CN115812893A - 饲料用霉菌毒素降解剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及饲料用霉菌毒素降解剂及其应用，属于农业生物领域。本发明提供了一种可用于饲料中霉菌毒素降解的高效霉菌毒素降解剂。本发明的饲料用霉菌毒素降解剂包括细菌漆酶Lac_P.E.和天然介体，能够高效地降解霉菌毒素，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T‑2毒素，广泛用于饲料中霉菌毒素脱毒。
Description
技术领域
本发明涉及饲料用霉菌毒素降解剂及其应用，属于农业生物领域。
背景技术
霉菌污染已经成为一个全球性问题。霉菌毒素是霉菌生长过程中产生的毒性次级代谢产物，由于气候、地理位置、储存条件等原因，粮食谷物和饲料等极易受多种霉菌毒素污染。目前已知的霉菌毒素有500多种，其中黄曲霉毒素(AF)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，赭曲霉毒素A(OTA)，伏马毒素(FB)，呕吐毒素(DON)、T-2毒素等是各个国家和地区重点关注的。这些霉菌毒素具有致癌、致突变和致畸性，可导致人和动物死亡，且多种霉菌毒素共存的几率大，具有协同毒性，严重威胁畜禽和人类健康。因此，建立一个安全简单的霉菌毒素脱毒方法是一个十分重要的问题。
目前，国内外报道的饲料原料和饲料霉菌脱毒的主要方法有吸附法、物理法、化学法和生物法。吸附法操作简单，但是存在使用量大，需要考虑成本等问题。物理和化学脱毒法在饲料脱毒领域取得一定的进展，但是具有操作复杂、效果波动较大、影响饲料的品质、安全性可能受到影响等缺点。生物脱毒法包括微生物法和酶法，但由于微生物存在毒力因子等有害成份，并且微生物脱毒的本质是通过微生物产生的酶对霉菌毒素进行降解。由于酶法脱毒是指降解酶通过酶促反应将毒素转化成低毒或者无毒产物，因此，酶法脱毒被认为是最佳的霉菌毒素脱毒方法。酶法与上述脱毒法相比，作用条件温和、高效、安全、不易流失营养且环境友好，被认为是最佳的霉菌毒素脱毒方法。
降解酶主要包括氧化酶(如漆酶、锰过氧化物酶)和水解酶(如酯酶)等，，建立酶法降解霉菌毒素的高效降解体系是生物脱毒技术的关键所在。漆酶属于多铜氧化酶家族(MCO)，由于具有宽底物谱、催化氧化过程中不产生任何有毒有害的物质、“绿色环保”等优势，是理想的工业用酶。然而，现有漆酶对霉菌毒素的降解率普遍较低。
漆酶在介体的参与下可以降解多种不同结构的霉菌毒素。介体是一类起电子传递中间体作用的小分子酚类化合物，其本身即为漆酶的底物，能在漆酶的作用下形成活性高且稳定的中间体，参与漆酶对底物的间接氧化。通过漆酶-介体体系，使得漆酶具有更广泛的底物范围和更高效的降解率。
据文献报道，利用漆酶-介体体系进行染料脱色时，介体的效果取决于被处理染料的类型，如白腐菌漆酶能够以HBT作为介体有效降解酸性红。利用云芝漆酶进行农药降解时，不同农药底物也表现出了对介体的选择性，如降解嘧霉胺和异丙隆时，效果最好的介体是紫脲酸，乙酰丁香酮和HBT是降解百菌清和草脱净时效果最佳的介体。由此可见，不同的霉菌毒素也对介体具有选择性，漆酶的适当介体因其降解底物性质的差异而显著不同。因此，寻找高效介体，使漆酶对霉菌毒素的降解率得以提高，是酶法脱毒技术的关键所在。
发明内容
本发明提供饲料用霉菌毒素降解剂，该饲料用霉菌毒素降解剂可以高效低降解饲料中多种霉菌毒素，对饲料霉菌毒素脱毒生物法的研究具有重要意义。
本发明还提供了饲料用霉菌毒素降解剂的应用，该饲料用霉菌毒素降解剂可以高效低降解饲料中的霉菌毒素，可以广泛的用于饲料及其加工副产物中霉菌脱毒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
饲料用霉菌毒素降解剂，包括细菌漆酶Lac_P.E.和天然介体,所述的天然介体为乙酰丁香酮或丁香醛，所述的细菌漆酶Lac_P.E.氨基酸序列如SED ID NO.2所示。
该饲料用霉菌毒素降解剂可以高效低降解饲料中的霉菌毒素，可以广泛的用于饲料及其加工副产物中霉菌脱毒。
优选地，所述的细菌漆酶Lac_P.E.核苷酸序列如SED ID NO.1所示。
优选地，所述的霉菌毒素降解剂为液体剂型，其中细菌漆酶Lac_P.E.的终酶活为1U/mL-3U/mL，介体的用量为1mM。
进一步优选地，天然介体为乙酰丁香酮，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素和/或赭曲霉毒素A和/或T-2毒素。
进一步优选地，天然介体为丁香醛，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或T-2毒素。
饲料用霉菌毒素降解剂的应用，在饲料中霉菌毒素脱毒方面的应用。
饲料用霉菌毒素降解剂可以高效的降解饲料中的霉菌毒素，可以广泛的用于饲料及其加工副产物中霉菌脱毒。
优选地，天然介体为乙酰丁香酮，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素和/或赭曲霉毒素A和/或T-2毒素。
优选地，天然介体为丁香醛，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或T-2毒素。
进一步优选地，降解所述霉菌毒素的反应温度为30℃。
进一步优选地，降解所述霉菌毒素在pH为8的环境中进行。
附图说明
图1为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T-2毒素的降解作用；
图2为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系降解黄曲霉毒素B1的HPLC分析结果；
