CN111197041A - 制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途 - Google Patents
制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。本发明的方法包括下述步骤：形成包括编码融合标签msyB的多核苷酸和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的表达载体；将所述表达载体转化至宿主菌中，得到转化的宿主菌；培养所述转化的宿主菌，使其表达包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基；将所述包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基分离和纯化；和将纯化后的包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基进行酶切，得到所述青鳉鱼肠激酶活性亚基。本发明的肠激酶活性亚基具有提高的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。具体而言，本发明涉及在宿主菌中制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途。
背景技术
肠激酶(Enteropeptidase，EK，EC3.4.4.8)是一类广泛使用的工具酶。天然肠激酶是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。在体内激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联[1-2]。肠激酶分子量为150KDa，并且由1条115KDa的重链和1条35KDa的轻链组成。重链和轻链通过1个分子间二硫键结合。轻链是活性亚基，特异性识别DDDDK序列。因此，工业上常用的肠激酶为基因工程方法表达的肠激酶轻链活性亚基。同时，肠激酶是一类非常倾向于聚集的蛋白。肠激酶难以表达，容易在细胞内形成包涵体形式。但是，包涵体复性存在问题，其效率仅为2％[3]。另外，虽然肠激酶特异性识别DDDDK序列，但是大量的研究表明，实际酶切反应中很易产生非特异性酶切。例如，在酶切大肠杆菌硫氧还蛋白-重组人生长激素融合蛋白(Trx-rhGH)时，因非特异性酶切而产生生长激素Nick蛋白，其对后续分离、目的蛋白产率甚至产品稳定性都带来较大影响。
因此，本领域亟需能够在宿主菌中可溶性表达，并且具有提高的特异性的肠激酶。
发明内容
为了解决上述问题，满足能够在宿主菌中可溶性表达，并且具有提高的特异性的肠激酶的需求，本发明人成功开发了一种能够在宿主菌中可溶性表达并且具有高特异性的青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法。
在一个方面中，本发明提供了一种制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法，所述方法包括下述步骤：
形成包括编码融合标签msyB的多核苷酸和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的表达载体；
将所述表达载体转化至宿主菌中，得到转化的宿主菌；
培养所述转化的宿主菌，使其表达包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基；
将所述包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基分离和纯化；和
将纯化后的包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基进行酶切，得到所述青鳉鱼肠激酶活性亚基。
通过上述方法解决了青鳉鱼肠激酶活性亚基可溶性表达和特异性的问题。
其中所述表达载体进一步包括纯化标签，优选地，所述纯化标签为6His。
6His标签利于融合蛋白的纯化。
其中所述6His在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间。
本发明人意外地发现，6His在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间时，所得青鳉鱼肠激酶活性亚基具有高的酶切特异性。
其中所述编码融合标签msyB的多核苷酸的序列如SEQ ID No:1中所示，并且所述融合标签msyB的氨基酸的序列如SEQ ID No:4中所示；
其中所述编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的序列如SEQ ID No:2中所示，并且所述青鳉鱼肠激酶活性亚基的氨基酸的序列如SEQ ID No:5中所示。
其中所述载体为pET-28a、pET-28b或pET-28c。
其中所述宿主菌为带λDE3的溶源菌，优选大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
其中所述酶切用肠激酶进行，优选地，所述肠激酶选自牛肠激酶或青鳉鱼肠激酶。
在另一方面中，本发明提供了根据本发明的方法制备的青鳉鱼肠激酶活性亚基。
在另一方面中，本发明提供了根据本发明的方法制备的青鳉鱼肠激酶活性亚基在特异性酶切具有DDDDK序列的蛋白质中的用途，优选地，所述具有DDDDK序列的蛋白质为Trx-rhGH融合蛋白。
在另一方面中，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合标签msyB、接头和青鳉鱼肠激酶活性亚基，优选地，接头包含6His标签，更优选地，接头在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间，最优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID No:10中所示的氨基酸序列。
根据本发明的方法，能够以高表达量、低成本和可溶性表达来获得青鳉鱼肠激酶活性亚基。获得的青鳉鱼肠激酶活性亚基可对具有DDDDK序列的蛋白质，比如Trx-rhGH融合蛋白等进行特异性酶切，而不产生Nick蛋白等非特异性酶切产物。
附图说明
下面将参考附图，更详细地描述本发明的实施方式，其中：
图1显示了根据本发明的实施方式的经接头连接的编码融合标签msyB的多核苷酸与编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的示意图；
图2显示了根据本发明的实施方式的载体pET-28b的示意图；
图3显示了根据本发明的实施方式的msyB-接头-MEKL蛋白和6His-msyB-MEKL蛋白的电泳图；
图4显示了根据本发明的实施方式的分离和纯化青鳉鱼肠激酶活性亚基的工艺流程图；
图5显示了根据本发明的实施方式的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白和6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL的电泳图；
图6显示了根据本发明的实施方式直接表达青鳉鱼肠激酶活性亚基(包涵体)的电泳图；
图7显示了根据本发明的实施方式的纯化的青鳉鱼肠激酶活性亚基以及牛肠激酶在4℃下切割Trx-rhGH融合蛋白的电泳图；
图8显示了根据本发明的实施方式的纯化的青鳉鱼肠激酶活性亚基以及牛肠激酶在37℃下切割Trx-rhGH融合蛋白的电泳图；
图9显示了根据本发明的实施方式的纯化的青鳉鱼肠激酶活性亚基以及牛肠激酶切割rhGH蛋白的电泳图。
具体实施方式
工业上，肠激酶的生产主要存在可溶性表达和酶切特异性两方面的难题。
就可溶性表达方面而言，肠激酶直接表达时倾向于在细胞内聚集，即使通过氨基酸突变或添加常用增加溶解性的融合标签，如TrxA、MBP、DsbA、NusA和SUMO等也不易溶解或表达量低，大多以包涵体形式存在。Gasparian等人[3]在大肠杆菌中表达了添加了硫氧还蛋白融合标签的人肠激酶Trx-hEKL，包涵体复性效率仅2％。Simeonov等人[4]通过氨基酸突变改变人肠激酶表面电荷以提高溶解性，但是表达量不高，方法难以推广。采用可溶性形式的肠激酶一般在酵母菌表达，但是目前可溶性表达的水平难以达到工业化生产要求。Choi等人[5]使用人IL-1β的N端序列作为分泌头，在啤酒酵母中表达了C端带His标签的牛肠激酶活性亚基，bEKL。Smith等人[6]在毕赤酵母Pichia pastoris中表达了人肠激酶活性亚基，hEKL，表达量为1.7mg/L。因此，增加肠激酶的产率是一个亟待解决的问题，而表达水平是影响产量的决定因素。Su及Zou等人[7-8]研究了大肠杆菌来源的超酸性蛋白多肽msyB可以增加难溶性蛋白，如bEK、绿色荧光蛋白(GFP)、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、rbcL的溶解性。虽然融合标签msyB具有助溶效果，但是Nomine等人[9]报道了在很多情况下，一些所谓助溶的融合标签影响目的蛋白的正确折叠，导致蛋白活性和功能改变或丧失。此外，用于可溶性表达的融合标签有很多种，但是，对于不同的蛋白质，并不能确定哪一种融合标签能得到可溶性表达的目的蛋白[14]。
