JP2844346B2 - 新規ペプチドならびに新規dna - Google Patents

新規ペプチドならびに新規dna

Info

Publication number
JP2844346B2
JP2844346B2 JP1135781A JP13578189A JP2844346B2 JP 2844346 B2 JP2844346 B2 JP 2844346B2 JP 1135781 A JP1135781 A JP 1135781A JP 13578189 A JP13578189 A JP 13578189A JP 2844346 B2 JP2844346 B2 JP 2844346B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rrf
amino acid
acid sequence
peptide
new
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP1135781A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03200797A (ja
Inventor
昭 梶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to JP1135781A priority Critical patent/JP2844346B2/ja
Publication of JPH03200797A publication Critical patent/JPH03200797A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2844346B2 publication Critical patent/JP2844346B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明のDNA及びリボゾームリサイクリング因子(RR
F:当初はリボゾーム−リリーシング・ファクターと称し
た)は、大腸菌における蛋白合成過程において、リボゾ
ームのmRNAからの離脱を促進するペプチドであり、生体
外でのペプチド合成を工業的に行う際に、その重要性が
期待できるものである。又RRFは新規抗生物質のターゲ
ットとして重要である。
[従来の技術および課題] 従来、その存在と機能については、本発明者等が報告
していた(Biochemistry,11,4037−4044(1972))が、
RRFを大量に生産せしめた例はなく、その選択的大量生
産が求められていた。
[課題を解決するための手段] 本発明者は、既に、本発明者等が報告したアッセイ方
法並びに精製方法(Biochemistry,11,4037−4044(197
2))により、その活性を確かめながら、精製し、BrCN
分解して得られた部分ペプチドのアミノ酸配列を決定
し、そのアミノ酸配列を基に、DNAプローブを合成し、
大腸菌の遺伝子バンクよりスクリーニングし、適当なベ
クターに組み込み、大腸菌で発現させることに成功し、
本発明のペプチドを提供するに至った。
即ち、本発明は、下記のアミノ酸配列 からなるペプチド又はその1もしくは数個のアミノ酸が
欠失、置換もしくは付加したペプチドをコードする新規
構造遺伝子ならびにRRFの大量製造方法に関する。
上述した本発明のペプチドアミノ酸配列および以下の
説明においては、Valは、バリン、Argは、アルギニン、
Serは、セリン、Thrは、スレオニン、Proは、プロリ
ン、Lysは、リジン、Alaは、アラニン、Hisは、ヒスチ
ジン、Asnは、アスパラギン、Glnは、グルタミン、Glu
は、グルタミン酸、Glyは、グリシン、Leuは、ロイシ
ン、Aspは、アスパラギン酸、Tyrは、チロシン、Ile
は、イソロイシン、Pheは、フエニルアラニン、Cysは、
システインの各残基を意味する。
本発明の新規ペプチドは、大腸菌等を用いた遺伝子組
換え法により、容易に大量生産できるという特徴を有し
ているので、遺伝子組換え法により生産するのが好まし
い。
以下に、本発明の新規ペプチドの製造方法について、
説明する。
1)構造遺伝子の入手 本発明のペプチドの構造遺伝子を例えばシーンライブ
ラリー例えば、ClarkとCarbonの遺伝子バンク(Cell,9,
91−99(1976))より、適当なプローブを用いて、釣取
するのが好ましい。特に、本発明者は、RRFの遺伝子が
大腸菌のF線毛接合時の2から6分領域に存在すること
を確認しており、この部分の遺伝子バンクより釣取する
ことが特に好ましい。
2)発現ベクターの調製 本発明においてはその発現のためのプロモーター等の
発現システムを有し、大腸菌内で増殖可能なさまざまな
プラスミドを用いることが可能であり、それらのプラス
ミドを調製するにあたつては、公知の常法に従って行う
