CN104561063A

CN104561063A - 一种牛肠激酶的cDNA片段、高效表达重组质粒及其基因工程菌和表达方法

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Publication number: CN104561063A
Application number: CN201510039882.7A
Authority: CN
Inventors: 周晓雷; 董力; 张世光; 朱重悦; 邹卫; 黄岩; 段普凡
Original assignee: HEBEI BAIAO BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd; Hebei University of Science and Technology
Current assignee: HEBEI BAIAO BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd; Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明涉及一种牛肠激酶的cDNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.4；发明还涉及该cDNA片段构建的重组质粒和基因工程菌，另外还涉及上述基因工程菌的表达方法。发明对ekl基因的密码子进行优化，优化后的ekl基因片段可以实现甲醇酵母对EKL基因的高效表达。发明在ekl基因序列的C末端插入了组氨酸标签，以利于对目标蛋白的纯化。发明对甲醇酵母的表达条件进行了优化，可以使重组的基因工程菌表达牛肠激酶的量再增加1倍，进一步提高发酵效率，提高牛肠激酶的生产能力。

Description

一种牛肠激酶的cDNA片段、高效表达重组质粒及其基因工程菌和表达方法

技术领域

本发明涉及牛肠激酶真核表达，具体涉及牛肠激酶的的重组质粒、基因工程菌及其表达方法。

背景技术

近年来国内外学者对重组肠激酶（Enterokinase，EK）进行了研究，所做的尝试多是克隆与表达具有酶学活性的235个氨基酸的肠激酶轻链（EKL）。2002年Yuan等运用被Lavallie等认为不能有效表达具有生物活性肠激酶轻链的Trx融合表达体系，在大肠杆菌中表达了重组牛肠激酶轻链。与之相似，Gasparian等在2003年运用肠Trx融合表达体系在大肠杆菌中融合表达了人肠激酶轻链，但发现可溶性融合产物没有切割活性，只有通过包涵体复性的方法才能恢复活性。2003年，Huang等从中国北方黄牛的十二指肠组织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增得到肠激酶轻链cDNA，通过DsbA融合体系在大肠杆菌中进行了表达，纯化后的融合蛋白具有酶切活性。1996年，Vozza等首先报道了用甲醇酵母pich pastoris作为宿主菌制备肠激酶轻链的方法，经过分泌表达和离子交换层析与亲和层析后，从发酵上清液中得到了具有活性的目标蛋白。2001年，Choi等在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae系统中尝试了牛肠激酶轻链的分泌表达，并将His亲和标记引入蛋白C端，发酵上清液经过亲和层析纯化，活性目标蛋白产量达到1mg/ml。在融合蛋白的酶切反应中，他们还发现由于肠激酶的自身特性而导致被切蛋白降解的现象。2006年，李德华等在pich pastoris表达系统中构建了重组牛肠激酶轻链工程菌，并进行了高密度发酵、纯化及活性鉴定等方法的研究。

低表达量和昂贵的分离纯化成本是当今制约肠激酶大规模生产和应用的主要原因。目前只有少数几个实验室能够制备基因工程牛肠激酶，但表达量都较低。巴斯德毕赤酵母作为一类简单的真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物可对表达的蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，非常有利于基因的表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达牛肠激酶的方法，其是通过将目的基因进行优化后转入酵母表达细胞进行高效表达，并进行高密度发酵和纯化，最终得到可用于工业化生产和应用的重组肠激酶轻链。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明高效表达牛肠激酶的cDNA片段序列为SEQ ID No.4。

本发明高效表达牛肠激酶的cDNA片段C末端还设置有his标签的编码序列。

本发明高效表达牛肠激酶的重组质粒为pPICZαA/ekl表达质粒，其中ekl的编码序列为SEQ ID No.4。

本发明高效表达牛肠激酶的基因工程菌为转染有pPICZαA/ekl表达质粒的甲醇酵母，所述表达质粒中ekl的cDNA序列为SEQ ID No.4。

本发明高效表达牛肠激酶的基因工程菌为毕赤酵母。

本发明高效表达牛肠激酶的表达方法，使用上述基因工程菌进行表达，表达质粒为pPICZαA/ekl表达质粒的甲醇酵母，所述表达质粒中ekl的cDNA序列为SEQ ID No.4。

