CN115927135A - 一种高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻及其制备方法 - Google Patents
一种高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种制备高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，以及使用该方法制备的工程藻株。发明通过将蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框转入到聚球藻中，意外地使藻细胞具有了高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的功能，初步培养显示，本发明的工程藻株通过分泌使得培养物中含有高达570‑776mg/L的异麦芽酮糖和139‑326mg/L的海藻酮糖，浓度极高，通过一定培养优化后，即可用于商业化生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物工程领域。具体涉及一种生产异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻及其构建方法与应用。
背景技术
异麦芽酮糖又名帕拉金糖，是一种还原性双糖，是蔗糖的同分异构体，由葡萄糖与果糖以α-1,6-糖苷键结合而成，天然存在于蜂蜜和甘蔗汁中。它具有与蔗糖相似的物理和感官特性，甜度只有蔗糖的一半；此外异麦芽酮糖还具有能量值低，消化吸收率低的特点，它能缓慢地将葡萄糖释放到血液中，且不刺激胰岛素的生成，从而避免葡萄糖水平的突然上升和下降，有益于糖尿病患者食用；同时它不容易被形成牙菌斑的可变链球菌所利用，能够避免龋齿的发生。海藻酮糖也是一种还原性二糖，其功能特性与异麦芽酮糖基本类似，因此异麦芽酮糖和海藻酮糖作为健康的食品添加剂，在食品工业中均具有广阔的市场应用前景。
目前国内外生产异麦芽酮糖和海藻酮糖、普遍采用的方法为基于生物催化的蔗糖异构化法。以大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等异养微生物为底盘，在蔗糖异构酶的作用下，微生物能将蔗糖异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖。但是采用以上底盘进行工业生产发酵时需大量添加葡萄糖、蔗糖等糖原料来提高目标产物的积累，会增加制糖产业的经济和环境成本。而自养微生物如蓝细菌等可以以CO2为唯一碳源实现细胞生长，相较于异养微生物能节省发酵成本，并同时起到固碳减排和清洁生产的效果，因此也受到科学界越来越多的关注。
蓝细菌因具有结构简单、生长快速、易于进行遗传操作、光合效率高等优势被认为是最具潜力的光合生物制造的微生物底盘之一。随着合成生物学和代谢工程技术手段的快速发展，目前已实现以蓝细菌为光合平台合成多种天然或非天然代谢产物，包括糖、醇、酸、烷、烯、酮、脂肪酸、脂肪醇和萜类等。但是，尚无报道将蓝细菌用于商业化生产异麦芽酮糖和海藻酮糖。因此，以蓝细菌为底盘，开发高效、绿色的新型异麦芽酮糖和海藻酮糖合成技术对于提高产品竞争力和市场接受度具有重要意义。
发明内容
在前期研究中，我们发现，在聚球藻PCC7942转入蔗糖转运蛋白的表达框后，藻细胞向外大量分泌蔗糖。从理论上讲，蔗糖异构酶可以蔗糖为底物，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，当藻细胞内表达蔗糖转运蛋白导致蔗糖向外分泌时，细胞内的蔗糖量降低，即便向藻细胞中转入与异麦芽酮糖合成相关的酶，细胞合成异麦芽酮糖的效率也应当降低才对。
然而，意外地，我们发现，当向细胞内转入了蔗糖转运蛋白的表达框后，再转入蔗糖异构酶的表达框，结果异麦芽酮糖的合成效率不仅没有降低，反而提高了，甚至达到了数百毫克级的胞外异麦芽酮糖含量；并且，除了异麦芽酮糖外，海藻酮糖的含量和占比都大幅提高。因此，我们有望实现异麦芽酮糖和海藻酮糖的商业生产。
基于以上发现，本发明提供了一种制备高产异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，所述蔗糖异构酶为具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，所述底盘蓝细菌为所有能够产生蔗糖的蓝细菌，可为环境中直接分离的能够产生蔗糖的蓝细菌，或通过遗传改造之后使得能够生产蔗糖的蓝细菌。
在一个具体实施方案中，所述底盘蓝细菌为聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。例如，我们通过实验发现，聚球藻PCC7942、集胞藻PCC6803、聚球藻 UTEX2973、鱼腥藻PCC 7120、聚球藻PCC7002都可以通过本发明的方法来实现异麦芽酮糖和海藻酮糖的生产。
