CN115806892A

CN115806892A - 一种利用果胶的基因工程菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN115806892A
Application number: CN202211609154.1A
Authority: CN
Inventors: 郎绪业
Original assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Current assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-03-17
Also published as: WO2024124528A1

Abstract

本发明公开了一种利用果胶的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，基因工程菌中具有多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块。本发明对马克思克鲁维酵母进行基因工程改造，获得多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达的基因工程菌，通过对果胶的彻底水解，释放菌体可利用碳源，实现改造后的基因工程菌能够利用水解产物作为碳源用于继续生长。本发明基于马克思克鲁维酵母在SD培养基中具有高效的果胶蛋白酶表达分泌的特性，通过对培养条件优化，利用本发明提供的基因工程菌实现对水果加工废弃物以及排放水中果胶进行低能耗、高附加值的处理。

Description

一种利用果胶的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用果胶的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

果胶主要是由α-1,4-糖苷键联结而成的半乳糖醛酸与鼠李糖、阿拉伯糖和其他中性糖相联结的聚合物，是水果加工产业中主要的废弃物。水果加工废弃物中果胶占干重的25％，且在水果加工产业的排水中含量高，需要处理之后方可排放。因此围绕水果加工废弃物及排水的处理问题，人们做了很多尝试，例如，通过酸处理和高温处理制备得到果胶产品、利用果胶酶处理排放水、提取水果加工废弃物中的活性物质，上述方法能够在一定程度上缓解水果加工废弃物以及排放水中高果胶含量的问题，但相对成本较高，具体表现为能耗较高、酶制剂价格高、环境治理成本高。

果胶中的主要成分为多聚半乳糖醛酸，占的比重达到75％。多聚半乳糖醛酸酶水解的产物寡聚半乳糖醛酸具有优良的生物活性，具有作为绿色生物农药和绿色饲料的潜质。因此利用酶水解果胶生产得到高纯度的寡聚半乳糖醛酸也是现在处理水果加工废弃物的另外一个新兴的方向。但是缺点同样的明显，酶的价格相对较高且反应需要高温条件，同时分离纯化的成本相对较高。

微生物降解处理也是目前果胶废弃物处理的常用方法之一，已知不同的微生物群能产生多组果胶溶解酶，专利文献CN103204591A公开一种果胶废水的微生物处理工艺，将工程菌菌种灰霉菌、镰孢菌、黑曲霉和枯草杆菌中的一种或多种，负载于活性污泥上，驯化为果胶降解菌，诱导产生果胶酶，形成具有果胶降解活性的稳定菌胶团。但是由于果胶具有较强的黏附能力，系统中的好氧微生物会因果胶的包裹作用而失去活性，导致处理效率不高。

由于现有的水果加工厂相对规模较小，加之废弃物的运输成本相对较高，难以实现大规模的水果加工废弃物的处理以及污水的处理。因此，开发一种能够就地用于水果加工废弃物处理的方法显得尤为重要，上述方法中生物法处理优势突出。随着基因工程技术的发展，通过基因工程改造提升工程菌的产酶能力是目前研究方向之一。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)广泛存在于酸奶、水果、酸乳酒等环境中，是食品安全级酵母，其具有内源性的多聚半乳糖醛酸水解酶(果胶酶)，且酵母为兼性厌氧生物，因此，马克斯克鲁维酵母有望被开发成用于降解果胶的微生物产品。但是，前期研究结果显示马克斯克鲁维酵母在常规培养条件下(比如YPD培养基)不能分泌多聚半乳糖醛酸水解酶到胞外，且该菌株不能直接利用半乳糖醛酸作为碳源用于生长，制约了马克斯克鲁维酵母在果胶废弃物处理中的应用。