本发明高效表达牛肠激酶的表达方法中培养所述基因工程菌的培养基中甘油的质量比为0.1%~0.5%，甲醇的的质量比为0.3~1.0%，培养基的pH为3~6。

本发明高效表达牛肠激酶的表达方法中培养所述基因工程菌的培养基中甘油的质量比为0. 5%，甲醇的的质量比为0.5%，培养基的pH为5。

本发明对ekl基因的密码子进行优化，优化后的ekl基因片段可以实现甲醇酵母对EKL基因的高效表达。本发明在ekl基因序列的C末端插入了组氨酸标签，以利于对目标蛋白的纯化。本发明对甲醇酵母的表达条件进行了优化，可以使重组的基因工程菌表达牛肠激酶的量再增加1倍，进一步提高发酵效率，提高牛肠激酶的生产能力。

附图说明

附图1为pPICZaA/ekl双酶切的凝胶电泳图；

附图2为不同重组酵母菌株培养上清液的酶切活性检测结果；

附图3为Western Blot检测培养重组酵母菌上清液中rEKL表达的实验结果；

附图4为rEKL Ni亲和层析纯化结果；

附图5为不同EKL表达序列构建的表达菌株发酵不同时间的菌密度检测结果；

附图6为不同EKL表达序列构建的表达菌株发酵不同时间EKL表达量检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细的说明。

本发明所使用的培养基如下：

YPD培养基：1%酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖。

BMGY培养基：1.34% YNB ( Invitrogen) ，4 xl0^-5 %生物素，1%甘油，1% 酵母提取物，2 % 蛋白胨，100 mmol/L PB ，pH6.0。

BMMY培养基：1.34% YNB ( Invitrogen)，4 x10^-5%生物素，1% 酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L PB， pH6.0，0.5 %甲醇。

FM22培养基：每升 FM22培养基包含：42.9 g H₂PO₄，5g (NH₄)₂SO₄， 1.0 g CaSO₄•2H₂O，14.3g K₂SO₄，11.7 g MgSO₄•7H₂O，40g 甘油，pH4.5。

微量元素 PMT4：2.0 g CuSO₄•5H₂O，0.08 g NaI，3.0 g MnSO₄•H₂O，0.2 g Na₂MoO₄•2H₂O， 0.02 g H₃BO₃，0.5 g CaSO₄•2H₂O，0.5 g CoC1₂，7 g ZnCl₂，22 g FeSO₄•7H₂O，0.2 g biotin， l mL conc.H₂SO₄）用于发酵时的添加物。

实施例1 牛肠激酶cDNA密码子序列的优化

EKL的氨基酸序列为SEQ ID No.1，原cDNA编码序列为SEQ ID No.2，经过优化后，设计三个EKL的编码序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。为便于后期的载体构建，在各片段的5’端增加XhoⅠ酶切位点，在3'端增加 NotⅠ酶切位点。

原序列及优化后的序列均委托Invitrogen全序列DNA合成，并插入到pMD18-T simple载体中。

实施例2 pPICZαA/ekl的构建

用Xhol /NotI双酶切pMD18-T/EKL质粒及pPICZαA质粒，经1%的Agarose 电泳，用E.Z.N.A. Gel extraction kit 进行胶回收，获取 EKL DNA 片段和pPICZαA载体片段。其中pPICZαA质粒购自Invitrogen。

通过T4 DNA连接酶，将载体 pPICZαA(XhoI/NotI)片段和 DNA 片段 EKL(XhoI/NotI)按照摩尔比为1:5的比例进行连接，构建pPICZαA/ekl表达载体。

构建完成的pPICZaA/ekl质粒转化DH5α大肠杆菌，涂布Zeocin+ LB平板，筛选阳性克隆。阳性克隆菌落扩大培养后，利用质粒抽提试剂盒提取pPICZαA/ekl质粒。附图1中1为Marker；2为pPICZaA/ekl质粒；3为经XhoI/NotI双酶的pPICZaA/EKL质粒，结果显示经XhoI/NotI双酶切后，1%的Agarose 电泳可见740bp EKL基因片段及约3000bp的pPICZαA载体片段。pPICZαA/EKL表达载体构建正确。所述的质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实施例3 基因工程菌的构建