图3为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果；
图4为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系降解呕吐毒素的HPLC分析结果；
图5为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系降解赭曲霉毒素A的HPLC分析结果；
图6为本发明实施例3中重组普里斯特氏菌来源漆酶-乙酰丁香酮体系降解T-2毒素的HPLC分析结果；
图7为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T-2毒素的降解作用；
图8为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系降解黄曲霉毒素B1的HPLC分析结果；
图9为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果；
图10为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系降解呕吐毒素的HPLC分析结果；
图11为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系降解赭曲霉毒素A的HPLC分析结果；
图12为本发明实施例4中重组普里斯特氏菌来源漆酶-丁香醛体系降解T-2毒素的HPLC分析结果；
图13为本发明对比例1中重组普里斯特氏菌来源漆酶-对香豆酸体系对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T-2毒素的降解作用；
图14为本发明对比例2中重组普里斯特氏菌来源漆酶-阿魏酸体系对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T-2毒素的降解作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
生物材料：
菌株：普里斯特氏菌来源漆酶Lac_P.E.的大肠杆菌工程菌株，本实验室构建。
实验试剂：黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素，购自sigma公司；乙酰丁香酮等其它试剂为国产分析纯。
一、饲料用霉菌毒素降解剂
实施例1
本实施例的饲料用霉菌毒素降解剂包括细菌漆酶Lac_P.E.和天然介体乙酰丁香酮，漆酶Lac_P.E.的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。细菌漆酶Lac_P.E.的制备方法如下：
取含有重组质粒的BL21(DE3)/Lac_P.E.大肠杆菌工程菌株，接种于50mL LB培养液中，37℃，180rpm振荡培养12h后，按1％比例转接于400mL LB培养液中，37℃，180rpm振荡培养约3h(OD600≈0.6)，加入终浓度1mM IPTG和0.5mM CuSO4，16℃诱导16h后，离心收集菌体。将菌体重悬于磷酸盐缓冲液-0.5mM CuSO4(20mM，pH 7.0)中。采取超声破碎法裂解菌体。将破碎后的菌体碎片离心去除，利用Ni亲和层析柱进行纯化，缓冲液为20mM PB，0.5MNaCl，20mM咪唑，PH 7.4，收集电泳纯的洗脱组分。
实施例2
本实施例的饲料用霉菌毒素降解剂包括细菌漆酶Lac_P.E.和天然介体丁香醛，漆酶Lac_P.E.的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。细菌漆酶Lac_P.E.的制备方法如实施例1中所述。
二、饲料用霉菌毒素降解剂在霉菌毒素脱毒方面的应用
实施例3
本实施例的饲料用霉菌毒素降解剂在霉菌毒素脱毒方面的应用，该饲料用霉菌毒素降解剂为实施例1中所述。本发明对Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和、T-2毒素的效率进行检测，具体实施步骤如下：
1、Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL黄曲霉毒素B1溶液(100μg/mL)，10μL乙酰丁香酮溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1mL/min；进样量：10μL；荧光检测器检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm。
结果如图1、图2所示，部分黄曲霉毒素B1已被降解，以乙酰丁香酮作为介体时，降解率为100％，而当体系中未加入乙酰丁香酮时，降解率为16％。由此可知，当降解体系中加入乙酰丁香酮时，实现了黄曲霉毒素B1的全部降解。
2、Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到乙腈中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL玉米赤霉烯酮溶液，10μL乙酰丁香酮溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-甲醇(46:46:8)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝274nm，λem＝440nm。
结果如图1、图3所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，以乙酰丁香酮作为介体时，降解率为79％，而当体系中未加入乙酰丁香酮时，降解率仅为30％。由此可知，当降解体系中加入乙酰丁香酮时，玉米赤霉烯酮的降解率提高了2.7倍，乙酰丁香酮的加入显著提高了漆酶对玉米赤霉烯酮的降解率。
3、Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解呕吐毒素
将呕吐毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：900μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，80μL呕吐毒素溶液，10μL乙酰丁香酮溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析呕吐毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：乙腈-水(10:90)；流速：0.8mL/min；紫外检测器检测波长：218nm。
结果如图1、图4所示，部分呕吐毒素已被降解，以乙酰丁香酮作为介体时，降解率为43％，而当体系中未加入乙酰丁香酮时，降解率仅为34％。由此可知，当降解体系中加入乙酰丁香酮时，呕吐毒素的降解率提高了1.3倍，乙酰丁香酮的加入提高了漆酶对呕吐毒素的降解率。
4、Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解赭曲霉毒素A
将赭曲霉毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL赭曲霉毒素A溶液，10μL乙酰丁香酮溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析赭曲霉毒素A的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-冰乙酸(48:51:1)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝333nm，λem＝460nm。
结果如图1、图5所示，部分赭曲霉毒素A已被降解，以乙酰丁香酮作为介体时，降解率为16％，而当体系中未加入乙酰丁香酮时，赭曲霉毒素A降解率为12％。由此可知，当降解体系中加入乙酰丁香酮时，提高了漆酶Lac_P.E.对赭曲霉毒素A的降解率。
5、Lac_P.E.-乙酰丁香酮体系降解T2毒素
将T-2毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL T-2毒素溶液，10μL乙酰丁香酮溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析T-2毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水(50:50)；流速：1mL/min；紫外检测器检测波长：208nm。
结果如图1、图6所示，部分T-2毒素已被降解，以乙酰丁香酮作为介体时，降解率为21％，而当体系中未加入乙酰丁香酮时，T-2毒素降解率为19％。由此可知，当降解体系中加入乙酰丁香酮时，提高了漆酶对T-2毒素的降解率。
由上述结果可知，当细菌漆酶Lac_P.E.的降解体系中加入乙酰丁香酮，对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和、T-2毒素五种霉菌毒素的降解率均有提高，其中黄曲霉毒素B1的降解率达到100％，玉米赤霉烯酮的降解率提高了2.7倍，呕吐毒素的降解率提高了1.3倍。
实施例4
本实施例的饲料用霉菌毒素降解剂在霉菌毒素脱毒方面的应用，该饲料用霉菌毒素降解剂为实施例2所述。本发明对Lac_P.E.-丁香醛体系降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和、T-2毒素的效率进行检测，具体实施步骤如下：
1、Lac_P.E.-丁香醛体系降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL黄曲霉毒素B1溶液(100μg/mL)，10μL丁香醛溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1mL/min；进样量：10μL；荧光检测器检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm。
结果如图7、图8所示，部分黄曲霉毒素B1已被降解，以丁香醛作为介体时，降解率为99.3％，而当体系中未加入丁香醛时，降解率为16％。由此可知，当降解体系中加入丁香醛时，显著提高了漆酶Lac_P.E.对呕吐毒素的降解率。
2、Lac_P.E.-丁香醛体系降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到乙腈中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL玉米赤霉烯酮溶液，10μL丁香醛溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-甲醇(46:46:8)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝274nm，λem＝440nm。
结果如图7、图9所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，以丁香醛作为介体时，降解率为45％，而当体系中未加入丁香醛时，降解率仅为30％。由此可知，当降解体系中加入丁香醛时，提高了漆酶Lac_P.E.对呕吐毒素的降解率。
3、Lac_P.E.-丁香醛体系降解呕吐毒素
将呕吐毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：900μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，80μL呕吐毒素溶液，10μL丁香醛溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析呕吐毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-AcchromTnature C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：乙腈-水(10:90)；流速：0.8mL/min；紫外检测器检测波长：218nm。
结果如图7、图10所示，部分呕吐毒素已被降解，以丁香醛作为介体时，降解率为28％，而当体系中未加入丁香醛时，降解率仅为34％。由此可知，当降解体系中加入丁香醛时，降低了漆酶Lac_P.E.对呕吐毒素的降解率。
4、Lac_P.E.-丁香醛体系降解赭曲霉毒素A
将赭曲霉毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL赭曲霉毒素A溶液，10μL丁香醛溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析赭曲霉毒素A的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-冰乙酸(48:51:1)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝333nm，λem＝460nm。
结果如图7、图11所示，部分赭曲霉毒素A已被降解，以丁香醛作为介体时，降解率为5.8％，而当体系中未加入丁香醛时，赭曲霉毒素A降解率为12％。由此可知，当降解体系中加入丁香醛时，降低了漆酶Lac_P.E.对赭曲霉毒素A毒素的降解率。
5、Lac_P.E.-丁香醛体系降解T2毒素
将T-2毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL T-2毒素溶液，10μL丁香醛溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析T-2毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水(50:50)；流速：1mL/min；紫外检测器检测波长：208nm。
结果如图7、图12所示，部分T-2毒素已被降解，以丁香醛作为介体时，降解率为24.8％，而当体系中未加入丁香醛时，T-2毒素降解率为19％。由此可知，当降解体系中加入丁香醛时，提高了漆酶Lac_P.E.对T-2毒素的降解率。
综合来看，当细菌漆酶Lac_P.E.的降解体系中加入丁香醛，漆酶Lac_P.E.对黄曲霉毒素B1的降解率有显著提高，对玉米赤霉烯酮和T-2毒素的降解率有一定程度上的提高，对呕吐毒素、赭曲霉毒素A的降解率没有提高，出现抑制的趋势。
不同的霉菌毒素对介体具有选择性，漆酶的适当介体因其降解底物性质的差异而显著不同。本发明针对常用的天然介体同时还构建了Lac_P.E.-对香豆酸体系、Lac_P.E.-阿魏酸体系，并检测其体系降解霉菌毒素的降解率，具体操作说明如下。
对比例1 Lac_P.E.-对香豆酸体系对霉菌毒素的降解作用
1、Lac_P.E.-对香豆酸体系降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL黄曲霉毒素B1溶液(100μg/mL)，10μL对香豆酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1mL/min；进样量：10μL；荧光检测器检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm。
结果如图13所示，部分黄曲霉毒素B1已被降解，以对香豆酸作为介体时，降解率为40％，而当体系中未加入对香豆酸时，降解率为16％。由此可知，当降解体系中加入对香豆酸时，提高了漆酶Lac_P.E.对黄曲霉毒素B1的降解率。
2、Lac_P.E.-对香豆酸体系降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到乙腈中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL玉米赤霉烯酮溶液，10μL对香豆酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-甲醇(46:46:8)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝274nm，λem＝440nm。
结果如图13所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，以对香豆酸作为介体时，降解率为14％，而当体系中未加入对香豆酸时，降解率仅为30％。由此可知，当降解体系中加入对香豆酸时，降低了漆酶Lac_P.E.对玉米赤霉烯酮的降解率。
3、Lac_P.E.-对香豆酸体系降解呕吐毒素