ことができるが、市販の発現プラスミドを利用すること
も可能である。
これらのプラスミドに前記の本発明のペプチドの構造
遺伝子を含むDNAを一般の遺伝子組換えの操作によって
組込むことにより、プラスミド組換え分子を構築する。
3)組換え体の作成 常法にしたがい、この組み換え分子を用いて適当な大
腸菌株を形質転換し、形質転換体を得る。
4)ペプチドの生産 形質転換体の培養に当たつては、L−培地、M9培地、
M9−カザミノ酸培地、高リン酸培地、高リン酸−カザミ
ノ酸培地等を用いることができ、これらにおける培養に
より本発明のペプチドを量産することができる。
5)ペプチドの精製 大腸菌で発現したペプチドは、大腸菌を超音波破砕
後、遠心分離することによって、水溶性画分としての上
清を得、これにポリエチレンイミン等を加え、DNA、RN
A、リゾソームを沈澱させて除き遠心分離して上清を得
る。この上清より、硫安沈澱の手法を用い、粗分画を集
め、更に透析、陰イオンクロマトグラフィー等を行い精
製できる。
更に純度を上げるため、特異抗体を用いたアフイニテ
イークロマトグラフに付すのも好ましい。
以下、本発明について、実施例を示し、説明する。
[実施例] 1.RRFcDNAを含むプラスミドの単離 A)プローブの作成 本発明者等の報告(Biochemistry,11,4037−4044(19
72))したポリゾームを用いたRRF活性のアッセイ方法
を指標として、E.coli MRE600株のリボゾーム洗浄液よ
り本発明者等の報告(Biochemistry,11,4037−4044(19
72))した精製方法でRRF蛋白を精製して、NaDodSo4
含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動により、その
純度を確かめた。精製したRRF蛋白460μgをBrCN420μ
gとを室温、遮光下で、80%ギ酸50μ中で24時間反応
させた。この反応を450μの精製水を加えて停止せし
め、凍結乾燥後、再度0.1%トリフロ酢酸含有8M尿素水
溶液50μに溶解し、セフアデツクスG50カラムに付
し、0.1%トリフロ酢酸で溶出して、2種のフラクショ
ンを得、それぞれ、凍結乾燥し、アミノ酸配列分析に供
した。これを、プロテインシークエンサー(アプライド
バイオシステム470A)に付し、一方のフラクシヨンのN
末シークエンスが、AlaSerAspLeuGlyLeuAsnProAshSerAl
aGlySerAspIleArgValProLeuProProLeuであることを確か
め、DNA合成機(アプライドバイオシステム社製)によ
り大腸菌の利用コドンより推定した3′−TACCGCAGACTG
GACCCAGACTTGGGCTTGCCACGCCCAAGACTGTA(47塩基)を合
成し、RRF遺伝子のプロープとし、5′末端をT4ポリヌ
クレオチドキナーゼ及び(γ−32P)ATPを用いて32Pラ
ベルした。
B)プローブを用いてクローニングする前にクローニン
グを容易にするためRRF遺伝子の遺伝子座を決定した。
すなわち、種々のメロディプロイドの大腸菌中のRRF量
を測定して2分〜6分のメロディプロイドにRRFが倍増
することから、ClarkとCarbonの遺伝子バンク(Cell,9,
91−99)の内、0〜10分領域から20クローンを選抜し、
アルカリ融解を用いたミニプレパレーシヨン法(Maniat
is T.他,Molecular cloning(1982))でそれぞれのプ
ラスミドを得た。サザンハイブリダイズ法(Southern
E.M.,J.Mol.Biol.,98,503−517(1975))に従い、この
プラスミドをアガロースゲルよりNYTRAN膜に移し、プレ
ハイブリダイズした後、5×Denharts溶液、0.5% NaDo
dSO4、100μg/ml酵母tRNA、前述の合成プローブ(47塩
基)(0.6×108cpm/3.3pmole)を含有する6×SSPE(1
×SSPE:0.18M NaCl,0.01Mリン酸ナトリウム(pH.7.7),
1mM EDTA)溶液2ml中で、37℃、20時間ハイブリダイズ
した後、1% NaDodSO4を含有する1×SSPE溶液で洗浄
した結果、プラスミドpLC6−32にRRF遺伝子が存在する
ことを確認し、制限酵素EcoR Iで消化して2.2Kbの遺伝
子フラグメントを回収した。このフラグメントには、RR
Fの開始コドンから終止コドンまで(558塩基)が完全に
含まれていた。
2.遺伝子の発現 pLC 6−32を有するE.coli JA 200をコリシン1unit/ml
を含有する1.5mlのL−培地で定常期まで培養した。Man
iatisらの方法(Molecular cloning(1982))でこの大
腸菌よりプラスミドを抽出し、このプラスミドを10mMト
リス塩酸(pH 8.0)、1mM EDTAからなる溶液100μに
