CN111153968A

CN111153968A - 一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途

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Publication number: CN111153968A
Application number: CN202010074806.0A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 李玉; 彭冲; 陈雪佳; 王兴吉; 刘逸寒; 王克芬; 张会图; 刘文龙; 刘夫锋; 张�杰; 佟新伟
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: CN111153968B

Abstract

本发明公开了一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。所述突变体是将来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽的C端第‑1位和/或第‑3位氨基酸突变为丙氨酸,即将C端的最后三位氨基酸序列突变为AXA或者在信号肽C端后增加氨基酸序列AXA，所述X为任意氨基酸。本发明构建方法简单易行，适用于枯草芽孢杆菌系统，信号肽突变后的碱性蛋白酶表达量均高于未突变体。本发明为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，有效推动了碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。

Description

一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途。

背景技术：

碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。并且芽孢杆菌具有以下优点：(1)在工业生产中，一般要求菌株对健康或环境无毒无害，芽孢杆菌中除了炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌的少数菌株外，几乎都没有致病性；(2)芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

信号肽对于蛋白的分泌表达起着关键的作用。在枯草芽胞杆菌中，蛋白质分泌到细胞膜外主要通过两种途径，Sec途径和Tat途径，其中，绝大部分蛋白质是通过Sec途径分泌的，只有少量需要先折叠的蛋白质通过Tat途径分泌。Sec途径的信号肽虽然没有可识别的通用序列，但它们基本都由三个部分组成：由6个氨基酸组成的带正电的N端，10-18个氨基酸组成的疏水中间部分及H端，以及信号肽肽酶识别区域的C端。C端是信号肽肽酶识别位点对信号肽的切割效率起着重要的作用。

专利申请CN107200772A公开了一种优化角蛋白酶高效分泌表达的信号肽及其应用，此信号肽是通过对来源于枯草芽孢杆菌的三种信号肽改造获得，通过在角蛋白酶Ker的N端融合此信号肽，使重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶分泌效率显著提高，其胞外角蛋白酶酶活提高了3.39倍。专利申请CN104312933A公开了一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，通过与胰蛋白酶融合表达8种毕赤酵母胞外分泌信号肽，甲醇诱导启动子(pAOX)在Pichiapastoris GS115染色体上表达重组胰蛋白酶，该αmf信号肽与原始的α-factor信号肽相比，胰蛋白酶酶活提高了2.75倍，有效解决了胰蛋白酶胞外分泌量低的问题。CN107082801A公开了一种提高蛋白分泌效率的信号肽突变体及其应用，通过对己知的信号肽PelB进行改造，将PelB信号肽第三位酪氨酸突变成了组氨酸，使环糊精葡萄糖基转移酶的酶活和胞外分泌效率显著提高，可使目的蛋白环糊精葡萄糖基转移酶的酶活提高1.4倍，使得重组菌保外分泌蛋白能力增强，更有利于常规蛋白的胞外表达。201710352661.4公开了一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用。此信号肽突变体通过对来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽序列的N端进行饱和突变获得，突变的具体位点在将第七位的苏氨酸替换为缬氨酸。突变体信号肽与未突变信号肽相比，能提高来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达50％以上，有很好的应用价值。

发明内容

本发明利用定点突变对来Sec途径的信号肽进行改造，提高碱性蛋白酶在枯草芽胞杆菌中的胞外表达量，且方法简单、操作易行、表达稳定，适用于芽孢杆菌的表达系统。

本发明的目的是提供一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途，具体是利用定点突变对Sec途径的信号肽C端进行改造，以获得能够在芽孢杆菌进行高效表达分泌碱性蛋白酶的突变体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体，所述突变体是将来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽C端第-1位和/或第-3位氨基酸突变为丙氨酸,即将C端最后三位氨基酸序列突变为AXA或者在信号肽C端后增加氨基酸序列AXA，所述X为任意氨基酸，从而提高外源碱性蛋白酶的表达量，所述X为任意氨基酸。

优选地，所述信号肽来源于枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，来源于枯草芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：1所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码第-3位氨基酸T替换为氨基酸A，即将其C端编码的最后三位氨基酸突变为ASA，信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：3所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码第-3位氨基酸V替换为氨基酸A，即将其C端编码的最后三位氨基酸突变为ASA，信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：5所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码第-3位氨基酸V替换为氨基酸A，即将其C端编码最后三位氨基酸突变为ALA，信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：7所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码第-3位氨基酸T替换为氨基酸A，即将其C端编码最后三位氨基酸突变为AHA，信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：9所示的原始氨基酸序列的基础上，在其C端后增加氨基酸序列APA，信号肽突变体的氨基酸序列如SEQID NO：10所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。

优选地，编码所述SEQ ID NO：2的信号肽突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示。

优选地，编码所述SEQ ID NO：4的信号肽突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示。

优选地，编码所述SEQ ID NO：6的信号肽突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：15所示。

优选地，编码所述SEQ ID NO：8的信号肽突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。

优选地，编码所述SEQ ID NO：10的信号肽突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：17所示。

本发明的第三个目的是提供所述信号肽突变体在提高外源碱性蛋白酶表达中的用途。

优选地，所述碱性蛋白酶基因为碱性蛋白酶基因aprE。

所述碱性蛋白酶基因aprE，来源于克劳氏芽孢杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，其GenBank:FJ940727.1。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述信号肽突变体的编码基因的重组载体。

优选地，所述重组载体所用的表达载体为pWB980或PUB110。

本发明的第五个目的是提供一种含有所述重组载体或所述信号肽突变体编码基因的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

所述宿主细胞不具有分泌表达碱性蛋白酶的功能。

更优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。参考非专利文献(史超硕、李登科等。两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响[J].中国生物工程杂志.2019,39(10)：17-23。

本发明的第六个目的是提供一种基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞，通过载体表达连接有所述信号肽突变体编码基因和碱性蛋白酶基因。

本发明的第七个目的是提供所述信号肽突变体的构建方法，步骤如下：构建包含所述信号肽突变体的编码基因和碱性蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

本发明的第七个目的是提供所述碱性蛋白酶的生产方法，步骤如下：

将含有所述信号肽突变体的基因工程菌经活化后以1.5-2.5％(v/v)的接种量转接于发酵培养基中，于34-40℃、215-225r/min发酵培养47-49h；

所述发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水。

优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：将所述基因工程菌接入种子培养基中，34-40℃、215-225r/min振荡培养11-13h；

所述种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。

有益效果：

本发明通过定点突变芽孢杆菌属来源的Sec途径信号肽根据其结构特点进行定点的突变，高效异源表达碱性蛋白酶，并通过其自身的结构特点进行定点突变后进一步提高碱性蛋白酶表达量。方法简单易行，适用于枯草芽孢杆菌系统(枯草芽孢杆菌系统不具有碱性蛋白酶表达途径)，信号肽突变后的碱性蛋白酶表达量均高于未突变体。为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。

本发明通过C端进行突变，将信号肽C端第-3位和第-1位氨基酸突变为丙氨酸,即将信号肽C端最后三位氨基酸序列突变为AXA或者在信号肽C端后增加氨基酸序列AXA，从而提高外源碱性蛋白酶的表达量(其中，A为丙氨酸，X为任意氨基酸)，获得分泌效果更佳的信号肽突变体。同时，突变体信号肽将蛋白的合成与运送达到一个更佳的平衡，显著提高表达蛋白的总量。

