CN101235362A - 用于原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基 - Google Patents
用于原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基,每升培养基中含有以下重量的各组分:胰蛋白胨10-40g,酵母提取物5-20g,六水琥珀酸钠0-8.1g,二水柠檬酸钠0-1.5g,甘油15-50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氢二钠3.55g,磷酸二氢钾3.40g,氯化铵2.68g,硫酸钠0.71g,七水硫酸镁0.50g,六水氯化铁0.03g。用本发明复合自动诱导培养基表达外源蛋白,其外源蛋白的表达量与普通培养基LB相比,产量提高8倍以上;与同类型复合自动诱导培养基相比,产量提高达2倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基,尤其涉及一种用于含有lac启动子、T7lac启动子控制的原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基,属于生物技术领域。
背景技术
DNA测序技术的成熟能够准确的提供来源于不同物种的数以万计蛋白质的编码序列。应用DNA重组技术能够把这些编码序列克隆到表达载体上,实现目的蛋白的表达。最近几年来,利用基因工程手段生产商业化的蛋白急剧增加,这些表达的重组蛋白已经在工业上以及医学上得到广泛应用。由于大肠杆菌具有遗传背景清楚、易操作、生长迅速、表达量高、以及培养成本低等优点,再加上多年来外源基因表达的经验使其在大多数科研与应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。利用大肠杆菌成功表达的重组蛋白包括工业酶类(凝乳酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等)以及治疗性蛋白(非格司亭、生长激素、胰岛素、干扰素等)。另外据统计截止到2003年提交到蛋白质结构数据库(PBD)中的蛋白质有80%以上是利用了大肠杆菌表达系统。所以说蛋白质无论是理论上的研究还是工业化生产,大肠杆菌表达系统都具有举足轻重的地位。
随着对大肠杆菌表达系统研究的不断深入,现在已经设计出了一系列的与大肠杆菌相匹配的表达载体,如pET系列、pGEX系列等,其中pET表达系统是最为广泛使用的原核表达系统之一。截止到2003年提交到PBD中的蛋白质中,pET表达系统的使用占整个原核表达系统的90%以上。
pET表达系统采用了T7lac杂合启动子,一方面能够有效的启动目的蛋白的表达,还能够降低本底表达水平。但是这种原核表达系统的主流载体也存在一些不足。有研究表明,即使是使用这种表达系统表达外源蛋白时,当重组菌生长接近于饱和状态时,也会发生提前诱导的情况。这对于表达外源蛋白特别是对宿主菌有毒性的蛋白极为不利。有文献表明,当向处于生长期后期的培养基中加入1%的葡萄糖时,会阻止这种提前表达,Novagen公司的主页上就参考了这一研究结果,推荐向培养基中添加1%的葡萄糖来解决这一问题。尽管这种方法可以抑制提前表达,可是葡萄糖会使培养基变为酸性,这就影响稳定期的菌密度,有碍于外源蛋白的表达。
所以,找到一种既能高密度培养细菌,又能克服表达菌的提前表达,对于提高外源蛋白的表达量具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种既能高效表达外源蛋白,又能实现自动诱导的复合培养基。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
一种用于原核表达系统表达外源蛋白的培养基,每升该培养基,主要由以下重量的各组分组成:
胰蛋白胨 10-40g
酵母提取物 5-20g
六水琥珀酸钠 0-8.1g
二水柠檬酸钠 0-1.5g
甘油 15-50g
葡萄糖 0.5g