2.5 ODとなるように溶解し、この溶液よりプラスミド2.
0 OD相当量を取り、EcoR I 60 unitと混合し、BRLマニ
ュアル記載の反応溶液100μ中で37℃、3時間反応さ
せ、500mM EDTA10μをくわえて、反応終了後、0.3%
酢酸ナトリウム存在下、2倍量のエタノールでDNAを沈
澱させた。このDNAを1.2%アガロースゲル電気泳動に付
し、2.2kbのフラグメントを得た。Dumaisらのゲル内ラ
イゲーション法(Biotechniques,5,62−67(1987))に
より、このフラグメントとあらかじめEcoR I消化し、牛
小腸ホスフアターゼで処理してpUC 19ベクターをライゲ
ーションし、このライゲーション混合物10μをE.coli
DH5a 50μにトランスフォームし、50μg/mlアンピシ
リン、2%X−Gal 50μを含有するL−培地プレート
に撤いた。白色のコロニーとして、プラスミドを含む菌
を得、これらのうちから、サザン法により、pUC 19にRR
Fの遺伝子を含む2.2kbのプラスミドの組み込まれたプラ
スミド(pRR1)を含む菌(DH5a/pRR1)を得た。この菌
を培養し、Caskeyらの方法(J.Bacteriol.,158,365−36
8(1984))で調製した菌体分解物の総蛋白をSDS電気泳
動に付し、ゲルをクマシブルー染色し、Bradfordの方法
(Anal.Biochem.,72,248−254)で定量した。ここで、
大量菌の総蛋白の70%以上がRRFと同様の泳動速度を示
した。
更に、上記の2.2kbのフラグメントのうちのSma Iおよ
びEcoR I消化フラグメント(0.9kb)を同様にpUC19ベク
ターにライゲーションしてトランスフォームした場合
は、大腸菌の総蛋白の90%以上でRRFであった。
これらの大腸菌の抽出液のRRF活性を測定したとこ
ろ、通常の大腸菌に比べ圧倒的に高いRRF活性が認めら
れた。
3.RRFの精製 この菌体液より、本発明者等の報告(Biochemistry,1
1,4037−4044(1972))したポリゾームを用いたRRF活
性のアッセイ方法を指標として、DH5a/pRR1の菌体溶出
液より、本発明者等の報告(Biochemistry,11,4037−40
44(1972))した精製方法でRRF蛋白(分子量約20,000
ダルトン)を精製した。
4.DNAシークエンスの解析 また、pRR1を制限酵素EcoR I、Sma I、Sau3AIおよびB
gl IIで消化してえられたフラグメントについてジデオ
キシ法によりDNAシークエンス分析を行ったところ、RRF
の開始コドンから終止コドンまでのDNAシークエンス
は、 の(558塩基であり、そのDNAシークエンスに対応するア
ミノ酸シークエンスは、 であり、185アミノ酸、分子量20,639であることが確
認され、上記で得られた蛋白に対応するものであった。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記の(a)又は(b)のペプチドをコー
    ドする新規DNA。 の配列を有するペプチド。 (b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のア
    ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
    らなり、かつリボゾームリサイクリング因子(RRF)活
    性を有するペプチド。
  2. 【請求項2】下記のアミノ酸配列 からなるリボゾームリサイクリング因子(RRF)をコー
    ドする新規DNAが の配列のもの又はその縮重配列のものである新規DNA。
  3. 【請求項3】リボゾームリサイクリング因子(RRF)を
    コードしている遺伝子で形質転換されたE.coliを宿主細
    胞として培養しリボゾームリサイクリング因子を産生さ
    せ、当該細菌からリボゾームリサイクリング因子を回収
    することを特徴とする下記アミノ酸配列又はその1もし
    くは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
    ミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するリボゾームリ
    サイクリング因子の製造方法。
JP1135781A 1989-05-31 1989-05-31 新規ペプチドならびに新規dna Expired - Fee Related JP2844346B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1135781A JP2844346B2 (ja) 1989-05-31 1989-05-31 新規ペプチドならびに新規dna