在一个具体实施方案中，所述蔗糖转运蛋白表达框中，蔗糖转运蛋白的蛋白序列如SEQ ID NO:10所示。
我们试验了大部分我们能获得的具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，包括来源于沙雷氏菌属(Serrati)、欧文氏菌属 (Erwinina)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、分散泛菌属(Pantoea dispers)、红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum)的蔗糖异构酶，发现都能大幅提高异麦芽酮糖和海藻酮糖的含量。
在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶为来源于Erwiniarhapontici NX-5、Raoultella terrigena或Klebsiella sp.LX3 的蔗糖异构酶，或其变体。
在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶的蛋白序列如SEQID NO:1、4、7之一所示。
上述基因表达框中，用于驱动蔗糖转运蛋白和蔗糖异构酶表达的启动子没有特别的限定，只需要能够在目标藻株内使目的基因强表达即可。例如，在聚球藻PCC7942中，可使用的启动子包括但不限于：cpcB1启动子、cpcB560 启动子、rbcL启动子等组成型强启动子，lac启动子、trc启动子等诱导型强启动子。
在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶的核酸序列如SEQ ID NO:2、3、 5、6、8、9之一所示。
本发明还提供了通过上述方法得到高产异麦芽酮糖和海藻酮糖的蓝细菌。
本发明通过将蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框转入到聚球藻中，意外地使藻细胞具有了高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的功能，初步培养显示，本发明的工程藻株通过分泌使得培养物中含有高达570-776mg/L 的异麦芽酮糖和139-326mg/L的海藻酮糖，浓度极高，通过一定培养优化后，即可用于商业化生产。
附图说明
图1为pYW01的质粒图谱。
图2为pYW02的质粒图谱。
图3为pYW03的质粒图谱。
图4为带有蔗糖转运蛋白表达框的质粒的质粒图谱。
图5为对工程藻株的NS1位点(左)和NS3(右)进行扩增后，扩增产物的电泳照片。
图6为使用HPLC检测异麦芽酮糖A和海藻酮糖B标准品的峰图。
图7为使用HPLC检测工程藻株培养物的上清的峰图。
图8为工程藻株FL92、YW07、YW08、YW09的生长曲线A，以及胞内外蔗糖含量B、胞内外异麦芽酮糖含量C和胞内外海藻酮糖含量D的统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.所用到的藻株
本发明旨在以聚球藻PCC7942(Syn7942)为底盘藻，改造出一种可高效合成异麦芽酮糖的工程藻株，用于商业化生产。Syn7942是蓝细菌研究的模式藻，已被广泛应用，公众可通过多种方式得到。
2.质粒构建
1)从Erwinia rhapontici NX-5的基因组中找到蔗糖异构酶序列(蛋白序列如SEQID NO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO:2所示)，密码子优化后得到的序列如SEQ ID NO:3所示，将密码子优化后的序列连接在启动子PcpcB1下游，构成NX-5蔗糖异构酶基因表达框，并将该基因表达框与抗性片段Kmr连接，插入到Syn7942的一个中性位点(NS1)的上下游同源臂之间，整合到pUC19上，得到质粒pYW01(图1)。
2)从Raoultella terrigena的基因组中找到蔗糖异构酶序列(蛋白序列如SEQ IDNO:4所示，核酸序列如SEQ ID NO:5所示)，密码子优化后得到的序列如SEQ ID NO:6所示，将密码子优化后的序列连接在启动子PcpcB1下游，构成RT蔗糖异构酶基因表达框，并将该基因表达框与抗性片段Kmr连接，插入到Syn7942的一个中性位点(NS1)的上下游同源臂之间，整合到pUC19上，得到质粒pYW02(图2)。
3)从Klebsiella sp.LX3的基因组中找到蔗糖异构酶序列(蛋白序列如SEQ IDNO:7所示，核酸序列如SEQ ID NO:8所示)，密码子优化后得到的序列如SEQ ID NO:9所示，将密码子优化后的序列连接在启动子PcpcB1下游，构成LX3蔗糖异构酶基因表达框，并将该基因表达框与抗性片段Kmr连接，插入到Syn7942的一个中性位点(NS1)的上下游同源臂之间，整合到pUC19 上，得到质粒pYW03(图3)。
3.蓝细菌的转化和筛选