乳糖 2g
磷酸氢二钠 3.55g
磷酸二氢钾 3.40g
氯化铵 2.68g
硫酸钠 0.71g
七水硫酸镁 0.50g
六水氯化铁 0.03g;
优选的,各组分的重量份是:
胰蛋白胨 20.0g
酵母提取物 10.0g
六水琥珀酸钠 5.40g
二水柠檬酸钠 0.30g
甘油 25.0g
葡萄糖 0.50g
乳糖 2.00g
磷酸氢二钠 3.55g
磷酸二氢钾 3.40g
氯化铵 2.68g
硫酸钠 0.71g
七水硫酸镁 0.50g
六水氯化铁 0.03g;
本发明复合培养基的中各原料均可从生物化学试剂公司购买得到。
本发明复合培养基可按照本领域常规方法配制而成,这些方法为本领域普通技术人员所通晓。
现有的CAI培养基虽然能够实现菌的高密度培养和蛋白的大量表达,但是这种复合培养基各成分之间搭配并不是非常有效,还存在一些不足。通过对现有的这类复合培养基各个成分作用特点的研究发现,甘油浓度、酵母提取物含量以及缓冲液缓冲能力对于改进这种复合自动诱导培养基,提高蛋白表达量至关重要。通过对复合培养基的一系列改造,得到了一种高效的复合自动诱导培养基(改良培养基-4)。
本发明复合培养基中各成分的代谢差异促使了细胞的高密度培养,当细胞培养的密度接近于饱和时,培养基中的成分之一-乳糖又能自动诱导外源蛋白的表达,而无需监视细胞生长状态以及手动添加诱导剂IPTG;培养基中的复合成分能够抑制蛋白的提前表达,这对于表达对细胞有毒性的蛋白及为有利;并且这种自动诱导的复合培养基与常规培养诱导方法相比,蛋白产量至少提高数倍以上。
自动化和微型化已经成为后基因组时代高通量研究工程的两种关键因素。本发明复合培养基完全符合自动化微型化的要求,为大肠杆菌表达系统的更广泛应用奠下良好的工作基础。本发明复合培养基既能极大方便实验室科研人员的实际操作,又能够扩大培养满足工业化生产的需求。
具体来说,本发明复合培养基主要具有下述优点:
1)本发明复合培养基使用乳糖代替了传统的诱导剂IPTG,一方面大大节约了培养基成本,另一方面替换了有毒物质IPTG的使用,更适合于医药领域的应用;
2)本发明复合培养基无需监控细胞生长以及手动添加诱导剂,极大方便了实验室操作;
3)本发明复合培养基可加速平行筛选克隆,接种培养简单,容易自动化高通量地验证蛋白的表达与可溶情况;
4)本发明复合培养基的复合成分能够抑制重组蛋白的提前表达,这对于表达对细胞有毒性的蛋白极为有利;
5)用本发明复合培养基表达外源蛋白,其外源蛋白的表达量与普通培养基LB相比,产量提高8倍以上;与国外同类型培养基相比,产量提高2倍以上。
6)能够放大培养满足工业化生产需求;
7)便于进行蛋白的结构分析(如15NH4Cl、(15NH4)2SO4和13C标记的甘油用于NMR分析等)。
本发明复合培养基可作为含有lac启动子、T7lac启动子控制的原核表达系统表达外源蛋白的培养基,其适用范围涵盖了原核表达系统的90%以上。
本发明复合培养基的使用方法如下:
将含有目的基因的大肠杆菌接种于本发明复合培养基中,37℃,振荡培养12-24小时,收集所表达的外源蛋白。
优选的,本发明复合培养基的使用方法:
(1)挑取单菌落接种于装有10ml细菌高密度增值培养基的250ml三角瓶中,培养(37℃,250rpm)12h;按1∶1000的接种比例加入到装有本发明复合自动诱导培养基的三角瓶中,继续培养12h,收集所表达的外源蛋白。(注:利用细菌高密度培养基增值培养细菌后,放入-80℃冰箱保存数周很少发生质粒丢失现象);
(2)或者直接挑取单菌落,放入装有本发明复合自动诱导培养基的三角瓶中,过夜培养,收集所表达的外源蛋白。
(3)或者直接挑取单菌落,放入装有本发明复合自动诱导培养基的三角瓶中在37℃,250rpm培养3-4h,略见混浊后放入低温(15-30℃)摇床振荡培养(这样能够极大提高可溶性外源蛋白的表达量)。
附图说明
图1 7种重组蛋白的SDS-PAGE分析;
