CN103305536A - 漆酶基因及工程菌与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境生物领域，公开了一种漆酶基因及漆酶基因工程菌与其在微生物法水解处理造纸废水中的应用。漆酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，漆酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的按毕赤酵母偏爱密码子优化的漆酶基因，能够在酵母菌中高效组成型表达，可提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

Description

漆酶基因及工程菌与用途

技术领域

本发明涉及环境生物领域，特别涉及一种漆酶基因及漆酶基因工程菌与其在微生物法水解处理造纸废水中的应用。

背景技术

漆酶是一种结合多个铜原子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶。漆酶作用底物相当广泛，能够对多种污染物如各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚、芳香胺等。漆酶是近年发现在造纸工业中最具潜力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能选择性地催化木质素降解，不会产生有毒物质，并且生产在常温、常压的温和条件下进行，节约设备和能耗。因此漆酶在造纸工业废水处理等方面有着非常巨大的应用前景。

分泌漆酶的真菌主要有担子菌、多孔菌、半知菌、子囊菌、脉胞菌、柄孢壳菌和曲霉菌等属种，其中绝大部分分布于担子菌，其次是子囊菌，研究最多的是担子菌亚门的白腐菌，但是目前还没有在酵母中发现内源性漆酶的存在。（SUZUKI T, et al, 2003）

随着研究的不断深入，人们发现一些原核生物也产漆酶，如1993年从稻草根上第一次分离出产漆酶的细菌——生脂固氮螺菌（G ivaudan,et al.1993）。随后人们陆续在许多细菌中发现了漆酶如链霉菌、枯草芽孢杆菌、水生细菌、海洋细菌等。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势。将漆酶基因按毕赤酵母的密码子偏好性进行设计，在毕赤酵母中进行组成型表达，能大幅度提到基因的表达水平，同时应用于造纸废水的生物处理中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种漆酶的核苷酸序列，本发明按毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化，并将该基因在毕赤酵母中实现高效组成型表达，从而应用于造纸废水的生物处理中。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

本发明所述优化后的漆酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的漆酶基因按如下毕赤酵母偏爱密码子的优先结构设计见表1：

氨基酸	代码	密码	氨基酸	代码	密码
						Leu	L	TTG	His	H	CAT
Ile	I	ATT	Gln	Q	CAA
						Met	M	ATG	Asn	N	AAC
Val	V	GTT	Lys	K	AAG
						Ser	S	TCT	Asp	D	GAT
Pro	P	CCA	Glu	E	GAA
						Thr	T	ACT	Cys	C	TGT
Ala	A	GCT	Trp	W	TGG
						Phe	F	TTT	Tyr	Y	TAC
Arg	R	AGA	Gly	G	GGT
						End		TAA

本发明的优化的漆酶基因采用连续延伸PCR方法制备而成，使用的基因模板为枯草芽孢杆菌的cotA基因序列（GENE ID: 936023）。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，将含有所述基因的重组载体转化至宿主菌（通常为毕赤酵母菌）中，进行表达，即可获得本发明漆酶。

本发明还涉及所述基因在制备重组漆酶中的应用。

本发明还涉及所述的漆酶在造纸废水生物处理中的应用。本发明的漆酶的最适温度是25~35℃，最适pH为4.5~5.5。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果： 

本发明提供了一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的漆酶基因，能够在酵母菌中高效组成型表达，可提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为漆酶的最适pH曲线；

图2为漆酶的最适温度曲线。

具体实施方式

下面结合附图1至附图2与实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

漆酶基因密码子的优化

根据枯草芽孢杆菌的cotA基因序列 （GENE ID: 936023），同时结合毕赤酵母表达的密码子偏好性，对cotA基因序列进行密码子优化，同时在基因全长上下游引入酶切位点：EcoRⅠ和NotⅠ。同时，为了防止优化后的基因序列含有EcoRⅠ酶切位点及后续DNA线性化Bgl II酶切位点，同时调整优化后基因的GC含量，故将第855个碱基A突变为G，第1098个碱基T突变为C。基因全长1542个碱基，编码514个氨基酸。优化后的漆酶基因命名为Tcot。