因此，对马克斯克鲁维酵母进行基因工程改造并且对培养条件进行优化，使其能够做到对果胶进行水解、利用、以及高附加值产物的生产是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于基于酵母菌株马克思克鲁维酵母进行基因改造，提供一种可以利用果胶的基因工程菌，并且对培养条件进行优化，使其能够做到对果胶进行水解、利用、以及高附加值产物的生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明利用已报道的多聚半乳糖醛酸水解酶氨基酸序列进行比对，在马克思克鲁维酵母基因组中寻找相关的基因，从马克思克鲁维酵母CBS6556中克隆得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段。以马克思克鲁维酵母为出发菌，通过生物学技术手段构建了多聚半乳糖醛酸水解酶过表达的基因工程菌。研究表明，改造之后的基因工程菌过量表达分泌多聚半乳糖醛酸水解酶，一方面可以水解多聚半乳糖醛酸生产寡聚半乳糖醛酸，也可以利用果胶水解物生产高价值产物2-苯乙醇；另一方面，由于果胶得到彻底水解，菌体可以利用部分水解产物作为碳源用于持续生长。

因此，本发明提供了一种利用果胶的基因工程菌，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，基因工程菌中具有多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块，所述过表达模块含有多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有70％以上同源性且编码的蛋白在功能上等价。

所述过表达模块包括启动子和编码基因，所述编码基因可以采用马克思克鲁维酵母内源多聚半乳糖醛酸水解酶基因，也可以采用其他来源的同样编码多聚半乳糖醛酸水解酶的基因片段。

进一步的，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，其基因组的ABZ1位点插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块，所述过表达模块包含转录增强因子3(TEF3)启动子、多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因和终止子。

本发明研究表明，对马克思克鲁维酵母的ABZ1位点进行基因编辑，插入效率高，且在ABZ1位点插入基因之后不会对马克思克鲁维酵母的生长造成影响。优选的，过表达模块中启动子采用TEF3启动子，有助于提高下游目的基因的表达强度，更为优选，TEF3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选的，终止子采用CYC1终止子，CYC1终止子能够有效终止mRNA的转录，更为优选，CYC1终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。采用上述表达模块改造的基因工程菌，其多聚半乳糖醛酸水解酶的表达与分泌量提升接近一倍。

进一步的，所述出发菌为马克思克鲁维酵母CBS6556。马克思克鲁维酵母CBS6556为公众可获得材料。

进一步的，所述基因工程菌培养采用SD培养基。SD培养基包括酵母基础氮源(无氨基酸和硫酸铵)、氨基酸核苷酸混合物和葡萄糖。本发明研究发现，马克思克鲁维酵母在SD培养基中培养可以分泌多聚半乳糖醛酸水解酶到胞外，且分泌的多聚半乳糖醛酸水解酶占分泌蛋白量的90％以上，无需破胞即可获得具有生物活性的多聚半乳糖醛酸水解酶。

本发明还提供了一种构建上述基因工程菌的方法，包括：以马克思克鲁维酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块或者在宿主菌中导入含有多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因的重组表达质粒。

进一步的，本发明利用CRIPSR-Cas9技术通过双质粒系统实现基因工程菌的构建，所述构建方法包括以下步骤：

(1)构建CRISPR-Cas9质粒：在sgRNA插入位点插入sgRNA序列AGAATCTTGCTGTTCGAAGC，获得靶向切割ABZ1位点的CRISPR-Cas9质粒；

(2)构建同源重组质粒：在同源供体质粒中插入具有ABZ1切割位点上游同源序列、多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块、ABZ1切割位点下游同源序列的基因片段；

(3)将CRISPR-Cas9质粒和同源重组质粒同时导入马克思克鲁维酵母中，培养筛选获得插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块的基因工程菌。

上述方法中，CRISPR-Cas9质粒靶向切割马克思克鲁维酵母基因组的ABZ1位点，同源重组质粒在该切割位点上进行同源重组修复，插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块。

优选的，步骤(2)中，采用pIW 1246载体(ABZ1上游和下游同源序列，启动子P_KmTEF3，pIW578，EGFP)作为同源供体质粒，将多聚半乳糖醛酸水解酶基因片段替换EGFP基因，即得同源重组质粒。pIW 1246载体为公众可获得材料，其构建方法见文献(CRISPR-mediatedmultigene integration enables Shikimate pathway refactoring for enhanced2-phenylethanol biosynthesis in Kluyveromyces marxianus[J].Biotechnology forBiofuels,2021,14(1).)。