附图说明

图1：信号肽突变体结构示意图，其中(a)C端最后三位氨基酸序列突变为AXA的结构示意图，(b)为信号肽C端后增加氨基酸序列AXA的结构示意图。

图2：克劳氏碱性蛋白酶基因重组表达载体图谱，其中P₄₃和SP_SacB是原有的载体上的启动子和信号肽序列。

图3：启动子和突变前/后信号肽重组载体图谱，其中SP代表所要替换的突变前/后的信号肽。

图4：本发明实施例中碱性蛋白酶编码基因PCR琼脂糖电泳图，其中泳道1为marker，泳道2为碱性蛋白酶PCR产物；

图5：信号肽突变前/后重组菌株酶活示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用培养基及酶活测定方法：

种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。

发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

SP-A盐溶液：(NH₄)₂SO₄ 4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，柠檬酸钠2g/L，余量为水；

SP-B盐溶液：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，余量为水；

100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L，余量为水；

SPI(200mL)：SP-A盐溶液98mL，SP-B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂ 6mL；

100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

本发明实施例中的含有信号肽突变体的基因工程菌应用于发酵生产重组碱性蛋白酶，摇瓶发酵培养48h后发酵液中重组碱性蛋白酶的活性，重组菌株中信号肽突变体的酶活均高于其未突变体。一种碱性蛋白酶，以未突变的信号肽的重组菌株做对照。

实施例1：碱性蛋白酶基因的获取

根据GenBank:FJ940727.1的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列设计引物，以克劳氏芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增碱性蛋白酶基因aprE，纯化回收，测序，测序结果经过在NCBI上比对与GenBank:FJ940727.1的碱性蛋白酶基因同源性为100％。以碱性蛋白酶基因为报告基因。所用引物序列及酶切位点如下表1：

表1引物列表

扩增目的基因时所用的反应体系为50μL，如下所示：

aprE的退火温度是58℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

实施例2：重组碱性蛋白酶基因工程菌的构建

将碱性蛋白酶aprE基因经PCR扩增纯化后经双酶切(BamHI-SphⅠ)回收。通过Solution I连接酶连接到经双酶切(BamHI-SphⅠ)的pWB980表达载体上(如图1所示)，转化枯草芽孢杆菌WB600。后续构建信号肽的宿主的表达。

酶切体系如下：

pWB980表达载体的酶切及与目的基因的连接：

(1)提取pWB980质粒，然后根据所需要的限制性内切酶双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；

(2)对酶切目的片段进行胶回收纯化；

(3)将回收好的目的片段和pWB980片段连接，连接条件：16℃，6h或过夜连接，获得重组载体，其中，连接体系如下：

碱性蛋白酶基因片段 4.5μL

线性pWB980片段 0.5μL

Solution I 5.0μL

将重组载体导入枯草芽孢杆菌WB600的化转方法：

(1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

(2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD₆₀₀＝1.2(约3–4h)；

(3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

(4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100r/min培养10min；

(5)加入重组载体，37℃，100r/min培养30min；

(6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。其中，碱性蛋白酶编码基因PCR琼脂糖电泳图参照附图4。

实施例3：解淀粉来源的Sec途径Alpha-amylase(GenBank:J01542.1)信号肽以及其突变体的制备

利用解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218基因组数据，通过在线分析软件SignalP5.0Server和TatP 1.0Server预测获得解淀粉来源Sec途径的信号肽，分析其结构特点筛选出不是以AXA结尾的信号肽通过引物设计构建其自身的突变体。将信号肽及其信号肽突变体分别与启动子P_ly-2(核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，启动子来源于枯草芽孢杆菌淀粉酶，构建方法来源于专利申请号为201910332240.4的发明专利《一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》)通过重叠PCR的方法构建目的片段。

表2信号肽突变

Alpha-amylase以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218的基因组为模板，以Alpha-amylase-F为上游引物，以Alpha-amylase-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽Alpha-amylase，其氨基酸如SEQ ID NO：1所示，在信号肽Alpha-amylase的基础上，以Alpha-amylase-F为上游引物，以Alpha-amylase-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端的TSA突变成ASA，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4.实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶P_ly-2+SP_DacB)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)，以P_ly-2-F为上游引物，以P_ly-2-RA为下游引物，进行PCR扩增P_ly-2-A的基因片段。

采用重叠PCR的方法，以P_ly-2-A和信号肽Alpha-amylase基因为模板、以P_ly-2-F为上游引物，以Alpha-amylase-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子P_ly-2和信号肽Alpha-amylase的重叠PCR产物，同时以P_ly-2-A和突变后的信号肽为模板，以P_ly-2-F为上游引物，以Alpha-amylase-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子P_ly-2和突变后的信号肽的重叠PCR产物。启动子P_ly-2和Alpha-amylase的信号肽所用引物序列及酶切位点如下表3所示。表3中，下划线是酶切位点，小写字母为为同源片段，RT为突变体的下游引物。

表3引物列表

启动子P_ly-2和Alpha-amylase信号肽及其突变信号肽，重叠PCR时所用的反应体系为50μL，如下所示：

通过PCR扩增获得的信号肽及其突变体以及重叠PCR的退火温度是60℃，延伸时间与基因长度对应，重叠PCR延伸时间为45s反应程序如下：

启动子片段P_ly-2分别和信号肽及其突变体的基因经重叠PCR扩增后的连接基因片段，纯化回收后经双酶切(EcoRI-HindIIⅠ)回收产物酶切体系同上，分别构建到经双酶切(EcoRI-HindIIⅠ)含有碱性蛋白酶基因aprE的pWB980表达载体上(如图2所示)。转化枯草芽孢杆菌WB600。转化方法同实施案例2的将重组载体导入枯草芽孢杆菌WB600的化转方法。获得重组菌株分别命名为A(含有原信号肽)，AT(含有信号肽突变体)

实施例4：解淀粉来源的Sec途径bglA(GenBank:M15674.1)信号肽以及其突变体的制备

利用解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218基因组数据，通过在线分析软件SignalP5.0 Server和TatP 1.0 Server预测获得解淀粉来源Sec途径的信号肽，分析其结构特点筛选出不是以AXA结尾的信号肽通过引物设计构建其自身的突变体。将信号肽及其信号肽突变体分别与启动子P_ly-2通过重叠PCR的方法构建目的片段。

表4信号肽突变

以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218的基因组为模板，以bglA-F为上游引物，以bglA-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽bglA，其氨基酸如SEQ ID NO：3所示，在信号肽bglA的基础上，以bglA-F为上游引物，以bglA-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端的VSA突变成ASA，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQ ID NO：4所示。

以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4。实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶P_ly-2+SP_DacB)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)，以P_ly-2-F为上游引物，以P_ly-2-RB为下游引物，进行PCR扩增P_ly-2-B的基因片段。

通过重叠PCR的方法，以P_ly-2-B和信号肽基因为模板、以P_ly-2-F为上游引物，以bglA-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子P_ly-2和信号肽bglA的重叠PCR产物，同时以P_ly-2-B和突变后的信号肽为模板，以P_ly-2-F为上游引物，以bglA-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子P_ly-2和突变后的信号肽的重叠PCR产物。构建启动子分别和信号肽及其突变体的连接基因片段。

启动子P_ly-2和信号肽bglA所用引物序列及酶切位点如表5所示。表5中，红色下划线是酶切位点，小写字母为为同源片段，RT为突变体的下游引物。

表5引物列表

启动子P_ly-2分别和信号肽bglA及其突变信号肽的重叠PCR体系及其重组菌株的构建方法同实施案例3.其重组菌株分别命名B(含原信号肽),BT(含有信号肽突变体)实施例5：解淀粉来源的Sec途径Chitosanase(NCBI Reference Sequence:NC_014551.1)信号肽以及其突变体的制备

