JPH0279978A

JPH0279978A - δ−エンドルフィン

Info

Publication number: JPH0279978A
Application number: JP63231248A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Iwakura; 正寛巌倉; Shinichi Ohashi; 信一大箸; Tsukasa Sakai; 坂井　士; Yoshio Tanaka; 芳雄田中
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1988-09-14
Publication date: 1990-03-20
Also published as: JPH042235B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、δ−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に関する。

α−エンドルフィンは、１９個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。

α−エンドルフィン：　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−５ｅ
ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ本発明の新規組換えプラスミドｐＥＮＤＤ２は。

第１図において示されるＤＮＡ配列を有する。本発明は
９発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術］ δ−エンドルフィンは９モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。

ロイシンエンケファリンの約４．４倍、メチオニンエン
ケファリンの約２．９倍の鎮痛活性を示す興味深い生理
活性ペプチドである。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いδ−エンドルフィンの製造方法既に、米発明者らは、
大腸菌由来のジヒドロ葉〜１酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す。）遺伝子に関して
、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミ
ドベクターｐＴＰ７０−１　（特願昭６１−３１２８３
６）と、それを利用した融合遺伝子の作成方法（特願　
昭６２−３０２１５３）を開発している。また、ｐＴＰ
７０−１にメチオニンエンケファリン（以下、ＭＥＫと
略す、）を暗号化する化学ＤＮＡを組み込んで、ＭＥＫ
の効率よい生産方法を開発している（特願　昭６３−７
９６８０）。効率のよいＭＥＫの生産方法を開発する際
に得られた組換えプラスミドｐＭＥＫ２は、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉ部位の間の配列を異種ＤＮＡと取
り替えるだけで、ＤＨＰＲとの融合遺伝子を容易に作成
できる。また、ｐＭＥＫ２を利用して融合遺伝子を作成
した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タンパ
ク質の大腸菌菌体の蓄積量としては、全菌体タンパク質
の約２０％が期待される。しかしながら、δ−エンドル
フィンの生産に上記発現ベクターを用いた例はない。

［発明の目的コ本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたδ−エンド
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。

本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
δ−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、　　ｐＭＥＫ２に組み込むことにより、δ−エン
ドルフィン遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子を作
成し、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、Ｄ
ＨＦＲ−δ−エンドルフィン融合タンパク質（以下、融
合タンパク質と略す。〉を大量に生産できることを見い
だし。

さらに、融合タンパク質を用いることにより効果的にδ
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし２本発
明を完成させた。

可能にする新規組換えプラスミドｐＥＮＤＤ２゜（２）
　ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌菌体、（３）ｐＥＮＤ
Ｄ２を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、（４
）ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌からの融合タンパク質
の分離精製方法、および（５）融合タンパク質を用いた
δ−エンドルフィンの製造方法、の発明により構成され
る。

（１）新規組換えプラスミドｐＥＮＤＤ２第１図は８本
発明のｐＥＮＤＤ２の全塩基配列を示している。図は、
２本鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、プ
ラスミド中に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位のう
ち制限酵素Ｈｉｎｄｍ部位、に近い方の切断認識部位、
　５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’、の最初の”Ａｌ１を１番
として数えて、５′末端から３′末端の方向に記述して
いる。本発明のｐＥＮＤＤ２は、新規な朝換えプラスミ
ドである。

ｐＥＮＤＤ２は、４６８２塩基対の大きさであり。

宿主である内１稈菌にトリメトプリムおよびアンピシリ
ン耐性？’イを与することができる。ｐＥＮＤＤＫを暗
号化する配列を含む２６塩基対の配列を。

δ−エンドルフィンを暗号化する配列を含む６８塩基対
の化学合成りＮＡと置き換えた構造をしている。第１図
において、５３３番目から６００番目迄日進列が化学合
成りＮＡ由来の配列である。

それ以外の配列がｐＭＥＫ２由来の配列である。

第１図の５７番目から５９６番目まで配列は。

ＤＨＰＲのカルボキシ末端側にδ−エンドルフィンがア
ルギニン（Ａｒｇ）を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。

融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。

遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願
　昭６１−３１２８３６）。即ち、４３番目から５０番
目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、４６４０番目から４６６８番目までが、
コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写
に貢献する。このことから、ｐＥＮＤＤ２は、大腸菌に
導入された場合、多量の融合タンパク質を作らせること
ができる０作られた融合タンパク質は、菌体内に可溶性
の状態で２面体タンパク質の約２０％程度蓄積する。こ
のことによって、ｐＥＮＤＤ２を含有する大ｉ！菌はト
リメトプリム耐性を示すようになる。また、ｐＥＮＤＤ
２は、ｐＭＥＫ１由来の。

アンピシリン耐性遺伝子を有している。このことから、
ｐＥＮＤＤ２が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す。ｐＥＮＤＤ２は、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、ｐＥＮＤＤ２を含有する大ＩＩｉ菌は、微
工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０３１として寄託されてい
る。

このような特長を有するｐＥＮＤＤ２は、実施。

例１に従って作成することができるが９Ｍｉ換えプラス
ミドの作成方法によって本発明が制限されるものではな
い。

（２）ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。ｐＥＮＤＤ２
を含有する大腸面をＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、５
ｇのＮａＣｌ、８ｇのトリプトン。

５ｇのイーストエキス、及び５０ｍｇのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地）を用いて、３７℃で定常期ま
で培養り、た場合、蓄積する融合タンパク質は２面体タ
ンパク質の約２０％に達する。

培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
融合タンパク質は上清中に回収される。ｐＥＮＤＤ２を
含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０３
１として寄託されている。

（３）融合タンパク質第２図は、　融合タンパク質を暗号化する部分のＤＮＡ
配列とそれから作られると予想されるタンパク質のアミ
ノ酸配列を示している。融合タンパク質は、１８０アミ
ノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側か
ら数えて、１から１５９番目までの配列が、大腸菌の野
生型ＤＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換が起こった（　
Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　−＋　Ｇｌｕ
−１５２）配列であり、１６２番目から１８０番目まで
がδ−エンドルフィンの配列である。δ−エンドルフィ
ンの配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Ａ　ｒ　ｇ）
である。δ−エンドルフィンはアルギニンを含まない。

このことから。

融合タンパク質をアルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒ
ｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として
人手可能）で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。１６０と１６１番目のイソロイシン（Ｉｆｅ
）−ロイシン（Ｌｅｕ）の配列は、ｐＭＥＫ２のＢａｍ
Ｈ１部位にδ−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡを導
入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるために生
じた配列である（ｐＭＥＫ２のもとどなったｐＴＰ７０
−１が作るＤＨＦＲから数えて、１から１６０番目まで
の配列に。

Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。）。融合タンパク質およびδ−エンドルフィ
ンの分子量は、それぞれ２０，４１０および２．１３４
である。

融合タンパク質は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤ）（ＦＲのカルボキシ末端側に。

δ−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。

ＤＨＦＲの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。

（４）融合タンパク質の分離精製本発明の融合タンパク質の分Ｍ精製法は、■菌体の培養
、■菌体の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨパール力うム処理、
■メソトリキセート（ＭＴＸ）結合アフィニティクロマ
トグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラムク
ロマトグラフィーの過程より成り立っている。

■菌体の培養ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌のｔｇ糞は、ＹＴ＋Ａｐ
培地（培地ＩＩ中に、５ｇのＮａＣｌ、８ｇのトリプト
ン＋５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地。

）で培養することができる。培地としては、この他にＳ
Ｔ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に＋２ｇのグルコース、１ｇ
のリン酸２カリウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイー
ストエキスおよび５０　ｍ　ｇのアンピシリンナトリウ
ムを含む液体培地。）など。

面体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＹＴ＋Ａｐ培地が最
適であった。

ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌を、培地に接種し、３７
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、５，０００回転／分の遠心分離により集
める。培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得られる
。

集面およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（ｏ、Ａ）ら１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。

■菌体の破砕培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝液１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カワウム緩衝液、ｐＨ７
，０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕す
る０面体破砕液を、３５゜０００回転、１時間超遠心分
廂し、上溝を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラム処理無細胞抽出液を、あらかじめ５０ｍＭのＫＣＩを含む緩
衝液１で平衡化したＤＥＡＥ）ヨパールカラムにかけ、
カラム容量の５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液１でカラム
を洗う、酵素の溶出は、緩衝液ｌを用いて０．１Ｍから
０．３Ｍ（７）ＫＣＩ（７）直線濃度勾配を用いて行い
、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて
分画する。酵素の溶出は、０．３ＭのＫＣｌを含む緩衝
液ｌを用いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコ
レクターを用いて分画する。分画した溶出液についてＤ
ＨＦＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める
。

■ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡
化したＭＴＸ結合アガロースーアフィニティ力ラムに吸
着させる。吸着後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液２　（０
，１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
、　　ｐＨ８，５）で洗う。洗いは、カラムからの溶出
液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．１以下
になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、ＩＭ
のＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する０分画した溶出液についてＤＨＰＲ活性を測定し
、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた酵素液を
、ｖＭ衝液ｌに対して。

３回透析する。この段階で、純度９５％以上の融合タン
パク質が得られる。

！：１ ■ＤＥＡＥ−ドヨパール力ラムク口マトグラフィ透析、
えｉ偏２．あ、ヵ１６．１１Ｇカ化したＤＥＡＥ−）ヨ
パール力ラムに吸着させる。

吸着後、５０ｍＭＫＣＩを含む緩衝液１で洗う。

酵素の溶出は、緩衝液１を用いて５０ｍＭから０゜３Ｍ
のＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて分画する。分画し
た溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦＲＨＦ上
を測定する。

酵素活性／２８０ｎｍの吸光度の値が、一定な両分を集
める。

以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、培養を含め
て一週間以内に行うことができ２回収率４５％以上で、
均一な酵素標品を得ることができる。

ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０））を、１ｍｌのキュヘットとり、これに酵素液を
加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定することに
より行う。酵素ｌユニットは、上記反応条件において、
１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義する。この測定は９分光光度計
を用いて容易に行うことができる。

（５）融合タンパク質を用いたδ−エンドルフィンの製
造精製した融合タンパク質からの８−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒｇｉ
ｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として入手
可能）で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質１重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ０
．０１３４量の割合で加え、３７℃で５０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＭＣＩ緩衝液、ｐＨ８，５中、２４時間処理する
。反応液に等量の５０％酢酸を加える。；の試料を、Ｈ
ＰＬＣ装置（島津り当Ｃ−４Ａ　、　１ｎｅｒｔ′ｓｉ　ｌ−００５カラム）
を用いて、０．１溶出物は、２２０ｎｍにおける吸光度
の測定により検出することができる。第３図は、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ処理したエンドルフィン融合タ
ンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示している。

試料注入後約２２．５分後のピークがδ−エンドルフィ
ンである。このピーク画分を分離する。分離した溶出液
をエバホレーターで乾燥後。

少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、δ−エンドルフ
ィンを得ることができる。また、得られたペプチドを酸
加水分解後、アミノ酸分析することによりアミノ酸組成
を確かめることができる。

本発明の実施例においては、３１の培地から湿ｔｒｉｍ
約１３ｇの面体が得られ、この面体（計算上。

約２５３ｍｇの融合タンパク質、約２６．８ｍｇのδ−
エンドルフィンを含む、）から、約１１６ｍｇの融合タ
ンパク質（収率、４６％、計算上約１２ｍｇのδ−エン
ドルフィンを含む、）を精製して得ることができ、この
うち、２０ｍｇの融合タンパク質をフルギニルエンドペ
ブチダーゼ処理後、ＨＰＬＣで分離・精製することによ
り、約０゜６８ｍｇのδ−エンドルフィンを得ることが
できた。

［発明の効果コ本発明の、新規プラスミドｐＥＮＤＤ２およびｐＥＮＤ
Ｄ２を含有する大腸薗を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分離精製することが得られる
こと、また、タンパク質分解酵素で処理することにより
融合タンパク質から効率よくδ−エンドルフィンを切り
出すことができることからモルヒネ様生理活性を有する
ことが知られているδ−エンドルフィンの生産に有効で
ある。

次に本発明の実施例を示す。

ｐＥＮＤＤ２の作成 δ−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＣＴＣＡＧ−３’２．５’−ＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’３、５’−ＴＣＧＡＧ
ＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’４、５’−Ｔ
ＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧ−３’５、５’
−ＧＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＣ−３’６、
５’−ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡ
ＣＣＡＧＣＧＧＧＧ−３’の６本のＤＮＡをホスホアミ
ダイト法に従って化学合成し、精製後、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて、各ＤＮＡの５′末端をリン酸化し
た。リン酸化したＤＮＡを約０．１ｍ１（約０．０１ｇ
ｇのＤＮＡを含んでいる。）ずつ取り、これを６０℃で
インキュベートすることによって両ＤＮＡをアニールさ
せた（これをＤＮＡＩと呼ぶ）。

約１μｇのｐＭＥＫ２を、ＢａｍＦ（ＩおよびＸｈｏｌ
で切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした。ア
ルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノール処理
することにより、共存する酵素タンパク質を変性除去し
、その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤ
ＮＡを７０％エタノールで洗った後、エタノールを除き
、減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ
ｌによるＤＮＡの切断、アルカリホスファターゼ処理、
フェノール処理、およびエタノール沈澱の各操作は、い
ずれも、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ８ＡＬ
ｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　（Ｔ、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、ε、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）、以下９文献
１と呼ぶ。）に記載している方法に従って行った。乾燥
させたＤＮＡを５０μｍのリガーゼ用反応液（１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−■ｃＩ、ｐＨ７，４，５ＩＩＩＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１Ｏｎ＋Ｍジチオトレイトール。

５　ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解後、５μｌのＤＮＡＩを加え
、これに１ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて。

１０℃で、１２時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。

この反応物を、形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎａ＋ｅｔｈｏｄ、上記文献１に記載）に従って、大
＆ｊＪ菌ＨＢＩＯＩ株に取り込ませた。この処理をした
面体よび１０　ｍ、ｇ１／　ｍ　ｌのトリメトプリムを
含む栄養寒天培地（培地ｌｌ中に、２ｇのグルコース、
１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス。

５ｇのポリペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布
し、３７℃で２４時間培養することにより。

６個のコロニーを得ることができた。これらのコロニー
を、１．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に、５ｇ
のＮａＣ１，５ｇのイーストエキス。

８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウム
を含む。）で、３７℃、１晩、菌体を培養した。培養液
を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、１２，０００回
転／分で１０分間遠心分離し。

菌体を沈澱として集めた。これに、０．１ｍｌの電気泳
動用サンプル調製液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ。

ｐＨ６，８，２Ｘ（７）　５　ウ’）　弗硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）。

１０％のグリセリン、５χの２−メルカプトエタノール
。

０．００１Ｘのブロムフェノールブルーを含む、）を加
え２Ｍ体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち。

菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｕ、Ｋ。

Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　
、ｐ、６８０（１９７０））に従って分析した。標準サ
ンプルとしてｐＭＥＫ２を含有する大腸菌に同様な処理
をしたもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン（分子ｆｆ１１４．２００）、トリプシンインヒビ
ター（分子ｆｔ２０，１００）、トリプシノーゲン（分
子１ｉ２４，０００）　、カルボニックアンヒドラーゼ
（分子ｆ１２９，０００）　、グリセロアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（分子ｆｆ１３６，０００）、
卵アルブミン（分子量４５，０００）　、および牛血清
アルブミン（分子量６６．０００）を含むサンプルをポ
リアクリルアミド濃度の１０から２０％濃度勾配ゲルで
泳動した。その結果、すべてのコロニーにおいて、ｐＭ
ＥＫ２のＤＨＦＲ−ＭＥＫＭ合タンパク質のバンドが消
失し、それより明らかに分子量が大きくなったタンパク
質（分子量約２４，０００と推定される。）が認められ
た。ｐＭＥＫ２のＤＨＦＲ−ＭＥＫ融合タンパク質（分
子量、１８，９６３）は、この条件で分子量約２２，０
００のタンパク質として泳動する。得られた６個のコロ
ニーから適当にＪ、　Ｂａｃｔｅｒ”’ｉ−ｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ、１２１．ｐ、３５４（１９７５））に従っ
て、プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＥ
ＮＤＤ２と名づけた。ｐＥＮＤＤ２は、ｐＭＥＫ２のＢ
ａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉとの間の配列が。

化学合成したＤＮＡ配列と置き変わった構造をしている
はずである。ｐＥＮＤＤ２のＥｃｏＲＩ　（第１図の４
７１−４７６番目の配列）と５ａｌＩ（第１図の８９９
−９０４番目の配列）による切断によって得られる約４
００ヌクレオチド長のＤＮＡについて９Ｍ１３フアージ
を用いたジデオキシ法（Ｊ、ＭｅＳＳＩｎ８＊Ｍｅｈｔ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０
１．ｐ、２０（１９８３））に従って、塩基配列を決定
した。その結果、第１図に示す配列の４７１番目から約
９０４番日進の配列が確かめられた。塩基配列を検討す
ることにより、ｐＥＮＤＤ２が融合タンパク質を暗号化
することが明らかとなフた。

ｐＭＥＫ２の塩基配列は２本発明者らによって明らかに
されている（特願　昭６３−７９６７９）。また、ｐＥ
ＮＤＡ２のＥｃｏＲ［−５ａｉｌ切断によって得られる
約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｈｉｎ
ｄｍ、Ｈｐａｌ、ＡａｔＩ［。

ＰｖｕＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＣ１ａｌを用いた制限
酵素による切断実験の結果、ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ−
Ｓａｌｌ切断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤ
ＮＡと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＥＮＤＤ２の全塩基配列が第１図に
示した配列であることが決められた。

実施例２ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌が作る融合タンパク質ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌が作る融合タンパク質の
アミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想することが
できる。第１図の５７番目から５９６番目の配列が融合
タンパク質を暗号化していることから、トリブレット暗
号表を用いて、アミ融合タンパク質の精製Ａ、用いた菌体ｆｆｉ：湿重ｊｉ１３ｇＢ、酵業精製表表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−）
ヨバール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨバー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。

精製　酵素液　回収タンパ　回収酵素　収率過程　の量
（１）り質（ｎａｇ）　　　活性（ユニット）（Ｘ）６
．７６３５、１１３４　、９８６３．０９０７５．６７３．７４５．７得られた酵素タンパク質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施
例に記載の方法）により分析したところ。

分子置駒２４　、０００の単一なタンパク質バンドが示
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。

分離Ｍ製した融合タンパク質の性質精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した（カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
）、その結果。

−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　（カルボキシ末端
）であることが予想された。また、精製して得られたタ
ンパク質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ
。

塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結果
が得られた。

実施例３精製分離した融合タンパク質からのδ−エンドルフィン
の分離実施例２で得られた２ｍｌの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液＜＊衝液１中、約２０ｍｇ。

約９８０ｎｍｏｌｅの融合タンパク質を含む）に。

０．２ｍｇのフルギニルエンドペブチダーゼを加え、３
７℃で２４時間反応させる。反応後、１ｍｌの酢酸を加
える。そのうちの、０．５ｍｌ　（約１０９ｎ１０９ｎ
の融合タンパク質を含むはず）をとり、高速液体クロマ
ドグフィー装置（島津ＬＣ−４Ａ）を用い１ｎｅｒｔｓ
ｉｌ’−０ＤＳ　５μｍカラムで分離した。溶出は、０
．１％トリフルオロ酢酸中。

アセトニトリルの濃度勾配（１５％から５０％）をかけ
ることにより行った。０から２分までは。

１５％の７セニトリルを用い、２分から３２分までは、
１５％から６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配をか
けた。その結果、第３図に示すようホレーターで乾燥後
、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得
た。得られたペプチドを酸加水分解後、その１０分の１
をアミノ酸分析に用いた。その結果、グルタミン＋グル
タミン酸。

ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。

チロシン、およびバリンが、それぞれ、？、３゜７．６
．　　７．７．　　７．０，３．３．　　７．０゜３、
５．　６．９．　９．２．　３．　１．および３．６ｎ
ｍｏｌｅずつ検出された。アミノ酸組成は、δ−エンド
ルフィンのそれと一致した。また。

アミノ酸分析に用いた標品は、約３．５ｎｍｏｌｅ（約
７．５ｎｇ）のδ−エンドルフィンを含んでいたことに
なる。この結果から、精製均一化した融合タンパク質を
用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した標品を
ＨＰＬＣを用いて分離することにより収率約３２％でδ
−エンドルフィンを回収できることが明かとなった。融
合タンパクな溶出曲線が得られた。試料注入後約２２．
５分後のピーク画分を分難し２分離した溶出液をエバる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥＮＤＤ２の全塩基配列を示した図であり
、２本鎮ＤＮへのうち片方のＤＮＡＳｉ配列だけを、５
′末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している０図中番号は
、ｐＥＮＤＤ２に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断
認識部位のうち制限酵ｇＨｉｎｄｌｌ！切断部位に近い
方のＣ１ａｌ切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡＴ−
３′、の最初の”′Ａパを１番として数えた番号を示し
ている。第２図は、ｐＥＮＤＤ２中に存在する融合タンパク質を
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを。質のＭ製の収率が約４６％であり、融合タンパク質から
のδ二晃ンドルフィンの分離の収率が約３−會：ｌＩＣはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは
アスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓは
システィンを、Ｇｉｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸を、Ｇｌｙはグリシンを＋　Ｈ１ｓはヒスチジン
を、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌ
ｙｓはリジンを。Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを。Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るＡＴＧコドンのＨＡ　Ｔｊを１番として数えた番号を
示している。第３図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した融合
タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示している
。横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、２２０
ｎｍの吸光度を任意単位で表現している。木戸で示した
ピークがδ−エンド薯１ルフィンの溶出ピゴクである。第図のＧωＧα；ＣＡＴＧ　ＡσＡπσ■刃ＣαＣＡ口ＴＡＴ
　ＧＡσＩ’＆Ｔσ１−１ｔ：　’１−ＩＴＡ’ｌｔ；
＾ｌ坑第図のＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧ　ＡＡにＣＧＴＧＧＣＧ　ＣＴＴ
ｒＣＴＣＡＡＴ　ＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧ　ＴＡＧＧＴＡ
ＴＣ’１℃第図の第図のＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ　ＧＣＧｆ？ＴＴＡＧＣＴ　ＣＣ
’１ＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴ　ＧＴＣＡＧ
ＡＡＧＴＡ第図の ’ＩＴＡＡＣＴＡＩＴｒ　ＧＴＴＡＴＡＡＴＧＴ’　Ａ
ＴｒＣＡＴＡＡＧＣＴｒ第図

Claims

【特許請求の範囲】１、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、４６８２塩基対の大きさを有し、第１図に
おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
ドｐＥＮＤＤ２。２、ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌。３、ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌が生産し、第２図に
よって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元
酵素−δ−エンドルフィン融合タンパク質。４、ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ
葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−δ
−エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細胞
抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラム
クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒド
ロ葉酸還元酵素−δ−エンドルフィン融合タンパク質の
分離精製方法。５、ｐＥＮＤＤ２を含有する大腸菌の生産するジヒドロ
葉酸還元酵素−δ−エンドルフィン融合タンパク質を分
離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−δ−エンド
ルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化し
た後、δ−エンドルフィンを分離精製することを特徴と
するδ−エンドルフィンの製造方法。