JPH01144978A - 新規組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有することが知
られている牛成長ホルモン放出因子（以下、ＧＲＦと略
す。）のうち、一番目から２９番目迄のペプチドフラグ
メントをカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵
素の生産を可能とする新規組換えプラスミドに関するも
のである。

本発明の新規組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５は、第
１図に示されるＤＮＡ配列を有する。

ｐＧＲＦ２−１５およびｐＧＲＦ２−１５を含有する大
腸菌は９発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術および問題点 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡを
２例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに朝み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入い目的遺
伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリペプチ
ドを分離精製することが行われている。このような状況
においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且つ効率
よく発現させる組換えプラスミドを構築することが最も
重要な課題である。また、目的ポリペプチドが異なれば
自ずからその方法論が異なっており、この点が解決しな
ければならない技術課題である。

ＧＲＦは生長ホルモンの分泌を促すペプチドである。牛
のＧＲＦは４４個のアミノ酸からなり。

その配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−アス
パラギン酸−アラニン−イソロイシン−フェニルアラニ
ン−トレオニン−アスパラギン−セリン−チロシン−ア
ルギニン−リジン−バリン−ロイシン−グリシン−グル
タミン−ロイシン−セリン−アラニン−アルギニン−リ
ジン−ロイシン−ロイシン−グルタミン−アスパラギン
酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−アル
ギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタミ
ン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グルタ
ミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−バ
リン−アルギニン−ロイシンであり、カルボキシ末端が
アミド化されている。

ＧＲＦは、視床下部に存在するが、その含量は少なく、
牛５００頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり、効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。牛ＧＲＦとその構造が極めて良く似たヒ）Ｇ
ＲＦは、４４個のアミノ酸よりなるが、このうち一番目
のチロシンから２９番目のアルギニンまでのペプチド部
分く以下。

ＧＲＦＩ−２９と示す。）だけでも、ＧＲＦの約４分の
１の活性を持つことが報告されている（Ｎ、Ｌｉｎｇ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

ｖｏｌ、　１２３．　ＰＪｌ、、８５４（１９８４））
。

だ組換えプラスミドについては２本発明者らが構築した
ｐＧＲＦ２Ｂ−２９が公知である（特開昭６２−１１５
２８７）。しかしながら、ｐＧＲＦ２８−２９を組み込
んだ大腸菌においては、目的ポリペプチドが発現される
が、その量は非常に少なく２問題である。

一般に２分子ｆｆ１１万以下のポリペプチドは、大腸菌
などの宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなど
によって分解されるため安定に細胞内に蓄積されない。

これは２分子として小さいため安定なコンホメーション
をとれないためであると考えられている。従って、遺伝
子操作を利用してＧＲＦＩ−２９などの短いポリペプチ
ドを生産しようとした場合、融合遺伝子を作成し、融合
タンパク質として発現させることが必要であると考えら
れる。

発明の目的 本発明の目的は、上記の問題点を解決するために、ＧＲ
ＦＩ−２９の大量生産を可能にする絹換えプラスミドを
開発することにある。また２本発明は、遺伝子操作の手
法を用いてＧＲＦＩ−２９を大量に生産する方法の開発
の一環として行われたものである。

本発明者らは、既に本発明者らが（１）大腸菌のＤＨＦ
Ｒを大量に発現する発現プラスミドを構築していること
（特願　昭６Ｏ−２１０８１３）。

（２）大腸菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側の配列を変
化させても、枯草菌のＤＨＦＲ同様酵素活性が失われな
いこと、（３）大腸菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側に
異種ペプチドを融合させることを可能とするプラスミド
ベクターｐＴＰ７０−１を構築していること（特願　昭
６１−３１２８３６）、（４）　ｐＴＰ７０−１上の改
変ＤＨＦＲは、大腸菌で効率良く発現すること、を明ら
かにしている。