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1135781A JP2844346B2 (ja) 1989-05-31 1989-05-31 新規ペプチドならびに新規dna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03200797A JPH03200797A (ja) 1991-09-02
JP2844346B2 true JP2844346B2 (ja) 1999-01-06

Family

ID=15159702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1135781A Expired - Fee Related JP2844346B2 (ja) 1989-05-31 1989-05-31 新規ペプチドならびに新規dna

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2844346B2 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037202A1 (fr) * 1997-02-24 1998-08-27 Akira Kaji Isolation de genes de facteur recyclant les ribosomes et determination des structures primaires de genes de facteur recyclant les ribosomes de pseudomonas aeruginosa et d'une autre bacterie
EP2794635B8 (en) * 2011-12-22 2018-11-14 H. Hoffnabb-La Roche Ag Ion exchange membrane chromatography

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemistry,Vol.11,No.22,p.4037−4044(1972)

Also Published As

Publication number Publication date
JPH03200797A (ja) 1991-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU659139B2 (en) Hybrid polypeptide
JP2686090B2 (ja) 新規融合蛋白質およびその精製方法
JP2694840B2 (ja) ポリペプチドを微生物により発現させる方法
JP3041644B2 (ja) ユビキチン特異的プロテアーゼ
CN111117977B (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
EP4328316A1 (en) Preparation method for polypeptide
CN109055339B (zh) Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用
US5047333A (en) Method for the preparation of natural human growth hormone in pure form
JP2844346B2 (ja) 新規ペプチドならびに新規dna
JP2021511785A (ja) 組換えポリペプチド生産用n末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法
CN107629129B (zh) 生产和纯化多肽的方法
US5620923A (en) Synthesis of peptides as cloned ubiquitin extensions
Scarabel et al. Overproduction, purification and structural characterization of the functional N-terminal DNA-binding domain of the fru repressor from Escherichia coli K-12
KR102064810B1 (ko) 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법
Chevalier et al. [31] Purification and properties of BiP
JPH02234679A (ja) ヒトラミニンb1鎖ポリペプチド断片及びこれを生産するための発現ベクター
CN114702571B (zh) 一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法
CN111349623B (zh) 9°n dna聚合酶突变体
CN111197041B (zh) 制备青鳉鱼肠激酶活性亚基的方法、其产物和用途
KR100535265B1 (ko) 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법
CA2232841A1 (en) Process for producing natriuretic peptides via streptavidine fusion proteins
CN116410961A (zh) 烟草蚀刻病毒蛋白酶融合蛋白及其制备方法和应用
CN116217699A (zh) 一种高效表达羊生长激素的方法
CN114480346A (zh) 一种dna水解酶及其制备方法
JPH0279978A (ja) δ−エンドルフィン

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees