CN105132396B

CN105132396B - 一种角蛋白酶及其编码基因和应用

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Publication number: CN105132396B
Application number: CN201510575220.1A
Authority: CN
Inventors: 黄艳; 邓宇; 马诗淳; 陈璐; 周正; 尹小波
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105132396A

Abstract

本发明提供了一种角蛋白酶，该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或在SEQ ID NO.1的基础上进行缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。本发明还提供了编码所述角蛋白酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或在SEQ ID NO.2的基础上进行缺失、突变、重组而获得的能表达所述角蛋白酶的核苷酸序列。本发明还提供了制备所述角蛋白酶的方法。本发明提供的角蛋白酶不仅具有非常有效的降解角蛋白底物的能力，其比活力高达92.55 KU/mg，且能在pH为4.0‑11.0以及温度为45‑95℃时保持良好的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市场应用前景。

Description

一种角蛋白酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术和酶工程技术领域，具体涉及一种角蛋白酶及其编码基因和应用。

背景技术

角蛋白是一种广泛存在于动物毛发、鳞片、羽毛、角等结构中的硬性纤维状蛋白，主要分为α角蛋白和β角蛋白。角蛋白分子中富含半胱氨酸，形成了大量的二硫键，加上分子中的氢键、疏水相互作用等分子作用，使角蛋白分子结构十分稳定，难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等普通蛋白酶降解(Thys et al., 2004;Riffel et al., 2007;Mazotto et al., 2011)。截止2011年，全世界每年将产生四五百万吨羽毛废弃物，仅我国就将产生近百万吨(Korniłłowicz-Kowalska & Bohacz, 2011)。而自然消耗是个漫长的过程，靠传统的物理化学方法处理羽毛，既破坏环境，又无法利用羽毛角蛋白中大量的营养价值。因此迫切的需要一种环境友好又可回收利用角蛋白价值的转化手段。

角蛋白酶是一种可以有效降解角蛋白的蛋白水解酶，广泛存在于真菌、细菌、古菌中(Brandelli et al., 2010;Korniłłowicz-Kowalska & Bohacz, 2011)。

然而，现有技术所得角蛋白酶对角蛋白的水解效果并不十分理想，同时，在利用微生物水解角蛋白底物时，通常是联合包括某一角蛋白酶在内的多种因素才能获得水解角蛋白的效果。因此，对具有高效角蛋白水解能力的角蛋白酶的氨基酸序列及其编码基因序列的研究是本领域所亟待解决的，这不仅可以获得更优质的角蛋白酶，更为重要的是这更加利于角蛋白酶的工业化生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供能高效降解角蛋白底物的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该角蛋白酶在广泛pH条件下可保持良好的蛋白酶活性且热稳定性优秀。

如本发明的实施例所示，本发明角蛋白酶的比活力为92.55 KU/mg，在pH为4.0-11.0时能保持很好的角蛋白酶活性，在温度为45-95℃时，仍具有较高的活性。

本发明的第二个目的在于提供上述角蛋白酶的编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的在于提供制备所述角蛋白酶的方法，该方法包括步骤：

1）利用PCR获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

2）将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列克隆到原核表达载体上；

3）将步骤2）所得物转化入基因工程菌上；

4）将步骤3）所得物进行诱导培养，即得所述角蛋白酶粗液。

优选的，步骤2）所述原核表达载体为pET28a。

优选的，步骤3）所述基因工程菌为大肠杆菌 Rosseta（DE3）表达菌株。

优选的，步骤4）所述诱导培养为：在含Kan 抗生素的LB液体培养基中，37℃，225rpm，震荡培养至OD600 0.6~0.8，加入0.5 mmol/L IPTG， 37℃，225rpm，培养6小时。取1 ml菌液12000 rmp离心2 min收集菌体，加入5 ml Lysis Buffer缓冲液充分混匀，超声波破碎细菌，4℃ 12000g离心30 min，取上清。

本发明的目的还在于提供所述角蛋白酶在处理含角蛋白物质的处理上的应用，所述含角蛋白物质包括羽毛。

本发明的有益效果：本发明提供的角蛋白酶不仅具有非常有效的降解角蛋白底物的能力，其比活力高达59.5 KU/mg，且能在pH为4.0-11.0以及温度为45-95℃时保持良好的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明所得角蛋白酶的pH稳定性实验结果，其中，“1854”代表实施例2所得角蛋白酶；