将呕吐毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：900μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，80μL呕吐毒素溶液，10μL对香豆酸溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析呕吐毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-AcchromTnature C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：乙腈-水(10:90)；流速：0.8mL/min；紫外检测器检测波长：218nm。
结果如图13所示，部分呕吐毒素已被降解，以对香豆酸作为介体时，降解率为0，而当体系中未加入丁香醛时，降解率仅为34％。由此可知，当降解体系中加入对香豆酸时，漆酶Lac_P.E.不能降解呕吐毒素。
4、Lac_P.E.-对香豆酸体系降解赭曲霉毒素A
将赭曲霉毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL赭曲霉毒素A溶液，10μL对香豆酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析赭曲霉毒素A的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-冰乙酸(48:51:1)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝333nm，λem＝460nm。
结果如图13所示，部分赭曲霉毒素A已被降解，以对香豆酸作为介体时，降解率为8％，而当体系中未加入对香豆酸时，赭曲霉毒素A降解率为12％。由此可知，当降解体系中加入对香豆酸时，降低了漆酶Lac_P.E.对赭曲霉毒素A的降解率。
5、Lac_P.E.-对香豆酸体系降解T2毒素
将T-2毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL T-2毒素溶液，10μL对香豆酸溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析T-2毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水(50:50)；流速：1mL/min；紫外检测器检测波长：208nm。
结果如图13所示，部分T-2毒素已被降解，以对香豆酸作为介体时，降解率为21％，而当体系中未加入对香豆酸时，T-2毒素降解率为19％。由此可知，当降解体系中加入对香豆酸时，提高了漆酶Lac_P.E.对T-2毒素的降解率。
综合来看，当细菌漆酶Lac_P.E.的降解体系中加入对香豆酸，漆酶Lac_P.E.对黄曲霉毒素B1和T-2毒素的降解率有一定程度上的提高，对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A降解出现抑制的趋势，对呕吐毒素完全没有降解作用，说明对香豆酸作为漆酶Lac_P.E.介体的效果不如乙酰丁香酮和丁香醛。
对比例2 Lac_P.E.-阿魏酸体系对霉菌毒素的降解作用
1、Lac_P.E.-阿魏酸体系降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL黄曲霉毒素B1溶液(100μg/mL)，10μL阿魏酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1mL/min；进样量：10μL；荧光检测器检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm。
结果如图14所示，部分黄曲霉毒素B1已被降解，以阿魏酸作为介体时，降解率为54％，而当体系中未加入阿魏酸时，降解率为16％。由此可知，当降解体系中加入阿魏酸，提高了漆酶Lac_P.E.对黄曲霉毒素B1的降解率。
2、Lac_P.E.-阿魏酸体系降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到乙腈中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL玉米赤霉烯酮溶液，10μL阿魏酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-甲醇(46:46:8)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝274nm，λem＝440nm。
结果如图14所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，以阿魏酸作为介体时，降解率为31％，而当体系中未加入阿魏酸时，降解率仅为30％。由此可知，当降解体系中加入阿魏酸时，漆酶Lac_P.E.对玉米赤霉烯酮的降解率影响不大。
3、Lac_P.E.-阿魏酸体系降解呕吐毒素
将呕吐毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：900μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，80μL呕吐毒素溶液，10μL阿魏酸溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析呕吐毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290 HPLC高效液相色谱分析系统，色谱柱为Waters-AcchromTnature C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：乙腈-水(10:90)；流速：0.8mL/min；紫外检测器检测波长：218nm。