本発明者らがすでに明らかにしている上記の特徴を利用
し、鋭意研究を行った結果、ｐＴＰ７０−１を用いるこ
とにより、ＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側にｃ杖Ｆｉｘ−
２９遺伝子を結合し２組換えプラスミドを作成し、これ
を大腸菌に導入し２発現させることにより、ＤＨＦＲの
カルボキシ末端側にＧＲＦ　１−２９が結合した融合タ
ンパク質が。

大Ｍ菌で安定に発現・蓄積することを見いだし。

その知見に従って、ｐＴＰ７０−１にＧＲＦＩ−２９遺
伝子を絹み込んだ組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５を
作成し２本発明を完成させた。

発明の構成 第１図は２本発明の組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５
の全塩基配列を示している。本発明のｐＧＲＦ２−１５
は、４７１５塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌
にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与するこ
とができる。ｐＧＲＦ２−１５は、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ
６００株に導入されて安定状態に保たれ、ｐＧＲＦ２−
１５を含有する［：、　ｃｏｌｉＣ６００株は、ｙ＆工
研にＦＥＲＭ［３Ｐ−１５７８として寄託されている。

ｐＧＲＦ２−１５は、ｐＴＰ７０−１０ＢａｍＨＩ切断
部位に、ＧＲＦＩ−２９を暗号化する配列を含む１０７
塩基対のＤＮＡが挿入した構造である。第１図において
、５３３番目から６３９番目迄の配列が挿入された配列
であり、それ以外の配列がｐＴＰ７０−１の配列と全く
同一である。

第１図の５７番目から６３５番目の配列は、ｐＴＰ７０
−１の改変ＤＨＦＲのカルボキシ末端側にＧＲＦＩ−２
９がイソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニ
ンよりなる４つのアミノ酸よりなる配列を介して結合し
た融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＩ−２９と
記す。）を暗号化する。第２図は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＩ
−２９を暗号化する部分のＤＮＡ配列とそれから作られ
るタンパク質のアミノ酸配列を示している。ＤＨＦＲ−
ＧＲＦ　１−２９は、１９３アミノ酸よりなるタンパク
質であり、このうちアミノ末端側から数えて、１から１
５９番目までの配列が、大腸菌の野生型ＤＨＦＲに１箇
所アミノ酸置換置換が起こった（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉ
ｌｄ　ｔｙｐｅ）　＋　Ｇｌｕ−１５２）配列であり、
１６１から１６４番目のイソロイシン−グルタミン酸−
グ１ルンーアルギニンの配列は、牛血液凝固因子Ｘａの
認識切断配列であり、最終的に牛血液凝固因子Ｘａで処
理することにより、　　ＧＲＦ　１−２９ペプチドを切
り出すことを可能とする配列である。１６０番目の配列
は、ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ由来のアミノ酸である。

１６５から１９３番目迄がＧＲＦＩ−２９の配列である
。ｐＴＰ７０−１が作る改変ＤＨＦＲは、１６２個のア
ミノ酸よりなり、第２図のＤＨＦＲ−ＧＲＦｌ−２９の
アミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数えて、１から
１６０番目までの配列に。

Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。

ＤＨＦＲ−ＧＲＦ　１−２９は、　　ｐＴＰ７０−１の
改変ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に、ＧＲＦＩ−２９が
融合した構造をしているにもかかわらず。

