CN105255925A - 一种蔗糖异构酶的高效制备方法及其基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产蔗糖异构酶的基因工程菌及其高效生产蔗糖异构酶的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明采用密码子和信号肽优化使蔗糖异构酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达量比原来提高了3倍以上。最后，建立了适合酶的合成与分泌、产品回收与制备的生长培养基和发酵工艺，使得产物中异麦芽酮糖的含量达到100％。这为蔗糖异构酶在食品及其它行业的应用奠定了坚实的基础，也为其它工业酶制剂的高效制备提供了技术支持。

Description

一种蔗糖异构酶的高效制备方法及其基因工程菌

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种高产蔗糖异构酶的基因工程菌及其高效生产蔗糖异构酶的方法。

背景技术

异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose)，又名帕拉金糖(Palatinose)，在自然界中以微量水平存在于蜂蜜和蔗汁中。它与蔗糖互为同分异构体，不仅具备蔗糖的物理性质和口感，还具有低甜味、耐酸解、防龋齿和吸湿性低等特点，因此受到了食品届制取无糖甜食品的欢迎，已逐渐被用作蔗糖的替代品。

蔗糖异构酶(Sucroseisomerase,SIA,E.C.5.4.99.11)广泛应用于异麦芽酮糖的工业生产。该酶催化蔗糖异构化产生异麦芽酮糖和海藻酮糖，同时生成少量的葡萄糖、果糖和异麦芽糖等。目前来源于大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)、肠杆菌属(Enterobactersp.)、精蛋白杆菌(Protaminobacterrubrum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、分散泛菌(Pantoeadispersa)、植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)、沙雷氏杆菌(Serratiaplymuthica)、嗜中酸假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)以及克雷伯氏杆菌属(Klebsiellasp.)细胞都具有产生蔗糖异构酶的能力(WanmengMu,etal.ApplMicrobiolBiotechnol,2014,98:6569-6582)。目前，对于蔗糖异构酶的异源表达主要是在大肠杆菌等非食品级的宿主中进行的(WanmengMu,etal.ApplMicrobiolBiotechnol,2014,98:6569-6582)。1995年，Ralf等第一次报道了将深红红螺菌(RhodospirillumrubrumCBS574.77)来源的蔗糖异构酶在大肠杆菌中进行了表达。接着，来源于7种不同的微生物的蔗糖异构酶也在大肠杆菌中得到了表达。但是，有一些大肠杆菌表达的重组蔗糖异构酶很容易失活。此外，韩国庆熙大学的研究者们也将蔗糖异构酶在乳酸乳球菌和酿酒酵母中进行了表达(ParkJY,etal,BioresourTechnol,2010,101:8828-8833；LeeGY,BioresourTechnol,2011,102:9179-9184)。

异麦芽酮糖的高效制备方法也得到了广泛的研究，主要是对产蔗糖异构酶的游离细胞和固定化细胞生产异麦芽酮糖的条件进行优化。与游离细胞相比，固定细胞在异麦芽酮糖的工业化生产中具有可连续操作、操作稳定性较高以及生物催化剂可循环利用等优势。但目前已报道的大部分野生菌株均存在细胞得率低、细胞酶活低、高浓度底物下的耐受性差等问题，导致转化率低，转化时间长。因此，构建高效、底物耐受性好的产酶菌株将有利于异麦芽酮糖的生产。

地衣芽孢杆菌作为一个通常被认为是安全(generallyregardedassafe,GRAS)的菌种，由于其低廉的发酵成本与优良的蛋白分泌水平(可高达20～25mg/mL)，作为重组蛋白的表达宿主细胞具有很多优势，是重组蛋白，特别是工业酶制剂的重要生产宿主细胞。目前，60％的商业用酶的宿主均来自于芽胞杆菌属。发明人在前期研究中获得了一种地衣芽孢杆菌宿主细胞CBB3008及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法(ZL200810235368.0)，还获得了地衣芽孢杆菌的表达质粒pBL-WZX、pHY-WZX和pCHA03(ZL200510081648.7；ZL2010110252742.5；DandanNiuandZhengxiangWang.JIndMicrobiolBiotechnol,2007,34:357-362)。而且，已经将该表达系统成功应用于高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备(ZL200810235367.6；DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58)。