M:为蛋白质分子量Marker(Fermentas);1a,2a,3a,4a,5a,6a and 7a分别为P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6、P-7表达的可溶性蛋白,1b,2b,3b,4b,5b,6b and 7b为对应的非可溶性蛋白。
图2 分别便用LB和CAI为培养基表达外源蛋白,可溶性融合蛋白表达量的比较结果。
图3 改良的不同复合自动诱导培养基对可溶性融合蛋白表达量的影响。
图4 两种培养基与CAI相比对可溶性融合蛋白表达量的影响。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
实施例1 本发明复合培养基的制备
1)基础培养基(2XZY):
20g 胰蛋白胨
10g 酵母提取物
to 1L with H2O;
2)50X复合磷酸盐缓冲溶液:
17.75g 磷酸氢二钠
17.0g 磷酸二氢钾
13.4g 氯化铵
3.55g 硫酸钠
to 100ml with H2O;
3)100X有机酸缓冲溶液
54g 六水琥珀酸钠
3g 二水柠檬酸钠
to 100ml with H2O;
4)500X硫酸镁储存溶液:
25g 七水硫酸镁
to 100ml with H2O;
以上储存液0.1Mpa,121.5℃灭菌20min。
5)1000X氯化铁储存溶液:
3g 六水氯化铁
1ml 浓盐酸(pH~12M)
99ml 灭菌水;
6)50X复合碳源储存液:
125g 甘油
2.5g 葡萄糖
10g 乳糖to 100ml with H2O(过滤除菌)。
实施例2重组质粒p-1、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6和p-7的构建和表达
1.p-1、p-2、p-3这三种重组质粒的构建过程如下:
分别根据抗菌肽CAP和IB的编码序列,人工合成了两条寡核苷酸链,PCR后分别得到了CAP、CAP改造和IB的基因片段,这三条基因片段两端都带有KpnI和EcoRI识别位点;连接到用同样两个酶处理的载体pET-32a上,经酶切与PCR鉴定后得到重组质粒p-1、p-2、p-3。
2.p-4、p-5、p-6、p-7的构建过程如下:
用DNASIS和GENERUNNER软件分别分析了传染性喉气管炎病毒gC、gD、gE、gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的的区域,分别设计了四对不同的特异性引物,从提取的传染性喉气管炎病毒基因组中分别扩出了gC、gD、gE、gJ的基因片段,这三条基因片段两端都带有EcoRI和XholI识别位点;连接到用同样两个酶处理的载体pET-32a上,经酶切与PCR鉴定后得到重组质粒p-4、p-5、p-6、p-7。
注:这七种重组质粒表达的重组蛋白分别是:抗菌肽IB、抗菌肽CAP、改良的CAP、ILTV的gC蛋白、gD蛋白、gE蛋白和gJ蛋白。
将7种重组质粒分别转入E.coli BL21中,诱导之后均可从SDS-PAGE电泳结果中观察到外源蛋白的表达(图1),分子量大小分别为18.6kD,21kD,21.5kD,35kD,41.7kD,53kD,58kD。
试验例
分别使用LB和CAI(CAI是Complex auto-inducing media的缩写,是参照国外学者Studier的研究配方,自动诱导技术所应用的培养基;其具体配方见表1)表达实施例2所构建的7种重组表达质粒,核酸蛋白分析仪和薄层色谱扫描仪测定的结果如表2所示,从中可以看出,在CAI中这七种融合蛋白(抗菌肽IB、抗菌肽CAP、改良的CAP、ILTV的gC蛋白、gD蛋白、gE蛋白和gJ蛋白)的可溶性蛋白在总可溶性蛋白中所占比例与在LB中的相比(除了P-5之外)都有稍微的提高,但是它们总的可溶性蛋白产量与LB相比有大幅度增加,致使这七种融合蛋白在CAl中的可溶蛋白产量都明显高于在LB中的产量。为了更直观地看出外源种培养基表达量的差距,根据表2的数据绘制成了图2。
表1细菌高密度增值培养基和复合自动诱导培养基成分表
成分 | 细菌高密度增值培养基(g/L) | 复合自动诱导培养基CAI(g/L) |
胰蛋白胨酵母提取物磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化铵硫酸钠七水硫酸镁六水氯化铁甘油葡萄糖乳糖 | 1053.553.42.680.710.4930.02750.50 | 1053.553.42.680.710.4930.02750.52 |
表2在LB和CAI培养基中相比可溶性融合蛋白的数值
从图2可以看出,当使用复合自动诱导培养基表达外源蛋白时,其可溶性融合蛋白的表达产量与普通的LB培养基相比,产量提高了4倍左右。
Studier的CAI培养基虽然能够实现菌的高密度培养和蛋白的高效表达,但是这种复合培养基各成分之间的搭配并不是非常有效,还存在一些不足。
通过对复合培养基各个成分作用特点的研究发现,甘油浓度、酵母提取物含量以及缓冲液缓冲能力对于改进这种复合自动诱导培养基,提高蛋白表达量至关重要。当在这种复合培养基中添加某些物质或者改变某些成分的含量时,三种蛋白(P-1、P-2、P-3)产量得到了进一步提高(表3、表4、表5、表6)。
表3在改良培养基-1中可溶性融合蛋白的数值
Sample No | Total soluble protein(g/l) | Percentage of soluble fusion proteinin total soluble protein(%) | Concentration of solublefusion protein(g/l) |
P-1 | 13.07 | 61.0 | 7.973 |
P-2 | 12.37 | 47.0 | 5.813 |
P-3 | 11.64 | 42.6 | 4.959 |
表4在改良培养基-2中可溶性融合蛋白的数值
Sample No. | Total soluble protein(g/l) | Percentage of soluble fusion proteinin total soluble protein(%) | Concentration of solublefusion protein(g/l) |
P-1 | 16.54 | 58.3 | 9.643 |
P-2 | 17.18 | 46.4 | 7.972 |
P-3 | 16.21 | 43.1 | 6.987 |
表5在改良培养基-3中可溶性融合蛋白的数值
Sample No. | Total soluble protein(g/l) | Percentage of soluble fusion proteinin total soluble protein(%) | Concentration of solublefusion protein(g/l) |
P-1 | 15.57 | 59.1 | 9.202 |
P-2 | 16.96 | 45.9 | 7.785 |
P-3 | 16.17 | 42.7 | 6.905 |
表6在改良培养基-4中可溶性融合蛋白的数值
Sample No | Total soluble protein(g/l) | Percentage of soluble fusion proteinin total soluble protein(%) | Concentration of solublefusion protein(g/l) |
P-1 | 21.82 | 57.1 | 12.46 |
P-2 | 20.42 | 44.7 | 9.128 |
P-3 | 22.76 | 39.4 | 8.967 |
根据以上几个表格,把可溶性融合蛋白的数值绘制成从图3,结果可以看出,复合自动诱导培养基经过改良后均能提高目的蛋白的产量,其中以4号改良培养基对目的蛋白产量的提高最为明显。
甘油可以作为诱导后期良好的碳源,从而促进菌的生长,提高蛋白的表达量;并且伴随着最近几年来甘油价格的大幅度下降,甘油作为大肠杆菌发酵培养的碳源而备受亲睐。添加甘油使其浓度由原来的0.5%增加为2.5%,形成改良培养基-1(具体配方见表7),结果蛋白表达量得到了提高;可是诱导结束后发现3种菌的培养基pH值都降到4.8以下,这样酸性的条件下质粒的稳定性较差,并且对蛋白的表达非常不利(蛋白的表达的最适pH值在6.0~7.5左右)。经分析发现,共有2种方法可以解决这种问题:一是添加某些能够增强培养基缓冲能力的物质;二是增加原来培养基中缓冲液的磷酸盐浓度(由原来的50mmol/L增加到100mmol/L)。需要通过一系列的措施,找到解决这一问题的最适合办法。
本发明人首先把改良培养基-1中磷酸盐的浓度由50mmol/L增加到100mmol/L,形成改良培养基-2(具体配方见表8),诱导以后发现,pH值由原来的低于4.8升到了6.4左右,蛋白的表达量得到了大幅度提高;然后,往改良培养基-1中添加了适当浓度的2种物质-六水琥珀酸钠(5.40g/l)和二水柠檬酸钠(0.30g/l),形成改良培养基-3(具体配方见表9),诱导以后发现改良培养基-2的蛋白表达量略高于改良培养基-3。不过经研究发现,高磷酸盐浓度能够提高重组质粒的卡那抗性,在100mmol/L磷酸盐浓度的培养基中,卡那霉素的有效浓度必须提高到300μg/ml,这样就给我们表达卡那抗性的重组质粒带来困难,所以这种培养基只适合表达含有氨卞抗性的重组质粒,不具有通用性。故采用折衷的方法,使用改良培养基-3作为进一步的研究对象。
葡萄糖在这种自动诱导培养基中的作用是非常重要的。首先葡萄糖是大肠杆菌最偏爱的碳源,另外它还与其他碳源存在竞争关系,也就是说当葡萄糖存在时,大肠杆菌优先利用,直到其被耗尽时,才代谢其他碳源,这也就是所谓“自动诱导”培养基形成的理论基础。不过葡萄糖的存在还会带来一些负面影响。葡萄糖在代谢过程中会产生乙酸这样的短链酸类物质,短链酸能够降低RNA、DNA、蛋白质以及酯类的合成速率。并且乙酸浓度在0.5g/L的情况下就能严重影响菌的生长。在查阅文献的过程中,我们发现酵母提取物除了能够减少乙酸形成之外,还能够增加菌密度、阻止靶蛋白的降解、增强发酵培养基的缓冲能力等多种作用。借鉴于2×YT(含有10g酵母提取物、16g胰蛋白胨)、TRB(含有24g酵母提取物、12g胰蛋白胨)以及MBL培养基(含有30g酵母提取物、20g胰蛋白胨)中酵母提取物和胰蛋白胨的组成特点,我们往改良培养基-3中补加了适当浓度的酵母提取物和胰蛋白胨,形成了改良培养基-4(具体配方见表10),经诱导后发现,其蛋白表达产量与改良培养基-3相比又有较大幅度的提高。
本发明在改良培养基-4的基础上,又经过大量的试验发现,将改良培养基-4的下述一些组分在以下上下限范围内浮动,所得到的培养基表达外源蛋白时,其表达量与CAI相比,都有所提高:
胰蛋白胨10-40g,酵母提取物5-20g,六水琥珀酸钠0-8.1g,二水柠檬酸钠0-1.5g,甘油15-50g(以每升培养基计)。
作为一种例证,本发明配制了以下两种浓度的培养基:
(1)胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,甘油15g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氢二钠3.55g,磷酸二氢钾3.4g,氯化铵2.68g,硫酸钠0.71g,七水硫酸镁0.5g,六水氯化铁0.03g(以每升培养基计)。
(2)胰蛋白胨40g,酵母提取物20g,六水琥珀酸钠8.1g,二水柠檬酸钠1.5g,甘油50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氢二钠3.55g,磷酸二氢钾3.4g,氯化铵2.68g,硫酸钠0.71g,七水硫酸镁0.5g,六水氯化铁0.03g(以每升培养基计)。
上述两种培养基表达外源蛋白时,其表达量与CAI相比,其表达量都有所提高,具体结果参照图4。