表6信号肽突变

以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218的基因组为模板，以Chitosanase-F为上游引物，以Chitosanase-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽Chitosanase，其氨基酸如SEQID NO：5所示，在信号肽Chitosanase的基础上，以Chitosanase-F为上游引物，以Chitosanase-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端的VLA突变成ASA，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQ ID NO：6所示。

以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4。实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶P_ly-2+SP_DacB)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)，以P_ly-2-F为上游引物，以P_ly-2-RC为下游引物，进行PCR扩增P_ly-2-C的基因片段。

通过重叠PCR的方法，以P_ly-2-C和信号肽Chitosanase的基因为模板，以P_ly-2-F为上游引物，分别以Chitosanase-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子P_ly-2和信号肽Chitosanase的重叠PCR产物，同时以P_ly-2-C和突变后的信号肽为模板，以P_ly-2-F为上游引物，以Chitosanase-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子P_ly-2和突变后的信号肽的重叠PCR产物。构建启动子分别和信号肽及其突变体的连接基因片段。启动子P_ly-2和Chitosanase的信号肽所用引物序列及酶切位点如下表7所示。表7中，红色下划线是酶切位点，小写字母为为同源片段，RT为突变体的下游引物。

表7引物列表

启动子P_ly-2分别和信号肽Chitosanase及其突变信号肽的重叠PCR体系及其重组菌株的构建方法同实施案例3.其重组菌株分别命名为C(含原信号肽)，CT(含有信号肽突变体)

实施例6：解淀粉来源的Sec途径Aminopeptidase YwaD(GenBank:CP021505.1)信号肽以及其突变体的制备

表8信号肽突变

以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218的基因组为模板，以YwaD-F为上游引物，以YwaD-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽YwaD，其氨基酸如SEQ ID NO：7所示，在信号肽YwaD的基础上，以YwaD-F为上游引物，以YwaD-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端的THA突变成AHA，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4。实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶P_ly-2+SP_DacB)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)，以P_ly-2-F为上游引物，以P_ly-2-RD为下游引物，进行PCR扩增P_ly-2-D的基因片段.

通过重叠PCR的方法，以P_ly-2-D和信号肽基因为模板、以P_ly-2-F为上游引物，分别以YwaD-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子P_ly-2和信号肽YwaD的重叠PCR产物，同时以P_ly-2-D和突变后的信号肽为模板，以P_ly-2-F为上游引物，以YwaD-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子P_ly-2和突变后的信号肽的重叠PCR产物。构建启动子分别和信号肽及其突变体的连接基因片段。

启动子P_ly-2和信号肽YwaD所用引物序列及酶切位点如下表9所示，表9中，红色下划线是酶切位点，小写字母为同源片段，RT为突变体的下游引物。

表9引物列表

启动子P_ly-2分别和信号肽YwaD及其突变信号肽的重叠PCR体系及其重组菌株的构建方法同实施案例3，其重组菌株分别命名为D(含原信号肽)，DT(含有信号肽突变体)。

实施例7：枯草芽胞杆菌来源的Sec途径Vpr信号肽以及其突变体的制备

利用枯草芽孢杆菌168(NCBI:txid224308)的基因组数据，通过在线分析软件SignalP 5.0 Server和TatP 1.0 Server预测获得解淀粉来源Sec途径的信号肽，分析其结构特点筛选出不是以AXA结尾的信号肽通过引物设计构建其自身的突变体。与启动子P_ly-2(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)通过重叠PCR的方法构建目的片段。

其中信号肽Vpr的Gene ID:937291，氨基酸序列来源于NCBI ReferenceSequence:：NC_000964.3(3907844..3910264)。

表10信号肽突变

以枯草芽孢杆菌168(NCBI:txid224308)，所述菌株来源于非专利文献BrockmeierU,Caspers M,Freudl R,et al.Systematic Screening of All Signal Peptides fromBacillus subtilis:A Powerful Strategy in Optimizing Heterologous ProteinSecretion in Gram-positive Bacteria[J].Journal of Molecular Biology,2006,362(3):0-402.中的Results。

基因组为模板，以V-F为上游引物，以V-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽vpr，其氨基酸如SEQ ID NO：9所示，在信号肽vpr的基础上，以V-F为上游引物，以V-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端后增加氨基酸序列APA，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQID NO：10所示。

以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4。实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶P_ly-2+SP_DacB)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)的质粒为模板(其含有启动子P_ly-2)，以P_ly-2-F为上游引物，以P_ly-2-RV为下游引物，进行PCR扩增P_ly-2-V的基因片段.