用SacI 酶切上述步骤中制备的表达载体pPICZαA/ekl，使其线性化，有利于其在毕赤酵母细胞内基因组DNA的aoxl基因位点进行同源重组。

从YPD平板上挑取毕赤酵母GS115单菌落，接种于5ml YPD培养液中，30℃振荡培养过夜，次日取50μl转接于50ml YPD培养液中，30℃培养至OD₆₀₀=1.1-1.3，菌液分装于50ml的离心管中，1500r/m 4℃离心5min，弃上清，加入50ml无菌预冷去离子水，枪吹打重悬。重复离心一次，再加入25ml无菌去离子水，重悬菌体，1500r/m 4℃离心5min，再加入2ml 1M山梨醇重悬酵母细胞，离心，弃上清，重复2次。最后将酵母细胞重悬于1ml山梨醇中，置于冰上待用，制得酵母感受态细胞。其中所述毕赤酵母GS115购自中国典型培养物保藏中心。

取上述制备的酵母感受态细胞与约10μl（约30μg）线性化pPICZαA/ekl质粒混匀，加入到预冷的0.2cm的电击杯底部，冰浴中放置5min。调节电转仪的参数，尝试2000V和1500V两种电压，电击时间控制在4ms以上，电击一次。电击后，立刻加入冰冷的1mol/L山梨醇1ml，吹打均匀。吸200～600μl涂布于含有Zeocin 100μg/ml 的YPDS平板培养基，共涂布7块平板。30℃培养2-3天，直到有单菌落长出。每块平板上挑取10个单菌落于含有Zeocin 500ng/ml的YPDS平板培养基上继续筛选培养，筛选获得单克隆酵母菌rEKL₁~ rEKL₇。

将上述步骤获得的单克隆酵母菌rEKL₁~ rEKL₇接种于25ml BMGY 培养基，30℃，250rpm培养16-18小时。待OD₆₀₀达到2-6，3000rpm 离心5分钟，去掉上清。重悬于BMMY培养基，使OD₆₀₀达到1。并于1L的培养瓶中30℃、250rpm继续培养。每隔24小时加入100%的甲醇，终浓度为0.5%，每次加甲醇前取lml 培养基于1.5ml的离心管。其时间点为（小时）：0、24、48、72、96。

分别取重组酵母菌rEKL₁~ rEKL₇的96h培养液的上清20μl，分别加入 1ml Tag-SA (1mg/m1)融合蛋白溶液，20mM 的磷酸缓冲液，pH7.4，37°C 酶解反应16 小时，然后取酶解产物进行12% SDS-PAGE 电泳，如图2所示，其中第1列（最左端为第1列）为显示不同氨基酸片段大小的Marker，第2列为阴性对照，第3~9列分别显示重组酵母菌rEKL₁~ rEKL₇的培养液酶解Tag-SA的结果。其中rEKL₄~ rEKL₇的酶切活性优于rEKL₁~ rEKL₃。

取重组酵母菌rEKL₇的表达上清液25ml，加入25ml丙酮沉淀蛋白，离心后让丙酮完全挥发，加入500μl PBS缓冲液，500μl的2x上样缓冲液，充分混匀，放在100℃沸水中煮5分钟后，进行12% SDS-PAGE常规电泳。利用Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell进行常规湿转，将蛋白样品转移至PVDF膜。随后利用小鼠抗EKL蛋白的多克隆抗体以及碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG检测酵母表达的EKL。结果可检测到~46kD处特异性蛋白条带，且蛋白量随培养时间延长而增加，具体结果如图3所示，其中1为培养0h上清；2为培养24h上清；3为培养48h上清；4为培养72h上清；5为培养96h上清。

实施例4 rEKL的纯化

EKL的C端设计有His-tag，其纯化可以采用Ni亲和（Ni Sepharose™ 6 Fast Flow）层析法纯化。具体过程及结果如下：发酵上清液，用0.22μm膜过滤后进行上样。随后用200mM咪唑，20mMTris，pH8.0溶液进行洗脱，收集洗脱液，可得到90%纯度的 rEKL。经超滤(截留分子量8kD)浓缩，并将缓冲液置换为pH8.0，20 mmol/L PB 溶液，加入等体积的甘油即为 rEKL 样品，放-20℃长期保存。电泳检测纯化结果如图4所示，其中1为发酵上清液；2为Ni亲和层析流穿液；3-4为200mM 咪唑洗脱得到90%纯度rEKL；5为Marker。

实施例5 EKL的表达

将SEQ ID No.2~5的相关表达质粒转染毕赤酵母后，进行高密度发酵72h，检测酵母的 OD600以及EKL的表达量。不同发酵时间下不同表达菌株的菌体密度如图5所示，EKL的表达量如图6所示，检测结果如表1所示。经检测，EKL原表达序列SEQ ID No.2 构建的表达菌株72h结束发酵时，OD600为310。相同发酵条件下，而优化序列SEQ ID No.4构建的表达菌株72h结束发酵时OD600达到了400，EKL的表达量为9.50 mg/L，明显高于原序列的EKL表达量6.69 mg/L。优化序列SEQ ID No.4的表达量明显高于原始序列，及其它两个优化序列。

表1

实施例6~21 重组酵母菌表达条件的优化

以FM22 培养基进行发酵罐的高密度发酵，并优化重组酵母菌的表达条件，分别控制培养基pH3~6，甘油含量0.1~0.5%，甲醇含量0.3~1.0%，检测重组酵母在上述条件下发酵时，牛肠激酶的产量。检测结果如表2所示。

表2

如上表所示，本发明制备的重组酵母菌在培养基pH3~6，甘油含量0.1~0.5%，甲醇含量0.3~1.0%的培养条件下，均可高效的表达牛肠激酶，其表达量高于4 mg/L，远远高于现有技术中重组载体对牛肠激酶的表达量。进一步的，当优化培养条件为ph5，甲醇含量0.5%，甘油含量0.5%时重组酵母菌对牛肠激酶的表达量最高，为优选的表达条件。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北百奥生物制品有限公司

<120> 一种高效表达牛肠激酶的cDNA片段、重组质粒及其基因工程菌和表达方法

<130> 2014

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met

35 40 45

Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met

85 90 95

His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys

100 105 110

Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile

115 120 125

Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu

165 170 175

Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met

180 185 190

Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly

195 200 205

Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro

210 215 220

Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

225 230 235

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60

gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120

cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180

atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240

aacccacact acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300

aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360

cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac ttatatatca aggttctact 420

gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480

atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta 540

gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600

ctggctggcg tgacatcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660

gcccgggtgc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacat 705

<210> 3

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcattgtgg gaggttctga ctcaagagag ggtgcatggc catgggttgt cgccttgtat 60

ttcgatgacc aacaagtttg tggcgcttca cttgtgtcca gagattggct tgtctcagct 120

gctcattgtg tatatggtag aaacatggag ccttctaagt ggaaagctgt tctaggattg 180

cacatggctt ccaacctaac ttcaccccag atcgaaacta ggttgattga ccagattgtc 240

attaatccac attataataa aaggcgaaag aacaatgaca ttgctatgat gcatcttgag 300

atgaaagtta actatactga ttacatacaa cctatctgtt tgccagaaga aaaccaagtt 360

ttccctccag gcagaatttg tagtattgct ggttggggtg ccttgattta tcaaggctcc 420

acggctgatg tactgcaaga ggccgacgta cccttattga gtaacgaaaa gtgccaacaa 480

caaatgccag agtacaatat cactgaaaat atggtttgcg ccggatacga ggcaggaggt 540

gtcgattcat gtcaggggga cagtggaggg ccattaatgt gccaggagaa taatagatgg 600

ttattagctg gagttacgtc attcggatac caatgtgcac ttccaaatcg acccggcgtc 660

tacgctagag tcccaagatt tacagagtgg atccagtcat tcttgcat 708

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttattgttg gtggtagtga cagtcgagag ggtgcctggc catgggtcgt cgccttatac 60