图2为本发明所得角蛋白酶的适应温度范围实验结果；

图3为本发明所得角蛋白酶对羽毛的降解效果图，其中，“1854”代表实施例2所得角蛋白酶，“Con”代表对照组。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

2.1、载体、菌株及培养基

菌株：E.coli DH5α、E.coli Rosseta（DE3）

载体：pET28a

培养基： 1）LB 培养基液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。

固体培养基：液体 LB 培养基中加入 1.5%琼脂粉。

2.2、实验方法（重组质粒构建）

引物合成

本实验所用引物由上海英俊合成。引物序列见表1。

PCR反应/酶切/连接

以DNA为模板，合成需要克隆的基因上游及下游引物1854-F和1854-R，进行PCR反应，反应体系为30 μl（表 2）。将PCR产物经1.5%琼脂糖电泳后，切下目的片断的胶块，按胶回收试剂盒步骤进行纯化，回收DNA片断。将上述目的DNA与pMD19T Vector进行TA克隆连接反应（表3）。目的基因DNA与载体的摩尔比优化至2:1-10:1即可,推荐3:1，DNA浓度通过核酸定量仪测定。各反应物混匀后16℃连接过夜。

2.3 连接产物转化

从-80℃中取出E.coli DH5α感受态细胞（每管100 μl）置于冰上融化，将连接产物全量加入感受态中，再冰浴30min，42℃热激90 s，再冰浴2 min，加入890μl SOC培养基，37℃，180 r/min振荡培养60 min; 取适量转化好的感受态细胞涂布于含Amp和IPTG的LB平板，37℃培养14-18h。挑选阳性克隆提取质粒并对阳性克隆质粒进行PCR和双酶切鉴定重组克隆子。

2.4阳性克隆筛选与鉴定

随机挑取阳性单菌落，分别接种于5 ml含有卡那霉素 (100 mg/m1)的LB培养液中，37℃摇床过夜培养。离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒提取质粒。经双酶切和PCR鉴定所得质粒是否携带插入片段将筛选出的重组质粒送金唯智公司测序以验证其正确性。

2.5 序列分析

将测序结果去除载体序列后与GenBank中的序列进行Blast比对分析。判断扩增序列正确性，利用ORF finder工具进行酶基因完整ORF的预测。序列如SEQ ID NO.2所示。

2.6 表达质粒构建及表达宿主菌转化

将pET28a载体和上述阳性克隆子重组质粒进行EcoR I和Xhol I双酶切（表4），琼脂糖凝胶回收，再用T4DNA连接酶连接酶切后的载体和目的基因片段（表5）。目的基因DNA与载体的摩尔比优化至2:1-10:1即可,推荐3:1，DNA浓度通过核酸定量仪测定。各反应物混匀后16℃连接过夜。连接产物全量转化至100 μl E.coli Rosseta（DE3），并涂布于含Kan和Amp的LB平板，37℃培养（方法同2.3）。

37℃水浴4-5 h。

2.7 阳性克隆筛选及诱导表达

挑取单克隆接种至50 mL含Kan和Amp的液体LB培养基中，37℃ 180 rpm/min恒温摇床培养到OD600至0.5-0.6左右。添加0.5 mM IPTG，37℃ 180 rpm/min继续培养4-5h。培养结束后，取适量收集菌体，加入Lysis Buffer缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃12000g离心30 min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。

实施例2

1）准备实施例2所得的序列SEQ ID NO.2；

2）将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列克隆到pET28a载体上；

3）将步骤2）所得物转化入E.coli Rosseta（DE3）工程菌上；

4）将步骤3）所得物，在含Kan 抗生素的LB液体培养基中，37℃，225 rpm，震荡培养至OD₆₀₀ 0.6~0.8，加入0.5 mmol/L IPTG， 37℃，225 rpm，培养6小时。取1ml菌液12000 rmp离心2 min收集菌体，加入5 ml Lysis Buffer缓冲液充分混匀，超声波破碎细菌，4℃12000g离心30 min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。

实施例3

将实施例2所得角蛋白酶进行pH稳定性和适应温度范围检测，检测结果如图1和图2所示。

实施例4

将实施例2所得角蛋白酶用于羽毛粉的处理，处理后，羽毛降解效果图如图3所示。其中对照组的处理方式为：对照组以50mM,pH 8.5的Tris-HCl缓冲液代替酶液，与实验组在相同条件下孵育羽毛。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 农业部沼气科学研究所