通过重叠PCR的方法，以P_ly-2-V和信号肽基因为模板、以P_ly-2-F为上游引物，以V-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子P_ly-2和信号肽Vpr的重叠PCR产物，同时以P_ly-2-V和突变后的信号肽为模板，以P_ly-2-F为上游引物，以V-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子P_ly-2和突变后的信号肽的重叠PCR产物。构建启动子分别和信号肽及其突变体的连接基因片段。

启动子P_ly-2和Vpr的信号肽所用引物序列及酶切位点如下表11，表11中红色下划线是酶切位点，小写字母为为同源片段，RT为突变体的下游引物。

表11引物列表

启动子P_ly-2和Vpr信号肽及其突变信号肽的重叠PCR体系及其重组菌株的构建方法同实施案例3，其重组菌株分别命名为V(含原信号肽)，VT(含有信号肽突变体)。

实施例8：重组碱性蛋白酶基因工程菌的表达及分析

将新鲜平板上的由实施例3-7制备的重组基因工程菌A、AT、B、BT、C、CT、D、DT、V、VT的单菌落分别接入50mL含有50μg/mL卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于含有50μg/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

按照国家标准GB/T 23527-2009附录B福林酚法，测定重组基因工程菌发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，经测定48h各重组菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力达到最高。测定重组碱性蛋白酶的酶活，与未突变组重组菌株酶活相比，本发明构建的信号肽突变体的重组菌株表达碱性蛋白酶的活性均比未突变组有所提高。这种针对Sec途径的信号肽的C端进行定点突变，能够有效的提高外源碱性蛋白酶的表达量，详见表12和附图5。

表12菌株的碱性蛋白酶表达量

重组菌株名称	碱性蛋白酶酶活(U/mL)
		A	3038
AT	3287
		B	4051
BT	7329
		C	1188
CT	1300
		D	1663
DT	2217
		V	2369
VT	4508

注：测定的酶活值误差在5％左右。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途

<130> 1

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌 CGMCC No.11218

<400> 1

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Ala Ser Ala

20 25 30

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218

<400> 3

Met Lys Arg Val Leu Leu Ile Leu Val Thr Gly Leu Phe Met Ser Leu

1 5 10 15

Cys Gly Ile Thr Ser Ser Val Ser Ala

20 25

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Arg Val Leu Leu Ile Leu Val Thr Gly Leu Phe Met Ser Leu

1 5 10 15

Cys Gly Ile Thr Ser Ser Ala Ser Ala

20 25

<210> 5

<211> 36

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218

<400> 5

Met Arg Ser Gly Leu Lys Lys Lys Ala Gly Phe Trp Lys Lys Thr Ala

1 5 10 15

Val Ser Ser Leu Ile Phe Thr Met Phe Phe Thr Leu Met Met Ser Gly

20 25 30

Thr Val Leu Ala

35

<210> 6

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Arg Ser Gly Leu Lys Lys Lys Ala Gly Phe Trp Lys Lys Thr Ala

1 5 10 15

Val Ser Ser Leu Ile Phe Thr Met Phe Phe Thr Leu Met Met Ser Gly

20 25 30

Thr Ala Leu Ala

35

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218

<400> 7

Met Lys Phe Ser Phe Ile Ser Ala Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Trp

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ala Gly Pro Leu Ser Glu Thr His Ala

20 25

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Lys Phe Ser Phe Ile Ser Ala Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Trp