本发明培养基与国外的同类型培养基相比,优化了胰蛋白胨,酵母提取物以及甘油的浓度,添加了两种合适浓度的能够增加缓冲液缓冲能力的物质-六水琥珀酸钠和二水柠檬酸钠,在此保护范围内,其外源蛋白的表达量都要优于studier的CAI培养基。(虽然本发明中没有确定其它物质的浓度范围,但是作为一种自动诱导培养基,只要关键物质确定后,其它物质是可以在一定范围内浮动的,比如:Na+10-200mM、K+10-200mM、NH4 +20-100mM、Mg2+1-10mM、Fe3+1-100uM、PO4 3-10-100mM等)。
表7改良培养基-1的配方
成分 | 改良培养基-1(g/L) |
胰蛋白胨酵母提取物磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化铵硫酸钠七水硫酸镁六水氯化铁甘油葡萄糖乳糖 | 10.05.003.553.402.680.710.500.0325.00.502.00 |
表8改良培养基-2的配方
成分 | 改良培养基-2(g/L) |
胰蛋白胨酵母提取物磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化铵硫酸钠六水琥珀酸钠二水柠檬酸钠七水硫酸镁六水氯化铁甘油葡萄糖乳糖 | 10.05.003.553.402.680.715.400.300.500.0325.00.502.00 |
表9改良培养基-3的配方
成分 | 改良培养基-3(g/L) |
胰蛋白胨酵母提取物磷酸氢二钠磷酸二氢钾硫酸铵七水硫酸镁六水氯化铁甘油葡萄糖乳糖 | 10.05.007.106.803.300.500.0325.00.502.00 |
表10改良培养基-4的配方
成分 | 改良培养基-4(g/L) |
胰蛋白胨酵母提取物磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化铵硫酸钠六水琥珀酸钠二水柠檬酸钠七水硫酸镁六水氯化铁甘油葡萄糖乳糖 | 20.010.03.553.402.680.715.400.300.500.0325.00.502.00 |
Claims (6)
1. 一种用于原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基,以每升培养基计,含有以下重量的各组分:
胰蛋白胨 10-40g
酵母提取物 5-20g
六水琥珀酸钠 0-8.1g
二水柠檬酸钠 0-1.5g
甘油 15-50g
葡萄糖 0.5g
乳糖 2g
磷酸氢二钠 3.55g
磷酸二氢钾 3.40g
氯化铵 2.68g
硫酸钠 0.71g
七水硫酸镁 0.50g
六水氯化铁 0.03g。
2. 按照权利要求1的复合自动诱导培养基,其特征在于:以每升培养基计,含有以下重量的各组分:
胰蛋白胨 20.0g
酵母提取物 10.0g
六水琥珀酸钠 5.40g
二水柠檬酸钠 0.30g
甘油 25.0g
葡萄糖 0.50g
乳糖 2.00g
磷酸氢二钠 3.55g
磷酸二氢钾 3.40g
氯化铵 2.68g
硫酸钠 0.71g
七水硫酸镁 0.50g
六水氯化铁 0.03g。
3. 权利要求1或2的复合自动诱导培养基在表达外源蛋白中的应用,包括:将含有目的基因的大肠杆菌接种于本发明复合自动诱导培养基中,37℃,振荡培养12-24小时,收集所表达的外源蛋白。
4. 按照权利要求3的应用,其特征在于:挑取含有目的基因的大肠杆菌单菌落接种于装有10ml细菌高密度增值培养基的250ml三角瓶中,37℃,250rpm培养12h;按1∶1000的接种比例加入到装有权利要求1所述复合自动诱导培养基的三角瓶中,继续培养12h,收集所表达的外源蛋白。
5. 按照权利要求3的应用,其特征在于:直接挑取含有目的基因的大肠杆菌单菌落,放入装有权利要求1所述复合自动诱导培养基的三角瓶中在37℃,250rpm过夜培养,收集所表达的外源蛋白。
6. 按照权利要求3的应用,其特征在于:直接挑取含有目的基因的大肠杆菌单菌落,放入装有权利要求1所述复合自动诱导培养基的三角瓶中在37℃,250rpm培养3-4h,略见混浊后放入低温摇床振荡培养,收集所表达的外源蛋白。
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