CN116217699A - 一种高效表达羊生长激素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达羊生长激素的方法。本发明提供了一种制备羊生长激素的方法，包括如下步骤：1)制备表达羊生长激素的重组载体；该重组载体含有Trx标签、凝血酶酶切位点和羊生长激素；2)将所述重组载体和表达分子伴侣的载体共同转入大肠杆菌中，得到表达羊生长激素融合蛋白的重组菌；3)诱导表达所述重组菌，得到带有Trx标签的羊生长激素；4)凝血酶酶切所述带有Trx标签的羊生长激素蛋白，即得到羊生长激素；本发明的方法显著提高生长激素的可溶性表达，通过改变表达条件，及与分子伴侣共表达，大大的提高了羊生长激素的可溶性表达。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效表达羊生长激素的方法。
背景技术
生长激素(growth hormone,GH)是由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞合成、储存和分泌的一种蛋白质激素，其结构是一条约186-191个氨基酸构成的肽链,分子质量约21kDa-22kDa。生长激素不仅可以增加体重和身高,而且其参与机体糖、蛋白和脂质的代谢调节。动物的生长激素(如：牛)主要用来增加产奶量和瘦肉率,提高饲料转化率等。
关于生长激素的获得主要来自两个途径，第一个是直接从动物或者人的脑垂体中进行提取；第二个方法是通过基因工程的手段来获得。而第一种方法是很久之前科技相对落后时候的方法，当时人的生长激素含量只占到了脑垂体干重的4％-8％，按一般的情况来讲一个垂体可得到3-5mg的生长激素。到了20世纪70年代，随着科技尤其是基因工程技术的发展，通常使用第二种方法来制备大量的重组生长激素来代替天然的生长激素。1985年，美国FDA批准了由基因工程技术产生的重组人生长激素。
从上世纪末到本世纪初，科学家们通过不同的方法对绵羊的生长激素进行了表达纯化，主要是使用原核表达。但是表达量低下、表达包涵体一直无法很好的解决，且包涵体复性后其活性无法保证。而出现包涵体主要是由于菌株在表达过程中强度太大，无法保障其所合成的肽链进行正确的折贴，从而形成了无活性的包涵体。
因此，如何能够高效制备绵羊生长激素成为值得探索的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高羊生长激素可溶性原核表达的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将重组载体和表达分子伴侣的载体共同转入大肠杆菌中，得到重组菌；
所述重组载体含有Trx标签和羊生长激素；
2)诱导表达所述重组菌，实现提高羊生长激素可溶性表达；
所述羊生长激素具体以绵羊生长激素为例，具体为如下任一种：
a)包括序列2第133-322位的氨基酸序列的蛋白；
b)在a)所示蛋白序列的末端带有标签的蛋白；
c)序列2第125-322位所示的蛋白；
d)与a)-c)中任一至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的蛋白。
上述诱导采用的诱导剂为IPTG。
上述提高羊生长激素可溶性原核表达体现在导入表达分子伴侣的载体制备重组菌比不导入表达分子伴侣的载体制备重组菌经过诱导后的羊生长激素可溶性表达量高。
本发明的另一个目的是提供一种制备羊生长激素的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)制备表达羊生长激素的重组载体；
该重组载体含有Trx标签和羊生长激素；
2)将所述重组载体和表达分子伴侣的载体共同转入大肠杆菌中，得到重组菌；再诱导表达所述重组菌，得到带有Trx标签的羊生长激素；
3)去除所述带有Trx标签的羊生长激素中的Trx标签，即得到羊生长激素；
所述羊生长激素具体为绵羊生长激素，具体为如下任一种：
a)包括序列2第133-322位的氨基酸序列的蛋白；
b)在a)所示蛋白序列的末端带有标签的蛋白；
c)序列2第125-322位所示的蛋白；
d)与a)-c)中任一至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的蛋白。
上述方法中，所述重组载体为将含有羊生长激素编码基因的核酸分子插入到带有Trx标签的表达载体，得到载体；
其中，所述含有羊生长激素编码基因的核酸分子进一步包括限制酶识别位点、凝血酶酶切位点、纯化标签、羊生长激素编码基因和另一限制酶识别位点。
更进一步，所述限制酶识别位点和所述另一限制酶识别位点分别为MscI和BamHI；
或，所述纯化标签在本发明的实施例中为His标签；
或，所述含有羊生长激素编码基因的核酸分子为序列1。
上述方法中，所述带有Trx标签的表达载体源于pET-32a(+)。
或，所述带有Trx标签的表达载体为将Msc1和BamH1双酶切pET-32a(+)载体后得到的线性载体骨架；
上述方法中，所述表达分子伴侣的载体为pGro7。