设计基因两端酶切位点和保护碱基，设计引物如下所示：

P1:ACGGAATTCATGACTTTGGAAAAGTTTGTTGATGCTTTGCCAATTCCAGATACTTTGAAGCCAGTTCAAC

P2:TTGATGAGTACATTCTTCCATAGTAACTTCGTAGTAAGTCTTTTCCTTAGATTGTTGAACTGGCTTCAAAGTA

P3:AGAATGTACTCATCAATTGCATAGAGATTTGCCACCAACTAGATTGTGGGGTTACAACGGTTTGTTTCCA

P4:TGTTCATCCACTTAACGTAAACGTTTTCGTTTCTCTTAACTTCAATAGTTGGACCTGGAAACAAACCGTT

P5:GTTAAGTGGATGAACAACTTGCCATCTACTCATTTTTTGCCAATTGATCATACTATTCATCATTCTGATTCTCA

P6:GGAGTAACACCACCATGCAAATGAACAACAGTCTTAACTTCTGGTTCTTCATGTTGAGAATCAGAATGATGA

P7:GCATGGTGGTGTTACTCCAGATGATTCTGATGGTTACCCAGAAGCTTGGTTTTCTAAGGATTTTGAACAAACT

P8:CACCTCTTTGTTGGTTTGGGTAATGGTAAACTTCTCTCTTAAAGTATGGACCAGTTTGTTCAAAATCCT

P9:ACCAACAAAGAGGTGCTATTTTGTGGTACCATGATCATGCTATGGCTTTGACTAGATTGAACGTTTACGCTG

P10:GCAACTTCAATCTCTTTTCCTTTGGATCATGAATAATGTAAGCACCAACCAAACCAGCGTAAACGTTCAAT

P11:AGAGATTGAAGTTGCCATCTGATGAATACGATGTTCCATTGTTGATTACTGATAGAACTATTAACGAAGAT

P12:GGGTTTGGCAAAGATGGAGATGGGTTTTCTGGAGCAGATGGGTAAAACAAAGAACCATCTTCGTTAATAGTT

P13:TCCATCTTTGCCAAACCCATCTATTGTTCCAGCTTTTTGTGGTGAAACTATTTTGGTTAACGGTAAGGTTTGG

P14:AGAAGCGTTAATAACTCTAAATCTGTACTTTCTTGGTTCAACTTCCAAGTATGGCCAAACCTTACCGTTAA

P15:AGAGTTATTAACGCTTCTAACACTAGAACTTACAACTTGTCTTTGGATAACGGTGGTGATTTTATTCAAATTGG

P16:AGCCAAAGAAAAAGAGTTCAACTTAACAGACCTTGGCAACAAACCACCATCAGAACCAATTTGAATAAAATCACC

P17:TGAACTCTTTTTCTTTGGCTCCAGCTGAAAGATACGATATTATTATTGATTTTACTGCTTACGAAGGTGAATCTAT

P18:AGCATCAGTTTCTGGGTTAACATCACCACCACAACCAGCAGAGTTAGCCAAAATAATAGATTCACCTTCGTAAGC

P19:TTAACCCAGAAACTGATGCTAACATTATGCAATTTAGAGTTACTAAGCCATTGGCTCAAAAGGATGAATCTAGAA

P20:ATGTTTTGGATTCTTTCATGTTGAACAGATGGGTAAGAAGCCAAGTACTTTGGCTTTCTAGATTCATCCTTTTGAG

P21:ACATGAAAGAATCCAAAACATTAGAACTTTGAAGTTGGCTGGTACTCAAGATGAATACGGTAGACCAGTTTTGTTGT

P22:GTAGTACCAACCTTTGGAGTTTCAGTAACTGGATCATGCCATCTCTTGTTGTTCAACAACAAAACTGGTCTACCGTAT

P23:AAACTCCAAAGGTTGGTACTACTGAAATTTGGTCTATTATTAACCCAACTAGAGGTACTCATCCAATTCATTTGCATT

P24:TTCTTGGTATCTAGCAATATCAAATGGTCTTCTATCCAAAACTCTAAAAGAAACCAAATGCAAATGAATTGGATGAGTA

P25:TTGATATTGCTAGATACCAAGAATCTGGTGAATTGTCTTACACTGGTCCAGCTGTTCCACCACCACCATCTGAAAAG

P26:TAGCAGCAATTCTCAAAACTTCACCAGCATGAGCTTGAATAGTATCCTTCCAACCCTTTTCAGATGGTGGTGGTGG

P27:GAAGTTTTGAGAATTGCTGCTACTTTTGGTCCATACTCTGGTAGATACGTTTGGCATTGTCATATTTTGGAACATGAAGATTACGATAT

P28:ACTGCGGCCGCTTACTTATGTGGATCAGTAATATCCATTGGTCTCATCATATCGTAATCTTCATGTTCCAAAATATG

PCR反应条件： 

第一轮：以所有引物为模板。95℃ 2min；95℃ 30s，54℃ 20s，72℃ 30 s，20个循环；72℃ 5min。

第二轮：以第一轮产物为模板，以P1和P28为引物。95℃ 3min；95℃1min，58℃ 30s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5min。PCR结束后，通过0.8%琼脂糖电泳检测大小。