ＤＨＦＲ酵素活性を有する。このため、大腸菌がＤＨＦ
Ｒ−ＧＲＦｌ−２９を多量につくると。

ＤＨＦＲの阻害剤であり、抗ｍ菌剤であるトリメトプリ
ムに対して、耐性を示すようになる。

ＤＨＦＲ−ＧＲＦ　１−２９を暗号化する配列の上流に
は、ｐＴＰ７０−１の改変ＤＨＦＲ遺伝子の発現を効率
良く行わせる配列が存在する（特願昭６ｌ−３１２８３
６）。即ち、４３番目から５０番目までの配列がＳＤ配
列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、４６７
４６７４番目７０１７０１番目、コンセンサス転写プロ
モーターであり、効率の良い転写に貢献する。また、　
　ｐＴＰ７０−１は、抗菌剤であるアンピシリンに対し
て耐性を付与する遺伝子を有しており、その遺伝子の発
現は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨＩ部位に異種ＤＮＡが
挿入されても影響を受けない。このことから、ｐＴＰ７
０−１のＢａｍＨＩ部位に、　　ＧＲＦｌ−２９を暗号
化するＤＮＡ配列が挿入した構造をしているｐＧＲＦ２
−１５は、大腸菌に導入された場合、多量のＤＨＦＲ−
ＧＲＦ　１−２９を作る。作られたＤＨＦＲ−ＧＲＦｌ
−２９は、菌体内に可溶性の状態で９面体タンパク質の
１５〜２０％にいたるまで蓄積する。このことによフて
。

ｐＧＲＦ２−１５を有する大腸菌はトリメトブリは、ｐ
ＴＰ７０−１由来のアンピシリン耐性を付与する遺伝子
を有することから、ｐＧＲＦ２−１５が導入された大腸
菌は、アンピシリン耐性をも示す。

このような特長を有するｐＧＲＦ２−１５は。

実施例に従って作成することができるが２組換えプラス
ミドの作成方法によって本発明が制限されるものではな
い。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 ｐＧＲＦ２−１５の作成 ＧＲＦ２−１５を暗号化するＤＮＡとしては。

すでに本発明者らが構築している。プラスミドｐＧＲＦ
２９−２８　（時開　昭８２−１１５２８７に記載。）
のＢｃｌＩ切断によって得られる１０７塩基対のＤＮＡ
断片（第１図の５３３から６３９番目までの配列）を用
いた。

ｄａｍ−株である大腸菌ＧＭ３３にｐＧＲＦ２９−２８
を形質導入し、ｐＧＲＦ２８−２９を含有するＧＭ３３
株から分離したｐＧＲＦ２９−２８゜約５μｇをＢｃｌ
ｌで切断した後、ＤＮＡをフェノール処理するすること
により、共存する酵素タンパク質を変性除去いその後エ
タノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを７０
％エタノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に
沈澱を乾燥させた。乾燥させたＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動用のサンプル用緩衝液に溶解し、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、１０７塩基対のＤＮＡ断片を分離し
たくこれをＤＮＡ−１と呼ぶ。）。

ＧＲＦＩ−１９を暗号化したＤＮＡを組み込むベクター
としては、ｐＴＰ７０−１を用いた（特願　昭６１−３
１２８３６）。　約１μｇのｐ’ｒｐ７０−１を、Ｂａ
ｍＨＩで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をし
た。アルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノー
ル処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性
除去し、その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱
したルを除き、−減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢｃｌＩ
およびＢａｍＨＩによるＤＮＡの切断、アガロースゲル
電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡの抽出、アルカ
リホスファターゼ処理、フェノール処理、およびエタノ
ール沈澱の各操作は、いずれも、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎＨＡ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１
ｔＳＣｔＴ＋　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　ｅｄｓ−Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　（１９８２）、以下。

文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従って行った。

乾燥させたＤＮＡを５０μｍのリガーゼ用反応液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４，５ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．１０　ｍＭジチオトレイトール、５　ｍＭ　Ａ
ＴＰ）溶解後、５μｍのＤＮＡＩを加え、これに１ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて、１５°Ｃで、４
時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反応物を、形質
転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
、上記文献ｌに記載）に従って、大腸菌に取り込ませた
。この処理をした菌体を、５０ｍｇ／Ｉのアンピシリン
ナトリウムおよび２ｍｇ／Ｉのトリメトプリムを含む栄
養寒天培地（培地１１中に、２ｇのグルコース、１ｇの
リン酸２カリウムｒ５ｇのイーストエキス＋５ｇのポリ
ペプトン。

