CN110353153A - 提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物领域，具体涉及提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体及其应用。本发明提供了一种可用于真菌毒素降解的漆酶介体，其包括荆芥水提物。本发明的介体能够协助漆酶有效地降解不同结构类型的真菌毒素，广泛用于食品和饲料真菌毒素脱毒领域。

Description

提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及显著提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体及其应用。
背景技术
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，主要污染储存的粮油食品和饲料，严重危害人畜健康。根据其结构特征，真菌毒素可分为芳香环和非芳香环两大类，芳香环类包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、桔霉素、赭曲霉素、棒曲霉素和单端孢霉烯族毒素等；非芳香环类仅包括伏马毒素，其中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮是最为常见和危害最大的真菌毒素。
目前，对真菌毒素污染的饲料的脱毒方法主要包括物理法、化学法、吸附法和生物法等。物理和化学脱毒法存在操作困难、效果不稳定、营养成分损失大以及影响饲料适口性等缺点。吸附法虽简单易行，但存在用量大、不够经济，容易引起二次污染等缺点。微生物脱毒法具有作用条件温和，对原料的感官性状、适口性等影响极小、增加原料营养价值等优点，被认为是最佳脱毒方法。生物脱毒作用主要是指降解酶通过酶促反应将毒素转化成低毒或者无毒产物，其中降解酶包括氧化酶如漆酶、锰过氧化物酶和水解酶(如酯酶)等。
生物脱毒技术实现规模化应用的过程中，寻找和筛选能降解真菌毒素的菌株，并对其所产胞外降解酶进行特性研究及对降解酶基因进行克隆和表达，是真菌毒素生物降解研究领域重要的突破点和发展方向。现有漆酶对真菌毒素的降解率普遍较低，因此，如何有效提高漆酶对真菌毒素的降解率是生物脱毒技术的关键所在。
研究表明，漆酶在介体的帮助下能氧化多种难降解的底物。漆酶介体是一类低分子量、低氧化还原电势的化合物，易得失电子，能在漆酶的作用下形成活性高且稳定的中间体，并作用于底物，使其被氧化。目前，常用介体可分为3类：1)合成介体，如：2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、紫脲酸(VIO)、1-羟基苯并三唑(HBT)、2,2’,6,6’-四甲基呱啶氧化物(TEMPO)等；2)天然介体，如：丁香醛(Syringaldehyde，SA)、乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)、乙酰香草酮(Acetovanillone)、对香豆酸(p-coumaric acid)等；3)其他类介体，如多金属氧酸盐(Polyoxometalates，POM)等。但合成介体存在以下缺点：1)稳定性较差；2)价格昂贵；3)有潜在毒性，有些介体氧化后会产生某些毒副产物使酶失活；4)大多数合成介体被氧化后不能再生。上述缺点限制了合成介体的应用。而天然介体不仅来源易、花费少而且对环境友好，更有经济价值，因此获得了越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体。
本发明的再一目的为提供上述介体的应用。
本发明的再一目的在于提供提高漆酶对真菌毒素降解率的方法。
本发明的再一目的在于提供真菌毒素降解剂。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，所述介体包括荆芥水提物。
其中，漆酶BsCotA氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVKRNENVYVKWMNNLPSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWYHDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEKRLKLPSDEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSAPENPSPSLPNPSIVPAFCGETILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINASNTRTYNLSLDNGGDFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIIIDFTAYEGESIILANSAGCGGDVNPETDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQHERIQNIRTLKLAGTQDEYGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKVGTTEIWSIINPTRGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQESGELSYTGPAVPPPPSEKGWKDTIQAHAGEVLRIAATFGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，所述荆芥水提物由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)粉粹荆芥；
(2)以水为提取剂提取荆芥，料液比为33-35g/L，调节pH 8.7-9.3，超声提取；
(3)将步骤(2)提取得到的上清液进行旋转蒸发；
(4)溶解步骤(3)旋转蒸发后产物，进行冷冻干燥，即得荆芥水提物。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，步骤(2)中，在温度45-55℃，功率600-800W条件下，超声提取20-25min。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，步骤(3)中，在温度45-55℃，转速50-60rpm条件下，进行旋转蒸发。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，所述介体为荆芥水提物的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲溶液，缓冲溶液的浓度为50mM，pH为7.0。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其中，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮。
根据本发明具体实施方式的提高漆酶对真菌毒素降解率的方法，所述方法包括将漆酶置于上述介体中降解真菌毒素的步骤。
根据本发明具体实施方式的真菌毒素降解剂，其包括上述介体和漆酶。
本发明的介体能够高效降解真菌毒素、成本低、适用范围广，可广泛用于饲料毒素降解酶领域。
附图说明
图1显示漆酶-荆芥水提物体系对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解作用；