结果如图14所示，部分呕吐毒素已被降解，以阿魏酸作为介体时，降解率为0，而当体系中未加入阿魏酸时，降解率仅为34％。由此可知，当降解体系中加入阿魏酸时，漆酶Lac_P.E.不能降解呕吐毒素。
4、Lac_P.E.-阿魏酸体系降解赭曲霉毒素A
将赭曲霉毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：970μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，10μL赭曲霉毒素A溶液，10μL阿魏酸溶液(100mM)，10μL Lac_P.E.(终酶活1U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析赭曲霉毒素A的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水-冰乙酸(48:51:1)；流速：1mL/min；荧光检测器检测波长：λex＝333nm，λem＝460nm。
结果如图14所示，部分赭曲霉毒素A已被降解，以阿魏酸作为介体时，降解率为0，而当体系中未加入阿魏酸时，赭曲霉毒素A降解率为12％。由此可知，当降解体系中加入阿魏酸时，漆酶Lac_P.E.不能赭曲霉毒素A。
5、Lac_P.E.-阿魏酸体系降解T2毒素
将T-2毒素溶解到甲醇中配制成100μg/mL的母液，按如下1000μL反应体系进行实验：940μL Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)，40μL T-2毒素溶液，10μL阿魏酸溶液(100mM)，10μLLac_P.E.(终酶活3U/mL)。以未加入漆酶Lac_P.E.的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行24h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析T-2毒素的降解率。液相色谱为Agilent 1290HPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters-Acchrom Tnature C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙腈-水(50:50)；流速：1mL/min；紫外检测器检测波长：208nm。
结果如图14所示，部分T-2毒素已被降解，以阿魏酸作为介体时，降解率为20％，而当体系中未加入阿魏酸时，T-2毒素降解率为19％。由此可知，当降解体系中加入阿魏酸时，漆酶Lac_P.E.对T2毒素的降解率影响不大。
综合来看，当细菌漆酶Lac_P.E.的降解体系中加入阿魏酸，漆酶Lac_P.E.对黄曲霉毒素B1的降解率有一定程度上的提高，对玉米赤霉烯酮和T-2毒素的降解率影响不大，对呕吐毒素和赭曲霉毒素A完全没有降解作用，说明对香豆酸作为漆酶Lac_P.E.介体的效果不如乙酰丁香酮和丁香醛。
综上所述，对香豆酸和阿魏酸作为漆酶Lac_P.E.的介体，降解曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A和T-2毒素的效果均不如乙酰丁香酮、丁香醛作为漆酶Lac_P.E.的介体。
Claims (10)
1.饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：所述的霉菌毒素降解剂包括细菌漆酶Lac_P.E.和天然介体；所述的天然介体为乙酰丁香酮和/或丁香醛；所述的细菌漆酶Lac_P.E.的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：所述的细菌漆酶Lac_P.E.核苷酸序列如SED ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：所述的霉菌毒素降解剂为液体剂型，其中细菌漆酶Lac_P.E.的终酶活为1U/mL-3U/mL，介体的用量为1mM。
4.如权利要求3所述的饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：天然介体为乙酰丁香酮，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素和/或赭曲霉毒素A和/或T-2毒素。
5.如权利要求3所述的饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：天然介体为丁香醛，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或T-2毒素。
6.如权利要求1所述饲料用霉菌毒素降解剂，其特征在于：在饲料中霉菌毒素脱毒方面的应用。
7.如权利要求6所述的饲料用霉菌毒素降解剂的应用，其特征在于：天然介体为乙酰丁香酮，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素和/或赭曲霉毒素A和/或T-2毒素。
8.如权利要求6所述的饲料用霉菌毒素降解剂的应用，其特征在于：天然介体为丁香醛，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮和/或T-2毒素。
9.如权利要求7或8所述的饲料用霉菌毒素降解剂的应用，其特征在于：降解所述霉菌毒素的反应温度为30℃。
10.如权利要求7或8所述的饲料用霉菌毒素降解剂的应用，其特征在于：降解所述霉菌毒素在pH为8的环境中进行。
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