实施例2

漆酶基因在酵母细胞中的表达

1、表达载体的构建

密码子优化后的PCR产物用 EcoRⅠ/NotⅠ双酶切，回收片段，以正确的阅读框插入到同样双酶切的毕赤酵母组成型表达载体pGAPZaA（美国invitrogen公司）连接，转化 E.coli DH5α，获得重组质粒pGAPZaA-Tcot。该重组质粒经 EcoRⅠ/NotⅠ双酶切验证。

2、电转化感受态的制备

在含 5 ml YPD 的 50 ml 离心管中，培养酵母细胞，30度过夜；取30~50 ul 过夜培养物，接种含 50 ml 新鲜培养基的 250 ml 摇瓶，过夜生长至 OD600＝1.3~1.5；在4 度，1500 g离心 5 min收集细胞,用 50 ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用25 ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用2 ml预冷的 1M山梨醇悬浮细胞；如上离心，用100 ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

3、电转化

将pGAPZaA-Tcot用Bgl II酶切线性化，将5~10ug线性化 DNA与80 uL 电转化细胞混匀，转移到0.1 cm电转化杯，冰浴5 min。电转化参数：0.75kV，25uF，200Ω。电击后立即加入1mL预冷的1M山梨醇。复苏1h后取150ul涂布含有Zeocin抗性的YPD平板上培养。在30 度孵育平板至克隆产生。

4、产漆酶转化子的筛选 

将转化子平板上的单菌落分别培养保存，进行阳性克隆子和高效产漆酶转化子的筛选。

初筛培养基

Bavendamm 氏反应培养基: 在PDA 固体培养基中加入鞣酸使其终浓度为0. 4 mmo l/ L;

氧化带测定培养基: 在PDA 固体培养基中加入愈创木酚使其终浓度为0. 04%。

复筛培养基

马铃薯200 g , 葡萄糖20 g , 磷酸二氢钾3 g , 七水硫酸镁1. 5 g, 酵母浸膏1 g , 蒸馏水1 000 mL, 煮沸过滤, 冷却后分装至250 mL 三角瓶, 每瓶装入50 mL 培养基。

产酶基础培养基

葡萄糖30 g , 硝酸钠2 g, 七水硫酸镁0. 5 g , 三水磷酸氢二钾1 g , 七水硫酸亚铁0. 01 g , 氯化钾0. 5 g , 蒸馏水1 000 mL, 自然pH。

高产菌株的初筛。Bavendamm 氏反应培养基常规灭菌倒平板, 取培养好的直径12 mm、7 d 菌龄待测菌塞2 片接种于初筛平板, 28℃ 生化培养箱培养, 挑选菌丝生长良好, 使鞣酸、愈创木酚二者变色能力强、变色速度快的平板, 并接种于PDA 斜面, 一并于4 ℃ 保存。

高产菌株的复筛。在无菌条件下, 用打孔器于初筛所得菌的平板上打孔, 制成直径12 mm 菌塞, 接入装有50 mL 产酶培养基的250 mL 三角瓶, 每瓶接种2 片，3 个平行，28 ℃、120 r/ min 振荡培养，每天取样测定漆酶活性，持续10 d，选择漆酶活力高的菌株。

漆酶酶活力用愈创木酚法测定，一个酶活单位定义为在25℃条件下每分钟使1μmol 的底物转化所需的酶量。

实施例3

漆酶的特性研究

1、pH值对漆酶活性的影响

将漆酶加入不同pH值的缓冲液体系中测定酶活力，pH设置从2.0到10.0，每隔0.5取点测定。酶活性测定反应在25℃进行，反应时间为15 min。结果如图1所示，漆酶的最适pH值为4.5~5.5，在pH4.0到pH6.5范围内，漆酶酶活能保持在50%以上。

 2、温度对漆酶活性的影响

   漆酶的最适反应温度测定在最适pH值下进行，反应时间为15 min，温度设置从15 ℃到75℃，每隔5℃取点测定。结果如图2示，漆酶的最适温度为25~35℃，20~45 ℃时的酶活能保持60%以上。 

实施例4 

漆酶基因工程菌在造纸废水处理中的应用

由于基因工程菌中漆酶为组成型表达，因此可将基因工程菌进行扩大培养后，按0.05%的添加量添加到某造纸废水处理厂SBR工艺（序列间歇式活性污泥法）曝气池中进行处理。与对照组相比，漆酶基因工程菌可将造纸废水处理效率提高10%，在未来的造纸废水处理中有重要的应用意义。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 <110>  浙江商达环保有限公司

 <120>  漆酶基因及工程菌与用途

 <160>  2   

 <170>  PatentIn version 3.4

 <210>  1

<211>  513

<212>  PRT

<223>  人工序列

 <400>  1

MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTI  60

EVKRNENVYVKWMNNLPSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDGYPE 120

AWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWYHDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEK 180

RLKLPSDEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSAPENPSPSLPNPSIVPAFCGETILVNGKVW  240

PYLEVEPRKYRFRVINASNTRTYNLSLDNGGDFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERY  300

DIIIDFTAYEGESIILANSAGCGGDVNPETDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPS  360

VQHERIQNIRTLKLAGTQDEYGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKVGTTEIWSIINPTRGTHP  420

IHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQESGELSYTGPAVPPPPSEKGWKDTIQAHAGEVLRIAAT  480

FGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK  513

 

<210>  2

<211>  1542

<212>  DNA

<223>  人工序列

 <400>  2

atgactttgg aaaagtttgt tgatgctttg ccaattccag atactttgaa gccagttcaa  60

caatctaagg aaaagactta ctacgaagtt actatggaag aatgtactca tcaattgcat  120

agagatttgc caccaactag attgtggggt tacaacggtt tgtttccagg tccaactatt  180

gaagttaaga gaaacgaaaa cgtttacgtt aagtggatga acaacttgcc atctactcat  240

tttttgccaa ttgatcatac tattcatcat tctgattctc aacatgaaga accagaagtt  300

aagactgttg ttcatttgca tggtggtgtt actccagatg attctgatgg ttacccagaa  360

gcttggtttt ctaaggattt tgaacaaact ggtccatact ttaagagaga agtttaccat  420

tacccaaacc aacaaagagg tgctattttg tggtaccatg atcatgctat ggctttgact  480

agattgaacg tttacgctgg tttggttggt gcttacatta ttcatgatcc aaaggaaaag  540

agattgaagt tgccatctga tgaatacgat gttccattgt tgattactga tagaactatt  600

aacgaagatg gttctttgtt ttacccatct gctccagaaa acccatctcc atctttgcca  660

aacccatcta ttgttccagc tttttgtggt gaaactattt tggttaacgg taaggtttgg  720

ccatacttgg aagttgaacc aagaaagtac agatttagag ttattaacgc ttctaacact  780

agaacttaca acttgtcttt ggataacggt ggtgatttta ttcaaattgg ttctgatggt  840

ggtttgttgc caaggtctgt taagttgaac tctttttctt tggctccagc tgaaagatac  900

gatattatta ttgattttac tgcttacgaa ggtgaatcta ttattttggc taactctgct  960

ggttgtggtg gtgatgttaa cccagaaact gatgctaaca ttatgcaatt tagagttact  1020

aagccattgg ctcaaaagga tgaatctaga aagccaaagt acttggcttc ttacccatct  1080

gttcaacatg aaagaatcca aaacattaga actttgaagt tggctggtac tcaagatgaa 1140

tacggtagac cagttttgtt gttgaacaac aagagatggc atgatccagt tactgaaact 1200

ccaaaggttg gtactactga aatttggtct attattaacc caactagagg tactcatcca  1260

attcatttgc atttggtttc ttttagagtt ttggatagaa gaccatttga tattgctaga  1320

taccaagaat ctggtgaatt gtcttacact ggtccagctg ttccaccacc accatctgaa  1380

aagggttgga aggatactat tcaagctcat gctggtgaag ttttgagaat tgctgctact  1440

tttggtccat actctggtag atacgtttgg cattgtcata ttttggaaca tgaagattac  1500

gatatgatga gaccaatgga tattactgat ccacataagt aa  542

Claims (7)

1.一种漆酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的漆酶基因，其特征在于：所述的漆酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的漆酶基因，其特征在于：所述的漆酶基因采用连续延伸PCR方法制备而成，使用的基因模板为枯草芽孢杆菌的cotA基因序列GENE ID: 936023。

4.漆酶基因工程菌，其特征在于：为含有上述基因的工程菌。

5.根据权利要求4所述的漆酶基因工程菌的用途，其特征在于：用于水解处理造纸废水。

6.根据权利要求5所述的漆酶基因工程菌的用途，其特征在于：将基因工程菌进行扩大培养后，按0.05%的添加量添加到废水池中进行处理。

7.根据权利要求5-6任一所述的漆酶基因工程菌的用途，其特征在于：所述的漆酶的适宜温度控制为25~35℃，pH为4.5~5.5。

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