CN111349575A

CN111349575A - 组成型表达猪胃蛋白酶原c的毕赤酵母工程菌及其应用

Info

Publication number: CN111349575A
Application number: CN201811562965.4A
Authority: CN
Inventors: 金渭武; 陈博; 郑晓卫; 杨鑫; 孙铁虎
Original assignee: Cofco Biotechnology Beijing Co ltd; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Biotechnology Beijing Co ltd; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN111349575B

Abstract

本发明公开了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌株。本发明将经人工改造的猪胃蛋白酶原C(PGC)基因连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA，并导入毕赤酵母菌株中，经筛选鉴定得到不需甲醇诱导即可高效组成型分泌表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌株。该工程菌株在培养基YPD中分泌表达猪胃蛋白酶原C，连续培养48h后酶活为180U﹒mL^‑1，实现了猪胃蛋白酶原C在毕赤酵母中的组成型高表达，后期再经过培养基及培养条件优化可实现猪胃蛋白酶原C的高效连续生产。本发明的猪胃蛋白酶原C可在pH 5.4以下的酸性条件下自动激活生成有活性的胃蛋白酶，可广泛应用于饲料、食品和医药等行业，具有良好的商业应用前景。

Description

组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，本发明涉及一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用。

背景技术

胃蛋白酶是蛋白酶中的一种，广泛应用于医药、食品、轻工以及生物技术等各个领域。目前其主要来源于动物(如牛、羊、猪等)的胃组织，但是动物源胃蛋白酶存在较多问题，例如易容受动物脏器资源的限制；胃蛋白酶产量小、价格高，且酶活性低、质量不稳定；容易产生有害化学物质残留，例如动物组织的有毒有害因子。因此，以上因素限制了胃蛋白酶的广泛使用。通过基因工程方法，构建重组胃蛋白酶高产工程菌，是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的有效方法，该方法通过大规模发酵生产，可大大降低成本，并且纯化得到的酶产物残留少，纯度高，具有环保、不受原料限制等优点。然而目前依然缺少高效表达有活性的胃蛋白酶的工程菌，商品化的重组胃蛋白酶还很少。

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，在酸性条件(例如pH5.4)下可自催化反应生成有活性的胃蛋白酶。目前针对其前体胃蛋白酶原构建基因工程菌是工业上获得胃蛋白酶的有效方法。目前对重组猪胃蛋白酶原的研究主要集中在猪胃蛋白酶原A上，而对猪胃蛋白酶原C的研究报道很少。因此有必要构建表达猪胃蛋白酶原C的重组菌株。综合比较可表达重组蛋白的不同宿主，由于毕赤酵母表达的蛋白易于纯化，产量高，目前研究使用较为广泛。毕赤酵母中表达异源蛋白通常采用甲醇诱导的方式，这样可以使菌株生长期及生产期分开，在前期实现菌体大量生长，在后期实现蛋白高效表达，但是诱导型菌株生产时也存在诸多不利，如甲醇易挥发、有毒、容易造成安全及环境问题；另外，当应用于食品、医药行业时，甲醇残留是要极力避免的。

因此，如何避免甲醇的使用并具有较高的猪胃蛋白酶原C产量，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌，实现了使用组成型表达载体来完成猪胃蛋白酶原C在毕赤酵母中的组成型表达，不需甲醇诱导，实现了猪胃蛋白酶原C更加安全有效的生产，并同时获得了较高的猪胃蛋白酶原C产量。

一方面，本发明提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主、pGAPZαA为载体表达猪胃蛋白酶原C(PGC)。

其中，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.:2所示。

其中，编码所述猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:1所示。

另一方面，本发明提供了构建上述组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：

(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；

(2)将步骤(1)获得的编码猪胃蛋白酶原C的所述多核苷酸序列连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA上，得到重组质粒pGAPZαA-PGC；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母菌株中，从而得到所述毕赤酵母工程菌。

再一方面，本发明提供了一种生产猪胃蛋白酶原C的方法，所述方法包括利用上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌来进行发酵，从而获得所述猪胃蛋白酶原C。