上述方法中，所述诱导表达的条件为：0.025mM-1mM的IPTG、20℃-37℃诱导培养20小时。
上述方法中，所述去除带有Trx标签的羊生长激素中的Trx标签为凝血酶酶切所述带有Trx标签的羊生长激素；
或，所述酶切的条件为0-4℃酶切8分钟。
上述方法中，所述方法还包括如下步骤：
在所述凝血酶酶切前或后，对酶切前产物或酶切后产物分别利用所述纯化标签纯化。
或，上述带有Trx标签的表达载体和上述表达分子伴侣的载体在提高羊生长激素可溶性原核表达中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述带有Trx标签的表达载体、表达分子伴侣的载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述羊生长激素、带有Trx标签的表达载体、表达分子伴侣的载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述羊生长激素、表达载体和表达分子伴侣的载体在制备表达羊生长激素的重组菌中的应用也是本发明保护的范围。
或，经过Msc1和BamH1双酶切后的pET-32a(+)载体和pGro7载体在提高羊生长激素可溶性表达中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述经过Msc1和BamH1双酶切后的pET-32a(+)载体、pGro7载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用也是本发明保护的范围。
或，上述重组载体或重组菌也是本发明保护的范围；
或，所述重组载体或重组菌在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的技术方案主要是使用TransB(DE3)进行表达；通过改造pET-32a(+)载体，使其保留Trx-Tag及Thrombin(凝血酶)酶切位点，Trx-Tag有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增加蛋白的可溶性；而凝血酶酶切位点是在融合表达后将Trx-Tag切掉。并且在转化的同时一并转进去另一个表达分子伴侣的载体pGro7，其表达的GroEL/GroES可以形成一个疏水结构，当肽链合成后可以在其中正确的折叠。综上可以实现羊生长激素的可溶性表达。
上述改造pET-32a(+)载体为使用限制性内切酶MscI和BamHI去除了pET-32a(+)上多余序列，使用PCR的方法重新排列了蛋白酶酶切位点及His标签的位点以便后期纯化，利用了载体原来的T7启动子来启动目的基因表达，并且为了防止融合标签损害重组蛋白的生物学功能，干扰其自然结构或免疫原性，使用廉价的凝血酶切除掉Trx标签，常规载体实现羊生长激素在大肠杆菌中的高效表达，提高了可溶性羊生长激素的表达量。
本发明的实验证明，本发明具有如下优点：
(1)序列的改造，根据密码子的偏爱性，重新设计的重组羊生长激素核苷酸序列，使oGH更易于表达。
(2)载体的改造，设计了融合蛋白Trx-hisogh的序列以便于后期切除掉Trx标签，去除了pET-32a(+)上不必要的多余序列，而且利用载体原来的T7启动子来启动目的基因的表达，通过以上所有改造成功实现了利用常规载体pET-32a(+)实现羊生长激素在大肠杆菌TransB(DE3)中的高效表达。
(3)显著提高生长激素的可溶性表达，通过改变表达条件，及与分子伴侣共表达，大大的提高了羊生长激素的可溶性表达。
(4)本发明采用的初始载体普遍，菌种常见，诱导表达参数控制简单，所以成本低廉，易于实现，方法简单，技术人员易于掌控，便于推广。
附图说明
图1为工程菌BAC ID NO：1诱导表达。
图2为工程菌BAC ID NO：1诱导表达后蛋白可溶性检测。
图3为工程菌BAC ID NO：1诱导表达IPTG浓度的优化。
图4为工程菌BAC ID NO：1诱导表达温度的优化。
图5为工程菌BAC ID NO：1表达条件优化后蛋白可溶性检测。
图6为工程菌BAC ID NO：2诱导表达蛋白的可溶性检测。
图7为融合蛋白Trx-hisogh酶切条件的优化。
图8为融合蛋白Trx-hisogh酶切后再次纯化得到最终粗蛋白hisogh。
图9为最终粗蛋白的western blot检测和LC-MS鉴定相对分子量。
图10为融合蛋白Trx-hisogh及酶切后hisogh的结构。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中以绵羊生长激素为例。
下述实施例中LC-MS的具体参数如下：
实验仪器和材料
Exactive Plus EMR(Thermo Fisher Scientific，US)，HPLC L-3120(RIGOL，CN)，ACN(Fisher)，FA(Fisher)，去离子水
Exactive Plus EMR质谱