就特异性方面，肠激酶虽然特异性识别DDDDK序列，但是Light等人[10]在1980年就证明了只要在P2位是酸性氨基酸，如Glu、Asp，P1位为碱性氨基酸，如Lys、Arg，肠激酶均可以识别。而且在P3至P5位，酸性氨基酸越多，水解效率越高。Gasparian等人[11]将DDDDK中的Lys替换为Arg后，肠激酶酶活提高了3至6倍。
牛肠激酶是用于酶切融合蛋白如Trx-rhGH融合蛋白(其氨基酸序列见SEQ ID No:7)的常用工具酶。用牛肠激酶(0.1至0.5IU/mg，4至37℃，2至24小时)酶切Trx-rhGH融合蛋白，将产生特异性酶切的目的片段(M1-K158 Trx融合标签，17.1KDa和F159-F349 rhGH目的蛋白，22.1KDa)。此外，片段Trx还会产生15KDa非期望的酶切产物(M1-R143，15.5KDa)。片段rhGH将在K199和R292位置被酶切，而产生非特异性酶切片段，即Nick片段，F159-R292，分子量为15.5kDa；T293-F349，分子量为6.6kDa；以及Y200-F349，分子量为17.1kDa。下面的Trx-rhGH融合蛋白的氨基酸序列中，下划线和箭头指示了bEKL的酶切位点。
MRDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFER↓QHMDSPDLGTDDDDK↓FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQK↓YSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPR↓TGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(见SEQ ID No:7)
针对肠激酶的非特异性酶切，除了在酶切之后尽快去除肠激酶之外，增加肠激酶的特异性是更加有利的方法，可以从根源上避免非特异性酶切的产生。Smith[6]及Chun[12]等采用氨基酸突变来增加肠激酶的特异性，但是突变位点及氨基酸对肠激酶及底物蛋白序列有特定要求。Ogiwara[13]报道了从青鳉鱼(medaka)小肠中克隆表达肠激酶，得到了青鳉鱼肠激酶活性亚基(MEKL)，其与牛肠激酶活性亚基的同源性仅为53％，但特异性好于牛肠激酶活性亚基。对含有Ala-Arg或Phe-Arg的合成短肽底物或者蛋白序列，酶活性很低，基本上不酶切。目前尚无青鳉鱼肠激酶活性亚基酶切rhGH的报道。Ogiwara K等人[13]报道的青鳉鱼肠激酶活性亚基是以融合蛋白包涵体形式表达，复性酶切后得到活性蛋白，仍然存在复性效率低以及产率低的问题。
为此，本发明人设计了一种在大肠杆菌中表达青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法。
本发明公开的在大肠杆菌中表达青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法解决了青鳉鱼肠激酶活性亚基在大肠杆菌中可溶性表达的问题，以及酶切特异性的问题。
具体而言，如图1中所示，将编码融合标签msyB的多核苷酸与编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸经接头连接，由其表达的融合蛋白称为msyB-接头-MEKL蛋白。
融合标签msyB是一种源自大肠杆菌的酸性蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:4中所示，并且编码其的多核苷酸序列如SEQ ID No:1中所示。
为了将融合标签msyB与青鳉鱼肠激酶活性亚基连接，本发明设计了接头，接头的氨基酸序列如SEQ ID No:6中所示，并且编码其的多核苷酸的序列如SEQ ID No:3中所示。
为了便于融合蛋白的纯化，本领域技术人员常规在融合蛋白的N端设计His标签。本发明人根据常规将编码融合标签msyB和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸直接连接，将编码6个His标签的多核苷酸与编码融合标签msyB的多核苷酸的N端连接的方案来在宿主菌中表达青鳉鱼肠激酶活性亚基。将编码融合标签msyB和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸直接连接，并且在N端设计6个His标签的方案表达的融合蛋白称为6His-msyB-MEKL蛋白。
但是，本发明人意外地发现，将6His标签放置在融合标签msyB和青鳉鱼肠激酶活性亚基之间，如图1中所示的融合标签msyB和青鳉鱼肠激酶活性亚基之间，不仅利于融合标签msyB的酶切以及青鳉鱼肠激酶活性亚基的分离，而且提高了所得青鳉鱼肠激酶活性亚基的产量和活性。
1、实验材料和实验方法
1.1、多核苷酸的合成
为了在宿主菌中表达上述两种融合蛋白，根据图1中所示的方案，通过基因合成，得到经编码接头的多核苷酸连接的编码融合标签msyB的多核苷酸与编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸，称为msyB-接头-MEKL多核苷酸，并且在两端分别设计Nco I和Xho I酶切位点。
1.2、表达载体的制备
本发明使用了载体，例如，图2中所示的pET-28b或其他pET系列载体，比如载体pET-28a或pET-28c。本发明所使用的载体含有Nco I和Xho I酶切位点，5’…CCATGG…3’和5’…CTCGAG…3’。使用Nco I和Xho I酶对载体进行酶切。将带有Nco I和Xho I酶切位点的msyB-接头-MEKL多核苷酸与载体连接，得到msyB-接头-MEKL蛋白的表达载体。类似地，针对6His-msyB-MEKL蛋白，通过基因合成，得到6His-msyB-MEKL多核苷酸，并且经酶切、连接，得到6His-msyB-MEKL蛋白的表达载体。
1.3、表达载体的转化
接下来，将表达载体稳定地转化到宿主菌中，得到转化的宿主菌克隆。本发明使用的宿主菌可包括所有带λDE3的溶源菌，比如大肠杆菌菌株BL21(DE3)。挑取阳性单菌落，培养，经PCR检测后，确认得到了包含目的基因的工程菌。
1.4、工程菌的诱导表达以及目的蛋白的测量
培养转化的宿主菌克隆，以诱导msyB-接头-MEKL蛋白和6His-msyB-MEKL蛋白的表达。本发明针对大肠杆菌菌株BL21(DE3)所使用的培养条件如下：
使用液态LB培养基(由10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母粉、10g/L的氯化钠以及余量的去离子水组成)，在37℃下，以220rpm，震荡培养6小时至8小时，加入IPTG，继续培养3小时至5小时，得到发酵液。将发酵液进行电泳，以确认培养后的培养基中包含要表达的msyB-接头-MEKL蛋白与6His-msyB-MEKL蛋白。其中，使用15％的SDS-PAGE，在120V至180V下，进行电泳60分钟，电泳结果如图3中所示。
接下来，使用Bio-Rad公司提供的ImageLab软件分析电泳胶片，测量msyB-接头-MEKL与6His-msyB-MEKL的表达量。
经上述测量，本发明的msyB-接头-MEKL蛋白在培养基中的表达量可达到20％至32％。6His-msyB-MEKL蛋白的表达量可达到13％至20％。
下面介绍从培养基中分离和纯化msyB-接头-MEKL蛋白以及6His-msyB-MEKL蛋白的过程。
1.5、目的蛋白的分离和纯化
参考图4，首先，使用破菌液，将发酵液重悬，得到发酵液悬液。然后，使用均质机将发酵液悬液中的宿主菌破碎。破菌压力在850至1500bar之间，温度在4至15℃之间。接着，将破碎的宿主菌离心，收集上清液。其中，使用的破菌液由50mM Tris、2M尿素和0.5％TritonX-100组成，并且pH为8.0。离心的条件为4℃下，以14,000g离心20分钟。
然后，将收集的上清液上样至Ni亲和层析柱中(GE Healthcare，XK16柱)，使用洗脱液洗脱，得到第一洗脱产物。将所得第一洗脱产物保存在4℃下备用。其中，所使用的洗脱液由50mM Tris、2M尿素和500mM咪唑组成，并且pH为8.0。此外，所使用的平衡液由50mMTris和2M尿素组成，并且pH为8.0。
取第一洗脱产物进行电泳，以确认第一洗脱产物是否为期望的msyB-接头-MEKL蛋白和6His-msyB-MEKL蛋白。
接下来，在Ni亲和层析柱洗脱后，将第一洗脱产物上样至G25层析柱(GEHealthcare，XK16柱)，进行换液操作，得到第二洗脱产物。其中使用的平衡液及洗脱液均为50mM Tris，pH为8.0。
向第二洗脱产物中添加痕量0.01IU/mg至0.02IU/mg的牛肠激酶(上海普欣生物技术有限公司，货号461-01)，在4℃至26℃下，酶切2小时至16小时，使第二洗脱产物完全裂解。所使用的牛肠激酶的酶活为1.2IU/ml至3.3IU/ml，浓度为0.2mg/ml至0.6mg/ml。添加痕量的牛肠激酶后，将从msyB-接头-MEKL中酶切出MEKL。接着，酶切出来的MEKL也参与msyB-接头-MEKL的酶切，从而产生更多的MEKL，形成一个酶切的链式反应。
将完全裂解的第二洗脱产物上样至Ni亲和层析柱中(GE Healthcare，XK16柱)，使用平衡液淋洗，收集流穿液，即为目的产物。将所得目的产物保存在4℃下备用。其中，所使用的平衡液由50mM Tris组成，并且pH为8.0。
将所得目的产物进行电泳，以确认所得产物为目的蛋白，即青鳉鱼肠激酶活性亚基，MEKL。结果见图5中C图的泳道。
另外，也可采用固定化酶两柱联用的方法，进行青鳉鱼肠激酶活性亚基的分离和纯化。即，将bEK固定在第一层析柱上；将含有msyB-接头-MEKL或者6His-msyB-MEKL融合蛋白的破菌离心上清液上样到固定有酶的第一层析柱，融合蛋白被bEK酶切后产生融合头、MEKL目的蛋白；然后将第一层析柱与第二层析柱(Ni亲和层析)串联，含有His标签的残留融合蛋白和融合头结合到第二层析柱，而不含His标签的MEKL目的蛋白流穿，得到纯化的青鳉鱼肠激酶活性亚基。
2、验证例
下面，为了验证所获得的青鳉鱼肠激酶活性亚基的活性，使用Trx-rhGH融合蛋白作为底物，加入所得目的产物，研究其对底物的酶切情况。
所使用的底物为Trx-rhGH融合蛋白(上海联合赛尔生物工程有限公司，批号：PAH406)。其中Trx-rhGH融合蛋白的制备方法如下：根据本领域常规技术手段，由带有Trx融合头和人生长激素基因的重组质粒转化大肠杆菌，经发酵培养，破菌上清液过Ni亲和层析柱，洗脱液即为Trx-rhGH融合蛋白。
在室温下，以1:4600至1:18000(即，0.055μg/mg至0.22μg/mg)的质量比，向pH8.0的缓冲液50mM Tris中的Trx-rhGH融合蛋白添加所得目的产物，在4℃下进行酶切16小时至72小时。接着，将酶切产物进行电泳，以确认酶切效果。同时，向Trx-rhGH融合蛋白中添加用于激活的痕量的牛肠激酶作为对照。发现，所得目的产物有明显的活性，而用于激活的痕量的牛肠激酶无法切割Trx-rhGH融合蛋白。
此外，申请人还研究了温度以及酶的加入量对于酶切效果的影响。
例如，用上述相同的程序，使所得目的产物在较高的温度，比如37℃下对Trx-rhGH融合蛋白底物进行酶切1小时至3小时。发现，随着酶切温度升高，酶切活性明显提高。
本发明还研究了本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基的酶切特异性。用上述相同的程序，使用相同酶活的本发明青鳉鱼肠激酶活性亚基和1:10000(即，0.1μg/mg)的牛肠激酶对Trx-rhGH融合蛋白底物，在相同的条件下进行酶切。结果发现，对于使用牛肠激酶的酶切，酶切产物中，除了未酶切的Trx-rhGH融合蛋白、Trx融合头及rhGH蛋白这三种产物之外，还存在至少5种其他非特异性酶切产物。而对于使用本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基的酶切，酶切产物中，除了三种主要产物之外，只存在一个主要杂带。本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基具有提高的酶切特异性。
为了进一步证实本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基的高特异性，本发明人使用纯化的重组人生长激素rhGH(上海联合赛尔生物工程有限公司，批号：GBM1201901)作为底物蛋白，对于本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基与牛肠激酶的酶切效果进行比较。其中rhGH蛋白的制备方法如下：根据本领域常规技术手段，将由带有人生长激素基因的重组质粒转化大肠杆菌，经发酵培养，破菌上清液经硫酸铵沉淀，离子交换层析和疏水层析等步骤纯化获得rhGH。结果发现，虽然rhGH序列不含有DDDDK序列，但是牛肠激酶仍可以酶切rhGH，说明了特异性不高。而，对于本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基，即使增加加酶量(1:3000至1:9000，即，0.11μg/mg至0.33μg/mg)并且延长酶切时间，也无法对rhGH进行酶切，由此进一步证实了本发明的青鳉鱼肠激酶活性亚基的高特异性。
下面通过具体的实施例来进一步阐释本发明的方法和构思，但是本发明的范围不受实施例的限制。
实施例
1、多核苷酸的合成
根据图1中所示的方案，化学合成SEQ ID Nos:1、2和3中显示的分别编码酸性标签msyB、接头和MEKL的多核苷酸，得到编码msyB-接头-MEKL蛋白的多核苷酸，即msyB-接头-MEKL多核苷酸，并且在两端分别添加Nco I和Xho I的酶切位点的序列5’…CCATGG…3’和5’…CTCGAG…3’。接着，对化学合成基因产物进行基因测序，以确认合成了正确的多核苷酸序列。确认的msyB-接头-MEKL多核苷酸连同Nco I和Xho I的酶切位点一起的序列如SEQ IDNo:8中所示。
2、表达载体的制备
接着，根据制造商的指导，使用Nco I内切酶和Xho I内切酶对质粒载体pET-28b进行酶切。
使上述合成的SEQ ID No:8中所示的多核苷酸分别与酶切的载体pET-28b连接，得到连接产物，即表达载体。
3、表达载体的转化
使用氯化钙法将表达载体转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。
挑取阳性单菌落，培养，经PCR检测后，确认得到了包含目的基因的工程菌。
4、工程菌的诱导表达以及目的蛋白的测量
将上述工程菌接种在由10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母粉、10g/L的氯化钠和余量的去离子水组成的液态LB培养基中，以220rpm，在37℃下培养15小时至16小时，得到种子液。
然后，将上述种子液接种在含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油5mL/L的半合成培养基中，接种量为7％。在37℃±2℃下，连续补料含蛋白胨140g/L、酵母粉140g/L、甘油50％的补料培养基为基础培养基体积的10％至20％，用磷酸和/或氨水将培养基的pH控制为6.5至7.5，通过提升转速和罐压、增加纯氧比例等方法控制溶氧10％至80％，当菌液A600达20时，加入终浓度为0.05mmol/L至1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导3至5小时，得到发酵液。
将发酵液使用15％的SDS-PAGE，在120V至180V下进行电泳60分钟，电泳图片如图3中所示。其中泳道1表示Marker的电泳结果；泳道2至7表示6份发酵液样品的电泳结果。从泳道2至7的结果可见，发酵液中含有分子量与本发明的msyB-接头-MEKL蛋白的理论分子量46.6KDa相近的产物。初步确认了发酵液中含有目的蛋白，即msyB-接头-MEKL蛋白。
接着，使用Bio-Rad公司提供的ImageLab软件分析电泳胶片，测量msyB-接头-MEKL的表达量。测得的发酵液中目的蛋白，即msyB-接头-MEKL蛋白的含量为3mg/ml。
5、目的蛋白的分离和纯化
如图4中所示，首先，对于msyB-接头-MEKL蛋白，使用250ml破菌液，将11g发酵菌体重悬，采用均质机将宿主菌破碎。破碎压力为900bar，温度为10℃。接着，将破碎的宿主菌离心，收集上清液250ml。其中，使用的破菌液由50mM Tris、2M尿素和0.5％Triton X-100组成，并且pH为8.0。离心的条件为4℃下，以14,000g离心20分钟。
然后，将收集的250ml上清液，以3ml/分钟的速度，上样至Ni亲和层析柱中(GEHealthcare，XK16柱)，使用洗脱液洗脱，得到第一洗脱产物23ml。将所得第一洗脱产物保存在4℃下备用。其中，所使用的洗脱液由50mM Tris、2M尿素和500mM咪唑组成，并且pH为8.0。此外，所使用的平衡液由50mM Tris和2M尿素组成，并且pH为8.0。
取第一洗脱产物进行电泳，结果见图5的A图的泳道2。从图5的A图的泳道2可见，第一洗脱产物中含有分子量与本发明的msyB-接头-MEKL蛋白的理论分子量约46.6KDa相近的产物。由此，再次确认了msyB-接头-MEKL蛋白发酵液的第一洗脱产物中含有msyB-接头-MEKL蛋白。
接下来，在Ni亲和层析柱洗脱后，将23ml第一洗脱产物上样至G25层析柱(GEHealthcare，XK16柱)，洗脱，得到54ml第二洗脱产物。其中使用的平衡液及洗脱液均为50mMTris，pH为8.0。
向54ml的第二洗脱产物中添加0.12mg的牛肠激酶(上海普欣生物技术有限公司，货号461-01)，在4℃下，酶切16小时，使第二洗脱产物裂解。所使用的牛肠激酶的酶活为3.06IU/ml。
将酶切0小时、1小时、2小时、3小时、16小时后第二洗脱产物进行电泳。图5的A图中的泳道3、4、5、6、8分别显示了酶切0小时、1小时、2小时、3小时、16小时后的第二洗脱产物的电泳的结果。基于泳道8相对于泳道6已经没有区别，可以说明在16小时之后，第二洗脱产物已经被完全裂解。此外，泳道1表示Marker的电泳结果；泳道2为第一洗脱产物的电泳结果。
将54ml裂解16小时后的第二洗脱产物上样至Ni亲和层析柱中(GE Healthcare，XK16柱)，使用平衡液淋洗，收集到68ml流穿液，即为目的产物。其中，所使用的平衡液由50mM Tris组成，并且pH为8.0。图5的A图中的泳道9显示了流穿液的电泳的结果。图5的C图中的泳道1为最终纯化所得的目的蛋白，确认了其中所得目的产物含有纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的青鳉鱼肠激酶活性亚基。
采用280nm蛋白紫外吸收法，基于青鳉鱼肠激酶活性亚基的消光系数ε＝2.207，测量所得目的产物中青鳉鱼肠激酶活性亚基的含量。由此计算出青鳉鱼肠激酶活性亚基的产率为240μg/ml发酵液。将所得目的产物保存在4℃下备用。
对比例1
1、多核苷酸的合成
化学合成SEQ ID No:9中显示的编码6His-msyB-MEKL蛋白的多核苷酸，即6His-msyB-MEKL多核苷酸，并且进行基因测序确认。确认的6His-msyB-MEKL多核苷酸连同Nco I和Xho I的酶切位点一起的序列如SEQ ID No:9中所示。
2、表达载体的制备
接着，根据制造商的指导，使用Nco I内切酶和Xho I内切酶对质粒载体pET-28b进行酶切。
使上述合成的SEQ ID No:9中所示的多核苷酸与酶切的载体pET-28b连接，得到连接产物，即表达载体。
3、表达载体的转化
将表达载体进行转化。方法与上述实施例相同。
挑取阳性单菌落，培养，经PCR检测后，确认得到了包含目的基因的宿主菌。
4、宿主菌的诱导表达以及目的蛋白的测量
将上述宿主菌分别经LB培养基培养，诱导表达，得到发酵液。方法与上述实施例相同。
将发酵液使用15％的SDS-PAGE，在120V至180V下进行电泳60分钟，电泳图片如图3中所示。其中泳道1表示Marker的电泳结果；泳道8至12表示5份发酵液样品的电泳结果。从泳道8至12的结果可见，发酵液中含有分子量与本发明的6His-msyB-MEKL蛋白的理论分子量47KDa相近的产物。初步确认了发酵液中含有6His-msyB-MEKL蛋白。
接着，使用Bio-Rad公司提供的ImageLab软件分析电泳胶片，测量发酵液中6His-msyB-MEKL蛋白的含量。测得的发酵液中6His-msyB-MEKL蛋白的含量为2mg/ml。
5、6His-msyB-MEKL蛋白的分离和纯化
如图4中所示，首先，对于6His-msyB-MEKL蛋白，使用250ml破菌液，将11g发酵菌体重悬，采用均质机将宿主菌破碎。破碎压力为900bar，温度10℃。接着，将破碎的宿主菌离心，收集上清液250ml。其中，使用的破菌液由50mM Tris、2M尿素和0.5％Triton X-100组成，并且pH为8.0。离心的条件为4℃下，以14,000g离心20分钟。
然后，将收集的250ml上清液，以3ml/分钟的速度，上样至Ni亲和层析柱中(GEHealthcare，XK16柱)，使用洗脱液洗脱，得到第一洗脱产物22ml。将所得第一洗脱产物保存在4℃下备用。其中，所使用的洗脱液由50mM Tris、2M尿素和500mM咪唑组成，并且pH为8.0。此外，所使用的平衡液由50mM Tris和2M尿素组成，并且pH为8.0。
取第一洗脱产物进行电泳，如图5的B图中显示，泳道5确认了6His-msyB-MEKL蛋白发酵液的第一洗脱产物中含有6His-msyB-MEKL蛋白。泳道1为Marker的电泳图，泳道2为破菌离心沉淀的电泳图，泳道3为离心上清/Ni层析上样的电泳图，泳道4为Ni柱流穿的电泳图，泳道5为Ni柱洗脱的电泳图，泳道6为G25换液后的电泳图，泳道7为酶切后的电泳图。
接下来，在Ni亲和层析柱洗脱后，将22ml的第一洗脱产物上样至G25层析柱(GEHealthcare，XK16柱)，洗脱，得到30ml的第二洗脱产物。其中使用的平衡液及洗脱液均为50mM Tris，pH为8.0。
向30ml的第二洗脱产物中添加0.12mg的牛肠激酶(上海普欣生物技术有限公司，货号461-01)，在4℃下，酶切16小时，使第二洗脱产物裂解。所使用的牛肠激酶的酶活为3.06IU/ml。电泳如图5的B图的泳道7所示。
将30ml完全裂解的第二洗脱产物上样至Ni亲和层析柱中(GE Healthcare，XK16柱)，使用平衡液淋洗，收集43ml的流穿液，即为目的产物。其中，所使用的洗脱液由50mMTris、2M尿素和500mM咪唑组成，并且pH为8.0。此外，所使用的平衡液由50mM Tris组成，并且pH为8.0。图5的C图中的泳道2显示了最终纯化所得的目的蛋白的电泳的结果，显示所得目的产物含有纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的青鳉鱼肠激酶活性亚基。
对比例2
1、多核苷酸的合成
化学合成SEQ ID No:2中显示的编码MEKL蛋白的多核苷酸连同Nco I和Xho I的酶切位点，并且进行基因测序确认。
2、表达载体的制备
接着，根据制造商的指导，使用Nco I内切酶和Xho I内切酶对质粒载体pET-28b进行酶切。
使上述合成的SEQ ID No:2中所示的多核苷酸连同Nco I和Xho I的酶切位点与酶切的载体pET-28b连接，得到连接产物，即表达载体。
3、表达载体的转化
将表达载体进行转化。方法与对比例1相同。
挑取阳性单菌落，培养，经PCR检测后，确认得到了包含目的基因的宿主菌。
4、宿主菌的诱导表达以及目的蛋白的可溶性测试
将上述宿主菌分别经LB培养基培养，诱导表达，得到发酵液。方法与上述实施例相同。
将发酵菌体用缓冲液20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0重悬，采用均质机将菌体破碎。破碎压力为900bar，温度10℃。接着，将破碎的菌体离心，收集上清液和离心沉淀。将离心沉淀用含2M尿素的洗涤液20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1％Triton-X100，pH8.0洗涤两次，以确认目的蛋白MEKL是可溶性表达还是包涵体表达。
将发酵液、离心上清和离心沉淀使用15％的SDS-PAGE，在120V至180V下进行电泳60分钟。电泳图片如图6所示，泳道1为发酵液的电泳图，泳道2为破菌离心上清的电泳图，泳道3为离心沉淀洗涤一次的电泳图，泳道4为离心沉淀洗涤两次的电泳图，泳道5为洗涤后的离心沉淀(即包涵体)的电泳图，泳道6为Marker的电泳图。
由图6可见，MEKL的直接表达在胞内形成包涵体。包涵体复性效率极低，而且复性后无活性(数据未显示)。
评估例
青鳉鱼肠激酶活性亚基的酶活测试
为了验证上述由msyB-接头-MEKL蛋白纯化的MEKL和由6His-msyB-MEKL蛋白纯化的MEKL的酶切活性，使用Trx-rhGH融合蛋白作为底物，加入上述各自的所得目的产物，研究其对底物的酶切情况。
所使用的底物为Trx-rhGH融合蛋白。其中Trx-rhGH融合蛋白的制备方法如下：根据本领域常规技术手段，由带有Trx融合头和人生长激素基因的重组质粒转化大肠杆菌，经发酵培养，破菌上清液过Ni亲和层析柱，洗脱液即为Trx-rhGH融合蛋白。
根据下面表1，向80ml含有Trx-rhGH融合蛋白(浓度为8.1mg/ml)的50mM Tris，pH8.0中分别添加所得目的产物(即，分别纯化自msyB-接头-MEKL蛋白和6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL)，以及作为阴性对照的痕量0.003μg的牛肠激酶和作为阳性对照的0.77μg的牛肠激酶，在4℃下进行酶切。在酶切16小时和72小时后，过滤，并且对滤液取样，分别进行电泳。结果见图7。
表1
图7中A图显示了Marker、酶切底物以及酶切16小时后相关酶切产物的电泳图。其中，泳道1为Marker的电泳图；泳道2为底物Trx-rhGH的电泳图；泳道3为阴性对照(加入痕量0.003μg的bEKL)的电泳图；泳道4为阳性对照(加入0.77μg的bEKL)的电泳图；泳道5为加入低剂量0.45μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL(即，来自实施例的MEKL)的酶切效果的电泳图；泳道6为加入高剂量1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL的酶切效果的电泳图；泳道7为加入低剂量0.45μg的纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL(即，来自对比例的MEKL)的酶切效果的电泳图；泳道8为加入高剂量1.77μg的纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL的酶切效果的电泳图。
图7中B图显示了酶切72小时后相关酶切产物的电泳图。其中，泳道1为Marker的电泳图；泳道2为底物Trx-rhGH的电泳图；泳道5为加入低剂量0.45μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL(即，来自实施例的MEKL)的酶切效果的电泳图；泳道6为加入高剂量1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL的酶切效果的电泳图；泳道7为加入低剂量0.45μg的纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL(即，来自对比例的MEKL)的酶切效果的电泳图；泳道8为加入高剂量1.77μg的纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL的酶切效果的电泳图。
从图7中可见，在低温(4℃下)加入激活用的少量bEKL无法酶切Trx-rhGH融合蛋白(如图7中A图的带条3中所显示)，加入纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL，即使增加酶的用量和延长酶切时间也无法酶切Trx-rhGH融合蛋白(如图7中A图的泳道7和8以及B图的泳道7和8中所显示)。但是，加入纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL可以酶切Trx-rhGH融合蛋白，并且随着时间的推移，酶切程度逐步提高，到72小时已基本酶切完毕(如图7中A图的泳道5和6以及B图的泳道5和6中所显示)。具体而言，如图7中A图的泳道6中显示，在4℃下，加入1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切16小时之后，已经从Trx-rhGH融合蛋白中酶切出了rhGH蛋白。如图7中B图的泳道6中显示，在4℃下，加入1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切72小时之后，已经将Trx-rhGH融合蛋白完全酶切。
申请人认为之所以纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL没有酶切活性，可能是因为6His标签的插入位点影响了MEKL的活性。当6His标签在msyB和MEKL之间时(例如，本发明设计的msyB-接头-MEKL蛋白的情况)，6His的正电荷中和了msyB的强负电荷，从而减少了msyB对MEKL的结构的影响。而当6His在融合蛋白的N端时，不能消除msyB对MEKL的结构的影响。
此外，申请人还研究了温度以及酶的加入量对于酶切效果的影响。
例如，用上述相同的程序，只是在37℃的温度下，对Trx-rhGH融合蛋白底物进行酶切1小时至3小时。结果见图8。
图8的A图中，泳道1为Marker的电泳图；泳道2为Trx-rhGH的电泳图；泳道3至5分别为加入低剂量0.45μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，在37℃下酶切1小时、2小时和3小时后，酶切效果的电泳图；泳道6至8分别为加入高剂量1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，在37℃下酶切1小时、2小时和3小时后，酶切效果的电泳图。
图8的A图中，泳道9和10分别为加入高剂量1.77μg的bEKL，在37℃下，酶切2小时和3小时后，酶切效果的电泳图。
具体而言，如图8的A图中的泳道8中显示，在用高剂量1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，在37℃下酶切3小时后，已经将底物Trx-rhGH完全酶切。相比在4℃下的酶切活性明显提高了。因此，从图7和图8的比较可见，随着温度的升高，本发明的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL的酶切活性明显提高。
图8的B图中的泳道显示了在37℃的温度下，加入低剂量(0.45μg)和高剂量(1.77μg)的纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL对Trx-rhGH融合蛋白底物分别进行酶切1小时至3小时的电泳图。
图8的B图中，泳道1为Trx-rhGH的电泳图；泳道2至4分别为加入低剂量0.45μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，在37℃下酶切1小时、2小时和3小时后，酶切效果的电泳图；泳道6至8分别为加入高剂量1.77μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，在37℃下酶切1小时、2小时和3小时后，酶切效果的电泳图。
从图8的B图可见，尽管温度升高了，但是纯化自6His-msyB-MEKL蛋白的MEKL对于Trx-rhGH融合蛋白仍然没有酶切活性。
从图8的A图的泳道6、7和8中可见，使用纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL对底物Trx-rhGH融合蛋白进行酶切，仅仅产生了三种产物，即Trx融合头片段、rhGH片段，以及由于融合蛋白不纯(泳道2)而导致的部分宿主蛋白酶切产物。这也说明了纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL对底物Trx-rhGH融合蛋白具有高特异性。同时，比较泳道8和泳道10，发现，在酶切较完全的情况下，bEKL对rhGH目的蛋白切割较严重(泳道10)，而纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL不切割rhGH目的蛋白(泳道8)。这一点在下面进行的酶切特异性测试中得到进一步验证。
酶切特异性测试
本发明还研究了本发明青鳉鱼肠激酶活性亚基的酶切特异性。用上述酶活测试中相同的程序，使用纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL以及bEKL对Trx-rhGH融合蛋白底物在相同的条件下进行酶切。
具体而言，根据下面表2添加各自酶。在37℃下酶切3小时至16小时。酶切后底物的电泳结果见图9。
表2
图9中，泳道1为Marker的电泳图；泳道2为rhGH的电泳图；泳道3为rhGH被0.77μg的bEKL酶切3小时后的电泳图；泳道4为rhGH被1.27μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切3小时后的电泳图；泳道5为rhGH被1.27μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切16小时后的电泳图；泳道6为rhGH被3.55μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切3小时后的电泳图；泳道7为rhGH被3.55μg的纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL酶切16小时后的电泳图。
从图9的结果可见，虽然rhGH蛋白的氨基酸序列中没有DDDDK序列，但是牛肠激酶活性亚基bEKL仍可对其进行酶切，说明了牛肠激酶活性亚基的特异性不高。而，对于纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL，即使在进行酶切时加入的量很大，并且延长酶切时间，比如16小时，也无法对rhGH进行酶切，由此进一步证实了纯化自msyB-接头-MEKL蛋白的MEKL的高特异性。
采用本发明描述的方法得到的特异性MEKL可以用于任何含有DDDDK序列的融合蛋白，相比现有技术具有表达量高、成本低且特异性好的优点，解决了生物技术领域亟待解决的问题。
本文中使用的缩写的全称含义如下：
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序列表
<120> 制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccatgt acgcaacgct tgaagaagcc attgacgctg cacgcgaaga atttcttgca 60
gacaaccccg gcatcgacgc cgaagatgcg aatgtgcaac agttcaatgc ccaaaaatac 120
gttttgcagg acggcgacat catgtggcaa gttgagtttt ttgccgacga aggggaagaa 180
ggtgaatgtt tacctatgct tagcggtgaa gccgcgcaaa gtgtttttga tggcgactat 240
gatgagatag agatacgcca ggagtggcag gaagagaata cattacatga atgggacgag 300
ggggaatttc agcttgagcc accgctggat accgaggaag gacgcgcagc agctgatgag 360
tgggatgaac gttaa 375
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgttggtg gtgttaacgc tgaaaaaggt gcttggccgt ggatggtttc tctgcactgg 60
cgtggtcgtc acggttgcgg tgcttctctg atcggtcgtg actggctgct gaccgctgct 120
cactgcgttt acggtaaaaa cacccacctg cagtactggt ctgctgttct gggtctgcac 180
gctcagtctt ctatgaactc tcaggaagtt cagatccgtc aggttgaccg tatcatcatc 240
aacaaaaact acaaccgtcg taccaaagaa gctgacatcg ctatgatgca cctgcagcag 300
ccggttaact tcaccgaatg ggttctgccg gtttgcctgg cttctgaaga ccagcacttc 360
ccggctggtc gtcgttgctt catcgctggt tggggtcgtg acgctgaagg tggttctctg 420
ccggacatcc tgcaggaagc tgaagttccg ctggttgacc aggacgcttg ccagcgtctg 480
ctgccggaat acaccttcac ctcttctatg ctgtgcgctg gttacccgga aggtggtgtt 540
gactcttgcc agggtgactc tggtggtccg ctgatgtgcc tggaagacgc tcgttggacc 600
ctgatcggtg ttacctcttt cggtgttggt tgcggtcgtc cggaacgtcc gggtgcttac 660
gctcgtgttt ctgctttcac ctcttggatc gctgaaaccc gtcgttcttc tttctctgac 720
ctggac 726
<210> 3
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttctggtt ctggccatat gcaccatcat catcatcatt cttctggtct ggtgccacgc 60
ggttctggta tgaaagaaac cgctgctgct aaattcgaac gccagcacat ggacagccca 120
gatctgggta ccgacgacga cgacaag 147
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn Val
20 25 30
Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile Met
35 40 45
Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys Leu
50 55 60
Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp Tyr
65 70 75 80
Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu His
85 90 95
Glu Trp Asp Glu Gly Glu Phe Gln Leu Glu Pro Pro Leu Asp Thr Glu
100 105 110
Glu Gly Arg Ala Ala Ala Asp Glu Trp Asp Glu Arg
115 120
<210> 5
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Val Gly Gly Val Asn Ala Glu Lys Gly Ala Trp Pro Trp Met Val
1 5 10 15
Ser Leu His Trp Arg Gly Arg His Gly Cys Gly Ala Ser Leu Ile Gly
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Lys Asn Thr
35 40 45
His Leu Gln Tyr Trp Ser Ala Val Leu Gly Leu His Ala Gln Ser Ser
50 55 60
Met Asn Ser Gln Glu Val Gln Ile Arg Gln Val Asp Arg Ile Ile Ile
65 70 75 80
Asn Lys Asn Tyr Asn Arg Arg Thr Lys Glu Ala Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Gln Gln Pro Val Asn Phe Thr Glu Trp Val Leu Pro Val Cys
100 105 110
Leu Ala Ser Glu Asp Gln His Phe Pro Ala Gly Arg Arg Cys Phe Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Arg Asp Ala Glu Gly Gly Ser Leu Pro Asp Ile Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Glu Val Pro Leu Val Asp Gln Asp Ala Cys Gln Arg Leu
145 150 155 160
Leu Pro Glu Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Met Leu Cys Ala Gly Tyr Pro
165 170 175
Glu Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Leu Glu Asp Ala Arg Trp Thr Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Val Gly Cys Gly Arg Pro Glu Arg Pro Gly Ala Tyr Ala Arg Val Ser
210 215 220
Ala Phe Thr Ser Trp Ile Ala Glu Thr Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asp
225 230 235 240
Leu Asp
<210> 6
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe
20 25 30
Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp
35 40 45
Lys
<210> 7
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Arg Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro
145 150 155 160
Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His
165 170 175
Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala
180 185 190
Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr
195 200 205
Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu
210 215 220
Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu
225 230 235 240
Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala
245 250 255
Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu
260 265 270
Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp
275 280 285
Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe
290 295 300
Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu
305 310 315 320
Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg
325 330 335
Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
340 345
<210> 8
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccattgatga ccatgtacgc aacgcttgaa gaagccattg acgctgcacg cgaagaattt 60
cttgcagaca accccggcat cgacgccgaa gatgcgaatg tgcaacagtt caatgcccaa 120
aaatacgttt tgcaggacgg cgacatcatg tggcaagttg agttttttgc cgacgaaggg 180
gaagaaggtg aatgtttacc tatgcttagc ggtgaagccg cgcaaagtgt ttttgatggc 240
gactatgatg agatagagat acgccaggag tggcaggaag agaatacatt acatgaatgg 300
gacgaggggg aatttcagct tgagccaccg ctggataccg aggaaggacg cgcagcagct 360
gatgagtggg atgaacgtta aggttctggt tctggccata tgcaccatca tcatcatcat 420
tcttctggtc tggtgccacg cggttctggt atgaaagaaa ccgctgctgc taaattcgaa 480
cgccagcaca tggacagccc agatctgggt accgacgacg acgacaaggt tgttggtggt 540
gttaacgctg aaaaaggtgc ttggccgtgg atggtttctc tgcactggcg tggtcgtcac 600
ggttgcggtg cttctctgat cggtcgtgac tggctgctga ccgctgctca ctgcgtttac 660
ggtaaaaaca cccacctgca gtactggtct gctgttctgg gtctgcacgc tcagtcttct 720
atgaactctc aggaagttca gatccgtcag gttgaccgta tcatcatcaa caaaaactac 780
aaccgtcgta ccaaagaagc tgacatcgct atgatgcacc tgcagcagcc ggttaacttc 840
accgaatggg ttctgccggt ttgcctggct tctgaagacc agcacttccc ggctggtcgt 900
cgttgcttca tcgctggttg gggtcgtgac gctgaaggtg gttctctgcc ggacatcctg 960
caggaagctg aagttccgct ggttgaccag gacgcttgcc agcgtctgct gccggaatac 1020
accttcacct cttctatgct gtgcgctggt tacccggaag gtggtgttga ctcttgccag 1080
ggtgactctg gtggtccgct gatgtgcctg gaagacgctc gttggaccct gatcggtgtt 1140
acctctttcg gtgttggttg cggtcgtccg gaacgtccgg gtgcttacgc tcgtgtttct 1200
gctttcacct cttggatcgc tgaaacccgt cgttcttctt tctctgacct ggacctcgag 1260
<210> 9
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatggcacc atcatcatca tcatatgacc atgtacgcaa cgcttgaaga agccattgac 60
gctgcacgcg aagaatttct tgcagacaac cccggcatcg acgccgaaga tgcgaatgtg 120
caacagttca atgcccaaaa atacgttttg caggacggcg acatcatgtg gcaagttgag 180
ttttttgccg acgaagggga agaaggtgaa tgtttaccta tgcttagcgg tgaagccgcg 240
caaagtgttt ttgatggcga ctatgatgag atagagatac gccaggagtg gcaggaagag 300
aatacattac atgaatggga cgagggggaa tttcagcttg agccaccgct ggataccgag 360
gaaggacgcg cagcagctga tgagtgggat gaacgttaag acgacgacga caaggttgtt 420
ggtggtgtta acgctgaaaa aggtgcttgg ccgtggatgg tttctctgca ctggcgtggt 480
cgtcacggtt gcggtgcttc tctgatcggt cgtgactggc tgctgaccgc tgctcactgc 540
gtttacggta aaaacaccca cctgcagtac tggtctgctg ttctgggtct gcacgctcag 600
tcttctatga actctcagga agttcagatc cgtcaggttg accgtatcat catcaacaaa 660
aactacaacc gtcgtaccaa agaagctgac atcgctatga tgcacctgca gcagccggtt 720
aacttcaccg aatgggttct gccggtttgc ctggcttctg aagaccagca cttcccggct 780
ggtcgtcgtt gcttcatcgc tggttggggt cgtgacgctg aaggtggttc tctgccggac 840
atcctgcagg aagctgaagt tccgctggtt gaccaggacg cttgccagcg tctgctgccg 900
gaatacacct tcacctcttc tatgctgtgc gctggttacc cggaaggtgg tgttgactct 960
tgccagggtg actctggtgg tccgctgatg tgcctggaag acgctcgttg gaccctgatc 1020
ggtgttacct ctttcggtgt tggttgcggt cgtccggaac gtccgggtgc ttacgctcgt 1080
gtttctgctt tcacctcttg gatcgctgaa acccgtcgtt cttctttctc tgacctggac 1140
ctcgag 1146
<210> 10
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn Val
20 25 30
Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile Met
35 40 45
Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys Leu
50 55 60
Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp Tyr
65 70 75 80
Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu His
85 90 95
Glu Trp Asp Glu Gly Glu Phe Gln Leu Glu Pro Pro Leu Asp Thr Glu
100 105 110
Glu Gly Arg Ala Ala Ala Asp Glu Trp Asp Glu Arg Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg
130 135 140
Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His
145 150 155 160
Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Val Val Gly
165 170 175
Gly Val Asn Ala Glu Lys Gly Ala Trp Pro Trp Met Val Ser Leu His
180 185 190
Trp Arg Gly Arg His Gly Cys Gly Ala Ser Leu Ile Gly Arg Asp Trp
195 200 205
Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Lys Asn Thr His Leu Gln
210 215 220
Tyr Trp Ser Ala Val Leu Gly Leu His Ala Gln Ser Ser Met Asn Ser
225 230 235 240
Gln Glu Val Gln Ile Arg Gln Val Asp Arg Ile Ile Ile Asn Lys Asn
245 250 255
Tyr Asn Arg Arg Thr Lys Glu Ala Asp Ile Ala Met Met His Leu Gln
260 265 270
Gln Pro Val Asn Phe Thr Glu Trp Val Leu Pro Val Cys Leu Ala Ser
275 280 285
Glu Asp Gln His Phe Pro Ala Gly Arg Arg Cys Phe Ile Ala Gly Trp
290 295 300
Gly Arg Asp Ala Glu Gly Gly Ser Leu Pro Asp Ile Leu Gln Glu Ala
305 310 315 320
Glu Val Pro Leu Val Asp Gln Asp Ala Cys Gln Arg Leu Leu Pro Glu
325 330 335
Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Met Leu Cys Ala Gly Tyr Pro Glu Gly Gly
340 345 350
Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Leu Glu
355 360 365
Asp Ala Arg Trp Thr Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Val Gly Cys
370 375 380
Gly Arg Pro Glu Arg Pro Gly Ala Tyr Ala Arg Val Ser Ala Phe Thr
385 390 395 400
Ser Trp Ile Ala Glu Thr Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asp Leu Asp
405 410 415。
Claims (10)
1.一种制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法，所述方法包括下述步骤：
形成包括编码融合标签msyB的多核苷酸和编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的表达载体；
将所述表达载体转化至宿主菌中，得到转化的宿主菌；
培养所述转化的宿主菌，使其表达包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基；
将所述包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基分离和纯化；和
将纯化后的包含融合标签msyB的青鳉鱼肠激酶活性亚基进行酶切，得到所述青鳉鱼肠激酶活性亚基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达载体进一步包括纯化标签，优选地，所述纯化标签为6His。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述6His在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码融合标签msyB的多核苷酸的序列如SEQID No:1中所示，并且所述融合标签msyB的氨基酸的序列如SEQ ID No:4中所示；
其中所述编码青鳉鱼肠激酶活性亚基的多核苷酸的序列如SEQ ID No:2中所示，并且所述青鳉鱼肠激酶活性亚基的氨基酸的序列如SEQ ID No:5中所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体为pET-28a、pET-28b或pET-28c。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主菌为带λDE3的溶源菌，优选大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶切用肠激酶进行，优选地，所述肠激酶选自牛肠激酶或青鳉鱼肠激酶。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的青鳉鱼肠激酶活性亚基。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的青鳉鱼肠激酶活性亚基在特异性酶切具有DDDDK序列的蛋白质中的用途，优选地，所述具有DDDDK序列的蛋白质为Trx-rhGH融合蛋白。
10.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合标签msyB、接头和青鳉鱼肠激酶活性亚基，优选地，接头包含6His标签，更优选地，所述接头在所述融合标签msyB和所述青鳉鱼肠激酶活性亚基之间，最优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID No:10中所示的氨基酸序列。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method, product, and use for preparing the active subunit of intestinal kinase in guppy Effective date of registration: 20230829 Granted publication date: 20220819 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI UNITED CELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023310000493 |
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