1)向Syn7942转入带有蔗糖转运蛋白(CscB)(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，核酸序列如SEQ ID NO:11所示)表达框的质粒(质粒图谱如图 4所示)，该表达框插入于一个中性位点(NS3)的上下游同源臂之间，得到工程藻株FL92；
2)向上述工程藻株FL92中分别转入pYW01、pYW02、pYW03，得到三个阳性藻株YW07、YW08和YW09(图5)。
4.工程藻株合成分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖
使用柱式光反应器，为直径3cm，长度为20cm的普通玻璃材质的圆底玻璃管；反应器总装液量可达100mL，实验过程中装液65mL。种子液为处于对数生长期的BG11培养物(补充有相应抗生素：卡那霉素，10μg/mL；氯霉素：5μg/mL)，初始接种浓度OD730为1，培养基为BG11(添加抗生素)，在30℃，150μmol photons m-2s-1，通入混合气(3％CO2+97％空气)的条件下进行培养。
取1mL培养过程中的工程菌株的藻液，13000rpm离心10min，将离心后的上清移入另一干净的1.5mL的EP管中，利用液相色谱测定胞外糖含量。使用安捷伦1260高效液相色谱仪，HPX-87H糖分析柱。流动相为5mM H2SO4溶液，流速为0.5mL/min。图6A所示为异麦芽酮糖标准品(400mg/L) 的峰图，出峰时间约在9.306min；图6B所示为海藻酮糖标准品(200mg/L)的峰图，出峰时间约在9.676min；图7为使用液相色谱测定基因工程菌株培养物上清峰图，异麦芽酮糖出峰时间为9.307min，海藻酮糖出峰时间为 9.684min，与标准品相吻合。
对胞外的蔗糖、异麦芽酮糖、海藻酮糖含量，以及胞内的异麦芽酮糖、海藻酮糖进行定量分析。
结果如图8所示，四个藻株0-6天的生长速度类似，但是培养至8-10 天，FL92的细胞浓度高于另外三个藻株(图8A)。经过6天培养，FL92胞外分泌蔗糖量达到860mg/L，而YW07、YW08、YW09的胞外分泌蔗糖量分别仅为63、41、21mg/L(图8B)。这说明，当藻细胞既表达蔗糖转运蛋白，又表达蔗糖异构酶的情况下，蔗糖异构酶能够先于蔗糖转运蛋白将蔗糖转化为其异构化形式，而且这种情况下，三种不同来源的异构酶对蔗糖的转化率分别高达92％、95％、97％。
此外，YW07、YW08、YW09的胞外异麦芽酮糖产量分别达到776、768、 570mg/L(图8C)，胞外海藻酮糖产量分别达到139、158、326mg/L(图8D)，胞外异麦芽酮糖与胞外海藻酮糖比例分别为85％：15％，83％：17％，63％：37％，说明三种异构酶中，来源于Erwiniarhapontici NX-5的蔗糖异构酶基因的异麦芽酮糖产率较高(即以蔗糖为底物转化成异麦芽酮糖的占比高，副产物海藻酮糖占比少)；YW07、YW08、YW09的胞内异麦芽酮糖含量分别为7、10.6、 4.6mg/L，即异麦芽酮糖的胞外分泌率分别为99％、98％、99％。我们通过这些结果不仅首次发现了蔗糖转运蛋白具有能够将异麦芽酮糖以及海藻酮糖分泌到胞外的作用，而且，似乎其对异麦芽酮糖以及海藻酮糖的转运优先级高于蔗糖，这才导致工程藻株能够生产的蔗糖降低为原来的不到1/10，且异麦芽酮糖和海藻酮糖的产量则远高于蔗糖。
这些结果说明，通过对模式底盘Sny7942进行系统代谢工程改造(表达异麦芽酮糖合酶、表达转运蛋白)，所获得的工程藻株能够将细胞内的蔗糖非常高效地进行异构，转化为异麦芽酮糖、海藻酮糖并优先将两者分泌到胞外。其中，当目标产物为异麦芽酮糖时，来源于Erwinia rhapontici NX-5 的蔗糖异构酶基因表达效果最好，异麦芽酮糖产量达到776mg/L，异麦芽酮糖的胞外分泌率分别为99％，胞外异麦芽酮糖与胞外海藻酮糖比例分别为 85％：15％。
本发明的实施例中出于举例说明的目的，列举了一些特定的启动子和特定的蔗糖转运蛋白和蔗糖异构酶的蛋白和核酸编码序列，但是，这些特定的启动子、蛋白和核酸编码序列不应当作为本发明限制。本领域技术人员在阅读本申请并领会其精神的情况下，可以自行设计已有的或将有的启动子和具有相同或相似功能的蛋白或核酸编码序列，形成所需要的基因表达框，转入到相应的蓝细菌中，以得到能够高产并分泌异麦芽酮糖、海藻酮糖的工程藻株，这样的启动子和蛋白及核酸编码序列，也应覆盖在本发明的保护范围之下。