１５８の寒天を含む。）上に塗布し、３７’　Ｃで２４
時間培養することにより、約５０のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に２０個選び、１
．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に。

５ｇのＮａＣ１，５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプ
トン、５０ＩＴ１ｇのアンピシリンナトリウムを含む。

）で、３７’　Ｃ，１晩、菌体を培養した。培養液を、
各々エッペンドルフ遠心管にとり、　１２，０００回転
回転下１０分間遠心分雌し、菌体を沈澱として集めた。

これに、０．１ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０，
０６２５Ｍ（７）Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８，２
＄（７）ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０χの
グリセリン。

５χの２−メルカプトエタノール、　０．００１χのブ
ロムフェノールブルーを含む。）を加え、菌体を懸濁し
、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かした。この
処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ。

ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０−６８５（１９７０乃に
従って分析した。

陽画に同様ｔ４−処理をしたもの、および分子量マーカ
ーとしてラクトアルブミン（分子ｆｉ１４，２００）　
、　）リブシンインヒビター（分子ｆｉ２０，１００）
　、　　）リブシノーゲン（分子量２４，０００）　、
カルボニックアンヒドラーゼ（分子ｆｆ１２９，０００
）　、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（分子ｆｆ１３６，０００）　。

卵アルブミン（分子ｆｉｔ４５，０００）　、および牛
血清アルブミン（分子ｆｆ１６６．０００）を含むサン
プルをポリアクリルアミド濃度の１０から２０％濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、２０個のコロニーのうち
、２個ではｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲのバンドが消失し
、それより明らかに分子量が大きくなフたタンパク質（
分子量的２４　、０００と推定される。）を新たに生産
していること、残りの１８個のコロニーは、ｐＴＰ７０
−１のＤＨＦＲとほぼ同じ大きさのタンパク質を生産す
ること、ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ（分子量１８，３７
９）は、この条件で分子量的２１．０００のタンパク質
として泳動することが明らかになった。また、このＤＨ
ＦＲ−ＧＲＦＩ−２９のタンパク質と考えられるタンパ
ク質のバンドは全タンパク質バンドの約２０％程度であ
った。

分子量の大きい新らたなタンパク質を生産するコロニー
のうちから適当に一つ選び、これをＹＴ＋Ａｐ培地で培
養し、　Ｔａｎａｋａと−ｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ。

Ｔａｎａｋａ、　Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；　Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１２１゜ｐ、３５４（
１９７５））に従って、プラスミドを調製した。

得られたプラスミドをｐＧＲＦ２−１５と名づけた。ｐ
ＧＲＦ２−１５は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨ１部位に
合成りＮＡが挿入された構造をしているはずであるので
、ｐＧＲＦ２−１５をＥｃ。

ＲＩと５ａｌｌによる切断によって得られる約４００ヌ
クレオチド長のＤＮＡについて２Ｍ１３フアージを用い
たジデオキシ法（Ｊ　、Ｍｅｓｓｉｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄ
ｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０！、ｐ
、２０（１９８３））に従って塩基配列を決定した。そ
の結果、第１図に示すｐＧＲＦ２−１５の全塩基配列の
４７１番目から９３７番目の配列が明らかにされた。

ｐＴＰ７０−１の塩基配列は２本発明者らによって明ら
かにされている（特願　昭６１−３１２０−１のＥｃ６
−’ＲＩ−５ａｌｌの配列に間にあるＢａｍＨＩ部位に
、１０７ヌクレオチドのＤＮＡ（ＧＲＦｌ−２９を暗号
化する配列）が結合した配列であった。

また、ｐＧＲＦ２−１５のＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ■切断に
よって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、Ｐｓｔ
ｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｐａｌ。

Ａａ　ｔ　Ｉ　Ｉ、　　Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ、　Ｂｇｌ　Ｉ
　Ｉ、およびＣＪａｒを用いた制限酵素による切断実験
の結果。

ｐＴＰ７０−１のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断によって得
られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡと全く同一であるこ
とが示された。

以上の結果から、ｐＧＲＦ２−１５の全塩基配列が第１
図に示した配列であることが明らかである。

発明の効果 上記のように、新規組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５
は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦＩ−２９を暗号化しており、かつ
ｐＧＲＦ２−１５を有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦ
Ｉ−２９を大量に蓄積生産する。さらに、生成したＤＨ
ＦＲ−ＧＲＦｌ−２９は、ＤＨＦＲ酵素活性を示し、精
製を容易に行うことができると考えろる。このような性
質を有することから２本発明の新規組換えプラスミドｐ
ＧＲＦ２−１５およびそれを有する大腸菌は、ＤＨＦＲ
−ＧＲＦＩ−２９の生産、およびそれを利用したＧＲＦ
Ｉ−２９の生産に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＧＲＦ２−１５の全塩基配列を示した図で
あり、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、
５′末端から３２末端の方向に記述している。図中符号
は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを
、Ｇはグアニンを。 Ｔはチミンを示している。図中番号は、ｐＧＲＦ２−１
５に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断認識部位のう
ち制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に近い方のＣ１ａｌ
切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡＴ−−３−’、の
最初の”Ａ”を１番として数えた番号を示し＋いる。 第２図は、ｐＧＲＦ２−１５中に存在するＤＨＦＲ−Ｇ
ＲＦ　１−２９を暗号化する部分の塩基配列およびタン
パク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核
酸塩基およびアミノ酸を表し。 Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔ
はチミンを、Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニン
を、Ａｓｎはアスパラギンを、　Ａｓｐはアスパラギン
酸を、Ｃｙｓはシスティンを。 Ｇｉｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を。 Ｇｌｙはグリシンを、）（ｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅ
はイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジ
ンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニ
ンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒ
はトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒは
チロシンを、　　Ｖａｌはバリンを示している。図中番
号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗合化する
ＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示して
いＡＴＣＧＡＴＧＴＴＡ　ＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡ　ＧＣ
ＴＴＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡ　ＴＣＡＧＴＣ
ＴＧＡＴ　ＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡｌｌｏ　　　　　　　
１２０　　　　　　１３０ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣ
ＡＴＧＣＣＧＴ　ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＣＡＡ
ＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡ　ＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴ
ＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧ
ＣＡＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＧ　ＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧ
　ＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧ　ＴＧＧ
ＴＧＡＣＧＴＡ　ＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＡＴＧ
ＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＴ
ＡＡＣＴＣＣＧＧ　ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡ
ＧＡＴＣＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧ
ＣＣＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡ　ＴＡＣＣＴ
ＧＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡ
ＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧ　ＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴ
ＧＡＴＴＧＧ　ＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴＡ
ＴＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡ　ＧＴ
ＧＧＡＡＧＧＣＧ　ＡＣＡＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧ
ＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＣ
ＡＣＡＧＣＴＡＴＧ　ＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴ　ＴＣＴＧ
ＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴ　　ＡＴＣＴＴＣＡ
ＣＣＡ　　ＡＣＴＣＧ丁ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＡ
　ＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧ　ＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴ
ＣＧＡＴＧＡＴ　ＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＡ
ＴＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧ　ＴＴＧＣＴＧＧＣＧＣＣ
ＴＡＴＡＴＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＴＴＣ
ＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣ第　　１　　図 Ｑ７− ＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴ
ＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＧ
　ＡＡＧＧＴＣＧＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧ　ＧＧＴ
ＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＡＡＴＧ　ＡＴＣＣＡＧＡ
ＴＣＴＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴ　ＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧ
ＡＣＡＴＣＡＣＣＧ　ＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡの　　　１ ＴＧＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧ　ＧＡＣＴ
ＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴ
Ｇ　ＣＴＣＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＧ
ＡＧＴＣＧＣＡ　ＴＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣ
ＡＡＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴ　ＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧｌ
ｏｌｏ　　　　　　１０２０　　　　　１０３０ＴＣＧ
ＣＣＧＣＡＣＴ　ＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡ
ＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴ　Ｔ
ＴＴＣＧＧＣＧＡＧｌｌｌｏ　　　　　　１１２０　　
　　　１１３０ＧＡＣＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣ
ＧＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴ　ＣＧ
ＴＣＡＣＴＧＧＴ　ＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡｌつＩｎ　　
　　　　　　１つつ０　　　　　　１つつｎＣＧＣＣＡ
ＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴ
　ＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡ　ＴＧＣ
ＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＴＡＴ
ＣＧＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴ　ＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＡ
ＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＡＴＣ
ＴＴＧ　ＣＡＣＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＧＧ　
ＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧ１９Ａｎ　　　　　　１りｒ：％
ｎ 謬ムーｖＩＬＬｕＩＬＪυ ＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧ　ＣＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣ
ＧＡＣＧＣＧＧＴＴＣＧＣＧＡＣＧ　ＣＧＡＧＧＣＴＧ
ＧＡ　ＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴ　Ｃ
ＧＧＧＡＴＧＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣ
ＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡ　ＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡ
ＣＣＴＡＡＣＴＴＣＧ　ＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴ
ＧＡＴＣＧＴ・ＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧ
ＧＧ　ＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣ
ＣＣＣＧＣＧＴＴ　ＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴ・第　　ｌ　
　図 ＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧ　ＴＣＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴ
ＡＴＧＡＴＴ　ＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＣＴＧ
ＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＣＴＣＧＣＧＧ　ＣＴ
ＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴ　ＴＡＴＧＣＣ
ＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡＴＡＣＧ
ＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣの　　　２ ＡＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴ　ＴＧＣＧ
ＧＡＧＡＡＣ“ＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡ　ＣＡＴＡＴＣＣ
ＡＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＡ　’ＣＧＣＡＴＣＴＣＧＧ
　ＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧ　ＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡ　＋Ｃ
ＣＴＧＴＣＧＴＴＧ　ＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＡＧＧＣ
ＴＧＧＣＧ　（ＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＣＣＧＡＴＡＣ
ＧＣＧＡＧＣＧＡＡＣＧＴ　＋ＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ　
ＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧ’＜ＧＴＡ
ＡＡＧＴＣＴＧ　ＧＡＡＡＣＧＣＧＧＡ　ＡＧＴＣＡＧ
ＣＧＣＣ１ＴＣＴＧＣＡＴＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴ　（７ｎｌｎ　　　　　　　’）
ｎ’；’ｎ　　　　　　　’）Ｏ３０ｒＧＴＧＡＡＴＧ
ｃＧ　ＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣｒＣＴＣＣＡＧＣＡＧ　Ｃ
ＣＧＣＡＣＧＣＧＧ：ＧＧＧＴＧＣＧＣＡ　ＴＧＡＴＣ
ＧＴＧＣＴＥＧＧＴＴＧＣＣＴＴ　ＡＣＴＧＧＴＴＡＧ
ＣＥＡＡＧＣＧＡＣＴＧ　ＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡ３ＴＣ
ＴＴＣＧＧＴＴ　ＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣ：ｌ：ＴＧＣＡ
ＣＣＡＴＴ　ＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＥＴＧＧＡＡＣＡＣ
ＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧ
ＧＣＡＴＴＧ　ＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧ　７ＣＡＴＣＣＡ
ＴＡＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴ　ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡ
ノＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＣＣＧＴ　ＡＴＣ
ＧＴＧＡＧＣＡ　”ＡＴＣＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＧＡ
ＡＣＡＧ　ＡＡＡＴＴＣＣＣＣＣ−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧ
Ｇ　ＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＴＧ　（Ｇ
ＡＣＡＴＴＡＡＣＧ　ＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡ　ＡＡＣＴ
ＣＡＡＣＧＡ　（ＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧ　ＴＧＡＡＴＣ