图2显示漆酶-荆芥水提物体系降解黄曲霉毒素B1的HPLC分析结果；
图3显示漆酶-荆芥水提物体系降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株：产枯草芽孢杆菌来源漆酶BsCotA的大肠杆菌工程菌株。
2、生化试剂：黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、丁香酸甲酯；色谱纯乙腈、三氟乙酸、Tris。
3、培养基：
(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
实施例1制备重组漆酶BsCotA
取含有重组质粒的BL21(DE3)/BsCotA大肠杆菌工程菌株，接种于50mL LB培养液中，37℃，220rpm振荡培养12h后，按2％比例转接于300mL LB培养基中，37℃220rpm振荡培养约3h(OD600≈0.6)，加入终浓度1mM的诱导剂IPTG，于16℃诱导15h后，离心收集菌体。将菌体重悬于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(20mM，pH 7.5)中。采取超声破碎法裂解菌体。将破碎后的菌体碎片离心去除，利用Ni亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至Tris-HCl蛋白储存液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl)中。
实施例2制备荆芥水提物介体
2.1将荆芥植株于38℃烘箱烘干4h。将干植株加入粉碎机中进行粉碎，1min/次，共两次。以纯水作为提取剂，料液比33g/L，调节pH8.7左右，温度45℃，功率600W，超声提取20min，离心弃沉淀。将上清转移至圆底烧瓶中，温度45℃，转速50rpm，旋转蒸发。向烧瓶中加入约20mL蒸馏水，混匀后倒入两个50mL离心管中。置于-80℃冷冻2h。冷冻干燥，获得水提物。
配制50mg/mL的荆芥水提物溶液，室温颠倒混匀1h，12000rpm离心5分钟，弃沉淀。
2.2将荆芥植株于40℃烘箱烘干4h。将干植株加入粉碎机中进行粉碎，1min/次，共两次。以纯水作为提取剂，料液比26.7g:800mL，调节pH 9.0左右，温度50℃，功率700W，超声提取25min，离心弃沉淀。将上清转移至圆底烧瓶中，温度50℃，转速58rpm，旋转蒸发。向烧瓶中加入约20mL蒸馏水，混匀后倒入两个50mL离心管中。置于-80℃冷冻2h。冷冻干燥，获得水提物。
配制50mg/mL的荆芥水提物溶液，室温颠倒混匀1h，12000rpm离心5分钟，弃沉淀。
2.3将荆芥植株于42℃烘箱烘干4h。将干植株加入粉碎机中进行粉碎，1min/次，共两次。以纯水作为提取剂，料液比35g/L，调节pH 9.3左右，温度55℃，功率800W，超声提取25min，离心弃沉淀。将上清转移至圆底烧瓶中，温度55℃，转速60rpm，旋转蒸发。向烧瓶中加入约20mL蒸馏水，混匀后倒入两个50mL离心管中。置于-80℃冷冻2h。冷冻干燥，获得水提物。
配制50mg/mL的荆芥水提物溶液，室温颠倒混匀1h，12000rpm离心5分钟，弃沉淀。
实施例3 BsCotA-荆芥水提物介体体系降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/L的母液，按如下反应体系：50mM Tris-HCl(pH 7.0)，20μL黄曲霉毒素B1溶液(50mg/L)，20μL荆芥水提物水溶液(50mg/mL)，20μL BsCotA(300U/L)。以未加入漆酶BsCotA的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，10h后加入三倍体积的乙腈终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相A(0.06％TFA的水)，流动相B(0.05％TFA的乙腈)；梯度洗脱条件0％B洗脱4分钟，0％-100％B洗脱15分钟，100％B洗脱6分钟；检测波长365nm。
结果如图1、图2所示，部分黄曲霉毒素B1已被降解，降解率为47.2％。
漆酶在不添加介体的水和Tris-HCl缓冲液降解体系中，对黄曲霉毒素B1降解率分别为2.5％、8.3％，而添加了荆芥水提物作为介体的体系中，黄曲霉毒素B1的降解率提高了约6-19倍。因此，添加了荆芥水提物介体的体系显著提高了漆酶对黄曲霉毒素B1降解率。
实施例4 BsCotA-荆芥水提物介体体系降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/L的母液，按如下反应体系：50mM Tris-HCl(pH 7.0)，20μL黄曲霉毒素B1溶液(50mg/L)，20μL荆芥水提物水溶液(50mg/mL)，20μL BsCotA(300U/L)。以未加入漆酶BsCotA的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，10h后加入三倍体积的乙腈终止反应，采用高效液相色谱(HPLC)分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Zorbax SB-C18(4.6×250mm,5μm)，流动相A(0.06％TFA的水)，流动相B(0.05％TFA的乙腈)；梯度洗脱条件0％B洗脱4分钟，0％-100％B洗脱15分钟，100％B洗脱6分钟；检测波长316nm。
结果如图1、图3所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，降解率为37.4％。
漆酶在不添加介体的水和Tris-HCl缓冲液降解体系中，对玉米赤霉烯酮降解率分别为1.7％、2.6％，而添加了荆芥水提物作为介体的体系中，玉米赤霉烯酮的降解率提高了约14-22倍。因此，添加了荆芥水提物介体的体系显著提高了漆酶对玉米赤霉烯酮降解率。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 513
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
Met Thr Leu Glu Lys Phe Val Asp Ala Leu Pro Ile Pro Asp Thr Leu
1 5 10 15
Lys Pro Val Gln Gln Ser Lys Glu Lys Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met
20 25 30
Glu Glu Cys Thr His Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu
35 40 45
Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Glu Val Lys Arg
50 55 60
Asn Glu Asn Val Tyr Val Lys Trp Met Asn Asn Leu Pro Ser Thr His
65 70 75 80
Phe Leu Pro Ile Asp His Thr Ile His His Ser Asp Ser Gln His Glu
85 90 95
