CN101935617A - 一种耐热植酸酶毕赤酵母工程菌及其耐热植酸酶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种产耐热重组植酸酶的毕赤酵母工程菌GS115/appA NR的构建及利用该菌株生产耐热植酸酶的方法。本发明采用两步PCR法合成耐热植酸酶基因并构建重组质粒电击转入比赤酵母菌株GS115，表达步骤为：1)将两步PCR合成的耐热植酸酶基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体中，获得毕赤酵母重组表达质粒；2)将此重组表达质粒电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115，经MD平板和含植酸钙的底物平板筛选再从中筛选出出现最大水解圈的菌株；3)挑取阳性克隆利用0.5％甲醇诱导表达。通过测定，毕赤酵母工程菌GS115/appA NR表达的重组耐热植酸酶热稳定性较E.coli K12野生型植酸酶有很大的提高，具体表现为在95℃水浴10min，仍能保持92％的酶活。用该酵母基因工程菌发酵生产的重组植酸酶，其发酵粗酶酶活性可达978U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一株产耐热植酸酶毕赤酵母工程菌的构建及利用该菌株生产耐热植酸酶的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
植酸酶由于可通过水解植酸及植酸盐而在饲料、食品、医药中具有广阔的应用前景。在动物饲料方面，添加到饲料中的植酸酶通过水解植酸及植酸盐可缓解植酸及植酸盐在饲料中的抗营养作用，同时，动物体内由于植酸及植酸盐被植酸酶水解而可降低动物粪便中磷的排放量，减轻了磷对环境造成的污染。在食品工业方面，虽然到目前为止在市场上还没有出现与食品相关的植酸酶产品，但植酸酶在食品工业方面仍然存在着很大的应用潜力，如亚洲人主要以稻米、小麦为主食，而稻米、小麦中70％左右的磷都是以植酸的形式存在，由于植酸的抗营养作用，就会降低人体对各种营养物质的吸收利用，如果向稻米、小麦中添加植酸酶就能很好解决这个问题。同样，植酸酶也可应用于医药行业。
但是，在工业生产中要使植酸酶实现高效应用价值，就要求其具有良好的酶学性质。例如，在饲料行业中，饲料生产加工过程中存在高温制粒环节，这就要求植酸酶必须具备良好的热稳定性。另一方面，植酸酶的作用部位是动物胃肠道，而动物胃肠道的温度一般是37℃，所以商品化的植酸酶又必须在37℃时具有良好的活性。
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前广泛使用的外源基因表达系统之一，该系统已经成功表达了数百种外源蛋白，其在表达外源蛋白的过程中，因其表达量高、内源蛋白分泌量少、分离纯化简便、适宜工业化生产等优点倍受研究者的亲睐。随着其菌株和载体的改良以及表达策略的不断优化，此系统已经日渐成为实验室基础科学研究及商业化生产重组蛋白的宠儿。
目前，生产中耐热植酸酶大多数是在细菌中表达，很少有耐热植酸酶在酵母中表达，工业生产中更未见在酵母中表达且在90℃处理后仍保留50％及以上酶活的耐热植酸酶。
发明内容
本发明的目的是通过基因合成的方法得到衍生于E.coli K12经酵母密码子优化的耐热植酸酶基因，该耐热植酸酶基因在毕赤酵母中表达后热稳定性明显提高，通过基因工程的手段构建能高效表达的耐热植酸酶毕赤酵母工程菌，并从中培养分离纯化制取耐热的重组植酸酶，
本发明是这样实现的，以已知序列的耐热植酸酶出发，设计36条引物通过基因合成得到该耐热植酸酶基因，通过在酵母细胞表达，生产出热稳定性高的植酸酶。
具体做法是，设计36条引物(appA)F1-(appA)R36，通过两步法扩增得到耐酸植酸酶基因。首先，将大小为1299bp的耐热植酸酶基因分为641bp和658bp的两个小片段通过PCR来扩增，首尾引物浓度为10μmol/L，中间引物浓度为1μmol/L，℃920sec；℃6sec；℃6sec(25cycle)；℃6min，扩增出641bp和658bp的DNA片段，然后将得到的2份DNA片段等量混匀，加引物(appA)F1和(appA)R36进行第二步扩增，引物浓度10μmol/L，℃9sec；℃sec；℃6min 30sec(25个循环)；℃6min，扩增产物为1299bp的DNA片段。将上述的基因插入到毕赤酵母整合表达载体pHBM905A中，然后将得到的含耐热植酸酶基因的表达载体导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一株高效表达耐热植酸酶的酵母基因工程菌菌株，命名为GS115/appANR。该巴斯德毕赤酵母基因工程菌菌株GS115/appA NR(Pichia pastoris GS115/appA NR)已于2010年7月6日交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCCNO：M2010168。
GS115/appANR菌株的菌学特性：
a、形态特性：毕赤酵母菌的无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖产生子囊内含有1-4枚光滑圆形、礼帽形或土星子囊孢子。
b、生理生化特性：毕赤酵母菌能利用特殊的物质为原料生长，如石油、甲醇、氨态氮、有机酸等。GS115/appANR菌株具有毕赤酵母菌的生理生化特性，同时因插入了耐热植酸酶基因，具有高效表达耐热植酸酶的特性。