采集模式：正离子。采集范围：m/z1000～m/z9000；HCD：35.0eV；分辨率：17500；微扫描：10；质量锁定：关；最大离子注入时间：200ms；鞘气流速：30；辅助气流速：10；吹扫流速：0；喷雾电压：3.5kV；毛细管温度：350℃；辅助气加热温度：310℃；S-棱镜射频档：200。数据处理软件：ProteinDeconvolution(v4)
HPLC(RIGOL，L-3120)
色谱柱：Agilent C3色谱柱(3.5μm，150mm×4.6mm)。柱温：40℃。流动相A：H2O(含2％ACN，0.1％FA)；流动相B：ACN(含10％H2O，0.1％FA)。流速：0.25ml/min。上样量：50μl。检测波长：280nm。梯度如下表1：
表1
实验方法：取一定量样本，加入6μl 5％FA混匀，10000g高速离心5min，取上清进行LC-MS检测。
实施例1、利用大肠杆菌高效表达绵羊生长激素的方法
一、表达绵羊生长激素的重组菌的制备
1、目的基因羊生长激素的获得
根据已知的羊生长激素oGH的天然氨基酸序列(NCBI:NM_001009315.3，来自于绵羊)，按照大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，设计oGH的编码序列(序列1第59-631位)，且在该编码序列两端添加相关序列得到如下目的基因羊生长激素：限制性内切酶切位点1(MscI)-凝血酶酶切位点序列-His标签序列-oGH的编码序列-限制性内切酶切位点2(BamHI)，命名为目的基因羊生长激素。
目的基因羊生长激素的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中序列1第1-6位为MscI酶切位点，第7-22位为linker，第23-40位为凝血酶酶切位点序列，第41-58位为His标签序列，第59-628位为oGH的编码序列，第629-631位为终止密码子，第632-637位为BamHI酶切位点。
2、改造pET-32a(+)载体
pET-32a(+)(Novagen，69015-3)通过Msc1和BamH1双酶切，收集5747bp的片段，即为线性化的pET-32a-Trx。
线性化的pET-32a-Trx去掉了pET-32a(+)上的S-Tag标签、原来的Thrombin以及enterokinase位点的多余序列，保留Trx-Tag；Trx-Tag有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增加蛋白的可溶性，凝血酶酶切位点在序列1中被重新排列补充上，以便后期切掉Trx-tag及蛋白纯化。
3、重组表达载体pET-32a-Trx-his-oGH的制备
将上述1制备的目的基因羊生长激素和上述2制备的线性化的pET-32a-Trx连接，得到重组表达载体pET-32a-Trx-his-oGH。
该重组表达载体表达带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh(结构如图10的上图)，该带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh的氨基酸序列为序列2，其中序列2第1-109位为Trx标签，第110-126位为连接序列及凝血酶识别序列，第127-132位为his标签，第133-322位为oGH蛋白。
重组表达载体pET-32a-Trx-his-oGH为将序列1所示的目的基因羊生长激素替换线性化的pET-32a-Trx中Msc1和BamH1酶切位点间片段，得到的载体。
4、表达重组蛋白的重组菌的制备
1)重组菌BAC ID NO：1的制备
上述3制备的重组表达载体pET-32a-Trx-his-oGH转化大肠杆菌TransB(DE3)中，在含有氨苄青霉素(100ug/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒MscI和BamHⅠ双酶切鉴定(酶切得到631bp的为阳性)，以及测序鉴定，经鉴定克隆成功，成功获得阳性重组菌BACID NO：1。
该阳性重组菌BAC ID NO：1为含有pET-32a-Trx-his-oGH的TransB(DE3)工程菌。
2)重组菌BAC ID NO：2的制备
将上述1)得到的重组菌BAC ID NO：1制备为感受态细胞，将分子伴侣表达载体pGro7(takara，3340)转化工程菌BAC ID NO：1，并在含有氨苄青霉素(100ug/mL)和氯霉素(20ug/mL)的LB平板上挑选阳性克隆得到工程菌BAC ID NO：2。
二、来源于工程菌BAC ID NO：1的带有Trx标签的重组绵羊生长激素的诱导表达
1、重组绵羊生长激素Trx-hisogh的诱导表达
将上述一制备的工程菌BAC ID NO：1在LB培养基中培养10h得到菌液；再将菌液以1:100的比例加入LB培养基中37摄氏度培养3小时，取出部分菌液收集菌体(记作BAC IDNO：1诱导前全菌样品)，其他菌液再加入IPTG(IPTG终浓度为1mM)，37℃诱导培养4小时，5000g离心10分钟收集菌体，得到BAC ID NO：1诱导后全菌样品，SDS-PAGE胶电泳检测。
结果如图1所示，1为BAC ID NO：1诱导前全菌样品、2为BAC ID NO：1诱导后全菌样品，工程菌BAC ID NO：1表达约34KD的带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh(序列2)。
2、重组绵羊生长激素菌体中蛋白检测
将上述1得到BAC ID NO：1诱导后全菌样品，用lysis buffer(即为下文中的A液)重悬后进行超声破碎(冰浴200W,超声2s，停4s)，使用低温超速离心机17,000×g离心30分钟，收集上清及沉淀并且使用镍柱纯化富集上清(可能存在的目的蛋白)。
配制A液(pH 8.0)：50mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，10％甘油，余量为水。
SDS-PAGE胶电泳检测，结果如图2所示，1为BAC ID NO：1诱导前全菌样品、2为BACID NO：1诱导后全菌样品、3为BAC ID NO：1诱导后超声上清液过镍柱富集的洗脱样品；可以看出，工程菌BAC ID NO：1上清中有少量带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh(34KD)，表明该目的蛋白的可溶性蛋白很少。
3、诱导表达中诱导剂浓度的摸索
基于2中的结果，对工程菌BAC ID NO：1的表达条件进行了摸索：
将上述一制备的工程菌BAC ID NO：1在LB培养基中培养10h得到的菌液；再将菌液以1:100的接种比例加入LB培养基中在37摄氏度培养3小时，再加入IPTG，IPTG终浓度分别为0.025mM,0.05mM,0.1mM,0.5mM,1mM，37℃诱导4小时，5000g离心10分钟收集菌体，进行SDS-PAGE胶电泳检测。
结果如图3所示，1-6分别为工程菌BAC ID NO：1诱导前全菌样品，工程菌BAC IDNO：1使用0.025mM,0.05mM,0.1mM,0.5mM,1mM诱导后的样品，可以看出，IPTG浓度不影响带有Trx标签的重组绵羊生长激素的表达，因此，后期选用最小IPTG浓度0.025mM。
4、诱导表达中温度的摸索
基于3中的结果，对工程菌BAC ID NO：1的表达条件进行了摸索：
将上述一制备的工程菌BAC ID NO：1在LB培养基中培养10h得到的菌液；再将菌液以1:100的比例加入LB培养基中在37摄氏度培养3小时，加入IPTG，IPTG终浓度为1mM，培养温度调节为20℃，25℃，30℃，37℃，分别诱导20h，15h，10h，4h，5000g离心10分钟收集菌体，用lysis buffer重悬后进行超声破碎(冰浴200W,超声2s，停4s)，使用低温超速离心机17,000×g离心30分钟，收集菌体，进行SDS-PAGE胶电泳检测。
结果如图4所示，1-5分别为工程菌BAC ID NO：1诱导前全菌样品，工程菌BAC IDNO：1使用20℃，25℃，30℃，37℃诱导后全菌样品，可以看出，温度不影响带有Trx标签的重组绵羊生长激素的表达，因此，后期选用最小温度20℃。
5、重组菌BAC ID NO：1诱导表达
基于3和4的结果，将3和4的实验结果结合，将上述一制备的工程菌BAC ID NO：1在LB培养基中培养10h得到的菌液；再将菌液以1:100的比例加入LB培养基中在37摄氏度培养3小时，加入IPTG，IPTG终浓度为0.025mM，培养温度为20℃诱导20小时，5000g离心10分钟收集菌体，用lysis buffer重悬后进行超声破碎(冰浴200W,超声2s，停4s)，使用低温超速离心机17,000×g离心30分钟，收集上清和沉淀并且使用镍柱纯化富集上清，进行SDS-PAGE胶电泳检测。
结果如图5所示，1-6分别为1、BAC ID NO：1诱导前全菌样品，2、BAC ID NO：1诱导后全菌样品，3、BAC ID NO：1诱导后超声沉淀样品，4、BAC ID NO：1诱导后超声上清样品，5、BAC ID NO：1诱导后过镍柱洗脱样品，6、BAC ID NO：1诱导后过镍柱洗脱样品，可以看出，和图2中的过镍柱结果比，工程菌BAC ID NO：1的上清中带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh含量并无变化，表明优化后的诱导条件并没有改变可溶性Trx-hisogh蛋白的含量，仍然以包涵体的形式存在于沉淀或菌体中。
三、来源于工程菌BAC ID NO：2的带有Trx标签的重组绵羊生长激素的诱导表达
由于BAC ID NO：2来源于BAC ID NO：1，BAC ID NO：1的诱导表达条件适用于BACID NO：2，因此，使用上述二的5中的诱导表达条件对BAC ID NO：2进行诱导培养，具体如下：
1、诱导培养
将工程菌BAC ID NO：2在LB培养基中培养10h得到的菌液；再将菌液以1:100的比例加入LB培养基中在37摄氏度培养3小时，加入IPTG，IPTG终浓度为0.025mM，培养温度为20℃诱导培养20小时，5000g离心10分钟收集菌体。