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ala Gly Pro Leu Ser Glu Ala His Ala

20 25

<210> 9

<211> 28

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌168

<400> 9

Met Lys Lys Gly Ile Ile Arg Phe Leu Leu Val Ser Phe Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Ala Leu Ser Thr Gly Ile Thr Gly Val Gln Ala

20 25

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Lys Lys Gly Ile Ile Arg Phe Leu Leu Val Ser Phe Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Ala Leu Ser Thr Gly Ile Thr Gly Val Gln Ala Ala Pro Ala

20 25 30

<210> 11

<211> 1171

<212> DNA

<213> 克劳氏芽孢杆菌

<400> 11

atgaggaggg aaccgaatga agaaaccgtt ggggaaaatt gtcgcaagca ccgcactact 60

catttctgtt gcttttagtt catcgatcgc atcggctgct gaagaagcaa aagaaaaata 120

tttaattggc tttaatgagc aggaagctgt cagtgagttt gtagaacaag tagaggcaaa 180

tgacgaggtc gccattctct ctgaggaaga ggaagtcgaa attgaattgc ttcatgaatt 240

tgaaacgatt cctgttttat ccgttgagtt aagcccagaa gatgtggacg cgcttgaact 300

cgatccagcg atttcttata ttgaagagga tgcagaagta acgacaatgg cgcaatcagt 360

gccatgggga attagccgtg tgcaagcccc agctgcccat aaccgtggat tgacaggttc 420

tggtgtaaaa gttgctgtcc tcgatacagg tatttccact catccagact taaatattcg 480

tggtggcgct agctttgtac caggggaacc atccactcaa gatgggaatg ggcatggcac 540

acatgtggcc gggacgattg ctgctttaaa caattcgatt ggcgttcttg gcgtagcgcc 600

gagcgcggaa ctatacgctg ttaaagtatt aggggcgagc ggttcaggtt cggtcagctc 660

gattgcccaa ggattggaat gggcagggaa caatggcatg cacgttgcta atttgagttt 720

aggaagccct tcgccaagtg ccacacttga gcaagctgtt aatagcgcga cttctagagg 780

cgttcttgtt gtagcggcat ctgggaattc aggtgcaggc tcaatcagct atccggcccg 840

ttatgcgaac gcaatggcag tcggagctac tgaccaaaac aacaaccgcg ccagcttttc 900

acagtatggc gcagggcttg acattgtcgc accaggtgta aacgtgcaga gcacataccc 960

aggttcaacg tatgccagct taaacggtac atcgatggct actcctcatg ttgcaggtgc 1020

agcagccctt gttaaacaaa agaacccatc ttggtccaat gtacaaatcc gcaatcatct 1080

aaagaatacg gcaacgagct taggaagcac gaacttgtat ggaagcggac ttgtcaatgc 1140

agaagcggca acacgctaat caataataaa a 1171

<210> 12

<211> 596

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 12

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatcttatat tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

<210> 13

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaagcatca gcc 93

<210> 14

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgaaacgag tgttgctaat tcttgtcacc ggattgttta tgagtttgtg tgggatcact 60

tctagtgctt cggct 75

<210> 15

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgagaagcg gtttgaagaa aaaagcaggt ttttggaaga agacggcggt ttcatcactt 60

attttcacca tgttttttac cctgatgatg agcggaacgg ctttggcg 108

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgaaatttt catttatatc agctgcggtg gcagcaagtg ttatatgggg cgcgtctgcc 60

ggaccgctgt ccgaagccca tgct 84

<210> 17

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttgaaaaagg ggatcattcg ctttctgctt gtaagtttcg tcttattttt tgcgttatcc 60

acaggcatta cgggcgttca ggcagctccg gct 93

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccaagcttat gaagaaaccg ttggggaaaa ttg 33

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggcatgctta gcgtgttgcc gcttctgc 28