另一方面，本发明还提供由上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌生产的、或由上述方法生产的猪胃蛋白酶原C及其经活化后有活性的猪胃蛋白酶C。本发明的猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.:2所示。所述猪胃蛋白酶原C在pH 5.4以下的酸性条件下可活化得到有活性的猪胃蛋白酶C。所述猪胃蛋白酶C与动物源的猪胃蛋白酶(不同胃蛋白酶混合物)的活性一致且为单一胃蛋白酶C。

又一方面，本发明提供了上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌在食品、饲料或医药方面的应用。本发明还提供了本发明的猪胃蛋白酶原C及其经活化后得到的猪胃蛋白酶C在食品、饲料或医药方面的应用

本发明的有益效果：

本发明的组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌实现了猪胃蛋白酶原C在毕赤酵母中的高组成型表达，在基本培养基中连续培养48h，酶活可达180U﹒mL^-1，为猪胃蛋白酶的组成型生产奠定了基础，具有良好的工业应用前景。本发明的猪胃蛋白酶原C可在酸性条件下自催化反应生成有活性的胃蛋白酶C，可广泛应用于食品、饲料和医药等行业，具有良好的商业应用前景。

附图说明

图1是根据本发明的实施方式的pGAPZαA-PGC的质粒图谱。

图2为构建pGAPZαA-PGC质粒过程中的酶切结果；其中泳道1为pGAPZαA，泳道2为pGAPZαA-PGC，泳道3为pGAPZαA-PGC经EcoR I和Not I双酶切的产物。

图3是猪胃蛋白酶原C的SDS-PAGE分析结果；其中泳道1和2分别为Pichiapastoris GS115-pGAPZαA-PGC发酵48h和24h的上清液。

图4为人工合成的编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)。

图5为本发明的猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。

具体实施方式

本发明人通过将人工合成的毕赤酵母密码子偏好的编码猪胃蛋白酶原C(PGC)的多核苷酸序列连接至组成型载体pPGAPZαA中并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)中，获得了组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌，实现了不需甲醇诱导即可生产酶活高达180U·mL^-1的猪胃蛋白酶原C。

在一个实施方式中，本发明提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述菌株以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主、pGAPZαA为载体表达猪胃蛋白酶原C(PGC)。其中，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。基于酵母偏爱密码子对编码猪胃蛋白酶原C的核苷酸序列进行优化。在优选的实施方式中，所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:1所示。

其中，所述毕赤酵母选自巴斯德毕赤酵母，优选毕赤酵母GS115(Pichia pastorisGS115)。

在优选的实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115，由此得到的毕赤酵母工程菌称为Pichia pastoris GS115-pGAPZαA-PGC。

在一个实施方式中，本发明提供了构建本发明的组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：

(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母菌株中得到所述毕赤酵母工程菌。

其中，猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.:2所示。在优选的实施方式中，所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方式中，在步骤(2)中，可使用本领域技术人员已知的各种方法将所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列连接至pGAPZαA载体上，例如平末端连接法、粘性末端连接法。在优选的具体实施方式中，采用EcoR I和Not I内切酶进行酶切将所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列连接到pGAPZαA载体上。

在本发明中，所述pGAPZαA载体是可商购的，例如来自Invitrogen公司。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115菌株，得到的所述基因工程菌株为Pichia pastoris GS115-pGAPZαA-PGC。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，可使用本领域技术人员已知的各种酵母转化方法将所述重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母菌株中，例如化学转化法、电转化法。在优选的具体实施方式中，采用电转化法。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，进一步包括对转化后得到的毕赤酵母工程菌进行筛选和鉴定。所述筛选方法可为本领域技术人员熟知的各种筛选转化子的方法，例如通过抗生素抗性筛选，如Zeocin阳性筛选。所述鉴定方法可为本领域技术人员熟知的各种鉴定转化子的方法，例如检测基因组中含有的猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列，例如进行PCR分析；或者检测猪胃蛋白酶原C的表达，例如通过蛋白质印迹。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种生产猪胃蛋白酶原C的方法，所述方法包括利用本发明的毕赤酵母工程菌或由本发明的方法构建的毕赤酵母工程菌进行发酵，从而获得所述猪胃蛋白酶原C。

应当指出的是，发酵条件只要适用于毕赤酵母(例如毕赤酵母GS115)的发酵条件即可，本领域技术人员可根据实际需要对培养条件和培养基进行修改或优化，这些修改和/或优化也在本发明的范围内。

在优选的实施方式中，将本发明的毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中，在合适的发酵条件下进行发酵，例如培养温度为28℃-30℃，优选30℃；转速为150-250rpm，优选220rpm；发酵培养基为适于培养毕赤酵母的任何本领域已知的培养基或培养液，如YPD基本培养基；培养时间为连续24-72小时，优选48小时。在进一步优选的实施方式中，在接种之前先对本发明的毕赤酵母工程菌进行活化。

本发明的猪胃蛋白酶原C可在酸性条件下(例如pH 5.4)自催化反应生成有活性的猪胃蛋白酶C。所述猪胃蛋白酶C与动物源的猪胃蛋白酶(混合蛋白酶)的活性一致，但为单一蛋白酶，可作为商品化重组胃蛋白酶广泛应用于食品、饲料和医药等行业。

在一个实施方式中，本发明提供本发明所述的毕赤酵母工程菌或本发明的方法构建的毕赤酵母工程菌以及本发明的猪胃蛋白酶原C及其经活化后得到的猪胃蛋白酶C在食品、饲料或医药方面的应用。

实施例

下面，将参照附图详细地说明本发明的实施方式，但本发明的保护范围并不仅限于此。下述实施例中所述实验方法和设备，如无特殊说明，均为常规方法和常规实验设备。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，均可从商业途径得到。

实施例中所用的试剂：

YPD液体培养基：胰蛋白胨20g·L^-1、酵母粉10g·L^-1、葡萄糖20g·L^-1。

YPDS平板：胰蛋白胨20g·L^-1、酵母粉10g·L^-1、葡萄糖20g·L^-1、琼脂1.8g·L^-1，200ug·mL^-1Zeocin。

0.05mol/L乳酸缓冲溶液：按A液:B液:蒸馏水以8:1:9的体积比混匀制成，A液：称取80％-90％乳酸10.6g，以水定容至1000mL；B液:称取70％乳酸钠16g，蒸馏水溶解定容至1000mL。

实施例1重组菌的构建及鉴定

基于酵母偏爱密码子，对猪胃蛋白酶原C基因(NCBI，XM_003128394)进行优化，得到SEQ ID NO.1的多核苷酸序列。由生工生物生物工程有限公司人工合成由SEQ ID NO.1所示多核苷酸序列。根据Invitrogen公司提供的说明书，将该核苷酸序列克隆至表达载体pGAPZαA(Invitrogen公司)上的EcoR I和Not I酶切位点之间，获得重组质粒pGAPZαA-PGC(质粒图谱见图1)。使用EcoR I和Not I酶对重组质粒进行酶切后在含EB的1wt％琼脂凝胶上进行电泳，结果显示插入的基因序列大小正确(图2)。

然后使用电转化法将重组载体pGAPZαA-PGC导入Pichia pastoris GS115菌株(Invitrogen公司)中。具体步骤如下：

1)制备酵母感受态细胞：挑取毕赤酵母GS115的单菌落接种于25mL YPD液体培养基中，在30℃，220rpm摇床震荡培养过夜；以5v/v％接种量转接50mL YPD液体培养基中，在30℃，220rpm摇床震荡培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5；将发酵液于4℃、5000rpm离心5min，弃上清；用50mL冰预冷无菌水将菌体重悬，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；用25mL冰预冷无菌水将菌体重悬，4℃离心5000rpm，5min，弃上清；再用5mL 1mol·L^-1的冰预冷的山梨醇洗涤菌体1次，重悬，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；加入0.4mL体积1mol·L^-1的冰预冷的山梨醇，重悬；以每管80μL分装至无菌EP管中，以备转化用；

2)转化：用Avr II酶(NEB公司)线性化重组表达载体pGAPZαA-PGC(用购自TIANGEN的质粒小提试剂盒提取)，向上述80μL酵母感受态细胞中加入经Avr II酶线性化的质粒5μg冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中(冰预冷)，1500V电击，迅速加入1mL冰预冷的山梨醇，涂在含有200ug·mL^-1Zeocin(Invitrogen公司)的YPDS平板上，30℃条件下培养3-4天后挑取阳性单克隆。

将挑取的单克隆在5mL YPD液体培养基中，于30℃，220rpm摇床振荡培养过夜，通过酵母基因组小提试剂盒(TIANGEN公司)抽提阳性单克隆菌体的基因组，按照说明书以该基因组为模板进行PCR分析(引物1，α-Factor:5'TACTATTGCCAGCATTGCTGC 3'(SEQ ID NO.:3)；引物2，3'AOX：5'GGCAAATGGCATTCTGACAT 3'(SEQ ID NO.:4)；PCR程序：95℃5min；95℃30s，58℃40s，72℃1min；30个循环；72℃7min)，将PCR产物在含EB的1wt％琼脂凝胶上电泳，回收目的条带(约1.5k bp)后送至生工生物工程有限公司进行序列测序，筛选鉴定获得了含有猪胃蛋白酶原C基因的重组菌株Pichia pastoris GS115-pGAPZαA-PGC。

实施例2使用实施例1的毕赤酵母工程菌生产猪胃蛋白酶原C

使用实施例1构建的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS115-pGAPZαA-PGC来发酵生产猪胃蛋白酶原C，并对其酶活进行测定。

将本发明的毕赤酵母工程菌在YPD平板中划线，30℃下静置培养48小时，挑取单克隆接种到含5mL YPD液体培养基的试管中于30℃、220rpm条件下培养6小时，全部转接到50mL的YPD液体培养基中，于30℃、220rpm条件下连续培养24小时和48小时，分别取24h和48h的发酵液于8000rpm离心5min，取上清液(胞外PGC即包含于其中)进行SDS-PAGE分析。选用金斯瑞生物科技有限公司SDS-PAGE预制胶电泳，具体操作方法遵循产品说明书进行。将24h和48h的样品与6×上样缓冲液以体积比5:1混合，沸水浴10min，冷却后上样。80V恒压电压进行电泳，待指示剂进入分离胶后，电压调至120V，待指示剂至胶底时结束电泳。用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，脱色后拍照。

结果如图3所示，不加甲醇连续培养24小时可在约40kD处有一蛋白条带，与理论推测的猪胃蛋白酶原C的分子量大小接近，并且无其它杂带，说明杂质较少，不需要进一步纯化；在不加甲醇连续培养48小时时，蛋白含量增多，该结果表明本发明的毕赤酵母基因工程菌株实现了对猪胃蛋白酶原C的组成型高水平表达。

同时，对发酵液上清中的胞外PGC的酶活进行测定。单位酶活定义：在一定温度(40℃±0.2℃)和相应的pH条件下(pH3.0)，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量，为1个酶活单位，以U表示。采用分光光度法进行测定，具体步骤如下：

取发酵液于8000rpm离心5min，取发酵液的上清液稀释50倍做酶活检测，具体检测如下：

取1％酪蛋白溶液(用0.05mol/L乳酸-乳酸钠缓冲溶液配制，pH3.0)5mL，放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

再取4支带塞试管，各加入1mL 50倍稀释发酵上清液。取一支作为空白管，加2mL三氯乙酸，其它3管作为测试管各加入1mL预热的酪蛋白溶液，摇匀，40℃保温10min；

取出试管，3支测试管中各加入2mL三氯乙酸，空白管中加1mL预热的1％酪蛋白溶液；

静置10min，过滤沉淀，各取1mL滤液，分别加0.4mol/L的Na₂CO₃5mL、福林试剂1ml。在40℃显色20min。使用分光光度计于680nm处测OD值，以空白管调零点。

粗酶液酶活性计算：蛋白酶的活力＝A×K×4/10×n U/g(mL)

A：样品平行试验的平均OD值；K：吸光常数；

4：反应试剂的总体积；10：酶解反应时间；n：酶液稀释总倍数

结果显示，本发明的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS115-pGAPZαA-PGC，在摇瓶中不加甲醇连续培养48小时，得到的猪胃蛋白酶原C的酶活为200U·mL^-1，该产量为在基本培养基YPD中的初始产量，在经过培养基优化及培养条件优化后，极有潜力实现猪胃蛋白酶原C高效连续工业化生产，具有良好的工业应用前景。