2、破碎菌体
将上述1的菌体沉淀按体积比1:5加入A液重悬，冰浴超声破碎(200W,2s超声，4s间歇)使用低温超速离心机17,000×g离心30分钟，收集上清液和沉淀。
3、亲和层析
将上述2得到的上清液上样镍柱，4℃充分结合镍柱；用2倍体积的A液进行洗涤，5倍体积B液洗脱，收集洗脱液(含有带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh)。
配制A液(pH 8.0)：50mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，10％(体积百分含量)甘油，余量为水；
配制B液(pH 9.0):25mM Tris，250mM NaCl，200mM咪唑，5％(体积百分含量)甘油，余量为水；
SDS-PAGE胶电泳检测，结果如图6所示，1-4分别为BAC ID NO：2诱导前全菌样品，BAC ID NO：2诱导后全菌样品，BAC ID NO：2诱导后超声沉淀样品，BAC ID NO：2诱导后超声上清样品，5-7分别为BAC ID NO：2诱导后超声上清过镍柱洗脱样品，8-9分别为BAC ID NO：1在同样条件下诱导后超声上清过镍柱洗脱样品；可看出，和BAC ID NO：1相比，工程菌BACID NO：2上清中带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh的含量有很明显提升，表明工程菌BAC ID NO：2中带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh的可溶性蛋白含量高。
经过Bradford检测，重组菌BAC ID NO：2表达纯化后洗脱液中蛋白Trx-hisogh含量约为7.5mg/mL，总共38mL；而重组菌BAC ID NO：1表达纯化后洗脱液中蛋白Trx-hisogh含量约为760μg/mL。
因此，工程菌BAC ID NO：2比工程菌BAC ID NO：1可溶性Trx-hisogh目的蛋白含量高。
四、酶切获得重组绵羊生长激素
为了防止融合标签损害重组蛋白的生物学功能，干扰其自然结构或产生免疫原性，使用廉价的凝血酶切除掉Trx标签。经过试验选用0.005IU切割1ug蛋白，
具体方法如下：
1、亲和层析
将上述三来源于工程菌BAC ID NO：2的洗脱液(含有带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh)上样镍柱，4℃充分结合镍柱；用2倍体积的A液进行洗涤，5倍体积B液洗脱，收集洗脱液(含有重组绵羊生长激素hisogh)。
2、超滤
使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，作用是去除小分子杂质和盐类并且浓缩蛋白。
取上述1得到的洗脱液，加入10倍体积的C液稀释，进行超滤，重复4次后，得到纯化带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh溶液。
3、酶切
收集30Ml纯化带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh溶液(蛋白含量7.5mg/mL)，向其按照0.005IU/ug蛋白的量添加凝血酶(安徽经科生物技术有限公司，JK-034B,酶的比活2000U/mg)，在4℃的条件下酶切使用PMSF终止酶切。
从切割2分钟(从加入凝血酶起计时)时开始收样(酶切产物)，每隔2分钟收一次样品。
SDS-PAGE胶电泳检测不同切割时间的样品，结果如图7所示：1为酶切前原始样品(未加入凝血酶的带有Trx标签的重组绵羊生长激素)，2-12分别为酶切2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22分钟后的样品；可以看出，酶切8分钟就可以得到较为满意的结果，获得22KD的重组绵羊生长激素hisogh，因此选用酶切时间8min。
重组绵羊生长激素hisogh的氨基酸序列为序列2第125-322位。
五、重组绵羊生长激素hisogh的纯化
配制C液(pH 9.5):20mM Tris，余量为水；
1、亲和层析
将上述四得到的酶切8小时的酶切产物上样镍柱，4℃充分结合镍柱；用2倍体积的A液进行洗涤，5倍体积B液洗脱，收集洗脱液(含有重组绵羊生长激素hisogh)。
SDS-PAGE检测洗脱液，结果如图8所示，1为上述三得到的洗脱液(含有带有Trx标签的重组绵羊生长激素Trx-hisogh)，2为洗脱液(含有重组绵羊生长激素hisogh)，可以看出，得到含有约22KD重组绵羊生长激素hisogh的粗提液。
重组绵羊生长激素hisogh(图10下图)的氨基酸序列为序列2第125-322位。
2、超滤
使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，作用是去除小分子杂质和盐类并且浓缩蛋白。
取上述1得到的洗脱液，加入10倍体积的C液稀释，进行超滤，重复4次后，即得到纯化重组绵羊生长激素hisogh溶液。
经过Bradford检测并计算工程菌BAC ID NO：2制备的纯化重组绵羊生长激素hisogh可溶性蛋白产量为21.9mg/L，其中的L为BAC ID NO：2进行IPTG诱导培养20小时的菌液体积。
经过Bradford检测并计算工程菌BAC ID NO：1采用同样方法制备的纯化重组绵羊生长激素hisogh可溶性蛋白产量为2.4mg/L，其中的L为BAC ID NO：1进行IPTG诱导培养20小时的菌液体积。
3、westernbolt及质谱检测
将上述2得到的纯化重组绵羊生长激素hisogh使用His标签一抗(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：D191001)进行westernbolt检测，并且使用LC-MS检测纯化重组绵羊生长激素hisogh的分子量。
westernbolt检测结果如图9a所示，其中1为BSA空白对照，2-4分别为三次重复试验得到的纯化重组绵羊生长激素hisogh；可以看出，得到约22KD的重组绵羊生长激素(序列2的125-322位)。
LC-MS检测结果如图9b所示，可以看出，得到22749.22Da的重组绵羊生长激素。
SEQUENCE LISTING
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<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Gly Gly Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His
115 120 125
His His His His Phe Pro Ala Met Ser Leu Ser Gly Leu Phe Ala Asn
130 135 140
Ala Val Leu Arg Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Phe
145 150 155 160
Lys Glu Phe Glu Arg Thr Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile
165 170 175
Gln Asn Thr Gln Val Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro
180 185 190
Thr Gly Lys Asn Glu Ala Gln Gln Lys Ser Asp Leu Glu Leu Leu Arg
195 200 205
Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Leu Gln Phe Leu
210 215 220
Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val
225 230 235 240
Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Leu Ala Leu Met Arg
245 250 255
Glu Leu Glu Asp Val Thr Pro Arg Ala Gly Gln Ile Leu Lys Gln Thr
260 265 270
Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Met Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys
275 280 285
Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Arg Lys Asp Leu His Lys Thr Glu
290 295 300
Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Gly Glu Ala Ser Cys
305 310 315 320
Ala Phe
Claims (10)
1.一种提高羊生长激素可溶性原核表达的方法，包括如下步骤：
1)将重组载体和表达分子伴侣的载体共同转入大肠杆菌中，得到重组菌；
所述重组载体含有Trx标签和羊生长激素；
2)诱导表达所述重组菌，实现提高羊生长激素可溶性表达。
2.一种制备羊生长激素的方法，包括如下步骤：
1)将重组载体和表达分子伴侣的载体共同转入大肠杆菌中，得到重组菌；
所述重组载体含有Trx标签和羊生长激素；
2)诱导表达所述重组菌，得到带有Trx标签的羊生长激素；
3)去除所述带有Trx标签的羊生长激素中的Trx标签，即得到羊生长激素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述重组载体为将含有羊生长激素编码基因的核酸分子插入到带有Trx标签的表达载体，得到载体；