<120> 一种角蛋白酶及其编码基因和应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 631

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Met Thr Ile Pro Val Met Ala Glu Ser Gln Leu Leu Ser Asn

1 5 10 15

Ser Asn Ala Asp Gln Tyr Val Pro Gly Glu Leu Ile Val Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Asp Asn Gly Tyr Ser Thr Gln Ser Ile Arg Asn Asn Ile Val Lys

35 40 45

His Thr Ser Ile Ile Asn Ser Lys Lys Gly Phe Asn Ile Lys Lys Ser

50 55 60

Leu Ile Asp Thr Asp Glu Asn Asn Ile Lys Thr Ser Asn Phe Asp Ser

65 70 75 80

Asn Phe Lys Ala Thr Val Ile Glu Asn Met Gly Tyr Val Tyr Leu Val

85 90 95

Gly Tyr Ser Ser Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Asp His Ala Ile Lys Ala

100 105 110

Leu Lys Gln Glu Leu Glu Ser Asn Gly Leu Lys Val Asn Ser Ile Glu

115 120 125

Pro Asn Tyr Ile Met His Ala Ile Gly Glu Val Ala Glu Asp Glu Glu

130 135 140

Ile Gln Ile Tyr Asp Val His Asn Asn Gln Lys Trp Gln Tyr Glu Met

145 150 155 160

Ile Lys Ala Pro Gln Ala Trp Asp Ile Thr Pro Gly Ser Met Asp Val

165 170 175

Lys Ile Ala Val Val Asp Thr Gly Ile Asp Tyr Asn His Gln Ser Leu

180 185 190

Arg Asn Tyr Val Asn Thr Ser Leu Gly Lys Asn Phe Thr Ser Ser Asn

195 200 205

Ser Ser Asp Phe Met Asp Arg Ala Gly His Gly Thr His Val Ala Gly

210 215 220

Thr Ile Ala Ser Tyr Gly Ile Val Ser Gly Val Met Lys Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Ile Pro Val Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly Ser Gly Ser Val Tyr

245 250 255

Gly Ile Ile Glu Gly Ile Leu His Ala Ala Asn Val Gly Ala Asp Val

260 265 270

Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Val Gln Ala Phe Asp Asn

275 280 285

Ala Cys Gln Thr Ala Met Ser Lys Gly Val Ile Ile Val Ala Ala Ser

290 295 300

Gly Asn Glu Tyr Ser Ser Arg Ile Ser Tyr Pro Ala Ala Tyr Asp Gly

305 310 315 320

Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Arg Asn Arg Ala Ser Phe

325 330 335

Ser Asn Tyr Gly Thr Gly Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Asn Val

340 345 350

Tyr Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Gln Tyr Met Ser Gly Thr Ser

355 360 365

Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Gly Leu Met Arg Ser Val

370 375 380

Asn Lys Asn Ile Ser Val Gln Glu Ala Ala Asp Ile Leu Arg Glu Thr

385 390 395 400

Ala Gln Tyr Ala Gly Asp Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ile Val Asp

405 410 415

Ala Tyr Glu Ala Val Lys Ala Ala Arg Gly Glu Asp Val Ile Glu Pro

420 425 430

Ile Phe Lys Asp Ile Ser Thr Gln Glu Ala Ala Glu Met Ile Ala Ala

435 440 445

Asn Lys Asn Asn Pro Gln Phe Val Ile Leu Asp Val Arg Thr Pro Glu

450 455 460

Glu Tyr Lys Glu Ala His Ile Glu Gly Ala Ile Asn Ile Asp Tyr Tyr

465 470 475 480

Gly Asp Asn Phe Arg Ser Glu Ile Glu Lys Leu Asp Arg Asp Lys Lys

485 490 495

Tyr Leu Val Tyr Cys Arg Thr Gln Gly Arg Ser Gly Tyr Thr Val Asp

500 505 510

Leu Met Lys Glu Leu Asn Phe Lys Glu Val Tyr Arg Met Leu Gly Gly

515 520 525

Met Asn Lys Trp Leu Glu Glu Gly Arg Pro Val Val Ser Leu Glu Pro

530 535 540

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Asp Leu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Thr Thr