ttcgatgatc aacaggtgtg cggtgctagt ttggtgtcta gagattggtt ggtttccgcc 120

gcccactgcg tttatggaag aaatatggaa ccctctaagt ggaaggcagt tttgggtttg 180

cacatggctt ctaatcttac ttcaccacaa attgaaacac gattgattga tcagatcgtt 240

attaaccccc attataataa aaggagaaaa aataacgaca ttgctatgat gcaccttgag 300

atgaaggtga attacactga ctatatccag ccaatttgcc tgcctgaaga aaaccaagtt 360

tttccccccg gtagaatttg ttctatcgcc ggttggggag ctctgatcta ccaaggttcc 420

actgctgacg tacttcaaga ggcagacgtc ccacttctgt ctaatgaaaa atgtcaacaa 480

caaatgccag aatacaatat cacggagaac atggtttgcg ccggttatga ggctggaggc 540

gtagattctt gtcaagggga ttctggtggt ccattgatgt gccaggaaaa caacagatgg 600

ctgctagccg gtgtaacttc ttttggttat cagtgtgcct tgccaaaccg tccaggtgtt 660

tacgctcgtg ttccacgttt cactgaatgg attcaatcct ttttgcat 708

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttatagttg gtggaagtga ctccagggaa ggtgcttggc catgggtcgt tgctctttac 60

tttgacgacc agcaggtgtg cggcgcctca ttagtcagta gggactggtt ggtttcagcc 120

gctcactgtg tttatggaag aaatatggag ccctctaaat ggaaggccgt attaggtctg 180

catatggctt ctaatttgac ttcccctcag attgagacaa gattgataga tcaaattgtg 240

attaatccac actacaacaa gagacgtaag aacaacgaca tagccatgat gcaccttgaa 300

atgaaagtaa actacacgga ctatatccag cctatatgct tacctgagga gaaccaagtg 360

ttcccacctg gtagaatttg ttcaatcgct ggttggggag ccctaatata ccagggatct 420

accgctgacg tactgcagga agctgatgtt ccattattat ctaacgaaaa atgtcagcaa 480

caaatgcctg aatacaacat cactgaaaac atggtttgtg caggctacga ggccggaggt 540

gttgattctt gtcaaggaga ttctggagga cctttgatgt gtcaggagaa taatcgatgg 600

ttacttgctg gtgtcacatc atttggctac caatgtgctc taccaaatag accaggagtg 660

tatgcaagag tacctcgttt tactgaatgg atccagtcct ttttacac 708

Claims

1.一种牛肠激酶的cDNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的一种牛肠激酶的cDNA片段，其特征在于其C末端还设置有his标签的编码序列。

3.一种高效表达牛肠激酶的重组质粒，其特征在于其为pPICZαA/ekl表达质粒，其中ekl的编码序列为SEQ ID No.4。

4.一种高效表达牛肠激酶的基因工程菌，其特征在于其为转染有pPICZαA/ekl表达质粒的甲醇酵母，所述表达质粒中ekl的cDNA序列为SEQ ID No.4。

5.根据权利要求4所述的一种高效表达牛肠激酶的基因工程菌，其特征在于所述的甲醇酵母为毕赤酵母。

6.一种高效表达牛肠激酶的表达方法，其特征在于使用如权利要求4或5所述的基因工程菌进行表达，表达质粒为pPICZαA/ekl表达质粒的甲醇酵母，所述表达质粒中ekl的cDNA序列为SEQ ID No.4。

7.根据权利要求6所述的一种高效表达牛肠激酶的表达方法，其特征在于培养所述基因工程菌的培养基中甘油的质量比为0.1%~0.5%，甲醇的的质量比为0.3~1.0%，培养基的pH为3~6。

8.根据权利要求7所述的一种高效表达牛肠激酶的表达方法，其特征在于培养所述基因工程菌的培养基中甘油的质量比为0. 5%，甲醇的的质量比为0.5%，培养基的pH为5。