优选的，步骤(3)中，将完成转化的菌株接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD培养基中进行恢复培养后涂布于YPD培养板上，筛选获得插入目的基因的单菌落，再接种于含有5-氟乳清酸的YPD培养板中培养去除质粒，获得所述基因工程菌。

本发明的另一个目的在于提供所述的基因工程菌在水果加工废弃物及排放水处理或降解果胶生产寡聚半乳糖醛酸、2-苯乙醇、2-苯乙醇乙酯中的应用。

果胶为水果加工废弃物及排放水中的主要成分，多聚半乳糖醛酸水解酶能够水解果胶产生寡聚半乳糖醛酸、半乳糖醛酸和其他糖类。寡聚半乳糖醛酸可以用于制备生物农药或生物肥料。工程菌可利用其他糖类作为碳源用于生长，并生产高附加值产物如2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酯。

进一步的，所述应用包括：将扩大培养后的基因工程菌接种于含葡萄糖的SD培养基中发酵培养，将含有菌体的发酵液加入到待处理材料中，菌体表达分泌的多聚半乳糖醛酸水解酶对果胶进行水解，菌体利用水解产物作为碳源继续生长。

在基因工程菌初始培养过程中，由于不能直接利用果胶作为碳源，需要在SD培养基中添加葡萄糖供给菌株正常生长，当菌株到达生长平台期，过量表达分泌多聚半乳糖醛酸水解酶，水解果胶，此时菌株可以利用部分水解产物作为碳源，此后无需再添加葡萄糖。

优选的，所述SD培养基中含有3～20g/L葡萄糖。

优选的，所述发酵培养包括：基因工程菌接种于SD培养基的初始OD₆₀₀值为0.05～0.1，在30～37℃、200～220rpm条件下培养至OD₆₀₀值为10。

发酵培养结束后，将混有基因工程菌的发酵液直接与果胶废弃物或果胶废水混合，利用发酵液中的多聚半乳糖醛酸水解酶对果胶进行水解，同时水解产物也可以用于菌株生长，菌体持续表达并分泌多聚半乳糖醛酸水解酶。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明对马克思克鲁维酵母进行基因工程改造，获得多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达的基因工程菌，通过对果胶的彻底水解，释放菌体可利用碳源，实现改造后的基因工程菌能够利用水解产物作为碳源用于继续生长。

(2)本发明基于马克思克鲁维酵母在SD培养基中具有高效的果胶蛋白酶表达分泌的特性，通过对培养条件优化，改造后的基因工程菌能够分泌果胶酶，水解果胶，利用果胶水解物，生产高价值产物2-苯乙醇和寡聚半乳糖醛酸。利用本发明提供的基因工程菌实现对水果加工废弃物以及排放水中果胶进行低能耗、高附加值的处理。

附图说明

图1为SDS-PAGE法测定马克思克鲁维酵母表达分泌于YPD和SD培养基当中多聚半乳糖醛酸水解酶的含量，其中M为marker，泳道1为YPD培养基，泳道2为SD培养基。

图2为马克思克鲁维酵母CBS6556在SD(2％葡萄糖)30℃条件下的生长曲线(A)和在不同的时间点多聚半乳糖醛酸水解酶的相对分泌量(B)。

图3为过表达菌株构建的示意图。

图4为基因敲除菌株构建的示意图。

图5为多聚半乳糖醛酸水解酶基因敲入和敲除测序结果，其中(A)为敲入的测序结果示意图，(B)为敲除的测序结果。

图6为不同菌株的多聚半乳糖醛酸水解酶的表达量，其中M为marker，泳道1为野生型马克思克鲁维酵母CBS6556，泳道2为多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达菌株CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1，泳道3为多聚半乳糖醛酸水解酶敲除菌株CBS6556PGko。