545 550 555 560

Ile Thr Thr Asp Lys Thr Glu Tyr Leu Arg Gly Glu Thr Ala Lys Ile

565 570 575

Asn Ile Lys Val Thr Asp Arg Asp Gly Arg Pro Met Pro Tyr Ala Trp

580 585 590

Ile Asn Leu Tyr Ile Thr Arg Pro Asn Gly Thr Thr Phe Arg Asn Ile

595 600 605

Leu Leu Thr Asn Thr Ser Gly Ile Ala Val Tyr Asn Phe Asn Thr Thr

610 615 620

Ser Ser Met Glu Leu Gly Thr

625 630

<210> 2

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggctatga caattccagt catggcagaa agtcaattat tatcaaatag taatgcagat 60

caatatgttc caggagaatt gatagtttct attcaaaagg ataatggtta ttcaacccaa 120

agtattagaa ataacattgt taaacatact tcaataatta atagtaaaaa aggatttaat 180

attaaaaaat cccttattga tactgatgag aataatatca aaacaagtaa ttttgatagt 240

aattttaaag caactgtaat tgaaaatatg ggatatgttt atttggttgg ttattcatct 300

aatgaatata aaactataga tcatgcaatt aaggctttaa aacaagaact agaaagcaat 360

ggtttaaaag taaatagcat tgaaccaaat tatataatgc atgcaatagg agaagttgca 420

gaagatgaag aaattcaaat ttatgatgtt cataataatc agaaatggca atatgaaatg 480

attaaagcac cacaagcttg ggatattacc ccaggtagta tggatgtaaa aatagctgta 540

gtagatactg gaattgacta taatcatcaa agtttgagaa actatgttaa cacaagttta 600

gggaaaaact ttacaagttc taatagttca gattttatgg atagagctgg tcatggtact 660

cacgtagcag gaacaattgc tagttatggc atagtgtcag gagttatgaa acaaggtact 720

ttaataccag taaaagtatt aggcgataat ggcagtggat cagtttatgg gataattgaa 780

ggtatattac atgcagctaa tgtaggagct gatgtaatta atatgtcatt aggtggcgga 840

ggatatgtac aagcatttga taatgcatgt caaacagcaa tgtcaaaagg tgttattata 900

gtagcagcta gtggtaatga atattcttcc aggattagtt atccagcagc atatgatggt 960

gtaatagcag taggagctgt agattcaaat agaaataggg caagcttttc taattatggg 1020

acaggcttag atgtcatggc accaggagta aatgtatata gtacagttcc taataatggg 1080

tatcaatata tgtcaggtac ttcaatggca agtcctcatg tagctggagt agcaggattg 1140

atgcgatcag ttaataaaaa tatttctgta caagaagctg cagatatatt aagagagaca 1200

gcacaatatg caggtgatag ctattactat ggttacggga tagtagatgc ttatgaagca 1260

gttaaagcag ctagaggtga agatgtaata gaaccaatat ttaaggatat ttctactcaa 1320

gaagcagcag aaatgatagc agctaataaa aacaatccgc aatttgttat tttagatgta 1380

aggactccag aggaatataa agaagcccat attgaaggtg caataaatat tgattattat 1440

ggggataatt ttagaagtga gatagaaaaa ctagacagag ataaaaaata tttagtttat 1500

tgtaggactc aaggtcgtag cggatatact gtagatttaa tgaaagaatt gaattttaaa 1560

gaagtttata ggatgcttgg aggaatgaat aaatggttag aagaaggaag acctgtagta 1620

agtttagaac cagaaccaga accagagcca gatttaccta tctatgcaac aattacaact 1680

ataacaacag ataaaacaga atatttaaga ggagaaactg caaagataaa tataaaagta 1740

acagatagag atggcagacc aatgccatat gcatggataa atttatatat tacaagacct 1800

aatggaacta catttagaaa tatattattg acaaatactt caggtattgc tgtatataat 1860

tttaatacaa catcttcaat ggaactagga acttaa 1896

Claims

1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述角蛋白酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述角蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1)利用PCR获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

2)将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列克隆到原核表达载体上；

3)将步骤2)所得物转化入基因工程菌上；

4)将步骤3)所得物进行诱导培养，即得所述角蛋白酶粗液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述原核表达载体为pET28a。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述基因工程菌为Rosseta(DE3)表达菌株。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述诱导培养为：在含Kan抗生素的LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀0.6～0.8，加入0.5mmol/L IPTG，37℃，225rpm,培养6h；取1ml菌液12000rmp离心2min收集菌体，加入5ml Lysis Buffer缓冲液充分混匀，超声波破碎细菌，4℃12000g离心30min，取上清。

7.权利要求1所述角蛋白酶在处理含角蛋白物质的处理上的应用，所述含角蛋白物质包括羽毛。