ＧＣＴＴ　ＣＡＣＧＡＣＣＡＣＧ　１第　　ｌ　　図 へＴＴＴＴＴＣＴＣＴ　　ＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧへＣＧ
ＴＴＣＣＡＧＴ　　ＡＡＣＣＧＧＧＣＡＴｒＣＣＴＣＴ
ＣＴＣＧ　ＴＴＴＣＡＴＣＧＧＴｒＴＡＣＡＣＧＧＡＧ
　ＧＣＡＴＣＡＡＧＴＧ３ＣＣＣＧＣＴＴＴＡ　ＴＣＡ
ＧＡＡＧＣＣＡ３ＣＴＧＧＡＣＧＣＧ　ＧＡＴＧＡＡＣ
ＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴ　ＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣの
　　　３ ＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧ　ＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴ　ＧＴＣ
ＴＧＴＡＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧ　ＣＧＣＧＴＣＡ
ＧＣＧ　ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＴＡＧＣＧＡＴＡＧ　ＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＣＡＧＡ
ＧＣＡＧＡ　ＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧ　ＡＧＴＧＣＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡ　ＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴ　Ａ
ＣＣＧＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧ
ＣＴＣＧ　ＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧ
　ＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ　ＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡ
ＧＡＡＣＡＴＧ　ＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧ　ＧＣＣＡＧＣ
ＡＡＡＡ’）Ｑｌｎ　　　　　　　’）Ｑ’）ｎ　　　
　　　　　’）Ｑ’２ｎＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧ　ＡＧＣ
ＡＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧ　ＣＧＣＡＧＣＣ
ＡＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＡＡ　ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＡ
ＴＧＣＧＧＴＧＴＧ　ＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＣＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣ
ＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧ　ＡＴＡＡ
ＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
Ｇ２只７１ｎ　　　　　　２只へｎ ＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴ　ＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡ
ＧＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ
Ａ　ＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧ　ＴＴ
ＴＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＡＡＧＩ：ｌ、ＴＣＣＣＴＣＣＣ
ＴＧＣＣＧＣＴ　ＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧ
ＣＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＡＴＧＣＴＣＡＣＧ　Ｃ
ＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧ　ＣＴＧＧＧ
ＣＴＧＴＧ　ＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴ
ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴ　ＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴ第　　
１　　図　　の ＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡ　ＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣ
ＣＧＡＣＡＧ　ＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＴ
ＣＴ　ＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧ
ＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧ　ＴＧＴＡＧＧ
ＴＣＧＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧ　ＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴ
ＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴ　ＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡ
ＴＴＡＧＣＡ　ＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧ
ＧＴ　ＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴ　ＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣ
ＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴ　ＡＴＣＴＧ
ＣＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧ　ＴＴＧＧＴＡＧＣＴ
ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴ　ＴＴＴ
ＧＴＴＴＧＣＡ　ＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡ
ＡＧＡ　ＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧ
ＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴ　ＴＴＴＧＧ
ＴＣＡＴＧＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴ
　ＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡ　ＡＡＣ
ＴＴＧＧＴＣＴ　ＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣ。 ＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧ
ＡＡＧＣＣ−ＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ
Ａ　ＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡ　ＡＡ
ＡＡＡＡＧＧＡＴ３４４０　　　　　３４５０　　、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、トリメトプリム耐性を付与する遺伝子が大
   腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の３′末端側の配列
   が改変されたことによりジヒドロ葉酸還元酵素−牛成長
   ホルモン放出因子の１番目から２９番目までのペプチド
   フラグメントを含む融合タンパク質を暗号化し、４７１
   ５塩基対の大きさを有し、第１図において示されるＤＮ
   Ａ配列を有する新規組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５
   。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
   ＧＲＦ２−１５を含有するＥ．ｃｏｌｉＣ６００株。