图7为不同菌株在不同碳源的组合条件下的生长曲线，其中上图为马克思克鲁维酵母CBS6556菌株；下图为多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达菌株CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1。

图8为不同菌株不同碳源的组合在不同时间天数的OD值以及葡萄糖的剩余量。

图9为CBS6556和CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1在不同碳源组合条件下葡萄糖的剩余量、生物量的积累、2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酯的产量，D1、D2、D3分别为第一、二、三天，不同的碳源组合从左到右依次为CBS6556 2％葡萄糖、CBS6556 0.3％葡萄糖，CBS6556 0.3％葡萄糖+1.7％果胶、CBS6556 pTEF3-PG-tCYC@ABZ1 0.3％葡萄糖、CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1 0.3％葡萄糖+1.7％果胶。

图10不同菌株对培养基中果胶的降解程度，其中左图为过滤速度，右图为实物照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有内源性的多聚半乳糖醛酸水解酶(果胶酶)，在此研究当中通过与其他物种多聚半乳糖醛酸水解酶氨基酸序列进行比对，在马克思克鲁维酵母CBS6556菌株当中得到了多聚半乳糖醛酸水解酶的基因序列信息与氨基酸序列信息，基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

下述实施例中马克思克鲁维酵母CBS6556菌株购买自明舟生物。

YPD培养基：10g/L酵母提取物(oxoid公司)、20g/L蛋白胨(oxoid公司)、20g/L葡萄糖(coolaber公司)。

SD培养基：1.7g/L BD Difco^TM酵母氮源基础无氨基酸和硫酸铵(BD公司)，氨基酸和核苷酸混合物(coolaber公司)，20g/L葡萄糖(coolaber公司)。

SD-H-U培养基：在上述SD培养基基础上缺少组氨酸(His)和尿嘧啶(Uracil)。

半乳糖醛酸：CAS：91510-62-2(Sigma-Aldrich)。

果胶：CAS 9000-69-5(阿拉丁)。

实施例1

为使马克思克鲁维酵母表达分泌多聚半乳糖醛酸水解酶，尝试利用不同的培养基(YPD和SD)进行培养，同时利用SDS-PAGE方法对培养基中的蛋白的组分进行分析。具体的实验步骤如下：

1、将冻存的马克思克鲁维酵母CBS6556菌株在2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃下进行过夜活化培养；

2、将过夜培养的马克思克鲁维酵母CBS6556在YPD平板上进行培养；

3、将在YPD平板上培养得到的单克隆转移到2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃条件下进行过夜培养；

4、将过夜培养得到的菌液分别接种到YPD(2％葡萄糖)和SD(2％葡萄糖)液体培养基中，培养基体积为25mL，摇瓶的体积为250mL。接种之后的菌液的初始OD₆₀₀值为0.05；

5、对菌液在30℃、220rpm条件下进行24小时培养；

6、通过离心分离培养基与菌体；

7、利用SDS-PAGE方法对培养基中的多聚半乳醛酸水解酶进行分析。

结果如图1所示，马克思克鲁维酵母CBS6556在富营养培养基YPD当中并不能分泌多聚半乳糖醛酸水解酶，但是在24小时培养之后，在SD培养基当中多聚半乳糖醛酸水解酶可以被成功的表达与分泌。

实施例2

为研究马克思克鲁维酵母CBS6556在SD培养基当中的表达与分泌多聚半乳糖醛酸水解酶的规律。对马克思克鲁维酵母CBS6556在SD培养基当中的生长曲线和多聚半乳糖醛酸水解酶分泌的相对量在不同的时间点进行检测，具体的操作步骤如下：

4、将过夜培养得到的菌液接种到SD(2％葡萄糖)液体培养基中，培养基体积为25mL，摇瓶的体积为250mL。接种之后的菌液的初始OD₆₀₀值为0.05；

5、在固定的时间点测量OD₆₀₀值，并且在10、14、24、48h对培养基中的多聚半乳糖醛酸水解酶的相对量进行SDS-PAGE分析。

结果如图2所示，马克思克鲁维酵母CBS6556在14小时基本达到生长的平台期，同时多聚半乳糖醛酸水解酶的分泌量开始明显增加，此结果证明多聚半乳糖醛酸水解酶分泌的时间为接近正常的平台期。

实施例3

为了进一步验证此分泌到胞外的蛋白为多聚半乳糖醛酸水解酶，并且提高多聚半乳糖醛酸水解酶的分泌量，基于马克思克鲁维酵母CBS6556构建了多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达菌株(CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1)和多聚半乳糖醛酸水解酶敲除菌株(CBS6556PGko)。

一、菌株的构建利用CRIPSR-Cas9技术，具体的实施是通过双质粒系统实现的。质粒一为包含CRISPR-Cas9体系的质粒，主要的作用为在特定的靶点对DNA进行切割；质粒二为同源重组质粒，与在特定位点切开的基因进行同源重组修复，在修复的过程中特定的基因序列会被插入到基因中或特定的基因片段被删除。

1、过量表达菌株(CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1)构建的示意图如图3所示，具体的实验步骤为：

a.构建CRISPR-Cas9质粒，在sgRNA插入位点插入sgRNA序列AGAATCTTGCTGTTCGAAGC，构建成CRISPR-Cas9质粒；

b.构建同源重组质粒，质粒载体采用pIW 1246载体框架(Li M,Lang X,Cabrera MM,et al.CRISPR-mediated multigene integration enables Shikimate pathwayrefactoring for enhanced 2-phenylethanol biosynthesis in Kluyveromycesmarxianus[J].Biotechnology for Biofuels,2021,14(1).)，该载体由pIW 578改造得到，其中含有上游同源序列为切割位点上游699bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；下游同源序列为切割位点的701bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；TEF3启动子的序列为TEF3基因起始密码子上游700bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CYC1终止子核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。构建方法如下：

首先以CBS6556的基因组为模板，引物采用F：5’-AAGAGAAGTAACATTAAAGCATGTTATTCAGCAACACCTT-3’和R：5’-CAGTACATTAATCAATACAGTTAACAGGAAGCTCCGCTAC-3’，PCR扩增获得多聚半乳糖醛酸水解酶基因片段。然后利用限制性内切酶XmaI和XhoI去除质粒pIW 1246中的EGFP基因，利用Gibson assembly方法对载体和片段进行连接；

c.将两质粒利用电转染同时导入马克思克鲁维酵母CBS6556菌株当中；

d.将转染之后的菌在2mL SD-H-U培养基当中37℃条件下进行恢复培养；

e.48小时之后待OD₆₀₀值达到10，将10uL菌液转入2mL SD-H-U培养基中，37℃条件下培养24h；

f.将24小时培养之后的菌液在YPD培养板上进行涂布培养；

g.待得到单菌落之后，对单菌落进行菌落PCR，验证目的基因的插入，验证引物为：5’-GCCACTCGATGCGATGACTT-3’，5’-GTACAGTTTCCCCTCCTTAT-3’；

h.将带有插入基因的单菌落在YPD+5-foa中培养去除质粒；

i.去除质粒之后在YPD培养板上再次培养得到单菌落；

j.单菌落进行测序，确保序列正确；如图5(A)所示，在ABZ1的位点成功插入了多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块，构建了CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1；

k.保存。

2、多聚半乳糖醛酸水解酶敲除菌株(CBS6556PGko)构建的示意图如图4所示，具体的实验步骤为：

a)构建CRISPR-Cas9质粒，在sgRNA插入位点插入sgRNA序列GATTGGGACCTTGCTACCTG，构建成CRISPR-Cas9质粒；

b)构建同源重组质粒，上游同源序列为多聚半乳糖醛酸水解酶起始密码子上游768 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；下游同源序列为终止密码子下游729 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上游同源序列与下游同源序列中间没有多余序列。构建方法如下：

首先pIW1246质粒用Sac II和Eag I限制性内切酶进行切割；以CBS6556基因组为模板对多聚半乳糖醛酸水解酶上下游的同源序列进行克隆，引物为：上游同源序列F：5’-GGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCATCGCCGATCTCAAGTGTTC-3’；R：5’-CTGTCCACCAGTCATGCTAGCGAGCTTACTTTCTGTTGCTGTTG-3’；下游同源序列：F：5’-GCTAGCATGACTGGTGGACAGCGTGAAGAAGATAAGGGAAGTCTT-3’；R：5’-AGGGAACAAAAGCTGGTACCGGCCGGACGAGGTCTATCAAACCTACTAC-3’；然后利用Gibson Assembly方法进行连接构建同源重组质粒；

c)将两质粒利用电转染同时导入CBS6556菌株当中；

d)将转染之后的菌在2 mL SD-H-U培养基当中37℃条件下进行恢复培养；

e)48小时之后待OD₆₀₀值达到10，将10 uL菌液转入2 mL SD-H-U培养基中，37℃条件下培养24 h；

f)将24小时培养之后的菌液在YPD培养板上进行涂布培养；

g)待得到单菌落之后，对单菌落进行菌落PCR，验证目的基因的敲除验证引物为：5’-GGCATGGTAAGGGATACTGC-3’；5’-TGGCAGAGGTTTCTCGTTTG-3’；

h)将带有插入基因的单菌落在YPD+5-foa中培养去除质粒；

i)去除质粒之后在YPD培养板上再次培养得到单菌落；

j)单菌落进行测序，确保序列正确；测序结果如图5(B)所示，表明多聚半乳糖醛酸水解酶被成功的从马克思克鲁维酵母CBS6556中敲除，构建了CBS6556PGko菌株；

k)保存。

二、利用SDS-PAGE对培养基中的蛋白进行分析，在蛋白表达层面检验三个菌株的不同。具体的操作步骤为：

1.将冻存的马克思克鲁维酵母CBS6556、CBS6556PGko、CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1菌株在2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃下进行过夜活化培养；

2.将过夜培养的三种菌株在YPD平板上进行培养；

3.将在YPD平板上培养的得到的单克隆转移到2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃条件下进行过夜培养；

4.将过夜培养得到的菌液接种到SD(2％葡萄糖)液体培养基中，培养基体积为25mL，摇瓶的体积为250mL。接种之后的菌液的初始OD₆₀₀值为0.05；

5.在24小时收集培养基，并对其中的蛋白组分进行分析。

结果如图6所示，多聚半乳糖醛酸水解酶敲除菌株CBS6556PGko没有蛋白条带，证明了此基因编码多聚半乳糖醛酸水解酶，且过量表达菌株CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1条带明显变粗，证明多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达，多聚半乳糖醛酸水解酶表达量的提升大约为1倍。

实施例4

为了验证马克思克鲁维酵母是否可以水解果胶并利用果胶降解产物作为碳源用于生长，CBS6556和CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1菌株在不同的碳源组合的条件下进行培养。具体的操作步骤为：

1、将冻存的马克思克鲁维酵母CBS6556、CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1菌株在2mLYPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃下进行过夜活化培养；

2、将过夜培养的两种菌株在YPD平板上进行培养；

3、将在YPD平板上培养的得到的单克隆转移到2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃条件下进行过夜培养；

4、将过夜培养得到的菌液接种到SD液体培养基中，培养基体积为25mL，摇瓶的体积为250mL。接种之后的菌液的初始OD₆₀₀值为0.05，碳源的组合分别为2％葡萄糖、0.3％葡萄糖、0.3％葡萄糖+1.7％果胶、0.3％葡萄糖+1.7％半乳糖醛酸、2％果胶；

5、测量48小时内的生长曲线。

结果如图7所示，马克思克鲁维酵母CBS6556在果胶为唯一碳源的情况下不生长，当葡萄糖的浓度为0.3％的情况下，其生物量的积累小于葡萄糖浓度为2％的情况，表明马克思克鲁维酵母不能够直接利用半乳糖醛酸。当多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达的情况下，马克思克鲁维酵母CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1在第二天发生了二次生长，达到了和2％葡萄糖相同的生物量。

为了验证多聚半乳糖醛酸过量表达菌株在碳源组合为0.3％葡萄糖+1.7％果胶的情况下第二天的二次生长的碳源来源于果胶的水解产物，对培养基剩余的葡萄糖的浓度用专用试剂盒进行测量。具体结果如图8所示，在24h之后，培养基中的葡萄糖基本消耗完毕，因此后期生长的碳源主要来源于水解之后的果胶成分。此证明分泌的多聚半乳糖醛酸水解酶能够水解果胶，并且部分水解产物能够用于马克思克鲁维酵母CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1的生长。

实施例5

为了验证多聚半乳糖醛酸过量表达菌株利用果胶降解产物用于生产高附加值产物，检测了多聚半乳糖醛酸过量表达菌株CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1在不同碳源组合的条件下2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酯的产量，具体的操作步骤为：收集实施例4中多聚半乳糖醛酸过量表达菌株在不同碳源组合条件下培养24h、48h、72h后的培养基，利用气相色谱法测定2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酯的产量。结果如图9所示，水解之后的果胶有助于2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酯产量的积累。

实施例6

进一步检测了不同菌株CBS6556、CBS6556PGko、CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1菌株在碳源组合为0.3％葡萄糖+1.7％果胶的情况下对果胶的降解程度，降解程度用过虑速度来表示，过滤速度越快表示降解程度越高，其中的寡聚半乳糖醛酸的含量越多。具体的操作步骤为：

1、将冻存的马克思克鲁维酵母CBS6556、CBS6556PGko、CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1菌株分别在2mL YPD(2％葡萄糖)液体培养基中在30℃下进行过夜活化培养；

2、将过夜培养的马克思克鲁维酵母在YPD平板上进行培养；

4、将过夜培养得到的菌液接种到SD(0.3％葡萄糖+1.7％果胶)液体培养基中，培养基体积为25mL，摇瓶的体积为250mL。接种之后的菌液的初始OD₆₀₀值为0.05；

5、对菌液在30℃、220rpm条件下进行48小时培养；

6、通过离心分离培养基与菌体；

7、用10kDa的超滤膜对培养基进行浓缩，并计算流速。

结果如图10所示，多聚半乳糖醛酸水解酶过量表达菌株CBS6556pTEF3-PG-tCYC@ABZ1加速培养基中果胶的降解，加速寡聚半乳糖醛酸的生产。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种利用果胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，基因工程菌中具有多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块，所述过表达模块含有多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ IDNO.1所示序列具有70％以上同源性且编码的蛋白在功能上等价。

2.如权利要求1所述的利用果胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，其基因组的ABZ1位点插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块，所述过表达模块包含TEF3启动子、多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因和终止子。

3.如权利要求1所述的利用果胶的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌为马克思克鲁维酵母CBS6556。

4.如权利要求1-3任一项所述的利用果胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌培养采用SD培养基。

5.如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：以马克思克鲁维酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入多聚半乳糖醛酸水解酶过表达模块或者在宿主菌中导入含有多聚半乳糖醛酸水解酶编码基因的重组表达质粒。

6.如权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，将完成转化的菌株接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD培养基中进行恢复培养后涂布于YPD培养板上，筛选获得插入目的基因的单菌落，再接种于含有5-氟乳清酸的YPD培养板中培养去除质粒，获得所述基因工程菌。

8.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在水果加工废弃物及排放水处理或降解果胶生产寡聚半乳糖醛酸、2-苯乙醇、2-苯乙醇乙酯中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将扩大培养后的基因工程菌接种于含葡萄糖的SD培养基中发酵培养，将含有菌体的发酵液加入到待处理材料中，菌体表达分泌的多聚半乳糖醛酸水解酶对果胶进行水解，菌体利用水解产物作为碳源继续生长。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SD培养基中含有3～20g/L的葡萄糖。