由于不同的信号肽对不同蛋白的分泌表达具有不同的效果，通过改变信号肽实现异源蛋白的分泌优化是一项常见的技术。随着人们对芽胞杆菌分泌蛋白种类认识的加深，人们开始尝试大规模筛选针对特定蛋白具有分泌优化性质的信号肽。2006年，UlfBrockmeier等对枯草芽胞杆菌的信号肽进行优化，用170多个信号肽替换原来的信号肽，使得角质酶的胞外酶活从0提高到4.67U/mL。ChristianDegering等在2010年通过建立来源于枯草芽胞杆菌以及地衣芽孢杆菌的信号肽库，筛选获得地衣芽孢杆菌的dbi0038信号肽，使蛋白酶BPN的分泌效果比原来提高了6倍。

发明内容

本发明的目的是获得一种蔗糖异构酶的高效、低成本制备方法，用于蔗糖异构酶的工业化制备及异麦芽酮糖的高效生产，由此可降低其发酵制造成本、简化发酵制造工艺及降低发酵工业的环境压力。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种蔗糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所述基因的编码产物为蔗糖异构酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

上述蔗糖异构酶基因是通过对来源自土壤发散菌(Pantoeadispersa)的蔗糖异构酶基因sim进行密码子优化，并通过全基因合成技术获得，原始蔗糖异构酶基因sim的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码产物蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

进一步地，本发明提供一种含有序列如SEQIDNO:3所示的蔗糖异构酶基因的表达载体或基因工程重组菌。

更进一步地，本发明提供一种重组地衣芽孢杆菌CBBD302-2，其特征在于，所述重组菌包含序列如SEQIDNO:3所示的蔗糖异构酶基因的。

更进一步地，本发明提供一种重组地衣芽孢杆菌CBBD302-sYbdN，其特征在于，所述重组菌在蔗糖异构酶基因的上游还包含核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的信号肽基因。

更进一步地，上述重组地衣芽孢杆菌的构建方法包括利用基因工程的手段提高蔗糖异构酶的酶活，特别是密码子和信号肽的优化。

更进一步地，上述重组地衣芽孢杆菌菌株可合成并分泌蔗糖异构酶，重组菌CBBD302-sYbdN酶活比原始菌提高了3倍以上，比重组菌CBBD302-2提高了约83％。

更进一步地，本发明还提供一种蔗糖异构酶的高效制备方法，包括利用上述重组菌发酵进行蔗糖异构酶合成与分泌，以及重组酶产品的回收。

更进一步地，利用上述重组菌发酵生产的蔗糖异构酶，可催化蔗糖高效制备异麦芽酮糖，所制备的产品中异麦芽酮糖的含量可达100％。

本发明通过在含有编码蔗糖异构酶基因的重组地衣芽孢杆菌中基因密码子优化和信号肽优化，从而提高蔗糖异构酶的表达量。并对蔗糖异构酶分泌效果最好的重组地衣芽孢杆菌进行生长培养基和发酵工艺的优化。与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、本发明筛选获得的信号肽，实现了蔗糖异构酶的高效分泌表达，与原信号肽相比，蔗糖异构酶的分泌量提高了3倍多，对于降低蔗糖异构酶的生产成本及其进一步大规模应用具有重要意义；

2、本发明筛选获得蔗糖异构酶的分泌信号肽的方法，相当于转录效率的优化，不会引起分泌通道的阻塞，进而影响下游的发酵；

3、本发明的适合含有蔗糖异构酶编码基因的重组菌进行蔗糖异构酶合成与分泌，以及重组酶的回收与产品制备的生长培养基和发酵工艺，可以用于低成本、简约化制造蔗糖异构酶。

4、本发明的重组菌的选育方法，经过适当修饰后，可以用于其它类型的工业酶制剂，特别是以地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌等为宿主细胞的工业酶制剂生产菌株的选育。

5、本发明中异麦芽酮糖的高效制备工艺，可以使产物中异麦芽酮糖的含量达到100％

附图说明

图1：重组表达质粒pHY-sim和pHY-sim2的物理图谱；其中，图1(a)为重组质粒pHY-sim，图1(b)为重组质粒pHY-sim2；

图2：sim与sim2的核苷酸序列比对；其中，“*”表示核苷酸转换，“#”表示核苷酸颠换；

图3：信号肽优化策略提高蔗糖异构酶在地衣芽孢杆菌中的分泌表达；

图4：制备的蔗糖异构酶对蔗糖的水解作用；

图5：反应16h后蔗糖水解产物中异麦芽酮糖含量的测定。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1蔗糖异构酶编码基因的密码子优化

以PantoeadispersaUQ68J的基因组DNA为模板，根据NCBI数据库中P.dispersaUQ68J的蔗糖异构酶基因sim(GenBank登录号：AY223549.1)的序列设计引物，用PrimeSTARHSDNA聚合酶以扩增包含信号肽的sim基因(核苷酸序列SEQIDNO:1。PCR扩增体系及反应条件参考HSDNAPolymerase说明书(TaKaRa)。将PCR产物克隆入表达载体pHY-WZX(DandanNiuandZhengxiangWang.JIndMicrobiolBiotechnol,2007,34:357-362)的XbaI、KpnI位点中，获得重组表达质粒pHY-sim(图1a)。以pHY-sim为基础，通过网站http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/，优化蔗糖异构酶编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报，2007,13(4)：515-518)，获得密码子优化的编码蔗糖异构酶的新基因sim2(核苷酸序列如SEQIDNO:3所示)，其基因的编码产物命名为SIA2，氨基酸序列与原始菌蔗糖异构酶氨基酸序列相同(序列如SEQIDNO:2所示)。将sim2克隆入上述表达载体pHY-WZX的XbaI、KpnI位点中，获得相应的重组表达质粒pHY-sim2(图1b)。新基因sim2与sim的核苷酸序列比对如图2所示，其中的388个密码子进行了同义密码子的替换。

实施例2使蔗糖异构酶高效分泌表达的信号肽的筛选

从地衣芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中查找了173个信号肽序列，构建这些信号肽与蔗糖异构酶相融合的表达载体，再通过筛选从克隆中获得不同程度提高蔗糖异构酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：

1、质粒pHY-signalpeptidedatabase-sim2的构建

提取地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CBBD302(DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58)基因组DNA(细菌基因组DNA抽提试剂盒)，用相应的引物对选取的信号肽DNA进行PCR扩增。同时，以质粒pHY-sim为模板，PCR扩增启动子(Promoter)的序列。然后将这两个片段进行胶回收(TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0)，以等摩尔的这两个片段为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到包含Promoter-SP的片段。再将这个片段克隆入重组质粒pHY-sim2的BamHI与XbaI位点，构建重组质粒pHY-signalpeptidedatabase-sim2，具体过程见图3。每个信号肽(SP)与一个人工合成的核糖体结合位点(RBS，序列为AAGGAGG)和间隔区(序列为ATATT)一起扩增，克隆到蔗糖异构酶基因的上游。

2、重组菌的构建与筛选

按照文献(DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58)的方法将上述重组质粒电转化入地衣芽孢杆菌CBBD302中，采用一种高通量的筛选方法对重组菌进行筛选。具体操作如下：

配制蔗糖标准溶液：将2.632g蔗糖溶解于1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，定容至10mL。

(1)将待筛选的蔗糖异构酶产生菌接入含有培养基的微孔板I中，42℃，转速220rpm，振荡培养120h。

(2)将微孔板I离心去除菌体，将每孔的上清液依次转移入另一微孔板II中。每孔加入0.5mL10％(w/v)的蔗糖溶液进行酶转化反应。

(3)转化结束后，将微孔板II离心，并将每孔的上清液稀释50～100倍后依次转移50μL至另一微孔板III中。向微孔板III中加入950μL的蔗糖标准溶液(30℃预热10min)，30℃反应0.5h，取样50μL，沸水浴灭活处理5min。

(4)HPLC分析：

检测器：ELSD(蒸发光检测器)

流动相A：75％乙腈

流动相B：25％水

柱温：30℃

进样量：10μL

液相流速：1mL/min

漂移管温度：90℃

氮气流量：2.2L/min

色谱柱：PrevailCarbohydrateES5u(250mm×4.6mm)

蔗糖异构酶SI酶活定义：1个酶活力单位(U)是指在最适条件(30℃，pH6.0)下，1min内生成1μmol异麦芽酮糖的酶量。

经上述步骤筛选获得能提高蔗糖异构酶分泌效果的信号肽为sYbdN，其氨基酸序列为MVKKWLIQFAVMLSVLSTFTYSASA(SEQIDNO:4)，编码该氨基酸序列的核苷酸序列为ATGGTTAAAAAATGGCTTATCCAATTCGCGGTTATGCTTAGCGTTCTTAGCACATTCACATACAGCGCGAGCGCG(SEQIDNO:5)。

表1：不同信号肽对蔗糖异构酶的分泌效果

实施例3重组地衣芽孢杆菌中蔗糖异构酶的合成水平

将上述实施例1和实施例2中获得的重组表达质粒pHY-sim、pHY-sim2和pHY-sYbdN-sim2用电穿孔法转化入宿主细胞地衣芽孢杆菌CBBD302中，在选择性平板上筛选转化子，分别命名为CBBD302-1、CBBD302-2和CBBD302-sYbdN。在含有50mL培养基的250mL三角瓶中进行发酵。发酵在发酵培养基(酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1～4％，葡萄糖10～20％，其余为水，pH7.0)中，于42℃、220rpm下进行，发酵时间为120h，测定发酵液中蔗糖异构酶的酶活，结果汇总于表2。重组菌CBBD302-2与原始菌CBBD302-1相比，蔗糖异构酶合成水平提高76％。重组菌CBBD302-sYbdN合成与分泌蔗糖异构酶的水平是CBBD302-1的3倍多，较重组菌CBBD302-2提高了约83％。重组菌CBBD302-sYbdN在无抗生素培养基中传代100代后，质粒维持率在91％左右。

表2：重组地衣芽孢杆菌中蔗糖异构酶的合成水平

实施例4重组地衣芽孢杆菌CBBD302-sYbdN25L发酵系统发酵工艺的建立

进一步将重组地衣芽孢杆菌CBBD302-sYbdN在25L全自动发酵罐中进行发酵试验，发酵培养基为：酵母膏1％～3％，蛋白胨2％～4％，乳糖8％～12％，碳酸钙2％～3％，其余为水，pH7.0；工作发酵体积12L；发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0；发酵时间为150～180h。

实施例5在30m³发酵体系下蔗糖异构酶的制备

将实施例4的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例。分别完成种子培养(种子培养基组成：酵母膏3～5％，蛋白胨3.8～6.2％，葡萄糖10～20％，其余为水，pH7.0)，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备蔗糖异构酶液体成品(酶活为1100U/mL～1900U/mL)。或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型蔗糖异构酶成品。

实施例6在20m³制糖体系下制备异麦芽酮糖

(1)配制蔗糖标准溶液：将蔗糖溶解于1M、pH6.0的磷酸盐缓冲液中配制成蔗糖浓度为50％～80％(w/v)的蔗糖溶液。

(2)以蔗糖异构酶催化生产异麦芽酮糖所用条件是，按每Kg蔗糖(干)加入酶50,000～100,000U，将蔗糖异构酶液体成品加入到50％～80％(w/v)的蔗糖溶液中，控制反应液在pH6.0，温度在30℃～40℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应5～24h。当蔗糖浓度为50％时，酶活为70,000U的蔗糖异构酶16h就可以将蔗糖完全转化为异麦芽酮糖(图4)，且所制备的产品中异麦芽酮糖的含量可达100％(图5)。

Claims (9)

1.一种蔗糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

2.一种表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的蔗糖异构酶基因。

3.一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于包含权利要求1所述的蔗糖异构酶基因。

4.根据权利要求3所述的一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述重组地衣芽孢杆菌的构建方法包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的蔗糖异构酶基因克隆入表达载体pHY-WZX的XbaI、KpnI位点中，获得重组质粒pHY-sim2，所述重组质粒转化入宿主细胞地衣芽孢杆菌CBBD302。

5.根据权利要求3所述的一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述蔗糖异构酶基因的上游还包含核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的信号肽基因。

6.根据权利要求5所述的一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述重组地衣芽孢杆菌的构建方法包括如下步骤：以地衣芽孢杆菌CBBD302基因组DNA为模板，对核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的信号肽基因进行PCR扩增，同时，以质粒pHY-sim为模板，PCR扩增启动子Promoter的序列，然后将这两个片段进行胶回收，以等摩尔的这两个片段为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到包含Promoter-SP的片段，再将这个片段克隆入重组质粒pHY-sim2的BamHI与XbaI位点，构建重组质粒pHY-signalpeptidedatabase-sim2，所述重组质粒转化入宿主细胞地衣芽孢杆菌CBBD302。

7.权4或6所述重组菌的用途，其特征在于，用于发酵生产蔗糖异构酶，其酶活力为271U/mL或495U/mL。

8.利用权利要求4或6所述重组菌发酵生产蔗糖异构酶的方法，其特征在于，发酵培养基为：酵母膏1％～3％，蛋白胨2％～4％，乳糖8％～12％，碳酸钙2％～3％，其余为水，pH7.0；发酵条件为：发酵温度42±1℃，发酵过程中维持溶氧为20％以上，发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0，发酵时间为150～180h。

9.权利要求3-6任一所述重组菌在催化蔗糖生产异麦芽酮糖中的应用。