或，所述含有羊生长激素编码基因的核酸分子包括限制酶识别位点、凝血酶酶切位点、纯化标签、羊生长激素编码基因和另一限制酶识别位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述限制酶识别位点和所述另一限制酶识别位点分别为MscI和BamHI；
或，所述纯化标签为His标签；
或，所述羊生长激素为如下任一种：
a)包括序列2第133-322位的氨基酸序列的蛋白；
b)在a)所示蛋白序列的末端带有标签的蛋白；
c)序列2第125-322位所示的蛋白；
d)与a)-c)中任一至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的蛋白；
或，所述含有羊生长激素编码基因的核酸分子为序列1。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述带有Trx标签的表达载体源于pET-32a(+)；
或，所述带有Trx标签的表达载体为将Msc1和BamH1双酶切pET-32a(+)载体后得到的线性载体骨架。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述表达分子伴侣的载体为pGro7。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述诱导表达的条件为：0.025mM-1mM的IPTG、20℃-37℃诱导培养20小时。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述去除带有Trx标签的羊生长激素中的Trx标签为凝血酶酶切所述带有Trx标签的羊生长激素；
或，所述酶切的条件为0-4℃酶切8分钟。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括如下步骤：在所述凝血酶酶切前或后，对酶切前产物或酶切后产物分别利用所述纯化标签纯化。
10.权利要求3-9中任一中带有Trx标签的表达载体和表达分子伴侣的载体在提高羊生长激素可溶性表达中的应用；
或，权利要求3-9中任一中带有Trx标签的表达载体、表达分子伴侣的载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用；
或，权利要求3-9中任一中的羊生长激素、带有Trx标签的表达载体、表达分子伴侣的载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用；
或，权利要求3-9中任一中的羊生长激素、表达载体和表达分子伴侣的载体在制备表达羊生长激素的重组菌中的应用；
或，经过Msc1和BamH1双酶切后的pET-32a(+)载体和pGro7载体在提高羊生长激素可溶性表达中的应用；
或，经过Msc1和BamH1双酶切后的pET-32a(+)载体、pGro7载体和凝血酶在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用；
或，权利要求1-9中任一中的重组载体或重组菌；
或，所述重组载体或重组菌在制备羊生长激素或提高羊生长激素产量中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111474114.6A CN116217699A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种高效表达羊生长激素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111474114.6A CN116217699A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种高效表达羊生长激素的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116217699A true CN116217699A (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=86570166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111474114.6A Pending CN116217699A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种高效表达羊生长激素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116217699A (zh) |
-
2021
- 2021-12-03 CN CN202111474114.6A patent/CN116217699A/zh active Pending
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