Glu Pro Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr Pro
100 105 110
Asp Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe Glu
115 120 125
Gln Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Gln
130 135 140
Gln Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu Thr
145 150 155 160
Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His Asp
165 170 175
Pro Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Asp Glu Tyr Asp Val Pro
180 185 190
Leu Leu Ile Thr Asp Arg Thr Ile Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Ala Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asn Pro Ser Ile
210 215 220
Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp
225 230 235 240
Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Val Ile Asn
245 250 255
Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Asn Leu Ser Leu Asp Asn Gly Gly Asp
260 265 270
Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys
275 280 285
Leu Asn Ser Phe Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Ile Ile
290 295 300
Asp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly Glu Ser Ile Ile Leu Ala Asn Ser Ala
305 310 315 320
Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln
325 330 335
Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Ala Gln Lys Asp Glu Ser Arg Lys Pro
340 345 350
Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Ser Val Gln His Glu Arg Ile Gln Asn
355 360 365
Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ala Gly Thr Gln Asp Glu Tyr Gly Arg Pro
370 375 380
Val Leu Leu Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Thr
385 390 395 400
Pro Lys Val Gly Thr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg
405 410 415
Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Arg Val Leu Asp
420 425 430
Arg Arg Pro Phe Asp Ile Ala Arg Tyr Gln Glu Ser Gly Glu Leu Ser
435 440 445
Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys
450 455 460
Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Leu Arg Ile Ala Ala Thr
465 470 475 480
Phe Gly Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu
485 490 495
His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Ile Thr Asp Pro His
500 505 510
Lys

Claims (10)

1.提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，所述介体包括荆芥水提物。
2.根据权利要求1所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，所述荆芥水提物由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)粉粹荆芥；
(2)以水为提取剂提取荆芥，料液比为33-35g/L，调节pH8.7-9.3，超声提取；
(3)将步骤(2)提取得到的上清液进行旋转蒸发；
(4)溶解步骤(3)旋转蒸发后产物，进行冷冻干燥，即得荆芥水提物。
3.根据权利要求2所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，步骤(2)中，在温度45-55℃，功率600-800 W条件下，超声提取20-25min。
4.根据权利要求2所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，步骤(3)中，在温度45-55℃，转速50-60rpm条件下，进行旋转蒸发。
5.根据权利要求1所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，所述介体为荆芥水提物的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，缓冲溶液的浓度为50mM、pH为7.0。
6.根据权利要求1所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮。
7.根据权利要求1所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体，其特征在于，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.提高漆酶对真菌毒素降解率的方法，其特征在于，所述方法包括将漆酶置于权利要求1所述的介体中降解真菌毒素的步骤。
9.真菌毒素降解菌剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的介体和漆酶。
10.权利要求1所述的提高漆酶对真菌毒素降解率的荆芥介体的应用。
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