实施例3实施例2生产的猪胃蛋白酶原C的活化

在不同的pH条件(见表1)下检测实施例2生产的胃蛋白酶原C的酶活，测定见下表2。除了使用如下的缓冲液稀释发酵上清液(50倍)和替代0.05mol/L乳酸-乳酸钠缓冲溶液配制1％酪蛋白溶液以外，以与实施例2中的酶活测定方法相同的方法进行。以不同配比的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液来实现不同的pH条件，具体配比如表1所示。

表1不同的pH(20mL缓冲液体系)

如表2所示，在pH5.4以下的pH条件下，可检测到酶活，说明本发明的毕赤酵母工程菌生产的猪胃蛋白酶原C可在pH5.4以下的酸性条件下自催化反应生成有活性的胃蛋白酶C。

表2不同pH条件下实施例2生产的胃蛋白酶原C的酶活测定结果

pH	酶活(U/mL)
		pH3.0	151.4
pH3.4	66.5
		pH4.0	41.5
pH4.4	7.2
		pH5.0	5.1
pH5.4	2.2
		pH6.0	0.0

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中粮生物科技（北京）有限公司

中粮营养健康研究院有限公司

<120> 组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcaagt ggatggtggt ggccttggtc tgcctccaac tcttggaggc ttctgttatc 60

aaggttccat tgaagaagtt gaagtctatc agacaagcta tgaaggaaaa gggtttgttg 120

gaagagttct tgaagaccca caagtacgac ccagctcaaa gatacagatt cggtgacttc 180

tctgttgctt tggaaccaat ggcttacttg gaagctgctt acttcggtga aatctctatc 240

ggtaccccac cacaaaactt cttggttttg ttcgacaccg gttcttctaa cttgtgggtt 300

ccatctgttt actgtaagtc tttggcttgt accacccacg ctagattcaa cccatctaag 360

tcttctacct actctaccga cagacaaacc ttctctttgc aatacggttc tggttctttg 420

accggtttct tcggttacga caccttgaag atccaatcta tccaagttcc agaccaagag 480

ttcggtttgt ctgaaaccga accaggtacc tctttcttgt acgctcaatt cgacggtatc 540

atgggtttgg cttacccaga cttgtctgct ggtggtgcta ccaccgctat gcaaggtttg 600

ttgcaagaag acgctttgac ctctccagtt ttctctttct acttgtctaa ccaacaatct 660

tctcaagacg gtggtgaatt ggttttgggt ggtgttgact cttctttgta caccggtcaa 720

atctactggg ctccagttac ccaagaattg tactggcaaa tcggtatcga agagttcttg 780

atcggtgacg aagcttctgg ttggtgttct gaaggttgtc aagctatcgt tgacaccggt 840

acctctttgt tgaccgttcc acaagactac ttgtctgact tggttcaagc taccggtgct 900

gaagaaaacg aatacggtga gttcttggtt gactgtaagg acatccaatc tttgccaacc 960

ttcaccttca tcatcaacgg tgttgagttc ccattgccac catctgctta catcttggaa 1020

gaagacggtt tctgtatggt tggtgttgaa ccaacctacg tttcttctca aaacggtcaa 1080

ccattgtgga tcttgggtga cgttttcttg cggtcttact actctgtttt cgacttgggt 1140

aacaacagag ttggtttcgc taccgctgct taagcggccg c 1181

<210> 2

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Phe Lys Trp Met Val Val Ala Leu Val Cys Leu Gln Leu Leu Glu

1 5 10 15

Ala Ser Val Ile Lys Val Pro Leu Lys Lys Leu Lys Ser Ile Arg Gln

20 25 30

Ala Met Lys Glu Lys Gly Leu Leu Glu Glu Phe Leu Lys Thr His Lys

35 40 45

Tyr Asp Pro Ala Gln Arg Tyr Arg Phe Gly Asp Phe Ser Val Ala Leu

50 55 60

Glu Pro Met Ala Tyr Leu Glu Ala Ala Tyr Phe Gly Glu Ile Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Pro Pro Gln Asn Phe Leu Val Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser

85 90 95

Asn Leu Trp Val Pro Ser Val Tyr Cys Lys Ser Leu Ala Cys Thr Thr

100 105 110

His Ala Arg Phe Asn Pro Ser Lys Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asp Arg

115 120 125

Gln Thr Phe Ser Leu Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe Phe

130 135 140

Gly Tyr Asp Thr Leu Lys Ile Gln Ser Ile Gln Val Pro Asp Gln Glu

145 150 155 160

Phe Gly Leu Ser Glu Thr Glu Pro Gly Thr Ser Phe Leu Tyr Ala Gln

165 170 175

Phe Asp Gly Ile Met Gly Leu Ala Tyr Pro Asp Leu Ser Ala Gly Gly

180 185 190

Ala Thr Thr Ala Met Gln Gly Leu Leu Gln Glu Asp Ala Leu Thr Ser

195 200 205

Pro Val Phe Ser Phe Tyr Leu Ser Asn Gln Gln Ser Ser Gln Asp Gly

210 215 220

Gly Glu Leu Val Leu Gly Gly Val Asp Ser Ser Leu Tyr Thr Gly Gln

225 230 235 240

Ile Tyr Trp Ala Pro Val Thr Gln Glu Leu Tyr Trp Gln Ile Gly Ile

245 250 255

Glu Glu Phe Leu Ile Gly Asp Glu Ala Ser Gly Trp Cys Ser Glu Gly

260 265 270

Cys Gln Ala Ile Val Asp Thr Gly Thr Ser Leu Leu Thr Val Pro Gln

275 280 285

Asp Tyr Leu Ser Asp Leu Val Gln Ala Thr Gly Ala Glu Glu Asn Glu

290 295 300

Tyr Gly Glu Phe Leu Val Asp Cys Lys Asp Ile Gln Ser Leu Pro Thr

305 310 315 320

Phe Thr Phe Ile Ile Asn Gly Val Glu Phe Pro Leu Pro Pro Ser Ala

325 330 335

Tyr Ile Leu Glu Glu Asp Gly Phe Cys Met Val Gly Val Glu Pro Thr

340 345 350

Tyr Val Ser Ser Gln Asn Gly Gln Pro Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val

355 360 365

Phe Leu Arg Ser Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Leu Gly Asn Asn Arg Val

370 375 380

Gly Phe Ala Thr Ala Ala

385 390

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tactattgcc agcattgctg c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaaatggc attctgacat 20

Claims

1.一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主、以pGAPZαA为载体表达所述猪胃蛋白酶原C。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，编码所述猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:1所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

5.构建权利要求1-4中任一项所述的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：

(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；

(2)将步骤(1)中获得的所述多核苷酸序列连接到表达载体pGAPZαA上，得到重组质粒pGAPZαA-PGC；以及

(3)将步骤(2)中获得的所述重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母中，得到所述毕赤酵母工程菌。

6.根据权利要求5所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQ ID NO.:2所示；优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO.:1所示。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

8.一种生产猪胃蛋白酶原C的方法，所述方法包括：对权利要求1-4中任一项所述的毕赤酵母工程菌，或由权利要求5-7中任一项所述的方法构建的毕赤酵母工程菌进行发酵，从而获得所述猪胃蛋白酶原C。

9.由如权利要求1-4中任一项所述的毕赤酵母工程菌生产的、或由如权利要求5-7中任一项所述的方法构建的毕赤酵母工程菌生产的、或由如权利要求8中所述的方法生产的猪胃蛋白酶原C，及其经活化得到的猪胃蛋白酶C。

10.如权利要求1-4中任一项所述的毕赤酵母工程菌或由如权利要求5-7中任一项所述的方法构建的毕赤酵母工程菌，由如权利要求8所述的方法生产的猪胃蛋白酶原C及其经活化得到的猪胃蛋白酶C，和/或如权利要求9所述的猪胃蛋白酶原C及其经活化得到的猪胃蛋白酶C在食品、饲料或医药方面的应用。