还需要说明的是，本发明虽然使用Syn7942作为底盘藻，但是使用其他相似蓝细菌(如聚球藻PCC7002、集胞藻PCC6803等)也具有相同或相似的效果。本领域技术人员在阅读本申请并领会其精神的情况下，可以自行选用已有的或将有的蓝细菌作为底盘藻来构建具有高产和分泌异麦芽酮糖、海藻酮糖的工程藻株，这样的底盘藻也应覆盖在本发明的保护范围之下。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制备高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，其特征在于，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，所述蔗糖异构酶为具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，所述底盘蓝细菌为能够产生蔗糖的蓝细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌为环境中直接分离的能够产生蔗糖的蓝细菌，或通过遗传改造之后使得能够生产蔗糖的蓝细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌选自聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌选自聚球藻PCC7942、集胞藻PCC6803、聚球藻UTEX2973、鱼腥藻PCC 7120、聚球藻PCC7002。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖转运蛋白表达框中，蔗糖转运蛋白的蛋白序列如SEQ ID NO:10所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶为来源于沙雷氏菌属(Serrati)、欧文氏菌属(Erwinina)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、分散泛菌属(Pantoea dispers)、红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum)的蔗糖异构酶，或其变体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶为来源于Erwiniarhapontici NX-5、Raoultella terrigena或Klebsiella sp.LX3的蔗糖异构酶，或其变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶的蛋白序列如SEQ ID NO:1、4、7之一所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶的核酸序列如SEQ ID NO:2、3、5、6、8、9之一所示。
10.一种高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的蓝细菌，其特征在于，通过权利要求1-9中任一项所述的方法制备得到。
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| US20120276637A1 (en) * | 2011-02-24 | 2012-11-01 | South Dakota State University | Genetically engineered cyanobacteria |
| CN105255925A (zh) * | 2015-11-03 | 2016-01-20 | 天津科技大学 | 一种蔗糖异构酶的高效制备方法及其基因工程菌 |
| CN107236754A (zh) * | 2016-03-28 | 2017-10-10 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 利用聚球藻utex2973生产糖类化合物的构建体、菌株与方法 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120220007A1 (en) * | 2009-09-04 | 2012-08-30 | President And Fellows Of Harvard College | Production of secreted bioproducts from photosynthetic microbes |
| US20120276637A1 (en) * | 2011-02-24 | 2012-11-01 | South Dakota State University | Genetically engineered cyanobacteria |
| CN105255925A (zh) * | 2015-11-03 | 2016-01-20 | 天津科技大学 | 一种蔗糖异构酶的高效制备方法及其基因工程菌 |
| CN107236754A (zh) * | 2016-03-28 | 2017-10-10 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 利用聚球藻utex2973生产糖类化合物的构建体、菌株与方法 |
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