而易见的相似替代和改变均在如所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思之内。
Claims (17)
1、重组酵母,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区进行功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活。
2、权利要求1的重组酵母,其中所述酵母属于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)种。
3、权利要求2的重组酵母,其中所述酵母是啤酒糖酵母TAM菌株。4、权利要求1的重组酵母,其中PYC是啤酒糖酵母丙酮酸羧化酶,MDH是啤酒糖酵母MDH1或啤酒糖酵母MDH3,以及MAE是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)SpMAE1。
5、权利要求4的重组酵母,其中通过相对于编码野生型MDH的编码区修饰编码MDH的编码区,将MDH靶向所述酵母的细胞溶胶。
6、权利要求1的重组酵母,其中PYC与SEQ ID NO:1具有至少75%的同一性,MDH与SEQ ID NO:2具有至少75%的同一性,MAE与SEQID NO:3具有至少75%的同一性。
7、权利要求6的重组酵母,其中PYC与SEQ ID NO:1具有至少95%的同一性,MDH与SEQ ID NO:2具有至少95%的同一性,MAE与SEQID NO:3具有至少95%的同一性。
8、权利要求6的重组酵母,其中PYC具有SEQ ID NO:1中所示的序列,MDH具有SEQ ID NO:2中所示的序列,MAE具有SEQ ID NO:3中所示的序列。
9、生产苹果酸的方法,包括:
在包括碳源和二氧化碳源的培养基中培养重组酵母,其中所述酵母是丙酮酸脱羧酶(PDC)活性阴性的(PDC阴性),并且用编码丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的编码区、编码苹果酸脱氢酶(MDH)的编码区和编码苹果酸转运蛋白(MAE)的编码区进行功能转化,其中PYC在细胞溶胶中是活性的,其中PEP羧化酶对苹果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感,其中MDH在细胞溶胶中是活性的,并在葡萄糖存在时不失活;和
从培养基中分离苹果酸。
10、权利要求9的方法,其中所述碳源是葡萄糖。
11、权利要求9的方法,其中所述酵母属于啤酒糖酵母种。
12、权利要求11的方法,其中所述酵母是啤酒糖酵母TAM菌株。
13、权利要求9的方法,其中所述酵母用编码啤酒糖酵母丙酮酸羧化酶的编码区、编码啤酒糖酵母MDH1或啤酒糖酵母MDH3的编码区和编码粟酒裂殖酵母SpMAE1的编码区进行功能转化。
14、权利要求13的方法,其中将MDH靶向所述酵母的细胞溶胶。
15、权利要求9的方法,其中所述酵母用编码与SEQ ID NO:1具有至少75%同一性的PYC的编码区,编码与SEQ ID NO:2具有至少75%同一性的MDH的编码区和编码与SEQ ID NO:3具有至少75%同一性的MAE的编码区进行功能转化。
16、权利要求9的方法,其中所述酵母用编码与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的PYC的编码区,编码与SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的MDH的编码区和编码与SEQ ID NO:3具有至少95%同一性的MAE的编码区进行功能转化。
17、权利要求16的方法,其中PYC具有SEQ ID NO:1中所示的序列,MDH具有SEQ ID NO:2中所示的序列,以及MAE具有SEQ ID NO:3中所示的序列。
18、权利要求9的方法,进一步包括从所述培养基中分离琥珀酸。
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