将工程菌GS115/appA NR在以甘油为碳源的培养基中，20-30℃培养至细胞密度OD600达到20时，加入甲醇，继续诱导培养24-216小时，每隔24小时测酶活，酶活性达978U/mL时停止诱导培养，将完成培养的酵母基因工程菌经离心除去菌体，收集上清液，经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得重组植酸酶产品。
表达的重组酶热稳定性显著提高，将表达的重组酶在9℃，水浴10min，在3℃， pH5.5测定酶活，经上述处理后表达的重组酶仍保持92％的活性，与E.coli K12野生型植酸酶相比其热稳定性提高了80％左右。摇瓶发酵表明该酶在酵母的表达量高达978U/mL。该酶分子量在90kDa左右，在40-60℃之间维持60％以上的酶活，最适pH在5.5，具有良好的胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性，该酶在低温中性pH条件下仍具有一定的酶活。
上述的重组耐热植酸酶粗酶液热稳定性的测量方法，其步骤为：
1)用pH5.5，0.25M的乙酸缓冲液配制7.5mmol/L的植酸钠溶液。
2)将粗酶液在9℃，水浴10min，在3℃测定酶活。
本发明的植酸酶生产成本低，具有良好的耐热性能，很好的解决饲料生产过程中因高温制粒而造成酶活损失较多的问题，具有很好的市场价值。具体体现如下：
1)酶活高。
2)酶学性质好。具有良好的热稳定性，另有很宽的pH值范围，具有良好的胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性，低温中性pH条件下仍具有一定的酶活。
3)后处理简单。其它来源的植酸酶后处理精制成本高，相应的价格要高，利用酵母基因工程菌GS115/appA NR生产的粗酶液可直接用载体吸附干燥后就可以达到商品的要求，生产成本相对低。
具体实施方式
实施例1：设计36条引物(appA)F1-(appA)R36，通过两步法扩增得到耐酸植酸酶基因。首先，将大小为1299bp的耐热植酸酶基因分为641bp和658bp的两个小片段通过PCR来扩增，首尾引物浓度为10μmol/L，中间引物浓度为1μmol/L，94℃20sec；60℃30sec；68℃50sec(25cycle)；68℃7min，扩增出641bp和658bp的DNA片段，然后将得到的2份DNA片段等量混匀，加引(appA)F1和(appA)R36进行第二步扩增，引物浓度10μmol/L，94℃20sec；60℃30sec；68℃ 1min 30sec(25cycle)；68℃7min)，扩增1299bp的DNA片段。将上述的基因插入到毕赤酵母整合表达载体pHBM905A中，经测序证实该DNA片段序列无误并正确插入表达载体pHBM905A中，然后将得到的含耐热植酸酶基因的表达载体导入到毕赤酵母GS115中，转化子点种在含植酸钙的底物平板上，再从中筛选出出现最大水解圈的一种高效表达耐热植酸酶的酵母基因工程菌GS115/appANR菌株。
实施例2：将实施例1得到的GS115/appANR菌株在以甘油为碳源的培养基中， 20-30℃摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到20，再转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于20-30℃诱导培养。诱导培养216小时，每隔24小时取样，对所取样进行分析，当产酶水平达978U/mL以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含耐热植酸酶的上清液，即为粗酶液，对粗酶液进行酶活测定，酶活性为978U/mL。经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得耐高温重组植酸酶产品。
用pH5.5，0.25M的乙酸缓冲液配制7.5mmol/L的植酸钠溶液，将上述粗酶液在95℃水浴10分钟，在37℃测定相对酶活，测得该酶在在95℃水浴10分钟，还有92％的残余酶活。以浓度为7.5mmol/L的植酸钠溶液为底物，测定该酶的其它酶学性质，结果发现其在中性pH的酶活高于E.coli K12野生型植酸酶，其他酶学性质和E.coliK12野生型植酸酶基本一致。另外，经测定该耐热植酸酶的表达量可达到10g/L。
本发明中用于转化大肠杆菌感受态细胞XL10-GOLD购于Strategene公司，Pichiapastoris GS115菌株和pHBM905A质粒均由本实验室保存。所有引物均由上海捷瑞生物工程公司合成。
Claims (2)
1.一种耐热植酸酶毕赤酵母工程菌GS115/appA NR，其保藏号为CCTCCNo：M2010168。
2.一种耐热植酸酶的生产方法，其特征在于将权利要求1所述的耐热植酸酶酵母工程菌GS115/appANR在以甘油为碳源的培养基中，20-30℃培养至细胞密度OD600达到20时，再转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中，在20-30℃，经24-216小时诱导培养，每隔12-24小时间测酶活，酶活性达978U/ml时停止诱导培养，将完成培养的酵母工程菌经离心除去菌体，收集上清液，经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得重组耐热植酸酶产品。
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