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccggaattcc attatgtttg aatttccgtt taaagaatgg g 41

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgctttcgtt tttgaatcat tcttgacact cctta 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

taaggagtgt caagaatgat tcaaaaacga aagcg 35

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgcggatccg gctgatgttt ttgtaatcgg caa 33

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgcggatccg gctgatgctt ttgtaatcgg caa 33

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccggaattcc attatgtttg aatttccgtt taaagaatgg g 41

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

attagcaaca ctcgtttcat tcttgacact ccttatttga 40

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tcaaataagg agtgtcaaga atgaaacgag tg 32

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgcggatcca gccgaaacac tagaagtgat cc 32

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cgcggatcca gccgaagcac tagaagtgat cc 32

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ccggaattcc attatgtttg aatttccgtt taaagaatgg g 41

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cttcaaaccg cttctcattc ttgacactcc ttatttga 38

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tcaaataagg agtgtcaaga atgagaagcg gtttgaag 38

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cgcggatccc gccaaaaccg ttccgctcat 30

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgcggatccc gccaaagccg ttccgc 26

<210> 35

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ccggaattcc attatgtttg aatttccgtt taaagaatgg g 41

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ataaatgaaa atttcattct tgacactcct tatttga 37

<210> 37

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tcaaataagg agtgtcaaga atgaaatttt catttat 37

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgcggatcca gcatgggttt cggacagc 28

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cgcggatcca gcatgggctt cggacag 27

<210> 40

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ccggaattcc attatgtttg aatttccgtt taaagaatgg g 41

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcgaatgatc ccctttttca atcttgacac tcctt 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aaggagtgtc aagattgaaa aaggggatca ttcgc 35

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

cgcggatcct gcctgaacgc ccgtaatgcc 30

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgcggatcca gccggagctg cctgaacg 28

Claims

1.一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体，其特征在于：所述信号肽突变体是将来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽的C端最后三位氨基酸序列突变为AXA或者在信号肽C端后增加氨基酸序列AXA，所述X为任意氨基酸。

2.如权利要求1所述一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体，其特征在于：所述信号肽突变体是在如SEQ ID No.1所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码最后三位氨基酸突变为ASA；

或所述信号肽突变体是在如序列SEQ ID NO：3所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码最后三位氨基酸突变为ASA；

或所述信号肽突变体是在如序列SEQ ID NO：5所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码最后三位氨基酸突变为ALA；

或所述信号肽突变体是在如序列SEQ ID NO：7所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C端编码最后三位氨基酸突变为AHA；

或所述信号肽突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：9所示的原始氨基酸序列的基础上，在其C端后增加氨基酸序列APA。

3.编码权利要求1-2任一所述信号肽突变体的基因。

4.如权利要求3编码所述一种信号肽突变体的基因，其特征在于：

原始氨基酸序列如SEQ ID No.1的信号肽的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示；

原始氨基酸序列如SEQ ID No.3的信号肽的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示；

原始氨基酸序列如SEQ ID No.5的信号肽的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：15所示；

原始氨基酸序列如SEQ ID No.7的信号肽的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示；

原始氨基酸序列如SEQ ID No.9的信号肽的突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：17所示。

5.如权利要求1所述一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体，其特征在于：所述碱性蛋白酶的编码基因为碱性蛋白酶基因aprE。

6.权利要求1-2任一所述信号肽突变体在提高外源碱性蛋白酶表达中的用途。

7.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求1-2任一所述信号肽突变体的编码基因。

8.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求1-2任一所述信号肽突变体的编码基因或权利要求7所述重组载体。

9.权利要求1-2任一所述信号肽突变体的构建方法，其特征在于：构建包含所述信号肽突变体的编码基因和碱性蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

10.一种碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：步骤如下：

将含有所述权利要求1的信号肽突变体的基因工程菌经活化后以1.5-2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于34-40℃、215-225r/min发酵培养15-49h；